Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

3.1 Введение

3.2 «Молекулярные беконы»

3.3 Сковороподобные ДНК-зонды для микрочиповой гибридизации

3.4 Заключение

Нормализация библиотек кДНК

4.1 Введение

4.1.1 Для чего нужна нормализация библиотек кДНК

4.1.2 Оценка эффективности нормализации

4.2 Основные подходы к нормализации библиотек кДНК

4.2.1 Создание нормализованных библиотек, обогащённых полноразмерными кДНК, с использованием дуплекс-специфичной нуклеазы (ДСН-нормализация)

Клонирование совпадений: эффективный метод экспериментального выделения общих последовательностей

5.1 Введение

5.2 Селекция гетеродуплексов на стадии клонирования

5.3 Физическое разделение гибридных молекул

5.4 Подходы, основанные на ПЦР

5.5 Краткое заключение

Гибридизация ДНК в растворе для детектирования мутаций

6.1 Введение

6.2 Химические методы

6.3 Энзиматические методы

6.3.1 Нуклеазное сканирование мутаций

6.3.2 Подходы, основанные на аллель-специфической ПЦР

6.3.3 Другие энзиматические подходы для сканирования мутаций

6.4 Физические методы

Подходы к повышению специфичности гибридизации нуклеиновых кислот

7.1 Введение

7.2 Улучшение параметров кинетики гибридизации

7.2.1 Упрощение гибридизационных смесей

7.2.2 Химические модификации

7.3 Ужесточение требований к селекции совершенных дуплексов

Практическая часть:

1. Методы идентификации новых копий геномных повторов

1.1 Введение

1.2 Метод TGDA: вычитающая гибридизация участков, фланкирующих геномные повторы

1.3 Метод Diffir: дифференциальная гибридизация фланков геномных повторов на фильтре

1.4 Приложение методов TGDA и Diffir для молекулярной генетики человека

1.4.1 Идентификация человек-специфичных инсерций эндогенных ретровирусов

1.4.2 Идентификация человек-специфичных вставок ретроэлементов L1

1.4.3 Новое семейство химерных ретроэлементов эукариот

2. Анализ транскрипционной активности геномных повторов

2.1 Введение

2.2 Метод GREM: полногеномный поиск промоторно-активных повторов

2.3 Приложение GREM для поиска промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека

2.4 Антисмысловая регуляция экспрессии генов молекулами РНК, транскрибируемыми с промоторов человек-специфичных эндогенных ретровирусов

3. Повышение специфичности гибридизации в растворе

3.1 Введение

3.2 Метод MDR: селективная деградация неправильно спаренных гетеродуплексов

3.3 Приложение MDR для поиска эволюционно консервативных последовательностей в геномах человека и обезьян

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ОБЩИХ СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ДИССЕРТАНТА

ВЫВОДЫ

Список цитируемых литературных источников

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта диссертационная работа посвящена структурно-функциональному анализу мобильных элементов эукариот. Основная часть результатов была получена при применении новых методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе. Литературный обзор посвящён именно описанию существующих на настоящий момент экспериментальных подходов к крупномасштабному анализу генома и транскриптома. Биология мобильных элементов рассматривается в литературном обзоре лишь вскользь, поскольку эта тема подробно описывалась в обзоре к диссертации автора на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Два фактора: нежелание повторяться, а также то, что методическим подходам, даже новым и оригинальным, как правило, уделяется до обидного мало места в печатных трудах, и сформировали позицию автора относительно структуры настоящей диссертационной работы.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Потенциал и границы применения гибридизации нуклеиновых кислот

Различные экспериментальные подходы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот, такие как гибридизация микрочипов, конкурентная геномная и Саузерн/Нозерн блот гибридизация, стали весьма популярны среди научного сообщества и используются в настоящее время повсеместно. Однако же, представляется недооценённым потенциал ряда родственных экспериментальных методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе. К таким методам относятся вычитающая гибридизация, которая позволяет эффективно находить различия в образцах геномной ДНК или кДНК; метод клонирования общих последовательностей (англ. coincidence cloning), который, напротив, позволяет идентифицировать последовательности, присутствующие во всех сравниваемых образцах; нормализация кДНК, которая используется для выравнивания концентраций часто- и редко представленных транскриптов в библиотеках кДНК; метод, названный TILLING, широко применимый для исследований в области обратной генетики. Наконец, некоторые методы направлены на крупномасштабный поиск полиморфных участков ДНК, включая выявление однонуклеотидных полиморфизмов. Литературный обзор настоящей диссертационной работы посвящён этим и другим недавним достижениям в области гибридизации нуклеиновых кислот, включая попытки повышения её специфичности. В первой, вводной, главе, автор старается дать краткую характеристику нынешнему уровню развития технологии гибридизации нуклеиновых кислот в растворе, а также определить основные принципы и области применения основанных на ней методов. В главе также будут обсуждаться преимущества и недостатки этих методов.

1.1 Введение

Уотсон-Криковская гибридизация комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот - это один из самых важных фундаментальных процессов, необходимый как для узнавания на молекулярном уровне in vivo (1), так и для выделения и анализа нуклеиновых кислот in vitro (2). Использование экспериментальных подходов, основывающихся на гибридизации ДНК в растворе, имеет ряд преимуществ для многих приложений, начиная от конструирования репрезентативных библиотек кДНК для секвенирования пулов EST, и заканчивая идентификацией эволюционно консервативных последовательностей, дифференциально экспрессирующихся генов и геномных делеций. Уникальные характеристики многих таких методов делают их сильными конкурентами таких широко известных и вошедших в моду подходов, как микрочиповая и конкурентная геномная гибридизации. В качестве примера можно привести следующие методы: вычитающая гибридизация позволяет находить различия в образцах кДНК или геномной ДНК; метод клонирования совпадающих последовательностей (coincidence cloning), напротив, эффективен для поиска общих последовательностей в сравниваемых образцах; нормализация кДНК успешно используется для выравнивания содержания часто- и редко встречающихся последовательностей в библиотеках кДНК, что особенно важно для создания репрезентативных библиотек EST (англ. expressed sequence tag). Более того, некоторые методы используются для крупномасштабного поиска полиморфных локусов, включая идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов.

Гибридизация нуклеиновых кислот в растворе имеет ряд преимуществ общего характера перед гибридизацией с нуклеиновыми кислотами, иммобилизованными на твёрдом носителе: более быструю кинетику гибридизации, лучшую дискриминацию совершенных дуплексов и возможность использовать полученные дуплексы для дальнейшей ПЦР амплификации и клонирования. Среди методов гибридизации в растворе, вычитающая гибридизация, безусловно, на настоящий момент является наиболее популярной техникой. Анализ дифференциально экспрессирующихся генов в постгеномную эру требует масштабного скрининга и включает в себя как анализ транскриптома и протеома, так и расширенный поиск функциональных полиморфизмов среди популяций. Основными подходами, используемыми для достижения этих целей, являются секвенирование по Сэнгеру и ДНК-чипы, применяемые как для качественных, так и для количественных измерений (3). Вместе с тем, нельзя не признать ряд существенных недостатков, которыми обладают многие популярные подходы, основанные на технологии микрочипов:

Анализ ограничен количеством кДНК или синтетических олигонуклеотидов, нанесённых на чип. Это количество, как правило, существенно ниже, чем общее количество генов у исследуемых организмов. Таким образов, многие гены избегают анализа в подобных системах.

Даже «полнотранскриптомные» ДНК-чипы в их нынешнем виде слабо дискриминируют различные сплайс-формы мРНК.

Экспрессия генов, транскрибируемых на низком уровне, не может быть детектирована с использованием стандартных микрочиповых систем.

Чипы, созданные на основе нанесенных на твёрдый носитель кДНК, не позволяют дискриминировать различных индивидуальных представителей многих генных семейств, а также многие транскрипты, содержащие в своём составе геномные повторы.

Наконец, микрочипы не содержат большинства регуляторных антисмысловых РНК и не могут быть использованы для масштабных исследаваний регуляции экспрессии генов по пути РНК интерференции.

Однако же, многие из вышеперечисленных недостатков могут быть исправлены при подборе или же разработке специфических вариантов технологии микрочипов.

Впрочем, наиболее важный минус закрытых систем, таких как микрочипы, сохраняется: все они требуют предварительной информации по геномной и транскриптомной последовательностям для обнаружения, например, дифференциально экспрессирующихся транскриптов.

Открытые системы обладают большей «подвижностью» в детекции новых последовательностей с неизвестной структурой и/или функциональным статусом. Различия в экспрессии генов между двумя образцами могут быть найдены как результат прямого сравнения двух образцов, без предварительного упрощения транскриптомов в угоду той или иной теории, которой придерживается исследователь или же основываясь на которой был разработан микрочип. К таким методам прямого сравнения относятся методы дифференциального дисплея (4), дифференциального клонирования (5), а также комбинация этих методов (6, 7). Эти подходы успешно применялись для поиска генов, дифференциально экспрессирующихся в двух сравниваемых образцах. Впрочем, следует упомянуть и недостаток упомянутых методов: они эффективно применимы лишь для анализа генов, экспрессирующихся на высоком уровне и/или показывающих значительные различия в уровнях экспрессии в сравниваемых образцах. При этом эффективность обнаружения дифференциальных слабо экспрессируемых транскриптов крайне низка (8). Эта проблема становится неразрешимой, когда разница в экспрессии таких «редких» транскриптов между образцами также мала. Необходимо заметить, что многие гены, экспрессируемые на низком уровне, играют важнейшие роли в установлении и поддержании различных фенотипических признаков, и их всесторонний анализ необходим для понимания целостной картины механистических изменений, происходящих в клетке. Основным преимуществом вычитающей гибридизации является возможность поиска дифференциально экспрессирующихся генов вне зависимости от уровня их транскрипции, и при отсутствии предварительных данных об их первичной структуре. Помимо получения дифференциальных библиотек кДНК, вычитающая гибридизация также чрезвычайно полезна для поиска различий в геномных ДНК (9-13).

1.2 Клонирование дифференциальных последовательностей: вычитающая гибридизация

1.2.1 Появление метода

Вычитающая гибридизация (ВГ) была впервые использована Баутцем и Рейлли в 1966 г. для очистки мРНК фага T4 (14). Позднее, в нескольких исследовательских группах использовались варианты этой техники, как для клонирования кДНК, полученных из мРНК сравниваемых образцов (вычитание кДНК), так и для выявления крупных делеций в геномной ДНК (геномное вычитание). Техника ВГ получила «второе дыхание» в 1984 г., когда Палмер и Ламар применили ВГ для создания рекомбинантных библиотек геномной ДНК мыши, обогащённых последовательностями, относящимися к У хромосоме (15). Начиная с этого момента, техника вычитающй гибридизации начала быстро развиваться и на настоящий момент значительно эволюционировала, став одним из наиболее важных и эффективных подходов молекулярной биологии. Этот поистине универсальный метод используется для весьма различных экспериментальных задач, таких как клонирование и характеристика новых генов, поиск болезнь-, организм- и ткане-специфических транскриптов, идентификация генов, дифференциально экспрессирующихся на различных стадиях эмбрионального развития, прогрессии рака, регенерации, для поиска генов, регулируемых в ответ на внешнюю или внутреннюю стимуляцию, и так далее (16, 17). Техника ВГ эффективна для полногеномного сравнения бактериальной ДНК (13), для выделения видо-специфических геномных локусов (18, 19) и полиморфных маркёров как в эукариотических, так и в прокариотических геномах (13, 20). Кроме того, ВГ использовалась для субклонирования ДНК из дрожжевых искусственных хромосом (YAC) в более мелкие векторы (21), для картирования геномных перестроек, ассоциированных с раком или хромосомными аномалиями, а также для заполнения протяжённых брешей геномной последовательности в крупномасштабных проектах по секвенированию геномов (22).

Однако же, важность ВГ остаётся на настоящий момент недооцененной. В этом разделе автор постарался описать все основные подходы, основанные на вычитании нуклеиновых кислот. Как было упомянуто, ВГ стала популярна начиная с 1984 г., когда Палмер и Ламар предложили простую идею разделения гибридных молекул ДНК. Двуцепочечные гомогибриды так называемой «трейсерной», или «тестерной» ДНК (образец, содержащий дифференциальные последовательности, которые надо найти) отделялись от гетерогибридов трейсер-драйвер и гомогибридов драйвер-драйвер («драйвер» - это контрольный образец, с которым сравнивают трейсер). Задачей ВГ является выделение фракции трейсер-специфичной ДНК, отсутствующей в драйвере. Предложенная идея заключалась в том, что трейсер и драйвер должны иметь различающиеся последовательности на концах (15). Авторы хотели создать рекомбинантную библиотеку ДНК мыши, обогащённую последовательностями, относящимися к У хромосоме (Рис. 1.1). ДНК самки мыши (драйвер) была фрагментирована ультразвуком, тогда как ДНК самца (трейсер) обработали эндонуклеазой рестрикции MboI. ДНК трейсера смешали со 100-кратным весовым избытком драйвера, денатурировали и ренатурировали. При этом только реассоцировавшие гомодуплексы трейсер-трейсер имели липкие концы с обеих сторон и могли быть лигированы в плазмидный вектор pBR322, расщеплённый эндонуклеазой рестрикции BamHI.

Рисунок 1.1. Схема вычитающей гибридизации геномной ДНК, предложенная Палмером и Ламаром, основана на клонировании гибридов трейсер-трейсер при помощи уникальных рестриктных сайтов.

Вскоре этот принцип был успешно применён для клонирования фрагментов ДНК человека, делетированных у пациентов с миотонической дистрофией Дюшенна (23). Одновременно, другая исследовательская группа использовала похожий подход для поиска матричных РНК, различающих анализируемые образцы (24, 25), специфичных для определённого типа клеток, тканей или же организма (Рис. 1.2). На матрице поли(A)+ фракции РНК трейсера, синтезировали первые цепи кДНК, затем исходную РНК расщепляли в щелочных условиях, так что в растворе оставались только первые цепи кДНК, комплементарные исходной мРНК трейсера. Трейсер смешивали с драйвером, взятым в 100-кратном или большем весовом избытке. Драйвер являлся фракцией поли (A)+ РНК из другого образца. В получившейся смеси, фрагменты трейсера либо гибридизовались с избытком комплементарных цепей драйвера, либо же оставались в форме одноцепочечной ДНК. Эта последняя одноцепочечная фракция, обогащённая трейсер-специфичными последовательностями, очищалась от драйвера и гибридов трейсер-драйвер на гидроксиапатитовой колонке (специфично связывает двуцепочечные нуклеиновые кислоты). На матрице очищенного одноцепочечного трейсера синтезировали вторую цепь кДНК и лигировали двуцепочечную кДНК либо в экспрессионный вектор (если требовались дополнительные раунды вычитания), либо в вектор для клонирования (24, 25). Для повышения скорости гибридизации, к гибридизационной смеси могли быть добавлены химические акселераторы, например фенол (26).

Рисунок 1.2. Схема вычитания кДНК/мРНК, использующая щелочную деградацию РНК на стадии 2.

Однако же, этот подход не завоевал популярности, в первую очередь из-за трёх серьёзных ограничений: (1) требовались большие количества очищенной мРНК, (2) технические манипуляции были чрезвычайно трудоёмки и (3) деградация РНК создавала проблемы на всех стадиях работы. Позднее, первая из этих проблем была решена при клонировании кДНК трейсера и драйвера в специальные одно- или двуцепочечные экспрессионные векторы. РНК нарабатывалась в E. coli, что давало возможность получения больших количеств для гибридизации (27-29). Третий барьер был частично снят, когда мРНК драйвера была заменена на двуцепочечную кДНК (использование первых цепей одноцепочечной кДНК было чрезмерно дорого, а двуцепочечная кДНК могла быть наработана в E. coli). Впрочем, при этом возникла новая проблема: как разделять дуплексы трейсер-трейсер от дуплексов драйвер-драйвер?

В 1986 Велхер с соавторами применили для вычитания биотин-стрептавидиновую систему (30): биотинилированные праймеры использовались для синтеза кДНК драйвера, и продукты вычитания инкубировались конъюгированные со стрептавидином медные гранулы. В результате, в растворе оставались дуплексы трейсер-трейсер, тогда как гранулы связывали остальные продукты гибридизации, кроме одноцепочечного трейсера. Этот метод разделения продуктов вычитания стал достаточно популярным (при этом модифицировались отдельные детали). В 1993, магнитные гранулы заменили медные гранулы в качестве твердофазного носителя для конъюгированного стрептавидина при очистке гибридов трейсер-трейсер (31, 32).

Подводя итог, можно сказать, что ранние методы вычитания кДНК обычно использовали один или два раунда гибридизации и использовали (-) мРНК как драйвер и (+) кДНК как трейсер. При этом наработка (-) мРНК в больших количествах была во многих случаях затруднительна. Степень обогащения трейсер-специфичными последовательностями ограничена соотношением драйвер:трейсер, и за один раунд вычитания произойдёт адекватное обогащение только тех молекул, которые редки в (-) популяции и часто представлены в (+) популяции. Последовательности, которые представлены на среднем и низком уровнях, либо же те, содержание которых различается в трейсере и драйвере не очень сильно (в единицы раз), оказываются недопредставлены в получающихся вычтенных библиотеках кДНК. Более того, количество кДНК, остающееся после гибридизации, может быть очень мало, что часто создаёт проблемы при клонировании продуктов ВГ.

1.2.3 Первый впечатляющий успех: репрезентативный дифференциальный анализ

В 1994 Николай Лисицын и коллеги опубликовали новый метод, основанный на ВГ, названный ими “репрезентативный дифференциальный анализ” (RDA) (54), что сделало вычитающую гибридизацию значительно более популярным подходом (см. Рис.1.3). Метод RDA широко используется до сих пор. RDA впервые применили для сравнения двух геномов млекопитающих и для клонирования дифференциальных последовательностей. Кинетические ограничения здесь обходятся благодаря случайному упрощению сравниваемых геномных смесей, что достигается либо благодаря использованию НЕ частощепящих эндонуклеаз рестрикции, либо благодаря эффекту ПЦР селекции.

На примере, проиллюстрированном на рисунке 1.4, геномные ДНК трейсера и драйвера фрагментируются эндонуклеазой рестрикции, и к фрагментированным ДНК лигируются различные олигонуклеотидные адапторы. Полученные лигазные смеси подвергают 50-100 циклам ПЦР амплификации с праймерами, специфичными для последовательностей адапторов. Благодаря широко известному эффекту «ПЦР селекции», различные фрагменты в сложных геномных смесях амплифицируются в ходе ПЦР с сильно различающимися эффективностями, зависящими, в основном, от размера фрагментов. В результате, большая часть исходных фрагментов ДНК оказывается недопредставленной или потерянной в полученных ампликонах, содержащих только около 2-10% от исходного разнообразия фрагментов. Ампликоны затем обрабатывают нуклеазой Mung bean для деградации 3'-концевых адапторных последовательностей (которые могли бы создать проблемы на следующей стадии благодаря кросс гибридизации адаптор-адаптор). Полученный трейсер затем смешивают с избытком драйвера, денатурируют и гибридизуют. Гибридизационную смесь инкубируют с ДНК полимеразой для заполнения 3' концов, а затем проводят ПЦР с праймером, специфичным к адаптору трейсера. При этом экспоненциально амплифицируются лишь дуплексы трейсер-трейсер, тогда как другие продукты гибридизации либо амплифицируются линейно, либо не амплифицируются вовсе. Экспоненциально амплифицированные двуцепочечные дуплексы могут быть легко клонированы в плазмидный вектор и секвенированы. Возможно проведение дополнительных раундов вычитания для повышения степени обогащения библиотеки дифференциальными последовательностями, присутствующими только в трейсере. Техника недорога, быстра и сравнительно проста; она позволяет работать с небольшими количествами исходного материала (геномной ДНК или кДНК). Поэтому неудивительно, что метод RDA стал популярен как для анализа транскриптов, так и для поиска геномных маркеров (55-60) (Рис. 1.3).

Рисунок 1.4. Применение метода репрезентативного дифференциального анализа (RDA) для идентификации дифференциальных последовательностей геномной ДНК. Упрощение исходной смеси геномной ДНК происходит за счёт 50-100 циклов ПЦР амплификации на стадии 3.

Однако же, техника RDA обладает серьёзным недостатком: в расчет берётся лишь небольшая часть транскриптома/генома, тогда как основная часть (90-98%) не анализируется. RDA не может быть использован для полногеномных сравнений ДНК, так как полученные с использованием этого метода результаты весьма фрагментарны. Другим минусом метода являестя большое количество фальш-позитивных сигналов при сравнении библиотек кДНК. Когда различия в спектре транскриптов малы, будет образовываться лишь небольшое количество дуплексов трейсер-трейсер, и линейная амплификация гибридов трейсер-драйвер может создать серьёзные проблемы при конструировании вычтенных библиотек (59). Картина становится ещё более пессимистичной, когда дифференциальные гены не только редки, но ещё и слабо транскрибируются. Несмотря на это, RDA в настоящее время широко используется; некоторые исследования, опирающиеся на результаты RDA, даже называются авторами «полногеномными и полнотранскриптомными», что на самом деле не так, как мы теперь знаем. С точки зрения автора настоящего обзора, RDA применим для поиска последовательностей дифференциальных маркёров для сравниваемых ДНК.

Поскольку интерес к вычитающей гибридизации повышался, было опубликовано несколько во многом дублирующих друг друга математических моделей ВГ, а также в 1995 г. были созданы две компьютерные программы, моделирующие ход ВГ in silico (45, 61). Далее будут описаны некоторые успешные и оригинальные экспериментальные приложения ВГ. Авторы первого исследования (62) предложили новую модификацию ВГ, включающую в себя гибридизацию продуктов вычитания с иммобилизованными на фильтре библиотеками кандидатного геномного локуса. Такое применение ВГ, по мнению авторов, позволяет проводить надёжное картивование геномных локусов, содержащих дифференциально транскрибируемые гены. Авторы другой статьи (63) применяли RDA для более эффективного субклонирования фрагментов дрожжевой искусственной хромосомы (YAC) в более мелкие векторы, подходящие для определения первичной структуры вставки. Геномы дрожжей, содержащих YAC (трейсер) и несодержащих YAC (драйвер) фрагментировали и подвергали вычитающей гибридизации; после нескольких раундов вычитания, продукты клонировали и секвенировали. Подавляющее большинство вставок содержало последовательности из YAC. Это очевидно многообещающее приложение ВГ не получило распространения, по-видимому, из-за прекращения использования YAC в крупномасштабных проектах по секвенированию геномов в пользу более стабильных бактериальных искусственных хромосом (BAC).

Другая модификация RDA использовалась для картирования делеций, произошедших в геномах опухолевых клеток (21). Продукты ВГ раковых и нормальных геномов гибридизовались с упорядоченной библиотекой YAC, что позволило авторам напрямую картировать дифференциальные последовательности и, таким образом, находить делеции, специфичные для раковых клеток (замечу, что в то время полная последовательность генома человека ещё не была опубликована). Позднее, RDA применили для заполнения брешей при секвенировании генома Xilella fastidiosa (22). Фрагменты с уже установленной первичной структурой вычитали из генома Xilella, затем дифференциальные последовательности гибридизовали с полной геномной клонотекой X. fastidiosa, и позитивные клоны (содержащие последовательности с пока не установленной перевичной структурой) секвенировали.

Ещё одним интересным применением ВГ стала техника поиска полиморфизмов длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), названная “RFLP subtraction” (64). Сравниваемые образцы геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции и поотдельности разделяли на агарозном геле. Затем для трейсера и драйвера вырезались определённые зоны (например, содержащие фрагменты длиной от 100 до 500 п.н.), ДНК элюировали из агарозы и использовали для ВГ. В результате получали ампликоны, обогащённые фрагментами, присутствующими в такой зоне в трейсере, но отсутствующие в аналогичной зоне в драйвере. Техника была эффективна для обнаружения новых ПДРФ, генетических маркёров универсальной применимости. Этот подход был затем значительно улучшен, когда авторы (65) применили ВГ непосредственно в геле. Оба фрагментированных сравниваемых образца, один (драйвер) - в 100-кратном весовом избытке относительно другого (трейсер), наносили на одну и ту же дорожку на геле и разделяли электрофоретически. Гель обрабатывали щелочью для химической денатурации ДНК, а затем нейтрализовали, что позволяло проводить гибридизацию непосредственно в геле. Наконец, гибридизованную ДНК элюировали из геля и амплифицировали с помощью ПЦР для селекции дуплексов трейсер-трейчер. Авторам удалось добиться чрезвычайно высоких значений обогащения по дифференциальным последовательностям, близких к теоретически достижимым. Такой успех может быть объяснён высокими локальными концентрациями фрагментов каждого типа в геле, которые были значительно выше, чем при гибридизации в растворе. К сожалению, этот подход, который мог бы стать превосходной альтернативой наиболее востребованным техникам ВГ, а именно RDA и SSH, является чрезвычайно трудоёмким.

1.2.4 Дальнейшие усовершенствования: супрессионная вычитающая гибридизация (SSH), эффект супрессии ПЦР и нормализация библиотек кДНК

На рисунке 1.3 можно увидеть, что разработка нового метода, названного «супрессионной вычитающей гибридизацией», англ. “suppression subtractive hybridization, SSH” (10, 66), а также появление на рынке соответствующего кита производства фирмы Clontech в 1996 вызвала революцию в использовании ВГ. Техника стала более производительной, воспроизводимой и простой в исполнении. Повышенный интерес к методу сопровождался некоторыми качественными изменениями в динамике цитирования ВГ в литературе: если за период 1984-1991 приблизительно каждая третья статья описывала модификации и улучшения (с точки зрения авторов) техники ВГ, в 1992-1995 - каждая пятая, то в 1998-1999 - каждая десятая, а в 2000-2005 (когда метод SSH стал популярен и соответствующий кит занял достойное место на рынке) - всего лишь каждая 62-я (!). Таким образом, можно говорить о том, что популяризация SSH и RDA в основном вытеснили другие приложения и «отрицательно» сказались на креативности авторов, которые теперь были удовлетворены предлагаемыми модификациями ВГ. Возможно, это означает, что эти методы не могут быть далее улучшены, или же то, что для большинства приложений улучшения этих методов и не требуется: ВГ стала рутинной и воспроизводимой методикой.

Основное преимущество SSH над остальными вариантами ВГ - это значительно уменьшенный фон фальш-позитивных клонов. В других методах этот фон вызывается линейной амплификацией гибридов трейсер-драйвер, что сводится к минимуму при применении SSH (см. более детальное объяснение в Главе 2). Другим преимуществом SSH стала возможность одновременной нормализации библиотек кДНК, которая применяется для выравнивания концентраций различных транскриптов, присутствующих в сравниваемых пулах кДНК. Выравнивание, например, необходимо для того, чтобы избежать дискриминации редкопредставленных транскриптов при вычитании. Нормализация библиотек кДНК может быть использована не только для нужд ВГ, но и, например, для конструирования репрезентативных библиотек EST. Эта независимая группа методов описана в Главе 4.

Оба преимущества техники SSH базируются на так называемом эффекте «ПЦР супрессии» (детальное описание дано в Главе 2). Приблизительно 40-нуклетидные ГЦ-богатые линкеры (называемые супрессионными адапторами) лигируют к фрагментированной двуцепочечной ДНК. Затем ДНК полимераза достраивает вторую цепь адапторов, так что в результатк исходные фрагменты ДНК фланкируются инвертированными ГЦ-богатыми повторами длиной около 40 п.н. Принцип метода заключается в том, что праймеры, комплементарные последовательности супрессионных адапторов, не могут эффективно отжигаться на матрице и инициировать ПЦР сами по себе (Рис. 1.5) благодаря значительно более сильным внутримолекулярным комплементарным взаимодействиям между инвертированными повторами, которые элиминируют сайты, доступные для посадки праймеров в ходе ПЦР. Использование эффекта ПЦР супрессии предотвращает фоновую амплификацию с адаптор-специфических праймеров.

Рисунок 1.5. Принцип эффекта ПЦР супрессии. GC-богатые инвертированные повторы (супрессионные адапторы) спариваются внутримолекулярно, тем самым мешая отжигу более коротких праймеров, специфичых последовательности адаптора. При этом значительно понижается фоновая амплификация при использовании адаптор-специфических праймеров.

На рисунке 1.6 схематично изображена процедура SSH и её приложение для идентификации различий между бактериальными геномами. Сравниваемые ДНК (как трейсер, так и драйвер) расщепляются эндонуклезами рестрикции, затем ДНК трейсера разделяется на две порции (назв. Трейсер А и Трейсер Б), и к порциям лигируются разные супрессионные адапторы. К ДНК драйвера при этом ничего не лигируется. Обе фракции трейсера смешиваются с избытком драйвера, денатурируются и гибридизуются. При последующей ПЦР амплификации с праймерами, комплементарными обоим использованным супрессионным адапторам, экспоненциально амплифицируются только дуплексы Трейсер А/Трейсер Б, обогащённые по последовательностям, специфичным для трейсера (12).

Рисунок 1.6. Схема метода супрессионной вычитающей гибридизации (SSH), применённой для сравнения двух бактериальных геномов. При анализе сложных геномов, как геномы млекопитающих, должны применяться другие подходы.

Обычно SSH используется для сравнения транскриптомов (10), что позволяет создать высококачественные дифференциальные библиотеки кДНК. Частично удалось решить одну из самых основных и общих проблем всех методов анализа кДНК, а именно - проблему потери редко представленных транскриптов в получаемых библиотеках. Метод, разработанный под руководством С.А.Лукьянова для нормализации библиотек кДНК в растворе (Рис. 1.7; см. также Главу 4) позволяет осуществлять простое и эффективное выравнивание концентраций редко- и часто представленных кДНК. К двум порциям фрагментированной двуцепочечной кДНК лигируются два различных супрессионных адаптора, обе порции отдельно денатурируют и оставляют ренатурировать на короткое время. На этой стадии, друг с другом гибридизуются в основном часто представленные последовательности. Затем обе фракции смешивают и оставляют гибридизоваться, уже на длительное время. Те кДНК, которые не сформировали дуплексы во время первой гибридизации, могут прогибридизоваться теперь. Затем концы гибридизованных кДНК достраиваются ДНК полимеразой и проводится их ПЦР амплификация с праймерами, комплементарными использованным супрессионным адапторам (Рис. 1.7). В результате, экспоненциально амплифицируются только те дуплексы, которые были сформированы во время второй, а не первой, гибридизации. Ампликон, таким образом, оказывается обогащён репликами редко представленных транскриптов. Такая стратегия является отличной альтернативой гораздо более сложному подходу (67), основанному на специальном вычитании последовательностей высоко представленных транскриптов из исходных пулов кДНК для обогащения по «редким» кДНК.

Рисунок 1.7. Схема нормализации библиотек кДНК с использованием эффекта ПЦР супрессии. Нормализация приводит к выравниванию концентраций часто- и редко-представленных транскриптов, что необходимо для более высокой представительности библиотек кДНК и для некоторых других приложений как секвенирование библиотек EST.

Хотя количество фоновых фальш-позитивных клонов при использовании SSH, как правило, невелико, было предложено дальнейшее усовершенствование этого метода (68). При помощи метода, названного “Mirror orientation selection (MOS)” (Рис. 1.8), количество недифференциальных клонов уменьшается основываясь на наблюдении, что фон, создающийся реассоциацией не-трейсер-специфичных молекул, появляеся случайным образом, и каждый из типов таких фоновых дуплексов представлен малым числом молекул относительно «правильных» трейсер-специфичных последовательностей. Поскольку продукты SSH несут адапторные последовательности (Рис. 1.8), фланкирующие ДНК трейсера в обеих ориентациях (продукты A и A' на рисунке), то удаление адаптора, денатурация и последующие гибридизация и заполнение концов приведут к появлению фрагментов трейсера, фланкированных последовательностью второго адаптора с обоих концов. При помощи ПЦР, такие фрагменты трейсера могут быть экспоненциально амплифицированы с использованием одного праймера (Рис. 1.8). При этом фоновые фрагменты теряются, поскольку они появляются в SSH-ампликонах случайно и каждый их вид представлен крайне низкими концентрациями (тогда как количество таких видов фоновых последовательностей может быть огромно), и возможность того, что они сформируют гибриды, несущие адапторную последовательность с обеих сторон, в большинстве случаев пренебрежимо мала (Рис. 1.8, правая сторона).

Рисунок 1.8. Схема метода мirror oriented selection (MOS). MOS применяют для уменьшения фона, создаваемого псевдо-селективной амплификацией случайных побочных последовательностей. MOS был признан эффективным как для сравнения кДНК, так и сложных геномных ДНК.

Кроме того, SSH может быть использована в комбинации с дифференциальным дисплеем (6) и микрочиповой гибридизацией (7). Последний подход представляется весьма перспективным, так как позволяет получать интегральную картину пространственно-временной дифференциальной экспрессии генов. При этом важно заметить, что непосредственное использование гибридизации с микрочипами как правило дискриминирует редкопредставленные транскрипты, тогда как предварительная процедура SSH, особенно со стадией нормализации кДНК, может значительно повысить как чувствительность метода, так и воспроизводимость результатов.

1.2.5 Другие перспективные подходы к вычитающей гибридизации

В предыдущих разделах были описаны две наиболее популярные экспериментальные техники, основывающиеся на ВГ, которые делают вычитающую гибридизацию одним из наиболее эффективных, своевременных и универсальных подходов молекулярной биологии, подобно дифференциальному дисплею, масштабному секвенированию геномов, секвенированию библиотек EST и серийному анализу генной экспрессии (69). Поскольку количество опубликованных работ, использующих ВГ, возрастает даже несмотря на отсутствие серьёзных популяризованных усовершенствований в её методологии в течение последних 6 лет, потенциал вычитающей гибридизации остаётся высоким. В этом разделе будут рассмотрены некоторые недавние оригинальные и перспективные методы, основанные на ВГ. Новый подход, названный “covalently hybridized subtraction (CHS)”, использует ковалентную сшивку трейсера и драйвера после гибридизации (70). Для этого ДНК драйвера химически модифицируется таким образом, чтобы все цепи ДНК, загибридизовавшиеся с драйвером, оказались ковалентно связаны с ним и не могли быть амплифицированы в ходе ПЦР, в отличие от гибридов трейсер-трейсер. Другой интересный подход был использован для улучшения техники RDA. Он основан на защите 3' концов ДНК трейсера с использованием альфа-тио-дезоксирибонуклеотидов (71). После гибридизации с немодифицированным драйвером, получившаяся смесь обрабатывается нуклеазами ExoIII, которая отщепляет незащищённые 3' концевые нуклеотиды, и Mung Bean, которая расщепляет участки одноцепочечной ДНК. После такой обработки, в растворе остаются лишь гибриды трейсер-трейсер, которые затем амплифицируют в ходе ПЦР, клонируют и секвенируют.

Наконец, новая техника, названная “primer extension enrichment reaction (PEER)” (72), основана на оригинальном принципе использования коротких фрагментов трейсера для праймирования реакции удлинения праймера на матрице ДНК драйвера. Для этого двуцепочечную ДНК трейсера фрагментируют на небольшие фрагменты при помощи расщепления эндонуклеазами, а затем лигируют к ним якорные последовательности специальных адапторов. 3' конец адаптора содержит сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции класса IIS. Фрагменты затем расщепляют ферментом класса IIS Mme I с тем, чтобы создать пул олигонуклеотидов с уникальным 3'-концом, пришедшим из последовательности трейсера, и адапторным 5'-концом. Такие помеченные адапторной последовательностью олигонуклеотиды отжигаются на ДНК драйвера и удлиняются в присутствии биотинилированных дидезоксинуклеотидтрифосфатов. Последние блокируют дальнейшую достройку и позволяют удалить биотинилированные молекулы из раствора при помощи магнитных гранул, конъюгированных со стрептавидином. Таким образом, праймеры, комплементарные последовательности драйвера, блокируются и удаляются из раствора, где остаются лишь праймеры с уникальными для трейсера последовательностями. В присутствии исходной полноразмерной ДНК трейсера, эти олигонуклеотиды могут праймировать реакцию достройки фрагментов, уникальных для трейсера. На этой стадии праймеры с якорными адапторными последовательностями достраиваются до полноразмерных матриц ДНК, которые могут быть далее амплифицированы с использованием адапторных праймеров. Получившиеся фрагменты клонируют и секвенируют. Авторы показали, что по крайней мере для некоторых приложений метод PEER был значительно более чувствительным и эффективным, чем другие варианты ВГ, включая SSH.

Заканчивая этот раздел, считаю своим долгом упомянуть о некоторых недостатках, присущих большинству методов, основанных на ВГ. Во-первых, ПЦР амплификация может исказить исходную картину распределения различных фрагментов ДНК в смеси благодаря эффекту ПЦР селекции в случае, когда используется слишком много циклов ПЦР (этот эффект упомянут выше в разделе 1.2.3). Вторая проблема заключается в том, что ВГ в ряде случаев не может дискриминировать различных представителей эволюционно молодых генных семейств, обладающих значительной гомологией первичной структуры. Похожая проблема возникает как на уровне геномной ДНК, так и для кДНК, когда исследуются геномные повторы. Наконец, «незначительные» изменения в экспрессии генов, то есть таковые менее одного порядка величины, обычно с трудом детектируются при использовании ВГ.

1.3 Поиск общих последовательностей: метод клонирования совпадений

В отличие от вычитающей гибридизации, задача которой - поиск дифференциальных последовательностей, присутствующих в образце, называемом трейсер, и отсутствующих в другом образце, называемом драйвер, подход, называемый “coincidence cloning” (CC; Глава 5) был разработан для нахождения общих последовательностей среди анализируемых образцов. Подход основан на клонировании идентичных нуклеотидных последовательностей, принадлежащих к различным пулам фрагментированной геномной ДНК или кДНК, и избавлении от всех остальных последовательностей (73). Сопоставляя фрагменты геномной ДНК с фрагментами какого-либо сходным образом фрагментированного локуса (клонированного в форме BAC, космиды, и т.п.), можно отобрать и клонировать геномные фрагменты, принадлижащие данному локусу.

Для этого оба образца сравниваемой ДНК фрагментируют, как-либо помечают (например, введением различных адапторных олигонуклеотидов), смешивают, денатурируют и гибридизуют, а затем выделяют дуплексы, имеющие обе специфические «метки», то есть гетерогибриды обоих образцов, соответствующие общим последовательностям. Последняя стадия является ключевой для всего процесса, поскольку эффективное выделение правильных гибридных молекул необходимо для создания СС библиотек, подлинно обогащённых общими последовательностями. Ранние версии техники СС были низко эффективны. Их самым серьёзным недостатком была низкая селективность, благодаря которой в итоговых библиотеках содержалось значительное количество фрагментов, уникальных для того или иного образца. Для улучшения этой ситуации, Ажикина и др. применили метод селективной супрессии ПЦР (упомянут в разделе 1.2.4, детально рассмотрен в Главе 2), что сильно повысило эффективность CC (74-76).

На рисунке 1.9 представлена простая модель использования метода coincidence cloning для поиска эволюционно консервативных последовательностей, содержащихся в сравниваемых геномах, предложенная в работе Чалой и др. Геномные ДНК человека и мармозетки были расщеплены часто щепящими эндонуклеазами рестрикции, а затем к ним были лигированы два различных набора супрессионных адапторов. Образцы смешали, денатурировали и гибридизовали, а затем достроили концы при помощи ДНК полимеразы, (Рис. 1.9) и обработали нуклеазами, специфичными к неспаренным нуклеотидам (77). Такие нуклеазы узнают неспаренные либо же неверно спаренные нуклеотиды в составе двуцепочечных ДНК и разрезают подобные «неправильные» гибриды, тем самым значительно повышая эффективность всего процесса. На следующей стадии, продукты гибридизации амплифицируют с праймерами, специфичными к последовательностям использованных супрессионных адапторов, так что в модельном эксперименте амплифицировались лишь гибридные молекулы ДНК человека и Callithrix pigmaea. В результате была создана геномная библиотека, высоко обогащённая эволюционно консервативными последовательностями, сохраняющимися в геномах человека и Callithrix pigmaea.

Рисунок 1.9. Схема метода Mispaired DNA Rejection (MDR). Принцип метода - это специфическая энзиматическая деградация несовершенных дуплексов в растворе (стадия V), что приводит к значительному снижению фоновой гибридизации. Метод был эффективен в том числе для сложных геномных смесей, таких, как ДНК приматов.

Ещё одним успешним вариантом техники клонирования совпадений является новый метод, названный “Non-methylated genomic sites coincidence cloning (NGSCC)”, который позволяет получить набор последовательностей, относящихся к интересующему геномному локусу и содержащих неметилированные сайты CpG. Метод основан на фрагментации исходных образцов ДНК эндонуклеазами рестрикции, чувствительными к метилированию. Для упрощения геномной гибридизационной смеси, ДНК дополнительно фрагментируется часто щепящим ферментом, не чувствительным к метилированию, например AluI. В результате, размер фрагментов оказываются в диапазоне, оптимальном для ПЦР амплификации (то есть в пределах до 1.5 тпн. Затем различные супрессионые адапторы лигируют к липким концам, образованным метил-чувствительным ферментом, и к тупым концам, созданным AluI. Дальнейшая ПЦР амплификация с праймерами, специфичными для обоих использованных адапторов, приводит к получению ампликона геномных фрагментов, обладающих неметилированным сайтом CpG с одной стороны и ограниченных рестриктным сайтом AluI с другой.