Основные протоколы резольвазного сканирования мутаций просты и в общих чертах напоминают метод химического расщепления (Рис. 6.3). Интересующий геномный локус (обычно длиной 0.1-2 тпн, но в некоторых случаях - до 4 тпн), амплифицируют с уникальными праймерами с матриц исследуемой и контрольной ДНК. Продукты ПЦР смешивают, денатурируют и гибридизуют (205). Слишком длинные молекулы могут неправильно отжигаться друг на друга, поэтому рекомендуется держаться вышеприведённого интервала длин (206). Дуплексы обрабатывают эндонуклеазами и анализируют в полиактиламидном геле, при капиллярном электрофорезе или с помощью хроматографии. Размер расщеплённых продуктов показывает положение произошедшей мутации, что потом проверяется при секвенировании. Как и для химического расщепления, были предложены модификации метода, включающие введение флуоресцентных меток (205) и мультиплексность (207, 208).

Рисунок 6.3. Обобщённая схема нуклеазного подхода к обнаружению мутаций.

Позднее были открыты два других фермента с похожей активностью и неизвестными клеточными функциями: нуклеаза CEL I из сельдерея (209) и близкородственная ей нуклеаза Surveyor (210, 211).

CEL I делает одноцепочечные разрывы, тогда как нуклеаза Surveyor с высокой специфичностью гидролизует ДНК по обеим цепям, с 3' конца. Surveyor узнаёт все типы замен, а также инсерции и делеции длиной до 12 нуклеотидов. Впрочем, в 100-кратном избытке нуклеаза CEL I также гидролизует обе цепи (212). Преимущество использования нуклеаз CEL I и Surveyor заключается в их способности в стандартных буферных системах детектировать 100% вариантов однонуклеотидных мутаций, включая делеции и инсерции (209, 213).

По сравнению с химическим расщеплением, резольвазный подход оказался более популярным, благодаря простоте, отсутствию вредных реагентов и коммерческой доступности многих ферментов и даже специализированных китов для сканирования мутаций. Например, T7 эндонуклеаза I производится фирмой New England Biolabs, а нуклеаза Surveyor - компанией Transgenomic.

В ряде опытов была доказана эффективность рассматриваемого подхода. Например, в группе из 29 больных наследственным панкреатитом были обнаружены новые диагностические мутации в гене трипсиногена (214); анализ кодирующей последовательности гена p53 в 178 образцах рака прямой кишки выявил мутации в 51 случае (203); метод был применим для крупномасштабной детекции мутаций в двух генах митохондриальной тРНК, даже когда мутации присутствовали на весьма низком уровне (порядка 3%) в образцах тотальной ДНК пациентов с нарушениями дыхательной цепи (215); метод позволял выявлять мутации в гене p53 при соотношении мутантных аллелей к нормальным 1:20 (205). Можно также привести множество других примеров успешного применения метода (216);(208, 217).

Кроме того, резольвазы могут быть использованы для «неканонических» целей. Например, нуклеаза Surveyor применялась для селекции удачных клонов в ходе сайт-специфического мутагенеза (218), а T7 эндонуклеаза I, T4 эндонуклеаза VII и эндонуклеаза V E. сoli - для повышения точности искусственного синтеза генов из более коротких олигонуклеотидов (219).

Классический протокол расщепления резольвазо-подобными нуклеазами значительно эволюционировал, тем самым дав начало некоторым новым экспериментaльным техникам. Например, подход, разработанный Сокуренко и коллегами (212), позволяет даже сравнивать целые бактериальные геномы и находить однонуклеотидные различия между ними (Рис. 6.4). Метод разбит на шесть стадий: (1) смешение сравниваемых геномных ДНК, (2) фрагментация смеси рестриктазами, (3) фракционирование рестриктных фрагментов по длине, (4) денатурация-гибридизация фракционированной ДНК с образованием гетеродуплексов, (5) обработка нуклеазой CEL I и, наконец, (6) анализ обработанных фракций в агарозном геле. Если появляется мутация, это приводит к визуализации на геле двух новых полос фрагментов меньшей молекулярной массы. Фрагменты можно выделить из геля и отсеквенировать, что позволяет локализовать мутацию. С помощью этого подхода, авторам удалось обнаружить разнообразные мутации в геномах бактерий Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и в различных изолятах рода Salmonella. Метод включает в себя много стадий и при этом трудоёмок, что препятствует его популяризации в научном сообществе.

Рисунок 6.4. Схема крупномасштабного скрининга SNP в бактериальных геномных контигах. Стадия 1: тотальная геномная ДНК двух сравниваемых штаммов выделяется и смешивается (полиморфный сайт обозначен жирной линией). Стадия 2: исчеспывающая рестрикция смеси геномных ДНК. Стадия 3: фракционирование рестриктных фрагментов по размеру. Стадия 4: Денатурация и гибридизация фракционированных фрагментов с образованием ДНК-гетеродуплексов (мутантный участок показан квадратом). Стадия 5: обработка дуплексов нуклеазой CEL 1. Стадия 6: анализ полученных фрагментов в агарозном геле.

Следующий метод, опубликованный Хуангом и коллеками (220), является элегантной модификации стандартного протокола, позволившей повысить специфичность получаемого на выходе сигнала. Авторы используют термостабильную бактериальную Эндонуклеазу V и ДНК лигазу (Рис. 6.5). ДНК образца и контроля метят флуоресцентно, смешивают, денатурируют и гибридизуют. Эндонуклеаза V Thermotoga maritima узнаёт и разрезает гетеродуплексную ДНК через один нуклеотид с 3' конца относительно неспаренного участка, а кроме того, на меньшем уровне даёт и нежелательное фоновое расщепление совершенных дуплексов. Используемая термостабильная ДНК лигаза из бактерии Thermus species репарирует фоновые разрывы, что значительно повышает специфичность всей тест-системы.

Рисунок 6.5. Высокоточная техника энзиматической детекции мутаций, основанная на репарации фоновых актов гидролиза при помощи ДНК лигзы. На стадии 4), ДНК лигаза сшивает разрывы, ошибочно внесённые нуклеазой на предыдущей стадии. При этом разрывы на месте неспаренных нуклеотидов остаются.

Миграция фрагментов в полиакриламидном геле позволяет найти позицию мутации. С помощью этого метода удалось обнаружить 31/35 уникальных точечных мутаций и 8/8 инсерций и делеций в исследуемых локусах (проверено секвенированием). Чувствительность метода позволяла детектировать мутантные аллели, разбавленные в соотношении 1:40 к аллелям дикого типа.

6.3.1.2 Рестриктазы, нуклеазы, специфичные к одноцепочечной ДНК и РНКазы

Расщепление неспаренных нуклеотидов в дуплексах исследуемой РНК с контрольной ДНК при помощи некоторых РНКаз было предложено более 20 лет назад (см. обзор (221)). Сначала использовалось расщепление РНКазой А; однако, этот фермент не может расщеплять многие варианты неспаренных нуклеотидов и в настоящее время заменён на другие ферменты, такие как РНКаза 1 и РНКаза T1. Интересно, что чувствительность метода увеличивается, когда ферменты используются одновременно с добавлением веществ - интеркаляторов нуклеиновых кислот (221). Самые серьёзные недостатки подхода - требование большого количества тестируемой РНК, а также неспецифическая деградация РНК.

Недавно для обработки гетерогибридов стали использовать также эндонуклеазы, специфичные к одноцепочечной ДНК. Например, в нашей работе (77) использовалась нуклеаза Mung bean для расщепления петлевых участков, образующихся в несовершенных гетерогибридах. Другая группа авторов в то же время стала использовать эту и другую нуклеазу сходной специфичности - S1 из чёрного аспергилла, для детекции однонуклеотидных замен (222). Оказалось, что в субоптимальных условиях (повышенные значения pH, температуры и содержания двухвалентных ионов) эти нуклеазы могут специфично расщеплять практически все варианты неспаренных нуклеотидов. Этот тип ДНКаз может стать предпочтительным для детекции мутаций, так как могут опознаваться не только однонуклеотидные замены, но также и значительно более длинные инсерции и делеции, часто игнорируемые резольвазами.

Для детекции мутаций могут также использоваться рестриктазы. Пример такого подхода - метод, недавно предложенный Че и соавторами для скрининга известных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в исследуемых образцах (223). Используется рестриктаза типа IIS (Рис. 6.6). Рестриктный сайт вводится в один из двух праймеров для ПЦР таким образом, что рестриктаза расщепляет ДНК сразу за сайтом целевого SNP. При рестрикции продуктов ПЦР получаются структуры с торчащими 5'-концами на месте целевого полиморфного сайта. Этот 5'-торчащий конец используется для реакции удлинения комплементарной цепи на одно основание с использованием флуоресцентно меченных терминирующих нуклеотидов.

Такие меченые фрагменты могут быть разрешены, например, при капиллярном электрофорезе. Можно дизайнировать праймеры таким образом, что получаемые продукты будут варьировать по длине, что позволит наносить в один капилляр до 44 фрагментов. Теоретически, количество SNP за один прогон может быть даже увеличено до 50-100 на один капилляр.

Рисунок 6.6. Техника Single-base extension (SBE) для мультиплексной детекции мутаций. Теоретически, в одном эксперименте можно проскринировать 50-100 потенциальных мутационных сайтов. Один из используемых праймеров несёт сайт узнавания рестриктазы типа IIS, подобранный таким образом, чтобы фермент производил разрыв сразу после исследуемого сайта SNP. Рестриктаза образует 5'-выступающий конец в целевом полиморфном участке. Этот выступающий конец застраивается на одно основание при помощи флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов. Полученные различные фрагменты разрешают в ходе капиллярного элексрофореза на секвенаторе.

В таких довольно редких случаях, когда определяемая точечная мутация разрушает некий существующий рестриктный сайт, можно использовать простую, дешёвую и чувствительную технику, основанную на обработке гетеродуплексов соответствующими рестриктазами (например, (224)). Недостатки метода - его редкая применимость и невозможность поиска новых мутаций.

Наконец, последний метод, рассматриваемый в этом разделе, создан для детекции SNP и основан на применении нового типа нуклеаз - нуклеазы, избирательно расщепляющей ДНК дуплексы (225). Дуплекс-специфичная нуклеаза из Камчатского краба (DSN) предпочтительно расщепляет ДНК в дуплексах ДНК-ДНК и ДНК-РНК, и неактивна по отношению к одноцепочечной ДНК. Кроме того, эта нуклеаза расщепляет совершенные дуплексы с гораздо большей скоростью, чем несовершенные гибриды. Таким образом DSN способна «чувствовать» даже однонуклеотидные замены. В разработанной авторами методике, содержащий сайт SNP участок ДНК амплифицируется в ходе ПЦР, продукт смешивается с сигнальными зондами (короткие олигонуклеотиды, специфичные для мутантного аллеля или для аллеля дикого типа, по-разному помеченные в системе FRET (fluorescent resonance energy transfer)) и с DSN (Рис. 6.7).

Во время инкубации, DSN расщепляет только совершенные дуплексы между исследуемой ДНК и сигнальными зондами, что по характеру флуоресценции позволяет понять, присутствует ли в исследуемом образце мутантный аллель. Метод эффективен при исследовании известных SNP, но не может быть использован для поиска новых мутаций.

Рисунок 6.7. Схема метода DSNP. Черная звёздочка обозначает первый донор флуоресценции, серая - второй, а кружок обозначает гаситель флуоресценции.

6.3.1.3 Искусственные эндонуклеазы

Последняя группа нуклеазных методов детекции мутаций подразумевает обработку гибридов ДНК искусственными нуклеазами, узнающими и расщепляющими специфическую последовательность. В зависимости от способа детекции сигнала, исследуемая мутация создаёт или, наоборот, разрушает такую последовательность.

Например, ПЦР-амплифицированный геномный локус, в составе которого исследуется определённый SNP, гибридизуют с сигнальным зондом (мутация-специфичный короткий олигонуклеотид, помеченный флуорофором и гасителем с противоположных концов). Гибриды обрабатывают нуклеазой, которая расщепляет дуплексы в присутствии мутации, затем измеряется флуоресценция. Если гаситель и флуорофор локализуются близко друг к другу, флуоресценция не детектируется (в случае нерасщеплённых дуплексов), тогда как в случае расщепления дуплекса расстояние между флуорофором и гасителем становится велико и происходит усиление флуоресценции.

Чисто теоретически, метод может быть применён для скрининга любой мутации - при наличии соответствующей нуклеазы. В роли искусственных нуклеаз могут выступать белки или же рибозимы. Искусственные нуклеазы белковой природы - это химеры, состоящие по крайней мере из двух доменов, один из которых отвечает за расщепление ДНК, а другой - за связывание с соответствующим локусом. Домен, отвечающий за расщепление ДНК, может быть создан, например, на основе эндонуклеазы Fok I (226) или металл-связывающего пептида Р1, активного в присутствии ионов лантаноидов (227).

Специфичность связывания ДНК обеспечивается цинковыми пальцами структуры Cys2His2, узнающими специфичные последовательности. Для успешного разрезания ДНК, домен Fok I должен димеризоваться, в случае металл-связывающего пептида этого не требуется. Пока этот интересный подход не может быть широко применён для сканирования мутаций, но, возможно, дальнейший прогресс в белковой инженерии выведет данную технологию на новый уровень.

В отличие от предыдущей группы нуклеаз, рибозимы вполне могут быть использованы для поиска мутаций. У этих РНК-ферментов специфичность задаётся нуклеотидной последовательностью и обусловлена комплементарными взаимодействиями с субстратом. Последовательность же домена, расщепляющего ДНК или РНК, может быть консервативна. При гибридизации с исследуемой ДНК или РНК, рибозим связывается с таргетным сайтом и, в случае идеального совпадения, гидролизует фосфодиэфирную связь. Эта многообещающая техника хорошо работает в руках нескольких исследовательских групп и имеет выраженные перспективы на будущее (228).

6.3.2 Подходы, основанные на аллель-специфической ПЦР

Аллель-специфическая ПЦР (как обычная, так и ПЦР в реальном времени) основана на использовании праймера, содержащего на 3' конце основание, комплементарное мутантному нуклеотиду (Рис. 6.8) и на ингибировании реакции при использовании матрицы дикого типа из-за неспаренного нуклеотида на 3' конце. Для того, чтобы повысить специфичность распознавания мутаций, можно допольнительно вводить искусственные замены на 3'-конец праймера, что приведёт к большему количеству неспаренных нуклеотиодов при отжиге праймера на матрицу (229). Эффективное образование продукта ПЦР свидетельствует о присутствии мутантного аллеля в образце. Хотя обычно используется Taq полимераза, в некоторых случаях дискриминация мутаций лучше осуществляется другими ферментами (230). В случае, когда фермент обладает 3' > 5' экзонуклеазной "proofreading" активностью, праймеры должны быть модифицировны на 3' конце (например, фосфотионатом), чтобы блокировать отщепление критически важного для детекции мутации 3' концевого основания.

Рисунок 6.8. Схема аллель-специфической ПЦР. Праймер для ПЦР содержит на 3' конце основание, комплементарное исследуемой мутации или варианту SNP.

Для проведения стандартного анализа достаточно 10 нг матрицы, и разница в появлении продукта в случае наличия и отсутствия мутации может достигать 20 циклов (231). Метод используется очень часто, как для анализа SNP, так и для детекции определённых бактериальных или вирусных штаммов в образцах (232);(232).

Модификация этого метода, названная аллель-специфичная competitive blocker-polymerase chain reaction (ACB-ПЦР) использует специальный блокирующий «праймер» для уменьшения фонового сигнала, получаемого с матрицы дикого типа.

Неспособный к удлинению блокирующий «праймер» предпочтительно отжигается на последовательность дикого типа и тем самым предотвращает посадку туда праймера, специфичного к мутантному аллелю. Специфичность дискриминации мутаций можно дополнительно повысить при использовании белка SSB, связывающегося с одноцепочечной ДНК, а также Stoffel фрагмента Taq полимеразы. (229).

В другом варианте метода, названном LigAmp, два олигонуклеотида гибридизуются по соседству на ДНК матрице. Один олигонуклеотид спаривается с целевой последовательностью и содержит последовательность адаптора для дальнейшей ПЦР амплификации. Если целевая последовательность (например, мутантный аллель) присутствует в смеси, оба олигонуклеотида лигируются вместе и отслеживаются методом ПЦР в реальном времени (217).

Все эти подходы хорошо работают для количественного, но не качественного анализа SNP, поскольку заранее нацелены именно на детекцию определённого мутантного аллеля и не могут находить новые мутации. Кроме того, прямым ПЦР анализом можно отслеживать относительно длинные (более 15 пар оснований) делеции или инсерции в ДНК. Для этого используют праймеры, фланкирующие участок возможной мутации, и более длинные, чем в случае дикого типа, продукты ПЦР, свидетельствуют об инсерции, тогда как более короткие - о делеции. При помощи различных флуоресцентных меток, все вышеописанные подходы можно перевести на «мультиплексный» уровень (233).

6.3.3 Другие энзиматические подходы для сканирования мутаций

Для анализа мутаций можно использовать не тольно нуклеазы, но и белки, специфично связывающие неспаренные нуклеотиды. Например, белок MutS системы репарации узнаёт неспаренные нуклеотиды в дуплексной ДНК. Иммобилизованный белок может избирательно связывать на колонке ДНК-гетеродуплексы, при этом не задерживая все типы гомодуплексов. В модельных экспериментах, немеченые и флуоресцентно меченные олигонуклеотиды, либо полностью комплементарные друг другу, либо же содержащие однонуклеотидные замены, формировали дуплексы, которые затем инкубировали с MutS. При разрешении смеси на капиллярном ДНК секвенаторе, получили 29-кратное обогащение для олигонуклеотидов с однонуклеотидными делециями, тогда как обогащение в случае однонуклеотидных замен составляло всего 2 раза (234).

Также на основе белка MutS был разработан чип для быстрого скрининга SNP. Специфическое связывание меченного MutS с иммобилизованной ДНК, или меченной ДНК с иммобилизованным MutS детектируют с помощью флуоресцентного сигнала (235, 236). Измеряя расстояние от участка посадки MutS до концов ДНК, можно картировать сайт мутации. Для этих целей можно использовать физические методы quartz crystal microbalance (QCM) (237) и surface plasmon resonance (SPR).

Ещё одним белком, связывающим неспаренные нуклеотиды, является дефектная форма эндонуклеазы VII, которая может лишь связываться с неспаренными участками, но не обладает нуклеазной активностью (204). Этот белок можно иммобилизовать на твёрдый носитель (например, сефарозу), и проводить несколько раундов обогащения гетеродуплексной ДНК (238). В модельных экспериментах, содержание гетеродуплексной ДНК повысилось от ~10 до 45% после третьего раунда и более не повышалось. Метод позволяет идентификацию ранее неизвестных мутаций, но является слабо чувствительным (содержание гетеродуплексов в исходной смеси должно быть более 10%) (238).

Техника, названная “Гликозилазная детекция полиморфизмов” основана на действии специфических гликозилаз для детекции неспаренных нуклеотидов (239, 240). Для этого, целевой локус амплифицируют в ходе ПЦР с тремя нормальными dNTP и с четвёртым - модифицированным (например, dUTP) таким образом, что при встраивании эти основания становились субстратами особой ДНК-гликозилазы. Праймеры дизайнируют таким образом, что позиция первого модифицированного нуклеотида (например, урацил) должна варьировать в зависимости от того, присутствует ли мутация или нет. Последующее гликозилазное отщепление остатков урацила и химическое либо энзиматическое расщепление апиримидиновых сайтов позволяет детектировать мутацию как полиморфизм длины фрагментов. Техника была достаточно чувствительна и эффективна, но начиная с момента создания в 1998 г. использовалась лишь в одной лаборатории (241).

Последняя техника в этом разделе основана на детекции точечных замен высокоточной ДНК лигазой (242). Её протокол включает три основные стадии (Рис. 6.9). Сначала происходит гибридизация исследуемой пре-амплифицированной цепи ДНК (дикого типа или мутантной) с двумя нуклеотидными зондами, меченными наночастицами золота. При этом образуется протяжённый агрегат ДНК и золотых наночастиц, меняющий цвет раствора с красного на пурпурный. На следующей стадии добавляется высокоточная лигаза (Tth ДНК лигаза в данном примере), которая ковалентно связывает между собой только совершенные дуплексы, а в случае неспаренных нуклеотидов на концах лигирования не происходит. Затем смесь нагревают для денатурации гибридов. Если лигирования не произошло, цвет снова становится красным (исчезает высокомолекулярный агрегат наночастиц золота), а если лигирование прошло успешно, цвет остаётся пурпурным. Метод применялся для анализа однонуклеотидных мутаций в протоонкогене человека K-ras (242).

Рисунок 6.9. Детекция точечных мутаций при помощи высокоточной ДНК лигазы и двух мутация-специфичный ДНК зондов, конъюгированных с наночастицами золота. В присутствии целевой мутации, оба зонда образуют совершенные дуплексы с исследуемой ДНК, и лигаза ковалентно сшивает оба (в реальности - больше) меченных зонда. После тепловой денатурации цвет ковалентно связанных агрегатов наночастиц остаётся пурпурным, в отличие от красного для несвязанных частиц (см. текст).

6.4 Физические методы

Эта группа методов детектирует различия в физических характеристиках между мутантными и интактными ДНК, что подразумевает либо физическое разделение совершенных и несовершенных дуплексов (например, в ходе электрофореза), либо поиск различий в их физических свойствах.

Первый описываемый в данном разделе подход напоминает хорошо известный метод белкового фингерпринтинга. Молекулу нуклеиновой кислоты расщепляют ферментом, чувствительным к определённому основанию (например, урацил ДНК гликозилазой, РНКазой A или T1), либо химическим способом (см. выше) и в результате получают набор коротких олигонуклеотидов, который анализируется масс-спектрометрически. Если присутствует мутация, нуклеотидная композиция соответствующиго олигонуклеотида будет отличаться от контрольной последовательности, что приведёт к различиям в масс-спектре (243). Анализ при помощи специализированного программного обеспечения позволяет получить сведения относительно (1) типа мутации, (2) её положения в молекуле ДНК или РНК. Подход, однако же, накладывает серьёзные ограничения на размер анализируемых олигонуклеотидов: они не должны быть слишком короткими, но и не должны превышать 25 нуклеотидов.

Следующий подход основан на наблюдении, что красители-интеркаляторы (например, SYBR Green) лучше связываются с совершенными дуплексами, чем с несовершенными (244). Например, дуплекс длиной 40 пар нуклеотидов и содержащий одну неспаренную пару оснований, в присутствии интеркалятора флуоресцирует на 13% слабее, чем совершенный дуплекс аналогичной длины.

Впрочем, самый популярный подход физической детекции мутаций - это single-strand conformational polymorphism (SSCP) (245). Эта простая и дешёвая техника может быть полезна при скрининге ДНК с какой-либо ожидаемой, заранее известной мутацией. Детекция основана на изменённой конформации дуплекса, содержащего участки неспаренных оснований, что отражается на его электрофоретической подвижности. Ограничения SSCP - часто возникающие проблемы с разрешением дуплексов в полиакриламидном геле (246).

Технология микрочипов позволяет анализировать большое количество полиморфизмов в одном эксперименте (245). Исследуемый образец (зонд) гибридизуется с нанесёнными на чип олигонуклеотидами. Условия гибридизации и температура подбираются таким образом, чтобы варианты, отличающиеся от нанесённых на чип олигонуклеотидов хотя бы на одно основание, не гибридизовались с чипом. Подход достаточно широко применяется, но при этом крайне дорог и не всегда достаточно специфичен (247).

Наконец, последний рассматриваемый в этой главе подход, названный “enzyme-amplified electronic transduction” (248), позволяет проводить количественный анализ мутаций без стадии предварительной ПЦР амплификации, при нижнем пределе детекции мутантной ДНК на уровне 1x10-14 моль/мл. Используется тиолированный «чувствительный» олигонуклеотид, комплементарный целевому участку ДНК, вплотную к сайту скринируемой мутации (Рис. 6.10). Олигонуклеотид гибридизуют с исследуемой ДНК, а затем в присутствии ДНК полимеразы к смеси добавляют биотинилированный нуклеотидтрифосфат, комплементарный сайту мутации. Меченный нуклеотид включается только в случае наличия мутантного аллеля. Последующее связывание конъюгата авидин-щелочная фосфатаза, а также дальнейшая амплификация сигнала химическими и физическими методами (например, quartz-crystal microbalance (QCM)), позволяют добиться невиданной чувствительности анализа (248).

Рисунок 6.10. Метод Enzyme-amplified electronic transduction (пояснения в тексте).

7. Подходы к повышению специфичности гибридизации нуклеиновых кислот

Будучи чрезвычайно полезными и информативными, многие методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот, страдают от «фонового» отжига последовательностей геномных повторов, присутствующих в образцах. Такое “неправильное” спаривание приводит к нежелательной гибридизации неортологичных фрагментов ДНК, что приводит к образованию химерных клонов и значительно осложняет анализ получающихся библиотек. Химеры могут составлять 40-60% ДНК всей библиотеки. При этом количество химерных клонов прямо коррелирует со сложностью гибридизационной смеси. Специфичность гибридизации становится критичной для множества методов. В данной главе обсуждаются подходы к повышению специфичности гибридизации на стадиях реассоциации нуклеиновых кислот и селекции правильно спаренных гибридов. Для этого можно использовать подходы, основанные на химических модификациях, улучшении кинетических параметров гибридизации и повышении точности селекции совершенных дуплексов.

7.1 Введение

Множество популярных экспериментальных методов изучения генома и транскриптома, включая Клонирование совпадений и Вычитающую гибридизацию, основаны на гибридизации ДНК в растворе c последующей ПЦР амплификацией определённых гибридных фракций (65, 249).

Специфичность гибридизации - ключевой фактор, определяющий как точность многих природных биологических процессов, так и эффективность методов, основанных на гибридизации. Специфичность гибридизации, f, определяется как относительный фактор дискриминации совершенных против несовершенных дуплексов, согласно уравнению: f =exp-|?Gm-?mm /RT|, где Gm-?mm - это значение свободной энергии для связывания с участками, различающимися от идеально спаренного дуплекса единичной парой неспаренных оснований. Если значение Gm-?mm составляет ~4 kкал моль -1 (137), то специфичность гибридизации попадёт в диапазон ~1/100-1/1000, и теоретически возможно подобрать условия, при которых совершенные комплексы будут существенно более стабильны, чем дуплексы, содержащие неспаренные основания (122).

Впрочем, в реальности «неправильный» отжиг последовательностей друг на друга (в основном речь идёт о геномных повторах) создаёт существенные проблемы (250), и количество химерных клонов может составлять 40-60% библиотеки ДНК (Рис. 7.1).

Рисунок 7.1. Помимо образования совершенных дуплексов, в гибридизационной смеси также формируются химерные гибриды между повторяющимися последовательностями, особенно при работе с геномными смесями большой сложности. Многие методы не позволяют на предварительных стадиях распознавать такие “неправильные” гибриды, которые в таком случае могут занимать до 60% получаемых библиотек

Количество химерных клонов прямо коррелирует со сложностью гибридизационной смеси. Это, например, основное ограничение, которое не позволяет использовать вычитающую гибридизацию для прямого сравнения сложных геномов, таких, как ДНК млекопитающих. Оба основных подхода для вычитания геномной ДНК - RDA (representative differential анализ (54, 56, 57) и TGDA (targeted геномный difference анализ) (18, 19, 251), основаны на значительном упрощении фракции ДНК перед стадией гибридизации.

В первом случае такое упрощение достигается за счёт эффекта ПЦР селекции, когда тотальный пул фрагментированной геномной ДНК с лигированными адапторами предварительно амплифицируется в ходе 50-100 циклов ПЦР.

Это приводит к огромному отклонению в содержании различных фрагментов ДНК в получающемся ампликоне: большинство последовательностей оказываются недопредставлены или потеряны из-за относительно неэффективной ПЦР с Taq полимеразой, тогда как другие, образующие относительно небольшую (~10% или меньше) фракцию исходного пула, оказываются перепредставлены из-за своего оптимального для Taq полимеразы соотношения длины и GC-состава. Таким образом, RDA использует случайное упрощение геномной ДНК, основанное на размере и GC-составе фрагментов. Соответственно, в получаемом на выходе пуле дифференциальных последовательностей недостаёт большинства их, присутствовавших в геноме изначально. Поэтому RDA применим для поиска отдельных маркерных последовательностей, но не используется для исчерпывающего анализа геномов или кДНК.

Второй подход, TGDA, основан на предварительной специфической ПЦР амплификации группы интересующих геномных последовательностей (например, последовательностей, фланкирующих ретроэлементы человека с 5' или 3' конца (18, 19, 252)). Эти последовательности селективно амплифицируются с использованием разумного количества циклов (25-40, в зависимости от необходимости nested ПЦР амплификации), и подвергаются вычитанию, что приводит к созданию полной библиотеки, обогащённой дифференциальной ДНК. Преимущество TGDA - в полном, а не случайном, анализе интересующих типов последовательностей (различные группы повторяющихся элементов, члены мультигенных семейств, псевдогены, дуплицированные геномные локусы). На настоящий момент, метод был успешно применён для поиска дифференциальных внедрений эндогенных ретровирусов человека (19), а также ретротранспозонов L1 (251, 253, 254) и Alu (252).

Впрочем, оба подхода -TGDA и RDA - нельзя применять для сравнения полных геномов. Для улучшения существующих техник гибридизации нуклеиновых кислот в растворе, представляется целесообразным в дальнейшем:

- улучшать параметры кинетики гибридизации (чтобы образовывались только совершенные дуплексы и

- повышать селективность узнавания совершенных дуплексов на стадии изготовления итоговых библиотек.

7.2 Улучшение параметров кинетики гибридизации

Хотя кинетика наилучшим образом была исследована для вычитающей гибридизации (42, 43, 45, 61), все основные сделанные выводы оказываются верны и для других методов гибридизации нуклеиновых кислот в растворе.

При вычитающей гибридизации, ожидаемое обогащение дифференциальными последовательностями (Ed (t)) вычисляется по формуле (9, 42):

Ed (t ) = (1 +RD 0 t )/(1 +RT 0 t )

где R [M-1сек-1 ] - это константа скорости реассоциации, а D 0 и T 0 - это исходные молярные концентрации драйвера и трейсера, соответственно. Максимальное обогащение при t ? составит D 0 /T 0. Для ограниченных величин t, как, например, 14 часов (ночная инкубация), значение обогащения возрастает с ростом RD 0. Поэтому для получения наилучших результатов следует повышать значения R и D 0. Значение R можно повысить при использовании химических акселераторов, например, фенола (15, 23).

Однако же, геномы млекопитающих слишком сложны для получения высоких значений D0, и только огромные различия (вроде наличия или отсутствия У хромосомы) можно исследовать прямым геномным вычитанием. Как только размер генома становится выше 5x108 пн (сложность, сравнимая с геномами арабидопсиса и дрозофилы), кинетика гибридизации становится важнейшим фактором, ограничивающим обогащении целевыми последовательностями (45). В принципе, для улучшения кинетических параметров можно увеличивать время гибридизации, повышать концентрацию драйвера, увеличивать соотношения драйвер:трейсер и размер фрагментов ДНК, а также использовать методы повышения скорости реассоциации, например, метод реассоциации в фенольной эмульсии (PERT) (46);(48).

7.2.1 Упрощение гибридизационных смесей

Как было сказано выше, одна из схем геномного вычитания, (RDA) (57), включает ненаправленное уменьшение сложности трейсера и драйвера перед гибридизацией (54), при этом значение D 0 повышается за счёт случайного упрощения генома. Упрощение и повторение циклов вычитания позволяют добиться особенно высокого обогащения целевыми последовательностями (58). RDA успешно применяли для клонирования делеций и дупликаций ДНК при раке (69), а также для создания специфических генетических маркеров (58, 255). Альтернативный подход использованию огромного количества циклов ПЦР - упрощение смеси с помощью НЕчастощепящих рестриктаз, при этом получается скромное количество фрагментов, не слишком длинных для последующей амплификации.

Очевиден системный недостаток RDA - из смеси случайным образом отбирается небольшая фракция (2-10%), которая и анализируется, а все остальные последовательности - «выкидываются». Решение проблемы для случаев, когда известно, какие именно последовательности подлежат анализу -метод TGDA (19), при этом геном упрощается направленно, при предварительной амплификации целевых разновидностей сравниваемых последовательностей. Например, в случае, когда исследовалось семейство геномных повторов человека, содержащее 2000 членов, сложность гибридизационной смеси составляла всего 0.017% от общей сложности генома человека. Результат - весьма значительное повышение скорости гибридизации (3.6x107) упрощённой смеси относительно исходной (42).

Следующей проблемой является гораздо более высокая скорость гибридизации повторов, чем уникальных фрагментов генома (об этом см. более подробно в Главе 5). Частичное решение - пре-гибридизация с фракцией конкурентной ДНК, обогащённой повторами (для снижения их эффективной концентрации).

Кроме того, стоит принимать в учёт температуру гибридизации, которая в значительной мере является регулятором специфичности гибридизации: чем ниже температура, тем больше фон, и наоборот. Впрочем, начиная со значения 65єC, повышение температуры уже не влияет на специфичность гибридизации при размере фрагментов смеси порядка 100-300 пн (77). В частности, количество неверно спаренных дуплексов не отличалось для 65 и 85єC.

7.2.2 Химические модификации

Подходы, основанные на химических модификациях ДНК или синтезе аналогов нуклеиновых кислот, позволяют избирательно повышать или понижать стабильность комплементарных взаимодействий между основаниями, в зависимости от конкретной задачи. Это особенно важно для увеличения операционного интервала температур, дискриминирующих совершенные дуплексы от несовершенных (например, см. (256)). Последующее “титрование” температуры позволяет находить условия, обеспечивающие наибольшую специфичность гибридизации фрагментов геномной ДНК заданной длины.

Следующая группа подходов использует химическую модификацию оснований для дискриминации совершенных и несовершенных гибридов ДНК или РНК (190). Этот принцип в основном используется для детекции мутаций (188, 195) и подробно описан в Главе 6. При определённых условиях, возможно проводить специфические химические модификации неспаренных нуклеотидов, а затем, при расщеплении гликозидных связей по позициям модифицированных оснований, вызывать деградацию неверно спаренных гибридов. Основное преимущество такого подхода - практически 100% эффективность модификаций по неспаренным нуклеотидам, а главный недостаток - то, что модифицированные и расщепленные продукты не могут быть клонированы или ПЦР-амплифицированы.

7.3 Ужесточение требований к селекции совершенных дуплексов

Данная стратегия направлена не на улучшение условий гибридизации, а на более эффективный селективный отбор совершенных дуплексов и на отбрасывание химерных гибридов (Рис. 7.1). Для этого можно использовать химические модификации неспаренных нуклеотидов (см. выше) или же специфичные к несовершенным дуплексам нуклеазы (подробно рассмотрено в Главе 6). Например, подход, названный mispaired DNA rejection (MDR), относительно недавно опубликованный Чалой и соавторами (77), позволяет практически полностью исключить химерные последовательности из гибридизационных библиотек даже большой сложности. При этом используются два фермента: узнающая единичные неспаренные нуклеотиды эндонуклеаза Surveyor, а также специфичная для участков одноцепочечной ДНК (и, соответственно, для петлевых участков несовершенных дуплексов) нуклеаза Mung Bean.

На основе данного обзора литературы были опубликованы следующие материалы:

1) Монография “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin и Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

2) Nucleic acids hybridization: potentials and limitations (Anton Buzdin) глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

3) Selective suppression of polymerase chain reaction and its most popular applications (Sergey Lukyanov, Nadezhda Gurskaya, Ekaterina Bogdanova, Anton Buzdin). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

4) Suppression subtractive hybridization (Sergey Lukyanov, Denis Rebrikov, Anton Buzdin). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

5) Stem-loop oligonucleotides as hybridization probes and their practical use in molecular biology and biomedicine (Anton Buzdin, Sergey Lukyanov). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

6) Coincidence cloning: robust technique for isolation of common sequences (Anton Buzdin). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

7) DNA hybridization in solution for mutation detection (Anton Buzdin) глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

8) Current attempts to improve the specificity of nucleic acids hybridization (Anton Buzdin). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

Экспериментальная часть работы

1. Методы идентификации новых копий геномных повторов

1.1 Введение

Выход молекулярной генетики на качественно новый уровень - уровень исследования и сопоставления структуры и функций целых геномов - возможен лишь при прогрессивном развитии арсенала соответствующих экспериментальных подходов. Первым этапом могло бы являться получение исчерпывающих структурных данных, вторым - расшифровка на их основе функциональной роли тех либо иных участков генома. Возможно, наилучшим из имеющихся подходов с точки зрения полноты охвата проблемы является тотальное секвенирование геномной ДНК и библиотек транскриптов различных тканей исследуемого организма. Вместе с тем, регуляторные участки генома таким способом выявить невозможно. Кроме того, подход очень дорог и требует огромного напряжения усилий множества учёных.

Применение технологии микрочипов не может быть полноценной заменой полного секвенирования, так как не позволяет различать слабодивергировавших представителей мультигенных семейств, а также те последовательности, в состав которых входят повторяющиеся элементы. Кстати, наличие большого количества повторяющихся последовательностей в определённых локусах создаёт проблемы и для определения полной структуры генома методом тотального секвенирования - так, последовательности теломерных и центромерных районов хромосом принципиально не могут быть получены при использовании имеющегося инструментария.

Одной из целей настоящей работы являлась разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить полногеномное сравнение распределения геномных повторов в ДНК представителей разных видов или между различными особями одного вида. Изменения в структуре ДНК, прямо или косвенно связанные с изменением количества копий геномных повторов, являются одним из важнейших факторов эволюции геномов и, соответственно, видообразования.

Помимо понимания многих аспектов эволюции, изучение геномных повторов, в особенности - мобильных элементов генома и их фракции, активной у позвоночных, ретроэлементов - может дать исследователям новые полиморфные маркёры, которые могут быть использованы как для филогенетических, так и для медико- и популяционно-генетических исследований. Такие маркёры, созданные на основе ретроэлементов, обладают рядом преимуществ относительно остальных типов полиморфных маркёров: (1) они относительно стабильны, (2) возможность нескольких независимых внедрений ретроэлементов в один и тот же сайт генома пренебрежимо мала, (3) известно “предковое” состояние геномного локуса - отсутствие ретроэлемента, поэтому можно определять степень родства между различными анализируемыми организмами и, наконец, (4) наличие либо отсутствие ретроэлемента в исследуемом локусе можно быстро и надёжно установить с помощью ПЦР.

Ретроэлементы обладают значительным регуляторным потенциалом, обеспечивающим контроль экспрессии их собственных генов. В то же время, известно, что активность многих уникальных функциональных участков генома, например, многих генов, модулируется располагающимися по соседству вставками ретроэлементов. Поэтому сравнение распределения ретроэлементов между геномами представляется одной из важнейших задач молекулярной генетики. Применяемые для решения этой задачи большинством исследователей экспериментальные подходы не обладают полнотой анализа. Казалось бы, наилучшим выходом могла бы стать тотальная идентификация геномных повторов в базах данных. Однако же этот подход имеет один крупный недостаток. Вся информация о наличии повторов в различных локусах генома берётся из баз данных и, учитывая, что для всех крупных проектов секвенируют ДНК лишь небольшого количества представителей исследуемого вида, подавляющее большинство аллелей теряется. Кроме того, прицентромерные и прителомерные участки с трудом поддаются анализу и недопредставлены во всех опубликованных последовательностях ДНК эукариот со сложным геномом. Таким образом, базы данных содержат неполную информацию. К тому же, таким способом можно исследовать только те объекты, геномная последовательность которых частично или же почти полностью установлена.

Поэтому актуальной представляется задача создания экспериментальных методов, позволяющих проводить полногеномное сравнение распределения повторяющихся элементов между организмами независимо от информации, содержащейся в базах данных. Далее будут рассмотрены два таких подхода, разработанные в нашей группе. Оба метода были успешно опробованы для поиска ретроэлементов, специфичных для ДНК человека.

1.2 Метод TGDA: вычитающая гибридизация участков, фланкирующих геномные повторы

В рабочей группе, включавшей Ю. Б. Лебедева, С. В. Устюгову, К. В. Ходосевича, И. З. Мамедова и А. А. Буздина, был разработан метод, названный TGDA (от англ. Targeted Genomic Differences Analysis), позволяющий проводить полногеномный сравнительный анализ геномных повторов в ДНК изучаемых организмов. Принципиальная идея метода принадлежит акад. Е. Д. Свердлову, автором рабочей версии метода и большинства его модификаций является автор настоящей работы.

Принцип метода. TGDA состоит из трёх основных стадий (cм. Рис. 1.2.1):

(1) Селективная амплификация последовательностей ДНК, фланкирующих повторяющиеся элементы в сравниваемых геномах, с использованием эффекта “ПЦР-супрессии”(97).

(2) Обработка полученных ампликонов экзонуклеазой ExoIII для получения 5'-выступающих концов (эта стадия критична для всего процесса; она призвана убрать из ампликонов, полученных после (1) стадии, остающиеся в них последовательности мобильных элементов.

(3) Основанная на ПЦР вычитающая гибридизация (ВГ) обработанных ампликонов.

Для вычитания один из ампликонов (так называемый драйвер, англ. driver) берётся в значительном избытке над другим, называемым трейсер, англ. tracer. ВГ (подробно описана в литературном обзоре) позволяет напрямую идентифицировать последовательности (назовём их мишени), присутствующие в трейсере, но отсутствующие в драйвере.

Остановимся на перечисленных трёх стадиях поподробнее.

Первая (1) стадия (Рис. 1.2.1.А), базирующаяся на использовании эффекта ПЦР-супрессии, включает в себя (i) фрагментацию геномной ДНК частощепящей (узнающей 4-нуклеотидные последовательности) рестриктазой; например, мы использовали фермент AluI. (ii) К полученным рестриктным фрагментам лигируются олигонуклеотидные адапторы, формирующие сковородоподобные структуры (Рис. 1.2.1.А, стадия 2; структуры олигонуклеотидов A1A2 и a1 приведены в разделе «Материалы и методы» соответствующей публикации (19).

Рисунок 1.2.1. Схема метода TGDA. (А) Селективная амплификация фланков мобильных элементов (обозначены как Тр) сравниваемых геномов. (Б) Вычитающая гибридизация полученных ампликонов

Использовались стандартные адапторы, образующие после лигирования одноцепочечные (оц) 5'-выступающие концы, по которым ДНК-полимераза достраивала 3'-концы. В результате, все рестриктные фрагменты ДНК оказывались фланкированы инвертированными повторами. Таким образом, при денатурации, образующиеся оц фрагменты содержат взаимно комплементарные последовательности, образующие мощные внутримолекулярные шпилечные (или сковородоподобные) структуры (Рис. 1.2.1.А).

ПЦР-амплификация фрагментов ДНК, содержащих такие внутримолекулярные структуры, супрессируется, если используются только праймеры, комплементарные лигированным адапторам (Рис. 3.2.1.А, стадия 2).

Если же такие праймеры используются в паре с праймерами, комплементарными внутренней (одноцепочечной) части сковородоподобной структуры, ПЦР проходит нормально (Рис. 1.2.1.А, стадия 2). Амплифицированная ДНК в этом случае будет иметь различающиеся концевые последовательности, не образующие внутримолекулярных структур, и может быть далее успешно амплифицирована с праймерами A1+T1 (iii). Этап “Nested” ПЦР с праймерами А2 и Т2 призван повысить специфичность амплификации. При правильном выборе праймеров процедура позволяет обеспечить амплификацию только лишь тех фрагментов, которые содержат последовательность интересующего мобильного элемента.

На второй (2) стадии, перед обработкой ExoIII, c помощью ре-амплификации полученных на предыдущей стадии ампликонов, готовят две отдельные фракции ДНК трейсера (Рис. 1.2.1.Б, слева, стадия 1). Для этого используется “step-out” вариант ПЦР (257) с праймерами А1А2, А1 и Т2, либо же А1Т2, А1 и А2 для амплификации фракций А и Б, соответственно. Получившиеся фрагменты ДНК фракции А содержат последовательность А1А2 на одном конце и Т2 - на другом, а у фрагментов фракции Б на концах содержатся последовательности А2 и А1Т2.

Затем полученные ампликоны обрабатывают экзонуклеазой ExoIII. Эта стадия получения оц 5'-концов (Рис. 1.2.1.Б, стадия 2) является критической для всего процесса: она предотвращает кросс-гибридизацию повторяющихся частей, общих для всех ампликонов, и обеспечивает последующую специфическую амплификацию двухцепочечных гетеродуплексов ТрейсерА/ТрейсерБ, образующихся в процессе ВГ. Для формирования оц 5'-выступающих концов, ампликоны (как трейсера, так и драйвера) обрабатывают ExoIII из рассчёта, что фермент удаляет ~6,7 3'-концевых нуклеотидов в минуту.

На последней (3) стадии трейсеры А и Б смешивают со 100- или 200- кратным избытком драйвера (Рис. 1.2.1.Б, стадия 3), денатурируют и оставляют гибридизоваться на 14 часов. Получившаяся в результате смесь содержит оц фрагменты трейсера и драйвера, двуцепочечные гибриды трейсера и драйвера, гомодуплексы, получившиеся при само-реассоциации драйвера и трейсеров А и Б, и гетеродуплексы, сформированные при кросс-реассоциации комплементарных цепей трейсеров А и Б (фракция ТрейсерА/ТрейсерБ).

После того, как выступающие оц концы последних упомянутых гетеродуплексов заполнены ДНК-полимеразой, эти гетеродуплексы получают сайт посадки праймера А1 с обоих флангов и становятся единственными фрагментами, которые могут быть экспоненциально ПЦР-амплифицированы, если в смеси присутствует только один этот праймер. Продукты последующей ПЦР клонируют в E. coli и далее анализируют вставки. Прохождение самой ВГ может быть описано формулой (цитируется по работе Е. Свердлова и О. Ермолаевой (53)):

Ed(t)=(1+RD0 t)/(1+RT0 t), где Ed(t) - это значение ожидаемого обогащения вычтенной ДНК дифференциальными последовательностями, R [M-1сек-1] - константа скорости реассоциации. D0 и T0 - исходные молярные концентрации драйвера и трейсера, соответственно. Максимальным обогащением при t®Ґ является соотношение концентраций трейсера и драйвера D0 /T0. Для ограниченных значений времени, таких как 14 часов, обогащение должно быть тем больше, чем больше RD0. Таким образом, для получения наилучших показателей обогащения следует повышать значения R или D0, либо обе эти величины.

Мы применили TGDA для поиска последовательностей мобильных элементов, специфичных для генома человека. Такими мобильными элементами являются те, которые интегрировали в геном представителей предковой линии человека уже после расхождения её с предковой линией ближайшего родственника H. sapiens - шимпанзе. Сейчас известны 5 таких семейств мобильных элементов, все они относятся к ретроэлементам. Это некоторые представители эндогенных ретровирусов HERV-K (HML-2), LINE L1 и ретропозонов Alu, SINE-R и SVA. Идентификация специфичных для генома человека (чс) внедрений таких ретроэлементов является важной задачей генетики H. sapiens, мы же таким образом ещё и проверяли возможности техники TGDA, тем самым одновременно “убивая двух зайцев”. Для проведения экспериментов мы выбрали два семейства ретротранспозонов: HERV-K (HML-2) и L1, которые, в отличие от остальных трёх семейств, обладают гораздо более сложной структурой и большим спектром воздействия на функционирование генома.

Большинство геномных копий HERV-K (HML-2) в ходе эволюции претерпели гомологичную рекомбинацию по последовательностям своих длинных концевых повторов (LTR), и теперь существуют в виде одиночных LTR. Поэтому праймеры, выбранные для специфической амплификации HERV-K-фланкирующих областей, были подобраны именно на консервативные последовательности LTR этих эндогенных ретровирусов. Проводили амплификацию последовательностей, фланкирующих LTR с 5'-конца, поэтому оба LTR-специфичных праймера (обозначены на Рис. 1.2.1 как Т1 и Т2) имеют обратную ориентацию относительно последовательности LTR.