Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

Потенциал и основные границы применения гибридизации нуклеиновых кислот. Использование сковородоподобных олигонуклеотидов как гибридизационных проб. Клонирование совпадений: эффективный метод экспериментального выделения общих последовательностей.

Рубрика Биология и естествознание
Вид диссертация
Язык русский
Дата добавления 18.11.2018
Размер файла 4,3 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Затем ампликон гибридизуют с фрагментированной ДНК интересующего геномного локуса, к которой предварительно были лигированы адапторы третьего типа (в своих экспериментах авторы метода анализировали профили метилирования геномного локуса 19 хромосомы человека D19S208-COX7A1 длиной около 1 млн. пар оснований). В ходе последующей ПЦР амплифицируются только те неметилированные CpG-содержащие фрагменты, которые относятся к локусу D19S208-COX7A1. Секвенирование соответствующих клонотек, полученных для нормальных и опухолевых тканей, позволило авторам создать для этого локуса первую полную крупномасштабную карту участков метилирования, включая её ткане- и опухоль-специфические варианты (75). Позднее, та же группа авторов объединила методы NGSCC и SAGE, создав методику, названную “RIDGES”. Эта методика более информативна, чем NGSCC, поскольку на выходе получается в 10-20 раз больше информации о сайтах метилирования при расчёте на один отсеквенированный клон, что обеспечивается технологией SAGE (74).

Впрочем, использование метода coincidence cloning не ограничивается анализом геномной ДНК. В частности, недавно опубликованный подход, названный “genomic repeat expression monitor (GREM)” использует принцип метода coincidence cloning для поиска общих последовательностей среди пре-амплифицированных 3'-концевых локусов, фланкирующих геномные повторяющиеся элементы, и набором 5'-концевых фрагментов кДНК, что приводит к созданию гибридной библиотеки геномной ДНК/кДНК, обогащённой промоторно-активными повторами. Это позволяет создать исчерпывающую полногеномную карту промоторно-активных повторяющихся элементов генома (78). Эти и другие применения метода CC будут подробно описаны в Главе 5.

1.4 Гибридизация в растворе для поиска геномных полиморфных участков

В отличие от вычитающей гибридизации, которая направлена на поиск относительно длинных дифференциальных фрагментов, следующая группа методов используется для поиска небольших, порядка единиц нуклеотидных замен, различий между сравниваемыми образцами ДНК. Исследование мутаций позволяет выявлять нормальные функции генов, белков, некодирующих РНК, причины многих заболеваний, а также исследовать вариабильность индивидуальных ответов на сигнал среди популяций. Многие однонуклеотудные полиморфизмы (SNP) не являются вредными сами по себе, но могут быть сцеплены с мутантными аллелями, связанными с генными заболеваниями или спецификой ответа на определённые лекарственные средства.

Тому огромному количеству исследователей, работающему в данной области, уже удалось найти десятки миллионов SNP за последние годы. Однако же, это число представляется ничтожным в сравнении с реальными количествами SNP и других мутаций, присутствующими в геномах. Идеальный метод детекции мутаций и SNP должен быть способен отыскивать мутации в больших фрагментах ДНК и картировать их с точностью до нуклеотида; при этом такой метод был бы чувствительным, надёжным и производительным. На настоящее время, для детекции мутаций применяют множество химических, энзиматических, биоинформационных и физических методов. Многие методы позволяют быстро и эффективно определить нприсутствие мутации в интересующем геномном участке, но не позволяют дать характеристику этой мутации и точно определить её локализацию. Другая группа методов позволяет проводить точное картирование мутаций, но дорогим и трудоёмким способом. Семейство новых подходов для детекции мутаций, основанных на гибридизации ДНК в растворе, сочетает в себе высокую производительность, экономичность, надёжность и детальную характеристику мутаций (детально рассмотрено в Главе 6).

В настоящее время, поиск мутаций при помощи секвенирования ДНК по Сэнгеру принято за эталонный подход. При этом, необходимо учесть, что хотя это и является единственным способом точной характеристики мутации, но не является лучшим способом детекции мутаций и скрининга большого количества образцов. Тот факт, что многие методы сканирования мутаций практически моментально способны детектировать присутствие 5-10% мутантных молекул на фоне избытка молекул дикого типа, доказывает преимущество таких подходов перед секвенированием, по крайней мере для некоторых приложений. Кроме того, биоинформатические подходы позволяют находить большое количество новых SNP при анализе геномных баз данных.

Впрочем, эти методы требуют предварительной информации, обычно получаемой при секвенировании ДНК, и поиск мутаций в этом случае осуществляется при множественном выравнивании доступных последовательностей. Последние исследования показывают, что лишь небольшая доля всех мутаций может быть найдена таким способом, и многие мутации, в частности, SNP, встречающиеся с низкой частотой, теряются. Становится очевидным, что для детекции таких вариантов требуются высокопроизводительные методы, которые можно было бы применять для скрининга популяций при исследовании, например, сложных генетических заболеваний, при которых затрагиваются протяжённые геномные локусы, большие гены и/или группы генов. Для этих задач были разработаны несколько групп методов. Все они основаны на том, что молекула ДНК, содержащая мутацию, образует неспаренный участок в мутантном сайте при гибридизации с ДНК дикого типа (Рис. 1.10). Таким образом, при гибридизации мутантной ДНК и ДНК дикого типа, образуются два аналогичных неспаренных участка. Детекция и правильное позиционирование этих участков и является ключём к идентификации новых мутаций.

Рисунок 1.10. При гибридизации, мутантные цепи и ДНК дикого типа образуют гетеродуплексы с неспаренными участками, соответствующими точкам мутации.

Такие неспаренные нуклеотиды могут быть идентифицированы прямо или косвенно с использованием самых различных химических, энзиматических или физических подходов, которые характеризуются превосходной эффективностью детекции, соединённой с высокой производительностью и низкой ценой. Следует отметить, что подтверждение новой мутации обязательно требует стадии секвенирования. Однако же в данном случае это секвенирование будет направленным, а не случайным, поиском в чётко определённом геномном локусе, что позволит избежать огромного количества лишней работы. В результате, эти методы снижают стоимость детекции мутации на порядок величины и более. Вкратце, химические подходы основаны на химическом расщеплении неспаренных нуклеотидов, энзиматические используют энзиматическое узнавание несовершенных дуплексов (с дальнейшим связыванием, расщеплением, модификацией или лигированием ДНК по позиции неспаренного нуклеотида), тогда как физические методы детектируют разность в физических характеристиках между мутантными цепями и ДНК дикого типа, будучи основаны либо на физическом выделении несовершенных гибридов ДНК (как электрофоретическое разделение), либо же на поиске различий физических свойств несовершенных и совершенных гибридов ДНК. Все эти методы используют гибридизацию нуклеиновых кислот в растворе и будут подробно описаны в Главе 6.

1.5 Заключение

В этой главе я постарался кратко проиллюстрировать то, как методы гибридизации нуклеиновых кислот в растворе могут быть полезны для большого количества приложений. Был дан краткий обзор основных методических подходов, описанных более детально в других главах.

Широкий спектр экспериментальных задач, решаемых с помощью таких подходов, включает в себя вычитающую гибридизацию, упорядоченный дифференциальный дисплей, метод прогулки по геному, мультиплексная ПЦР, создание библиотек кДНК на основе ничтожно малого количества тотальной РНК, быстрое клонирование концов кДНК (RACE), эффективное выравнивание концентраций редко- и часто-представленных транскриптов в библиотеках кДНК, поиск промоторно-активных повторов и дифференциально метилированной геномной ДНК, идентификация общих последовательностей в образцах геномной ДНК или кДНК, картирование новых генов, поиск эволюционно консервативных последовательностей, а также идентификация и крупномасштабный мониторинг протяжённых и однонуклеотидных мутаций. Разумеется, не существует панацеи, идеального метода, который помог бы разрешить все технические проблемы, стоящие перед исследователем, но комбинирование вышеперечисленных подходов с высокой вероятностью будет полезно для планирования и проведения успешных исследований.

2. Селективная супрессия ПЦр и наиболее популярные приложения этого метода

В этой главе рассматриваются методы, основанные на эффекте супрессии ПЦР (создание библиотек кДНК с использованием малого количества тотальной РНК, супрессионная вычитающая гибридизация, упорядоченный дифференциальный дисплей, метод быстрой амплификации концов кДНК, прогулка по геному, варианты метода Coincidence Cloning, нормализация библиотек кДНК, мультиплексная ПЦР, клонирование in vitro и др.). Вместе эти методы позволяют анализировать сложные образцы кДНК, начиная от поиска интересующих последовательностей до установления полной структуры соответствующих генов.

2.1 Введение

Наиболее важные процессы в самых разнообразных биологических системах (клеточная дифференцировка и морфогенез при эмбриональном развитии и регенерации, апоптоз или раковая трансформация клеток, и т.д.), находятся под контролем специфических регуляторных генов. Для понимания соответствующих молекулярных механизмов, гены, вовлечённые в эти процессы, должны быть выявлены и исследованы. К настоящему моменту, большинство методов молекулярной биологии, вовлечённых решение подобных задач, включают в себя стадию ПЦР, что позволяет работать даже с небольшими количествами биологического материала. Однако же, использование ПЦР требует наличия предварительной информации о последовательности исследуемых образцов ДНК. Когда последовательность интересующих генов частично или полностью неизвестна, прямое использование ПЦР может быть неэффективным.

Феномен селективной супрессии ПЦР (ССП), открытый в 1994 году (79), лежит в основе группы высокоэффективных, взаимнодополняющих методов поиска и анализа новых функционально значимых последовательностей ДНК и РНК, особенно полезных, когда первичная структура таких молекул неизвестна. Использование ССП позволило отбросить трудоёмкие и не всегда эффективные методы физического фракционирования ДНК и сделало методы поиска и анализа новых генов проще, быстрее и надёжнее.

2.2 Селективная супрессия ПЦР

Эффект ССП заключается в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертированными концевыми повторами (ИКП), в ходе ПЦР с праймерами, соответствующими внешней части ИКП, при условии, что такие праймеры существенно короче, чем полная последовательность ИКП (Рис. 2.1).

Принцип супрессии ПЦР - целевая ДНК дизайнируется так, чтобы ее концы образовывали самокомплементарные шпильки. Как правило, задачей ССП является предотвращение амплификации нежелательных последовательностей в ходе ПЦР.

Самокомплементарные структуры, используемые для ССП, по форме напоминающие сковороду, создают при лигировании GC-богатых адапторов к рестриктным фрагментам ДНК или кДНК (Рис. 2.1) (79). В результате, каждый одноцепочечный фрагмент ДНК оказывается фланкирован инвертированными концевыми повторами (то есть самокомплементарными концевыми последовательностями). В ходе ПЦР, при денатурации и отжиге, самокомплементарные концы каждой одиночной цепи образуют шпильки, превращая каждый такой фрагмент в сковородоподобную структуру. Образование стабильного дуплекса на концах фрагментов ДНК делает неэффективным прохождение ПЦР только с праймерами, комплементарными последовательности адаптора (A-праймер на рисунке), благодаря тому, что внутримолекулярный отжиг комплементарных концов кинетически более предпочтителен и более стабилен, чем межмолекулярный отжиг более короткого А-праймера (79). Однако же в присутствии не только A-праймера, но также и праймера на целевую последовательность (таргетного праймера; T-праймер на рисунке), ПЦР становится эффективной. Т-праймер отжигается на свою целевую последовательность и нормально используется ДНК полимеразой для инициации синтеза ДНК. Новосинтезированая цепь ДНК уже не имеет самокомплементарных концов, и может быть эффективно амплифицирована с праймерами А и T. Соответственно, амплифицируются только те цепи, которые содержат таргетные последовательности, тогда как фоновые последовательности, не обладающие сайтом посадки таргетного праймера, остаются инертными.

Рисунок 2.1. Схема эффекта супрессии ПЦР. Молекулы ДНК, фланкированные инвертированными концевыми повторами, образуют внутримолекулярные концевые дуплексы, тем самым предотвращая отжиг праймеров, специфичных к последовательности адаптора и, следовательно, ингибируя ПЦР.

Эффективность ингибирования амплификации зависит от многих параметров, основными из которых являются следующие:

(1) Разница в температурах отжига ИКП и праймеров, используемых для амплификации. Соотношение длины и GC-состава целого ИКП и последовательности праймера сильно влияет на эффективность ССП. Использование ИКП длиной 40-50 пн с повышенным содержанием нуклеотидов G u C во внутренней (супрессионной) части, и адапторного праймера длиной 20-25 нт, соответствующего внешнему сегменту ИКП, представляется оптимальным.

(2) Длина ИКП-содержащей молекулы ДНК. Чем длинее молекула, тем меньше вероятность встречи и внутремолекулярной гибридизации её концов. Эффект ССП не работает или работает плохо при амплификации длинных фрагментов ДНК (более 6 тпн).

(3) Концентрация праймеров в реакционной смеси ПЦР. Успех ССП зависит от конкуренции внутримолекулярной гибридизации и отжига праймеров. Поэтому, эффект ССП более выражен при низких концентрациях праймеров.

2.3 Подготовка образцов ДНК, содержащих инвертированные концевые повторы

Используют два основных способа введения супрессионных последовательностей в молекулы ДНК:

(1) лигирование двуцепочечных фрагментов ДНК с псевдодвуцепочечными олигонуклеотидами, называемыми супрессионными адапторами (80);

(2) ПЦР с длинным (супрессионным) праймером, 3'-конец которого комплементарен амплифицируемым фрагментам ДНК (79).

Первый способ наиболее универсален, так как он не требует предварительного введения в ДНК каких-либо последовательностей. Образец ДНК для лигирования может быть приготовлен при обработке двуцепочечной кДНК или геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции. При этом оптимально использовать ферменты, продуцирующие у рестриктных фрагментов тупые концы, поскольку в этом случае для различных ферментов может быть использован стандартный набор супрессионных адапторов. Второй способ может быть эффективен тогда, когда известна часть или вся последовательность амплифицируемого фрагмента: например, образцы кДНК, получаемые при добавлении гомополимерных последовательностей к первой цепи кДНК.

2.4 Стратегия применения различных вариантов ССП

ССП может быть использована для анализа сложных смесей фрагментов ДНК (кДНК или фрагментированных геномных ДНК) для супрессии нежелательной фоновой фракции ДНК при эффективной экспоненциальной амплификации целевых последовательностей. ССП позволяет проводить селекцию ассиметрично фланкированных молекул ДНК на фоне симметрично фланкированной ДНК. До открытия ССП, подобная задача не могла быть решена в ходе ПЦР. Можно обозначить три основных схемы применения ССП.

Первая схема (Рис. 2.2a) основана на добавлении одного и того же супрессионного адаптора ко всем молекулам ДНК. Затем проводят амплификацию с двумя праймерами, один из которых соответствует внешней части адаптора, а второй комплементарен таргетной ДНК (например, ген-специфичный или олиго(дT)-содержащий праймер). В ходе ПЦР происходит отбор молекул ДНК, несущих последовательность второго праймера. Эта схема соответствует таким методам, как поиск фрагментов геномной ДНК или кДНК, содержащих интересующую известную последовательность (80, 81), конструирование библиотек кДНК из малого количества тотальной РНК (82), а также упорядоченный дифференциальный дисплей кДНК (83).

Вторая схема (Рис. 2.2b) основана на добавлении двух различных супрессионных последовательностей к ДНК. После этого проводится амплификация с праймерами, соответствующими внешним частям адапторов. Во время ПЦР отбираются асимметрично фланкированные молекулы ДНК, то есть те, которые несут на концах последовательности разных адапторов. Эта схема применяется для метода клонирования in vitro (84).

Третья схема (Рис. 2.2c) является усложнённым вариантом предыдущей. К двум образцам ДНК добавляют различные 5'-концевые (но не 3'-концевые) супрессионные адапторы. Образцы затем денатурируют и гибридизуют. После достройки 3'-концов, проводят ПЦР с праймерами, соответствующими внешней части супрессионных адапторов. Как и во второй схеме, отбираются асимметрично фланкированные молекулы ДНК, но только в этом случае каждый такой дуплекс должен быть сформирован при гибридизации комплементарных цепей из разных образцов. Подобная селекция гетеродуплексов используется в вычитающей гибридизации кДНК (79), нормализации кДНК (85), модифицированном методе клонирования совпадений (76-78), и при поиске эволюционно консервативных последовательностей ДНК.

Рисунок 2.2. Основные стратегии, основанные на использовании эффекта ПЦР супрессии. A), один супрессионный адаптор лигирован к образцу; B), лигированы два различных адаптора; C) образец ДНК разделён на две части, к которым лигируют разлчные супрессионные адапторы.

2.5 Семейство методов, основанных на ССП

В настоящее время, при исследовании изменений экспрессии генов в ходе различных биологических процессов часто используется следующая стратегия: (1) конструирование библиотек кДНК из исследуемых биологических образцов; (2) скрининг этих библиотек на наличие генов (точнее, фрагментов этих генов), дифференциально экспрессирующихся или почему-либо интересных исследователям; (3) получение полноразмерных кДНК интересующих генов и определение их геномной структуры. Все эти стадии могут быть осуществлены с помощью методов, основанных на ССП (86).

В этом разделе будут рассмотрены некоторые такие методы: супрессионная вычитающая гибридизация, мультиплексная ПЦР и метод, названный targeted genomic differential display.

2.5.1 Создание библиотек кДНК с использованием малых количеств биологического материала

Создание библиотек кДНК требуется для большинства подходов к анализу экспрессии генов. Методы их получения из относительно большого количества биологического материала были разработаны сравнительно давно и сейчас являются рутинными процедурами. Однако же, такие методы бесполезны, когда количества биологического материала малы (что, пожалуй, характерно для большинства случаев).

ПЦР дала толчок методам конструирования библиотек кДНК из малых количеств тотальной РНК. Впрочем, использование ПЦР требует информации по крайней мере о части последовательности, которая должна быть амплифицирована. Поскольку мРНК абсолютного большинства генов содержит поли (А) последовательность, ПЦР может проводиться с олиго (дТ) содержащим праймером. Экспоненциальная амплификация требует введения искусственной последовательности также на противоположный конец кДНК для отжига второго праймера.

Было разработано несколько основных способов добавления таких последовательностей: (1) добавление гомополимерной последовательности к 3'-концу первой цепи кДНК с использованием терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (tailing) (87); (2) лигирование синтетического одноцепочечного олигонуклеотида к первой цепи кДНК (88) или к мРНК (89) при помоци T4 РНК лигазы; (3) лигирование двуцепочечного олигонуклеотидного адаптора к двуцепочечной кДНК при помощи Т4 ДНК лигазы (90).

Лигирование двуцепочечных молекул ДНК лигазой Т4 более эффективно и воспроизводимо, чем два другие метода (81). Впрочем, в своём первоначальном виде метод, основанный на использовании ДНК лигазы Т4 (90), имеет важный недостаток: он применим лишь к поли(А) + РНК. Если кДНК синтезируется на базе тотальной РНК, то даже использование олиго(дТ) содержащего праймера не может предотвратить синтеза избытка фоновой кДНК на матрице рибосомной РНК. На основе ССП, этот подход был значительно улучшен: к двуцепочечной кДНК при помощи T4 ДНК лигазы лигируют супрессионный адаптор, вслед за этим проводят ПЦР с олиго(дТ) содержащим праймером и с праймером, комплементарным внешней части адаптора (Рис. 2a) (82).

В ходе ПЦР происходит селективная амплификация фракции кДНК, содержащей сайт отжига олиго(дТ) праймера. В то же время, ССП ингибирует амплификацию остльной части кДНК, которая фланкирована адапторами с обеих сторон. Таким образом, библиотека кДНК может быть создана на основе малых количеств тотальной РНК без необходимости выделения поли(А)+ фракции (82). Библиотеки, созданные таким образом, применяли для анализа функционально значимых экспрессируемых последовательностей в самых разных биологических системах (91-93). Метод позволяет конструирование рептезентативных библиотек полноразмерных кДНК исходя из малых (10-100 нг) количеств тотальной РНК, сравнимых по качеству с библиотеками, получаемыми другими методами из 5-10 мкг поли(A) + РНК.

2.5.2 Детекция дифференцильно экспрессирующихся генов

Понимание молекулярных механизмов биологических процессов требует поиска и изучения генов, дифференциально экспрессирующихся в ходе этих процессов. Методы поиска таких генов основаны на детекции молекул мРНК, по-разному представленных в разных тканях и на разных стадиях исследуемого процесса. Изменения в количественном и качественном составе клеточных мРНК можно анализировать несколькими способами. Помимо микрочиповой гибридизации, наиболее широко используются два подхода: дифференциальный дисплей и вычитающая гибридизация.

2.5.2.1 Дифференциальный дисплей

Tехника дифференциального дисплея была разработана в 1992 г. (4) и вплоть до настоящего момента широко используется при поиске дифференциально экспрессирующихся генов. Используются короткие случайные олигонуклеотидные праймеры с низкими температурами отжига, которые инициируют ПЦР амплификацию ограниченного пула фрагментов кДНК. Сравнительный анализ таких амплифицированных образцов кДНК в ПААГ позволяет выявлять дифференциально представленные кДНК. Использование случайных праймеров, однако же, не позволяет проводить систематического сравнения образцов по всем типам мРНК: характеристический набор амплифицируемых фрагментов кДНК случаен, а кроме того, подавляющее большинство таких фрагментов относится к наиболее часто представленным транскриптам.

Также использование праймеров с низкими температурами отжига сопровождается неспецифической амплификацией и приводит к множественным артефактам. Другой подход включает в себя исчерпывающее сравнение всех типов мРНК на основе разделения молекул по наличию тех или иных рестриктных сайтов в 3' концевом фрагменте кДНК (94). Недостатки этого подхода - невысокая чувствительность и трудность выполнения протокола. Мац и коллеги разработали метод, названный ordered differential display (ODD), также основанный на анализе 3'-концевых рестриктных фрагментов кДНК (83). При этом, селекция фрагментов идёт при помощи ПЦР, а не физического разделения (Рис. 2.3). Это приводит к селективной амплификации 3'-концевых фрагментов кДНК (от олиго(дТ) содержащего праймера до ближайшего рестриктного сайта), что сильно упрощает метод и повышает его чувствительность. Эффективность метода ODD показали при поиске генов, дифференциально экспрессирующихся вдоль переднее-задней оси планарии (83).

Рисунок 2.3. Схема метода упорядоченного дифференциального дисплея (ODD), использующего эффект супрессии ПЦР для специфической амплификации 3'-концевых участков кДНК.

В случае же метода targeted genomic differential display (TGDD), эффект ССП используется для амплификации набора фрагментов геномной ДНК или кДНК при помощи единственного таргетного праймера, комплементарного последовательности геномного повтора. Благодаря ССП, не происходит амплификации геномных фрагментов, не имеющих таргетный повтор. Ампликон содержит множество фрагментов, каждый из которых содержит часть повтора и один из фланкирующих геномных локусов. После разрешения продуктов ПЦР в ПААГ, наблюдается характеристический паттерн распределения фрагментов, специфичный для каждого образца геномной ДНК или кДНК (Рис. 2.4) (95-98). Выделение и секвенирование дифференциальных продуктов позволяло находить новые однонуклеотидные полиморфизмы, инсерции и делеции (96). В методе TGDD, сложность разрешаемого ампликона регулируется при помощи 3'-концевых якорных нуклеотидов, добавляемых к последовательности праймера, аналогично методу ODD и некоторым другим подходам (99) (83). Это позволяет разделить геномные фрагменты на неперекрывающиеся наборы адекватного размера для разделения в ПААГ.

Рисунок 2.4. Репрезентативная электрофореграмма результатов основанного на ССП дифференциального дисплея транскрипции эндогенных ретровирусов в нормальной (N1) и в двух образцах раковой ткани (O1 и O2). Фрагменты 1.1, 1.2 и 1.3 ярко представлены в образцах O1 и O2, но не видны в N1. Дифференциальные фрагменты вырезают из геля и секвенируют, затем их дифференциальный статус подтверждают независимыми методами, например, ОТ-ПЦР или Нозерн блот гибридизацией.

В отличие от других методов дифференциального дисплея, созданных для таргетинга геномных повторов (100, 101), TGDD показывает большую специфичность: ~90% всех клонов действительно содержали таргетные последовательности (96, 97). TGDD применяли для анализа геномного полиморфизма и тканеспецифичности экспрессии эндогенных ретровирусов человека (98), а также для поиска полиморфных инсерций других мобильных элементов человека - ретротранспозонов L1 (102).

Следует также упомянуть о недостатках этих подходов: (1) неравномерная амплификация различных последовательностей может приводить к перепредствленности одних и потере других отдельных индивидуальных фрагментов; (2) размер различных фрагментов, разрешаемых в ПААГ, может совпадать, что не позволяет идентифицировать ряд дифференциальных последовательностей.

2.5.2.2 Вычитающая гибридизация кДНК

Вычитающая гибридизация (ВГ) кДНК - это процесс гибридизации двух образцов кДНК, называемых трейсер и драйвер, целью которого является получение библиотеки, обогащенной целевыми последовательностями, специфичными для трейсера, но отсутствующими в драйвере. ВГ включает гибридизацию трейсера с избытком драйвера с последующей селекцией целевых последовательностей.

Использование ВГ кДНК позволило идентифицировать большое количество функционально важных генов, вовлечённых в эмбриональное развитие, клеточную дифференцировку, раковую трансформацию и метастазировние. Однако же, низкая представительность получающихся обогащённых библиотек, скромные значения обогащения по целевым последовательностям, а также трудоёмкость очистки обогащённой фракции ограничивают использование этого подхода, особенно в случаях, когда количества биологического материала малы, а содержание целевых транскриптов невелико (например, десятки копий на клетку).

Перечисленные минусы, практически полностью снимаются при использовании метода супрессионной вычитающей гибридизации (SSH) (10, 11), которая позволяет идентифицировать в том числе и редко представленные дифференциальные транскрипты благодаря стадии нормализации концентраций различных транскриптов в исследуемых образцах. Это становится возможным при использовании ССП (Рис. 2.2c). Эффективность этого протокола впервые была проверена в модельных экспериментах, где в качестве таргетных последовательностей выступала экзогенная вирусная ДНК, в определённых концентрациях добавленная к трейсеру (79). Метод затем использовали для поиска дифференциальных транскриптов во многих биологических системах, например, при активации иммунного ответа в культурах иммунокомпетентных клеток (85), при изменении потенциала метастазирования раковых клеток, при регенерации плоского червя планарии (91), а также для конструирования тканеспецифических библиотек кДНК человека (10). Наиболее важные преимущества SSH заключаются в следующем: (1) процедура включает две стадии гибридизации, что приводит также к эффективной нормализации концентраций различных кДНК, (2) требуется только один раунд гибридизации, (3) не требуется проводить физического разделения фракций одноцепочечной и двуцепочечной ДНК. Частота фальш-позитивных клонов мала и, как правило, составляет менее 10% (10). В результате, SSH стала одним из наиболее популярных и эффективных методов исследования дифференциальной транскрипции генов (103, 104). Следует также упомянуть, что индекс цитируемости оригинальной статьи, где впервые упомянут метод SSH в своём «проработанном» варианте (10), составляет на настоящий момент более 2000.

Техника SSH нашла широкое применение (105-108)). Отдельные элементы и стадии этого метода были позднее применены для решения некоторых других задач, например, для конструирования библиотек кДНК (84, 86) и поиска эволюционно консервативных последовательностей (77).

2.5.3 Поиск 5'- и 3'-концевых фрагментов кДНК

Одной из наиболее важных, но технически затруднительных задач, связанных с характеристикой генов, является приготовление полноразмерных кДНК. Обычные методы детекции генетических последовательностей (скрининг библиотек кДНК, клонирование консервативных генов при помощи ПЦР с вырожденными праймерами, идентификация дифференциально экспрессирующихся генов с использованием дифференциального дисплея мРНК, или же вычитающая гибридизация кДНК) обычно позволяют определить последовательность только лишь фрагмента целой кДНК. Для эффективного клонирования полноразмерных кДНК, был предложен комплекс методических подходов, называемый RACE (англ. Rapid amplification of cDNA ends), позволяющий проводить амплификацию концевых последовательностей кДНК in vitro (109)).

Большая часть методов RACE основана на введении в 3'-конец первой цепи кДНК искусственной последовательности, служащей в качестве эффективного сайта отжига для ПЦР праймеров. Однако же, проблема супрессии неспецифической амплификации в ходе RACE для последовательностей редких генов даже более серьёзна, чем при конструировании библиотек кДНК. ССП позволяет преодолеть эти сложности. К образцу кДНК лигируют супрессионные адапторы, а затем кДНК амплифицируют с праймером, соответствующим внешней части супрессионного адаптора и с ген-специфичным праймером. (Рис. 2.5, см. также обобщённую схему на Рис. 2.2a). Амплифицируются лишь те молекулы, которые содержат 5'- or 3'-концевые последовательности (в зависимости от используемых праймеров). Амплификация остальных молекул подавляется благодаря эффекту ССП. Эффективность метода была доказана как в модельных экспериментах, так и при решении множества практических задач (81).

Рисунок 2.5. Метод быстрой амплификации концов кДНК (RACE), основанный на эффекте ССП. Этот быстрый и недорогой подход позволяет клонировать и идентифицировать как 3'-, так и 5'-концевые фрагменты кДНК.

2.5.4 Поиск промоторных участков и модификация метода «прогулки по хромосоме»

Анализ геномной организации выделенных фрагментов кДНК и клонирование регуляторных элементов, особенно в случае отсутствия доступной полногеномной последовательности, крайне важны для структурно-функционального анализа генов. При этом большинство основанных на ПЦР методов прогулки по хромосоме трудоёмки и малоэффективны. Была предложена усовершенствованная техника, основанная на эффекте ССП (80). Для приготовления образца ДНК, содержащей ИКП, геномную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции и затем лигируют с супрессионным адаптором. При этом выявление регуляторных участков исследуемых генов проводится при последующей ПЦР с ген-специфичным и с адапторным праймерами, согласно уже упомянутой схеме выделения полноразмерной кДНК. Этот метод также нащёл широкое применение (110-115).

2.5.5 Клонирование In vitro

Хотя в последнее время большинство классических методов генной инженерии претерпело модернизацию или было заменено более эффективными подходами, основанными на ПЦР, традиционные методы сохранили основную роль при молекулярном клонировании ДНК (клонирование в бактериальные, фаговые и другие in vivo системы). Принципиально иной метод клонирования, базирующийся на ССП, названный клонированием in vitro, был предложен Лукьяновым и соавторами (84). Метод позволяет проводить ПЦР-амплификацию и последующее секвенирование индивидуальных молекул ДНК неизвестной структуры без стадии клонирования in vivo.

Метод включает в себя следующие стадии (Рис. 2.2b):

(1) Одновременное лигирование двух различных супрессионных адапторов к двуцепочечным фрагментам ДНК;

(2) Многократное разведение полученной смеси для доведения концентрации ДНК в объёме, который будет использован для дальнейшей амплификации, до порядка единиц молекул;

(3) ПЦР-амплификация единичных молекул ДНК при помощи праймеров, комплементарных внешним частям адапторов.

Получающиеся продукты ПЦР, так называемые in vitro клоны, соответствуют одиночным молекулам ДНК. Благодаря ССП, эти клоны оказываются фланкированы последовательностями различных адапторов, что позволяет проводить определение последовательности ДНК клонированных фрагментов согласно любому протоколу секвенирования продуктов ПЦР. Метод может быть использован для решения большого круга методических задач вместо традиционного клонирования in vivo. Метод особенно удобен, когда требуется не более, чем несколько десятков клонов (116). Также, был выработан протокол для быстрого приготовления панели перекрывающихся субклонированных фрагментов для секвенирования протяжённых фрагментов ДНК (~5тпн) (117).

2.5.6 Мультиплексная ПЦР

Супрессия ПЦР также использовалась для создания новой стратегии мультиплексной ПЦР (mПЦР). В ходе mПЦР, в одной и той же пробирке одновременно амплифицируются многие фрагменты ДНК (118). Амплификация каждой целевой ДНК при обычной ПЦР требует использования двух ген-специфичных праймеров. Когда одновременно амплифицируют много типов целевых фрагментов, часто невозможно бывает избежать нежелательных взаимодействий праймеров и добиться одинаково эффективного синтеза всех типов ДНК. Несмотря на множество работ, посвящённых выработке эффективных стратегий mПЦР (119, 120) и минимизации взаимодействий праймеров друг с другом (121), mПЦР по-прежнему нельзя назвать стандартной процедурой (122).

Хотя в некоторых случаях и удавалось добиваться высоких уровней мультиплексности в ходе ПЦР (123), это были, всё же, исключения из правила. Обычная mПЦР не позволяет проводить равномерную амплификацию более 5-10 целевых типов матриц. Использование ССП для мПЦР потребует всего лишь одного ген-специфичного праймера на каждый тип и одного праймера, общего для всех амплифицируемых молекул. Таким образом, n-плексная ПЦР потребует только n+1 праймеров вместо 2n , как при обычной ПЦР (Рис. 2.6). В согласии с теоретическими предпосылками, ССП- mПЦР позволила проводить более эффективную амплификацию многих таргетных последовательностей (122, 124), и лишь небольшой оптимизации условий реакции оказалось достаточно для одновременной амплификации 30 таргетных ДНК различной длины из разных хромосом человека (122).

Рисунок 2.6. Схема мультиплексной ПЦР амплификации с использованием только одного специфичного праймера на каждый амплифицируемый локус (вместо двух праймеров при обычной ПЦР).

Кроме того, ССП-mПЦР демонстрировала повышенную специфичность амплификации целевых последовательностей (122, 124). Хотя метод и включает в себя две дополнительных стадии по сравнению с классической мПЦР (расщепление геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование адапторов), это не создаёт значительных трудностей. Было показано, что при амплификации многих таргетных фрагментов можно использовать одну эндонуклеазу рестрикции, так что один подготовленных образец ДНК может быть использован во многих экспериментах. Таким образом, приложение ССП для mПЦР предоставляет ряд преимуществ перед традиционными методами, таких как высокий уровень мультиплексности, более высокая специфичность, более простое дизайнирование праймеров и экономия затрат на их синтез (122).

Подводя итог, можно констатировать, что открытие эффекта ССП привело к созданию множества взаимнодополняющих прогрессивных методов анализа сложных образцов ДНК: конструирования библиотек кДНК, вычитающей гибридизации и дифференциального дисплея мРНК для поиска дифференциально экспрессирующихся генов, быстрого клонирования полноразмерной кДНК, прогулки по хромосоме для клонирования промоторов и других регуляторных участков, мультиплексной ПЦР, клонирования in vitro, и других приложений.

3. Использование сковородоподобных олигонуклеотидов как гибридизационных проб для нужд молекулярной биологии и биомедицины

Первоначально, сковородоподобные гибридизационные зонды представляли собой одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие участок, комплементарный целевой последовательности, фланкированный инвертированными повторами, образующими самокомплементарные концы, а также сопряжённую пару флуорофор / гаситель на 5'- и 3'-концах. Когда целевая последовательность отсутствует в гибридизационной смеси, такие зонды образуют сковородоподобные структуры, в которых флуорофор и гаситель флуоресценции оказываются пространственно сближенными. Это приводит к репрессии флуоресценции. Напротив, в присутствии целевой последовательности в гибридизационной смеси, зонд образует с ней комплекс, в котором гаситель и флуорофор пространственно разделены. Разделение флуорофора и гасителя приводит к повышению уровня флуоресценции, что позволяет проводить количественное измерение сигнала с пороговым значением, обозначающим присутствие целевой последовательности в образце. Кроме того, сковородообразные зонды могут использовать эффект FRET (fluorescence resonance energy transfer), при этом проводится мониторинг сдвига длины волны флуоресценции. Сковородоподобные зонды в настоящее время используются для многих задач, в основном для специфичной детекции мотивов нуклеиновых кислот и при ПЦР в реальном времени. Также сковородоподобные зонды применяют для исследования взаимодействия ДНК с белками, и даже для высокоспецифичной детекции неорганических ионов. Эта быстро эволюционирующая группа методов ежегодно находит отражение по крайней мере в 40 патентах и 50 статьях в реферируемых международных научных журналах.

3.1 Введение

Природные сковородоподобные структуры в составе РНК и ДНК исполняют важные регуляторные роли при нормальном функционировании клетки (125-127). Помимо узнавания белками (128) и специфического сайленсинга генов (129), сковородоподобные структуры показывают ряд преимуществ при гибридизации нуклеиновых кислот, по сравнению с другими конформациями (122, 130-134)). Использование олигонуклеотидов, формирующих на концах сковородоподобные структуры, для эффекта супрессии ПЦР, что позволило создать множество полезных экспериментальных подходов, основанных на ПЦР, рассмотрено во второй главе данного обзора и не будет упомянуто в этой части. Настоящая глава посвящена применению сковородоподобных (англ. stem loop - SL) олигонуклеотидов как зондов для гибридизации. Преимущества сковородоподобных олигонуклеотидов были чётко продемонстрированы при сравнении гибридизации линейных и сковородоподобных (называемых также molecular beacon-“молекулярные беконы”) ДНК-зондов. Последние показали значительно большую специфичность гибридизации (135, 136). С помощью анализа фазовых диаграмм свободной энергии молекулярных беконов в гибридизационной смеси в присутствии и без специфической целевой последовательности, авторы показали, что структурированные зонды могут специфично дискриминировать неспаренные нуклеотиды в большем диапазоне температур, чем при использовании неструктурированных зондов (122, 136).

Возможным объяснением этого эффекта может быть более низкая свободная энергия отжига SL зонда, связанная с меньшим количеством возможных конфигураций (и, соответственно, с пониженной энтропией гибридизации) (137). Выступающие петлевые участки, комплементарные целевой последовательности, лучше экспонированы для гибридизации по сравнению с линейным зондом. Основное преимущество структурированных зондов заключается в улучшенной дискриминации неспаренных олигонуклеотидов (138). SL структуры могут использоваться для гибридизации в растворе (например, в качестве специфического зонда при количественной ПЦР в реальном времени (139)), или же могут быть закреплены на твёрдом носителе таким образом, что петлевые участки иммобилизованы на его поверхности, а самокомплементарные концевые участки участвуют в распознавании целевой последовательности в гибридизационной смеси (122, 138).

3.2 «Молекулярные беконы»

Первоначально, сковородоподобные гибридизационные зонды представляли собой одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие участок, комплементарный целевой последовательности, фланкированный инвертированными повторами, образующими самокомплементарные концы, а также сопряжённую пару флуорофор / гаситель на 5'- и 3'-концах (140, 141) (Рис. 4.1). Когда целевая последовательность отсутствует в гибридизационной смеси, такие зонды образуют сковородоподобные структуры, в которых флуорофор и гаситель флуоресценции оказываются пространственно сближенными. Это приводит к репрессии флуоресценции. Напротив, в присутствии целевой последовательности в гибридизационной смеси, зонд образует с ней комплекс, в котором гаситель (например, часто используемое для этих целей вещество 4-{[4'-(диметиламино)фенил]азо}бензойная кислота (DABCYL)) и флуорофор пространственно разделены. Разделение флуорофора и гасителя приводит к повышению уровня флуоресценции, что позволяет проводить количественное измерение сигнала с пороговым значением, обозначающим присутствие целевой последовательности в образце (Рис. 3.1) (122).

Рисунок 3.1. Принцип действия молекулярных беконов первого поколения. Зонд образует сковородоподобную структуру благодаря внутримолекулярному спариванию инвертированных повторов на его концах. Зонд помечен флуорофором и гасителем флуоресценции на своих противоположных концах. При добавлении комплементарной зонду целевой последовательности, более сильное спаривание между целевой последовательностью и молекулярном беконом разрушает исходную сковородоподобную структуру и фруорофор пространственно удаляется от гасителя, что позволяет детектировать флуоресценцию.

Кроме того, сковородообразные зонды могут использовать эффект FRET (англ. fluorescence resonance energy transfer), при этом проводится мониторинг сдвига длины волны флуоресценции (Рис. 4.2). Энергия возбуждения флуоресценции может переноситься с одного флуорофора на другой при резонансном переносе энергии. После поглощения фотона и перехода в возбуждённое состояние, донорный флуорофор D может перенести энергию возбуждённого состояния на второй хромофор (акцептор, или A) непосредственно, без испускания фотона. Эффективность такого переноса энергии зависит, помимо прочего, от протяжённости участка перекрывания зон в спектрах испускания для D и поглощения для A, от относительной ориентации обоих флуорофоров, и - от расстояния между D и A.

FRET можно использовать для измерения расстояний от 20 до 100 Е (142), для детекции конформационных изменений и измерения их количественных характеристик (143). Наиболее часто FRET используется для исследования белковых взаимодействий и для создания гибридизационных ДНК-зондов (144-147). В случае молекулярных беконов, донорные и акцепторные флуорофоры прикрепляют к двум различным сторонам участка основания шпильки сковородоподобной структуры. Если оба флуорофора колокализуются, может осуществляться резонансный перенос энергии, и будет наблюдаться характеристический пик флуоресценции (типичный для акцептора); и наоборот, когда сковородоподобная конформация зонда нарушена, донорный и акцепторный флуорофоры находятся на слишком большом расстоянии друг от друга, и эффективный перенос энергии между ними невозможен.

Рисунок 3.2. Пример методики, использующей молекулярные беконы, помеченные при помощи FRET.

Подход молекулярных беконов быстро завоевал популярность для некоторых применений в силу его относительной простоты и возможности отслеживания протекающих процессов в реальном времени (134).

Благодаря улучшенному дискриминированию неспаренных нуклеотидов, ДНК молекулярные беконы успешно применяют для детекции однонуклеотидных полиморфизмов (141, 148, 149), для количественной ПЦР в реальном времени (150, 151), в качестве иммобилизованных зондов для ДНК-микрочипов (152-154), и как комплементарные зонды для детекции целевых РНК in vivo (122, 155). За последние годы был разработан ряд усовершенствований этой технологии. Например, несколько целевых типов молекул нуклеиновых кислот могут детектироваться одновременно в одном опыте с использованием различно окрашенных молекулярных беконов (150, 151). Была сильно увеличена чувствительность метода, который используется, например, для детекции патогенных вирусных и бактериальных штаммов (156-158).

В другом случае, точность и чувствительность метода были существенно повышены при использовании золотых наночастиц в качестве гасителя. Преимущество достигается благодаря более выраженной способности к гашению флуоресценции у кластеров золотых частиц (159). В случае, когда флуоресцентно меченные олигонуклеотиды оказываются поблизости от металлических поверхностей, интенсивность испускания зависит как от электромагнитных эффектов (то есть, гашение флуоресценции или усиление испускания), так и от структуры нуклеиновых кислот (например, неупорядоченной, петлевой, шпилечной, или дуплексной) (160). Использование металлических наночастиц для стратегии молекулярных беконов открывает новые перспективы для создания гасителей флуоресценции нового поколения с сильно различающимися характеристиками. Такие различия в свойствах могут быть заданы формой, размером и составом металлического кластера. В будущем, одновременная детекция нескольких целевых последовательностей в одной пробирке может быть осуществлена при использовании нескольких металлических гасителей флуоресценции (159). Альтернатива этому решению проблемы мультиплексной идентификации целевой последовательности в растворе - использование молекулярных беконов, сдвигающих длину волны испускания флуорофора (161). Впрочем, некоторые высокочувствительные методы детекции, основанные на молекулярных беконах, меченных различными флуорофорами, уже вошли в повседневную практику (162-164).

Уайткомб и соавторы объединили молекулярный бекон и праймер для ПЦР в едином SL зонде, названном “скорпион” (165). В этом подходе, ПЦР содержит 5'-выступающий участок, имеющий все характеристики бекона: петлевой участок, комплементарный целевой последовательности, фланкированный самокомплементарным стеблем, и пару флуорофор / гаситель на 5'- и 3'-концах этого участка, соответственно (Рис. 4.3) (122). Сковородоподобный участок соединён с ПЦР праймером через химически модифицированную линкерную последовательность, которая предотвращает амплификацию сковородоподобной структуры ДНК полимеразой. В ходе ПЦР, когда праймер достраивается и синтезируется целевая последовательность ДНК, сковородоподобная структура разворачивается и петлевой участок внутримолекулярно гибридизуется с целевой последовательностью, что повышает флуоресценцию (Рис. 4.3). Таким образом, скорпион-праймер использует мономолекулярный механизм гибридизации зонд-целевая последовательность, а не бимолекулярное узнавание, как при традиционном использовании молекулярных беконов. Это обуславливает более быструю кинетику гибридизации и увеличивает стабильность комплекса зонд-целевая последовательность (122, 166).

Рисунок 3.3. Молекулярный бекон типа “скорпион”. Зонд скорпион имеет модули молекулярного бекона и праймера для ПЦР. Когда целевая последовательность амплифицируется при помощи модуля праймера, бекон разворачивается и пара флуорофор\гаситель пространственно разделяется, что повышает флуоресценцию.

Следующая многообещающая техника основана на применении каталитических ДНК (ДНКzymes) в комбинации с молекулярными беконами. В этом случае, ПЦР праймер содержит последовательность, комплементарную каталитической ДНК (167). В ходе ПЦР, образуется активный ампликон, который расщепляет вносимый в реакционную смесь флуоресцентный субстрат в форме молекулярного бекона, что повышает флуоресценцию. Подход универсален, поскольку для детекции совершенно различных геномных целевых последовательностей используется одна универсальная пара ДНКzyme - субстрат (122).

Каталитические молекулярные беконы представляют собой следующее поколение молекулярных зондов с возможностью амплификации сигнала и детекции целевых нуклеотидных последовательностей без ПЦР амплификации. В данном случае, создаётся сложный двуцепочечный ДНК-зонд, сочетающий в себе свойства молекулярного бекона и ДНКzyme типа hammerhead; эти два модуля локализуются на различных цепях, на двух противоположных концах ДНК (168) (Рис. 4.4). В отсутствии целевой последовательности, модуль ДНКzyme блокирован гибридизацией с модулем бекона. При добавлении целевой последовательности, модуль бекона меняет свою конформацию и позволяет модулю ДНКzyme гидролизовать субстрат, который представляет собой линейный олигонуклеотид с флуорофором и гасителем на противоположных концах. ДНКzyme расщепляет субстрат по позиции специально вводимого в него рибонуклеотида, что разбивает связь флуорофора и гасителя и приводит к усилению флуоресценции. Расщеплённый субстрат диссоциирует, ДНКzyme вновь гибридизуется с модулем бекона, и цикл повторяется. Хотя флуоресцентный ответ, вызываемый круговоротом субстрата, был в несколько раз ниже, чем ответ, вызываемый изменением конформации обычного молекулярного бекона (168), этот подход был безусловно интересен, поскольку включал стадию каталитического расщепления (122). В отличие от классического протокола молекулярного бекона, основывающегося лишь на связывание с целевой последовательностью, этот метод использует каталитическое расщепление для высвобождения флуорофора для детекции и количественного анализа, что делает возможным использовать каталитический цикл для амплификации сигнала.

Рисунок 3.4. Молекулярный бекон, функционирующий как ДНКzyme. Без целевой последовательности, модуль ДНКzyme блокирован гибридизацией с модулем бекона. При добавлении целевой последовательности, модуль бекон меняет конформацию и позволяет модулю ДНКzyme гидролизовать субстрат, представляющий собой линейный олигонуклеотид с флуорофором и гасителем на противоположных концах. ДНКzyme расщепляет субстрат по последовательности специально введенного рибонуклеотида, что пространственно разобщает флуорофор и гаситель и повышает флуоресценцию.


Подобные документы

  • Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.

    курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009

  • Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК. Обнаружение мутации в геномной ДНК при помощи блот-гибридизации с помощью меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. Исследование фрагментов ДНК при полимеразной цепной реакции.

    учебное пособие [2,5 M], добавлен 11.08.2009

  • Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).

    презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014

  • Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая - ДНК, рибонуклеиновая - РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.

    реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014

  • Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.

    презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014

  • История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.

    контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012

  • Механизм действия и модификация антисмысловых олигонуклеотидов. Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени. Буферные растворы, использовавшиеся в работе. Электрофорез нуклеиновых кислот. Проведение полимеразной цепной реакции.

    курсовая работа [1,3 M], добавлен 18.01.2013

  • Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.

    презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013

  • История изучения нуклеиновых кислот как биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды, функции и значение в жизнедеятельности организма. Правила Чаргаффа. Первичная и вторичная структура ДНК. Особенности репликации у эукариот, ее разновидности.

    презентация [533,6 K], добавлен 05.11.2014

  • Объекты, полученные в результате клонирования. Метод "переноса ядра" как наиболее успешный из методов клонирования высших животных. Получение стволовых клеток, генетически совместимых с донорским организмом. Репродуктивное клонирование человека.

    презентация [657,4 K], добавлен 21.04.2013

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.