Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

Как показано на рисунке 2.3.2, 3' провирусные LTR обладают сходным транскрипционным профилем в обеих тканях: низкий уровень транскриптов для представителей группы C1, сильное (~30-60-кратное) повышение этого уровня в группе C2, потом опять довольно низкий уровень для группы C3 и, наконец, ~2.5-5-кратное повышение для группы C4. Профили для одиночных LTR выглядели по-другому: промоторная сила мала для группы C1, умеренна для групп C2 и C3 и, наконец, в 4_6 увеличена для группы C4. Хотелось бы отметить, что вновь максимальная промоторная активность одиночных LTR приходится на группу C4.

Рисунок 2.3.2. Относительная промоторная сила 3' провирусных (серый цвет) и одиночных LTR (чёрный), сгруппированных в зависимости от расстояния от генов (группы C1-C4). A, нормальная паренхима яичка; Б, семинома.

Полученные данные говорят о том, что в случае близости к генам транскрипция 3' провирусных LTR подавляется. Это может быть направлено на супрессию провирусных генов. Интересно, что относительная промоторная сила как одиночных, так и 3' провирусных LTR существенно понижена в группе С3 для нормальной ткани (паренхима яичка). Возможно, существует особый механизм селективной супрессии “лишних” промоторов, расположенных в интронах генов или очень близко от генов. Он мог бы минимизировать деструктивный эффект нежелательной фоновой транскрипции, включая экспрессию антисмысловых РНК, которые могут вмешиваться в устоявшиеся механизмы регуляции активности генов. В этой связи надо добавить, что ~90% интронных HS LTR находятся в обратной ориентации относительно направления генов; таким образом, транскрипция этих LTR может создавать пул регуляторных РНК (254).

Затем было проведено сравнение средних промоторных активностей для 5'провирусных, 3'провирусных и одиночных LTR (Рис. 2.3.3). Усреднённое значение относительной промоторной силы для каждой из групп рассчитывалось как частное относительного содержания соответствующих ELT в тотальном пуле ELT, и относительного содержания HS элементов этой группы относительно общего числа HS элементов.

Оказалось, что усреднённые значения промоторной силы для одиночных и 3' провирусных LTR практически совпадают, причём в обеих исследованных тканях. Промоторная сила 5' провирусных LTR была примерно вдвое выше в паренхиме яичка и в пять раз больше в семиноме, что отлично согласуется с большим количеством данных о предпочтительной экспрессии генов HERV-K (HML-2) именно в клетках раковых опухолей зародышевого пути. Можно предположить, что провирусные последовательности содержат некоторые пока не охарактеризованные регуляторные последовательности, лежащие ниже относительно LTR, которые и обеспечивают значительно более высокую экспрессию 5' провирусных LTR, особенно в семиноме.



Рисунок 2.3.3. Сравнение относительной промоторной силы одиночных, 5' провирусных и 3' провирусных LTR (на один LTR). Серые и чёрные столбцы представляют относительные промоторные силы LTR указанных типов в паренхиме яичка и в семиноме, соответственно.

Для того, чтобы исследовать, зависит ли промоторная активность LTR, картированных поблизости от генов, от уровня экспрессии этих генов, мы провели серию ОТ-ПЦР экспериментов, в которых была измерена транскрипция 16 генов, расположенных рядом со случайно выбранными представителями семейства HS. Ни в паренхиме, ни в семиноме, какой-либо выраженной корреляции между транскрипционными активностями генов и соседних LTR не наблюдалось.

Следует отметить, что частота встречаемости транскриптов варьировала ~ в 1000 раз (Рис. 2.3.4) среди различных индивидуальных представителей семейства HS: от крайне низкой и до уровня, сравнимого с генами домашнего хозяйства.

Высокий уровень промоторной активности некоторых LTR свидетельствует в пользу их возможной вовлечённости в регуляцию транскриптома хозяина.



Рисунок 2.3.4. Сравнение относительных уровней транскрипции некоторых генов человека и LTR. Относительные уровни транскрипции определяли при помощи ОТ-ПЦР, относительно уровня гена бета-актина (обозначен как 100%). A, паренхима яичка; Б, семинома.

Заключение. Впервые было проведено полногеномное сравнение in vivo-промоторной активности специфичных для генома человека эндогенных ретровирусов в нормальной и опухолевой тканях. Оказалось, что по крайней мере 50% HS элементов обладают промоторной активностью. Индивидуальные LTR экспрессировались на уровне от ~0.001 до ~3% относительно транскрипции гена бета-актина. Не наблюдалось связи между особенностями первичной структуры HS элементов и их транскрипционной активностью. И наоборот, функциональный статус LTR (одиночный, 5' или 3' провирусный) был одним из важнейших факторов: промоторные силы одиночных и 3' провирусных LTR были почти идентичны в обеих тканях, тогда как 5' провирусные LTR показали более сильную промоторную активность (вдвое и впятеро для паренхимы и семиномы, соответственно).

Это свидетельствует о наличии в провирусной последовательности некоторых пока не известных регуляторных элементов. Кроме того, важнейший фактор, влияющий на промоторную активность LTR - это расстояние от генов. Относительное содержание промоторно активных LTR в ген-богатых локусах значительно выше, чем в локусах, обеднённых генами.

Данные также свидетельствуют в пользу селективного подавления транскрипции 3' провирусных LTR, расположенных в интронах генов. Такая транскрипционная супрессия может быть нацелена на подавление активности провирусных генов, расположенных вблизи генов хозяина. Также в паренхиме яичка наблюдалось существенное понижение промоторной силы одиночных LTR в интронах генов. Это может свидетельствовать о существовании пока неустановленных механизмов подавления активности “лишних” промоторов, созданных мутациями или вирусными вставками, и расположенными вблизи генов или в интронах. Такой механизм может минимизировать деструктивный эффект «незапланированных» транскриптов - например, образование антисмысловых РНК. Многие транскрипционно компетентные LTR были картированы вблизи известных генов, и 86-90% этих генов транскрибируются в яичках. При этом не было выявлено никакой корреляции между уровнем транскрипции генов и соответствующих им LTR.

Таким образом, было проведено первое исчерпывающее качественное и количественное исследование промоторов человека, предоставленных небольшой группой эндогенных ретровирусов. Конечно, подавляющее большинство ретровирусных последовательностей, занимающих около 8% генома человека, ещё только предстоит исследовать. Но оптимизм внушает то, что разработанная методология вполне позволяет это сделать при наличии необходимых (достаточно скромных) временных и материальных ресурсов.

Детальные результаты картирования и анализа ELT, а также вся имеющаяся на сегодняшний день (31.12.2007) информация по структуре и функциональному статусу соответствующих HS LTR, содержатся в сводной таблице, доступной в Интернет по адресу: http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable1.xls

2.4 Антисмысловая регуляция экспрессии генов молекулами РНК, транскрибируемыми с промоторов человек-специфичных эндогенных ретровирусов

Возможно, что помимо промоторной и энхансорной активности, HS LTR могут принимать участие в регуляции генов антисмысловыми транскриптами. Исследованию такой возможности посвящена данная часть диссертационной работы. Работа проводилась Е.В.Гогвадзе (молекулярно-генетическая и генноинженерные части) и Е.А.Стукачёвой (клеточная часть работы) под непосредственным руководством диссертанта и при поддержке Е.Д.Свердлова.

На первом этапе работы были проанализированы все человек-специфические ретроэлементы HERV-K (HML-2) и для дальнейшего анализа были отобраны все LTR (13 индивидуальных ретроэлементов), расположенные в интронах известных генов человека в противоположной направлению транскрипции данного гена ориентации и удаленные от ближайшего экзона не более, чем на 5 т.п.н. (рис 2.4.1)



Для каждого из исследуемых локусов были дизайнированы праймеры на экзоны, фланкирующие LTR (Gfor и Grev, рис 22), а также праймер на 3'- и 5' - концевую часть LTR. Праймеры Gfor+Grev применяли для определения уровня транскрипции гена, а Gfor+LTRfor и Gfor+LTRfor2 - для определения уровня транскрипции LTR, расположенного в интроне анализируемого гена. В качестве матрицы для ПЦР использовали первые цепи кДНК, синтезированные с помощью олиго(dT)-праймера на суммарной РНК нормальной паренхимы яичка человека и герминогенной опухоли - семиномы.

Методом ОТ-ПЦР с праймерами Gfor+Grev и Gfor+LTRfor был определен уровень транскрипции исследуемых генов, а также уровень транскрипции LTR, находящегося в интроне (таблица 2.4.1). В результате было отобрано 9 LTR, для которых было показано, что они транскрибируются в исследуемых тканях.

Таблица 2.4.1. Результаты ОТ-ПЦР анализа транскрипционной активности LTR и генов, в интроне которых они располагаются*.

*Цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт; «-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека

Код доступа в геномных базах данных	LTRfor+Gfor	Gfor+Grev
	Паренхима	Семинома	Паренхима	Семинома
BC001407	-	37	36	36
AC023201	33	39	35	34
AL352982	34-35	34-35	34	31
AC027750	36	36	31	30
AC074117	31	31	36	33
AC011468	39	-	35	36
AC008648	36	36	34-35	34-35
AC006432	34-35	34-35	38	38
AC002400	-	-	34	33
AC007390	36	-	36	33

Однако для того, чтобы понять, действительно ли транскрипция начинается внутри LTR, необходимо было найти 5'-конец образующейся РНК. Для этого был применен метод 5'- RACE (Rapid Amplification of cDNA ends). Схема метода и полученные результаты представлены на рисунке 2.4.2. В качестве матрицы использовались первые цепи кДНК нормальной паренхимы яичка и семиномы, синтезированные с использованием cap-switch эффекта.



Рис 23. Поиск точки начала транскрипции внутри изучаемых LTR.

(А) Схема метода 5'-RACE. В качестве матрицы используются первые цепи кДНК, синтезированные с использованием «cap-switch» эффекта. На первой стадии проводят ПЦР с супрессионным адаптером А1, внутренняя часть которого комплементарна олигонуклеотиду, использованному при синтезе кДНК, и праймером на известную последовательность гена (Gfor1) (в данном случае, на последовательность близлежащего к LTR экзона); положительный контроль проводят для проверки работы праймера на кДНК. Во втором раунде ПЦР используется супрессионный адаптер А2, внутренняя часть которого комплементарна внешней части праймера А1, и заглубленный праймер на экзон (Gfor2); отрицательный контроль проводится с использованием только праймера А2 для проверки качества работы супрессионных адаптеров.

(Б) Результаты 5'-RACE для LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC.

Для всех LTR, транскрибирующихся в нормальной паренхиме и семиноме, было проведено два раунда ПЦР с праймерами на 5'- адапторную последовательность кДНК и на ближайший к LTR экзон. В результате продукт был получен только в случае LTR, расположенного между 23 и 24 экзонами гена SLB (selective LIM binding factor, rat homolog; AC074117) и между 5 и 6 экзонами гена SLC (solute carrier family 4; AC027750). Эти продукты были отсеквенированы и оказалось, что точка начала транскрипции находится внутри LTR на границе R и U5 областей (826 нуклеотид консенсусной последовательности человек-специфического LTR), что совпадает с полученными нами ранее данными о точке начала транскрипции LTR семейства HERV-K. Таким образом, было показано, что из 13 человек-специфических LTR, расположенных в интронах известных генов в противоположной направлению транскрипции гена ориентации и удаленных от ближайшего экзона не более чем на 5 т.п.н., только 2 служат промоторами для транскриптов, перекрывающихся с экзонами клеточного гена. В дальнейшем проводился анализ только двух данных локусов.

Для более полной характеристики этих двух случаев был определен уровень транскрипции генов SLB и SLC, а также находящихся в них LTR для еще десяти тканей человека: скелетной мышцы, печени, сердца, легкого (нормы и опухоли), гиппокампа и эмбриональных тканей мозга (лобной доли, затылочной коры, базальных ядер и гипоталамуса) (таблица 2.4.2). Транскрипционная активность LTR, находящегося в интроне гена SLC, была показана только для нормальной паренхимы яичка, семиномы и эмбриональных затылочной коры, гипоталамуса и лобной доли. Причем во всех случаях уровень транскрипции LTR был ниже уровня транскрипции гена.

Транскрипт LTR, находящегося между 23 и 24 экзонами гена SLB, был найден во всех проанализированных тканях кроме нормальной ткани легкого. В большинстве случаев, как и для LTR в гене SLC, уровень транскрипции LTR оказался в 4-8 раз ниже уровня транскрипции гена (эмбриональные лобная доля и гипоталамус, печень, лёгкое (опухоль) и гиппокамп). В случае эмбриональных базальных ядер и затылочной коры LTR и ген транскрибируются на одном уровне. Для скелетной мышцы, сердца, паренхимы яичка и семиномы был показан более высокий уровень транскрипции LTR по сравнению с геном. Особого интереса заслуживает нормальная паренхима яичка, в которой LTR транскрибируется в 16 раз интенсивнее гена.

Для доказательства того, что во всех случаях мы имеем дело именно с транскриптами, комплементарными РНК гена, был проведен синтез первых цепей кДНК с праймером, избирательно связывающимся с антисмысловыми к гену РНК. После этого был поставлен ОТ-ПЦР с праймерами LTRfor и Gfor. Во всех случаях ПЦР-продукт получался на тех же циклах, как и при амплификации кДНК, синтезированной с oligo(dT)-праймером. Следовательно, найденные нами ранее транскрипты LTR действительно являются антисмысловыми к гену. А для доказательства того, что транскрипция антисмысловых РНК начинается внутри LTR, были поставлены ОТ-ПЦР с праймерами на 5'- конец LTR (LTRfor2) и на экзон анализируемого гена (Gfor). Как видно из таблицы 2.4.2, в большинстве случаев продукт не детектировался или же появлялся на значительно более поздних циклах, из чего следует, что промотором для антисмысловых транскриптов в этих случаях действительно служит 3'-конец LTR. Однако при анализе кДНК четырех тканей в случае гена SLB (гиппокамп и эмбриональные затылочная кора, гипоталамус и лобная доля) продукты ОТ-ПЦР с праймерами LTRfor2+Gfor и LTRfor+Gfor появлялись практически на одинаковых циклах. Можно предположить, что в этих тканях присутствует дополнительный промотор, расположенный в 5'-концевой части LTR или вышележащий относительно LTR и сонаправленый с ним.

Таблица 2.4.2. Результаты анализа уровня транскрипции генов SLB и SLC, а также LTR, расположенных в интронах этих генов*.

*Цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт;

«-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека.

ткань	SLB	SLC
	Gfor+ Grev	Gfor+ LTRfor	Gfor+ LTRfor2	Gfor+ Grev	Gfor+ LTRfor	Gfor+ LTRfor2
Паренхима	35	31	37	31	36	-
Семинома	32	31	39	30	36	-
эмбриональные базальные ядра	36	36	-	34	-	-
эмбриональная затылочная кора	32	33	33	30	32	35
эмбриональный гипоталамус	33	35	36	30	33	36
эмбриональная лобная доля	33	35	36	31	35	39
Печень	34	36	-	36	-	-
легкие (норма)	33	-	-	33	-	-
легкие (опухоль)	31	35	-	36	-	-
Сердце	34-35	33	-	-	-	-
Гиппокамп	33	36	36	28	-	-



ткань	LTRfor+ SLBrev1	LTRfor+ SLBrev2	LTRfor+ SLBrev3	LTRfor+ SLBrev4	LTRfor+ SLBrev5	LTRfor+ SLBrev6
легкие (опухоль)	35	35	37	-	-	-
печень	37	36	36	-	-	-
эмбр. базальные ядра	36	36	36	-	-	-
паренхима	32	33	33	33	33	33

ткань	LTRfor+ SLCrev1	LTRfor+ SLCrev2	LTRfor+ SLCrev3	LTRfor+ SLCrev4
эмбриональная затылочная кора	32	32	32	33
эмбриональный гипоталамус	36	36	36	36
паренхима	33	33	33	37

Рис 24. Схема расположения праймеров, использованных для определения 3'-конца транскриптов, начинающихся в LTR (A) и результаты серии ОТ-ПЦР для транскриптов LTR, находящихся в генах SLB (Б) и SLC (В). (цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт; «-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека)

После этого была предпринята попытка определить 3'-конец транскриптов, начинающихся

После этого была предпринята попытка определить 3'-конец транскриптов, начинающихся в LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC. Нам не удалось получить необходимые результаты с помощью метода 3'-RACE, поэтому мы решили провести ОТ-ПЦР с праймером на 3'-конец LTR и серией праймеров, постепенно удаляющихся от LTR (рис 24).

В результате серии ОТ-ПЦР было показано, что в случае гена SLB существует, по крайней мере, 2 типа транскриптов: один включает в себя только экзон 23 (транскрипт 1), а второй - экзоны 23 и 22 (транскрипт 2) (рис. 2.4.4). Интересно отметить, что «длинный» транскрипт был найден только в нормальной паренхиме яичка, для которой была показана значительно большая активность LTR по сравнению с геном. В случае гена SLC 3'-конец транскрипта найден не был, но было определено, что весь экзон 5 входит в его состав (транскрипт 3).

Рисунок 2.4.4. Схематическое изображение транскрипционно активных LTR в интронах генов SLB и SLC и типы транскриптов, образующихся с промотора LTR.

На следующем этапе работы необходимо было определить, могут ли найденные транскрипты оказывать влияние на экспрессию соответствующих клеточных генов. Для этого предполагалось получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие изучаемые транскрипты, и посмотреть, изменяется ли в этих клетках уровень транскрипции генов SLB и SLC.

Нами был проведен скрининг 8 клеточных линий человека и для дальнейшего анализа были отобраны линии Tera-1 и NGP127, для которых был показан наиболее высокий уровень транскрипции генов SLB и SLC.



Рисунок 2.4.5. Схематическое изображение плазмид, использованных для трансфекции клеточных линий NGP127 и Tera-1.

Фрагмент ДНК, соответствующий анализируемому транскрипту, был помещен в плазмиду pcDNA 3.1 Hygro- между промотором цитомегаловируса (PCMV) и сигналом полиаденилирования гена бычьего гормона роста (BGHpA). Стрелками внутри экзонов показано направление транскрипции генов SLB (плазмиды 1 и 2) и SLC (плазмида 3). В случае успешной интеграции плазмиды 1 в ДНК NGP127/Tera-1 получалась клеточная линия, стабильно экспрессирующая траскрипт 1 (см рис25); интеграция плазмиды 2 приводила к стабильной экспрессии транскрипта 2, а плазмиды 3 - к стабильной экспрессии транскрипта 3. Плазмида 4 - контрольная конструкция, не содержащая вставки. Трансформанты отбирались на среде с антибиотиком гигромицином.

На основе плазмиды pcDNA3.1 Hygro- были созданы три конструкции, каждая из которых содержала под контролем конститутивного цитомегаловирусного промотора (Pcmv) участок ДНК, соответствующий найденным в работе LTR-транскриптам (рис 26). Этими конструкциями были трансфицированы клетки Tera-1 и NGP127 и в результате получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие интересующие нас транскрипты. Для каждой клеточной линии было проведено четыре трансфекции: 3 опытные (плазмидами, содержащими вставку соответствующего транскрипта) и 1 контрольная (плазмидой без вставки).

Важно отметить, что клетки, трансфицированные плазмидами со вставкой, оказались значительно менее жизнеспособными, чем контрольные. Таким образом, можно сделать вывод о негативном влиянии анализируемых транскриптов на жизнеспособность или пролиферативную активность клеток. Для проверки данной гипотезы был проведен эксперимент, позволяющий количественно оценить процент выживших клеток после трансфекции каждым типом плазмид. Для этого клетки Tera1 были трансфицированы четырьмя плазмидами и после 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7 и 10 дней инкубации определялось количество живых клеток. Результаты данного опыта представлены на рисунке 2.4.6. Как видно из графика, количество живых клеток в случае трансфекций плазмидами 1 и 4 (контрольной плазмидой без вставки) практически совпадает, из чего можно сделать вывод, что экспрессия транскрипта 1 не оказывает значительного влияния на жизнеспособность клеток. Экспрессия транскриптов 2 и 3, напротив, каким-то образом нарушает жизнеспособность или пролиферативную активность клеток, поскольку трансфекция плазмидами 2 и 3 приводит к заметному снижению количества живых клеток. Тот факт, что нам всё же удалось получить линии, стабильно экспрессирующих транскрипты 2 и 3 для клеток Tera-1 и NGP127, скорее всего, объясняется интеграцией конструкций в данных линиях в неблагоприятное геномное окружение, в котором активность промотора PCMV снижена. Дозированная экспрессия транскриптов типа 2 и 3, видимо, не критична для жизнеспособности клеток.



	контроль (клетки без плазмиды)	плазмида1	плазмида2	плазмида3	плазмида4
день0	0.245±0.012	0.266±0.020	0.204±0.015	0.218±0.013	0.229±0.037
день1	0.236±0.023	0.317±0.022	0.284±0.021	0.26±0.035	0.367±0.025
день2	0.189±0.047	0.291±0.021	0.252±0.018	0.269±0.029	0.334±0.021
день3	0.148±0.016	0.368±0.02	0.305±0.035	0.264±0.034	0.354±0.041
день4	0.105±0.016	0.336±0.04	0.292±0.032	0.194±0.029	0.324±0.018
день5	0.1±0.03	0.356±0.035	0.217±0.043	0.244±0.035	0.332±0.07
день7	0.069±0.009	0.209±0.036	0.122±0.023	0.107±0.013	0.177±0.028
день10	0.076±0.013	0.084±0.023	0.072±0.018	0.059±0.008	0.072±0.016

Рисунок 2.4.6. Результаты определения количества живых клеток после трансфекции. Трансфицированные клетки были рассеяны на 10 96-луночных планшет. Через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7 и 10 дней в плашки добавлял MTT, избирательно окрашивающий живые клетки, после чего проводили спектрофотометрическое измерение при длине волны 540 нм. Для каждой точки проводилось 10-12 измерений. Среднее значение оптической плотности и стандартное отклонение указаны в таблице.

В результате опытов по трансфекции, мы получили 4 линии клеток NGP127 (NGP127-1 - клетки, стабильно экспрессирующие транскрипт 1, NGP127-2 - стабильно экспрессирующие транскрипт 2, NGP127-3 - стабильно экспрессирющие транскрипт 3 и NGP127-К - контрольные клетки, транфицированные плазмидой без вставки) и 4 линии клеток Tera-1 (Tera1-1 - стабильно экспрессирующие транскрипт 1, Tera1-2 - стабильно экспрессирующие транскрипт 2, Tera1-3 - стабильно экспрессирющие транскрипт 3 и Tera1-K (контрольные клетки, несущие плазмиду без вставки). Из всех клеточных линий была выделена РНК, методом ОТ-ПЦР показана эксперессия изучаемых LTR-транскриптов в полученных линиях клеток, после чего был проведен ОТ-ПЦР в реальном времени для определения уровня экспрессии генов SLB и SLC. Результаты ПЦР представлены в таблице 2.4.3.

В случае клеточной линии NGP не было выявлено статистически достоверного изменения уровня транскрипции генов SLB и SLC в опытных клетках по сравнению с контрольными. В данных клетках антисмысловые РНК, образованные с промотора LTR не регулируют транскрипцию соответствующих клеточных генов. Возможно, это связано с нарушением процессов РНК-интерференции в данной клеточной линии.

Несмотря на отсутствие влияния антисмысловых РНК на транскрипцию соответствующих генов, для клеток NGP127, также как и для Tera1, было отмечено снижение выживаемости опытных клеток по сравнению с контрольными.

В случае же линии Tera1 было показано уменьшение количества РНК SLB в клетках, экспрессирующих транскрипт 1 (транскрипт, включающий только экзон 23 гена SLB) в 2,6 раза по сравнению с контрольными клетками (Pvalue<0,01), для более длинного транскрипта типа 2, перекрывающегося уже с двумя экзонами - снижение соответствующей таргетной мРНК уже в 3,8 раза. Также наблюдалось снижение уровня мРНК гена SLC в клетках, экспрессирующих транскрипт 3 - в 2,9 раз.

Таблица 2.4.3. Уровень транскрипции генов SLB и SLC в линиях клеток Tera1, стабильно экспрессирующих антисмысловые к гену транскрипты.

Клеточная линия	Уровень транскрипции генов SLB и SLC относительно в-актина, % х10-2
Tera1 (SLС РНК)
Tera1-3	1,31±0.37
Tera1-К	3,74±0.56
Tera1 (SLB РНК)
Tera1-1	2.21±0.24
Tera1-2	1,50±0.48
Tera1-К	5.75±1.39

Таким образом, можно сделать вывод, что антисмысловые РНК, образованные с промотора LTR, могут уменьшать уровень транскрипции соответствующего клеточного гена (как было показано для клеток Tera-1). Кроме того, они способны влиять на жизнеспособность клетки, не нарушая транскрипции комплементарной РНК (как в случае трансфицированных клеток NGP127). На основании проведенного нами биоинформатического анализа транскриптов, образованных с промотора LTR, можно предположить несколько способов их влияния на клетку:

- связываясь с комплементарной РНК, они могут не приводить к её деградации, но нарушать трансляцию соответствующего белка;

- образовавшиеся РНК могут сами служить матрицей для синтеза коротких пептидов, токсичных для клетки;

- образовавшиеся РНК могут быть предшественниками микроРНК, блокирующих трансляцию других клеточных генов.

В будущем планируется подробно рассмотреть и экспериментально проверить эти гипотезы.

3. Повышение специфичности гибридизации в растворе

Как уже упоминалось в литературном обзоре настоящей работы, специфичность гибридизации является камнем предкновения для многих методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе. Например, образование химерных гетерогибридов - это настоящий бич метода Клонирования совпадений, особенно, когда речь идёт о гибридизации сложных смесей нуклеиновых кислот. В этой части речь идёт о разработанном нашей группой подходе, основанном скорее даже не на повышении специфичности гибридизации, а на устрожении требований к продуктам гибридизации, которые амплифицируются в ходе ПЦР на последующих стадиях.

Идея метода принадлежит диссертанту, основной объём экспериментальной работы был проведён Е.В.Гогвадзе, помощь в проведении экспериментов оказывала Т.В.Чалая, а за мудрые советы и общее руководство проектом коллектив особенно благодарен Е.Д.Свердлову.

3.1 Введение

Хорошо известный недостаток гибридизации сложных смесей ДНК - побочная гибридизация ДНК геномных повторов, присутствующих в сравниваемых образцах. В результате такого «неспецифического» отжига, итоговые клонотеки изобилуют химерными последовательностями, получившимися при гибридизации повторяющихся частей из неортологичных локусов (Рис. 3.1.1). Такие химеры абсолютно бесполезны при анализе клонотек и даже вредны, поскольку для того, чтобы понять, является ли последовательность химерой или же целевым продуктом гибридизации, приходится проводить достаточно трудоёмкий анализ каждой последовательности поотдельности. Химеры в среднем могут занимать 40-60% библиотек ДНК. Хотя ситуация может быть несколько улучшена при добавлении к гибридизационной смеси конкурирующей фракции геномной ДНК, обогащённой последовательностями повторов, количество нежелательных химерных клонов в библиотеках всё же остаётся высоким (см. ниже). Для того, чтобы улучшить создавшуюся ситуацию, нашей группой был разработан метод, названный Mispaired DNA Rejection (MDR), позволяющий свести к минимуму содержание химер в конечных библиотеках. Метод основан на том, что подавляющее большинство взаимно-отжигающихся геномных повторов, хотя и содержат значительную гомологию нуклеотидной последовательности, но всё же не полностью идентичны друг другу. Поэтому их ДНК-дуплексы не являются совершенными и содержат протяжённые или же короткие участки неспаренных нуклеотидов. Это могут быть как одиночные нуклеотиды, так и значительные по длине выпетливания. Все такие структурные отклонения от нормы, то есть совершенных ДНК-дуплексов, могут узнаваться и расщепляться особыми нуклеазами, названными здесь мисмэтч-специфическими нуклеазами (МСН). МСН служат in vivo как участники репарации геномной ДНК или в ходе прохождения жизненного цикла вирусов. В настоящее время МСН широко применяются для поиска и детекции мутаций (детально рассмотрено в литературном обзоре). В настоящем разделе речь пойдёт об использовании МСН для селективного расщепления химерных дуплексов в гибридизационных смесях, что позволяет снизить число побочных химерных клонов с 44-60 до 0-4%.



Рисунок 3.1.1. Образование химерных клонов в гибридизационных библиотеках.

3.2 Метод MDR: селективная деградация неправильно спаренных гетеродуплексов

Для тестирования эффективности MDR была разработана тест-система (Рис. 3.2.1), включающая (1) расщепление геномной ДНК частощепящей рестриктазой, (2) лигирование различных олигонуклеотидных супрессионных адапторов, (3) денатурацию-гибридизацию двух порций ДНК, содержащих разные супрессионные адапторы, (4) заполнение концов дуплексов ДНК-полимеразой, (5) обработка МСН и (6) ПЦР-амплификацию (с использованием эффекта ПЦР супрессии, детально описан в литературном обзоре) тех гетеродуплексов, которые не были расщеплены на предыдущей стадии.

Nested ПЦР с праймерами A2 и B2 повышает специфичность процедуры так, что в результате амплифицируется исключительно ДНК гетеродуплексов. Контрольные эксперименты содержали все те же самые стадии, помимо этапа (5), то есть обработки гибридов нуклеазами.



Рисунок 3.2.1. Схема метода MDR, использованная для тестирования эффективности обработки гетерогибридов МСН.

Для того, чтобы исследовать эффект от применения конкурирующей фракции ДНК, обогащенной геномными повторами, на процесс гибридизации и на качество итоговых библиотек, в некоторых экспериментах на стадии гибридизации добавляли 100-кратный избыток быстро реассоциирующей фракции геномной ДНК человека CotA, сильно обогащённой геномными повторами. На стадии (5) использовались две МСН: нуклеаза Surveyor, расщепляющая неспаренные участки в составе гетеродуплексов, а также нуклеаза Mung Bean, расщепляющая участки одноцепочечной ДНК, и, следовательно, способная атаковать петлевые структуры в составе химерных гибридов. Эксперименты проводили на ДНК млекопитающих, поскольку они относятся к одним из наиболее сложных геномов эукариот и дают чрезвычайно сложные гибридизационные смеси, гораздо более сложные, чем, например, ампликоны кДНК. Поэтому, в случае успеха для геномных ДНК млекопитающих, можно быть уверенными в применимости метода для более простых смесей (кДНК или геномы меньшей сложности). Проводили шесть различных гибридизаций при следующих условиях: (H1), две порции геномной ДНК человека гибридизовали при 65°C (T65) без добавления фракции CotA (CotA-) и без расщепления МСН (N-); (H2), ДНК человека и шимпанзе гибридизовали при T65, CotA-, N-; (H3), ДНК человека, T65, CotA+, N-; (H4), ДНК человека, T85, CotA+, N-; (H5), ДНК человека и шимпанзе, T65, CotA-, с добавлением нуклеазы Surveyor; (H6), ДНК человека, T65, CotA+, с добавлением нуклеазы Mung bean.

Получившиеся библиотеки клонировали в E.coli, и из каждой из них отсеквенировали по 50 вставок (всего 300 последовательностей). Для определения химерных клонов мы использовали следующие критерии: вся последовательность целиком не должна иметь гомологов в геномных базах данных, а её 5'- и 3'- концевые фрагменты должны идеально соответствовать геномным последовательностям. На рисунке 3.2.2 приведены результаты анализа полученных шести библиотек. Видно, что добавление фракции CotA и повышение гибридизационной температуры с 65 до 85°C практически не оказывают никакого эффекта на количество химерных клонов, в отличие от действия МСН. Как Mung bean, так и Surveyor показали мощный анти-химерный эффект, выразившийся в снижении их количества с 44-60% до 0-4% клонов (!).

Многие отсеквенированные вставки содержали геномные повторы, что неудивительно, поскольку повторы занимают порядка 50% ДНК млекопитающих. Повторяющиеся последовательности со 100% идентичностью могут соответствовать нескольким геномным локусам в ДНК хозяина, что существенно осложняет задачу их картирования. Поэтому часто встаёт задача минимизации содержания последовательностей повторов в библиотеках. В наших экспериментах получилось, что доля повторов значительно различалась в разных библиотеках: CotA- библиотеки содержали много повторяющихся последовательностей независимо от добавления МСН (87-93% всех отсеквенированных клонов), CotA+/N- библиотеки--несколько меньшую долю повторов (76-78%), тогда как CotA+/N+ библиотека (H6, с добавлением нуклеазы Mung bean) содержала всего 44% вставок с повторяющейся ДНК. Результаты свидетельствуют, что наилучшие результаты могут быть получены при конструировании библиотек с одновременным использованием МСН и конкурентных фракций вроде CotA.



Рисунок 3.2.2. Сравнение шести библиотек ДНК, полученных при разных условиях гибридизации без и с использованием МСН. H1, гибридизация ДНК человек-человек, 65°C (T65), без конкурентной фракции CotA (CotA-), без добавления МСН (N-);

H2, ДНК человек-шимпанзе, T65, CotA-, N-; H3, ДНК человек-человек, T65, CotA добавлена (CotA+), N-; H4, ДНК человек-человек, T85, CotA+, N-; H5, ДНК человек-шимпанзе, T65, Cot A-, добавлена нуклеаза Surveyor; H6, ДНК человек-человек, T65, CotA+, добавлена нуклеаза Mung bean. (A) Высота цветных столбцов соответствует доле химерных клонов в полученных библиотеках. (Б) Высота столбцов соответствует доле клонов, содержащих последовательности геномных повторов.

3.3 Приложение MDR для поиска эволюционно консервативных последовательностей в геномах человека и обезьян

Нами было проведено исследование применимости метода MDR для межвидовой ДНК-гибридизации. Для этого, в двух гибридизационных экспериментах (H2 и H5) гибридизовались ДНК человека и шимпанзе. Геномы человека и шимпанзе являются наиболее близкородственными и показывают 98% идентичность нуклеотидной последовательности. Получилось, что использование MDR снизило количество химерных последовательностей с 44% практически до нуля. Все отсеквенированные вставки из библиотеки, обработанной нуклеазой Surveyor (H5), содержали последовательности, высоко консервативные для этих двух геномов (средняя идентичность 98.3%). Некоторые вставки содержали участки, эволюционно консервативные для всех отсеквенированных на тот момент (ноябрь 2004) геномов млекопитающих - человека, шимпанзе, мыши и крысы. Из этого следовало, что MDR можно применять для поиска эволюционно консервативных последовательностей в различных геномах. Для исследования этого предположения, мы провели ещё одну межвидовую гибридизацию (H7), между геномами человека и обезьяны Нового света мармозеткой Callithrix pygmaea, при 65°C, с обработкой нуклеазой Surveyor. Геном мармозетки гораздо сильнее дивергировал от генома человека, чем ДНК шимпанзе [предковые линии гоминид и обезьян Нового света разошлись около 45 миллионов лет назад], дивергенция в среднем составляет 20% последовательности ДНК. 71% вставок библиотеки содержал умеренно (14%) дивергировавшие повторяющиеся элементы, присутствующие как в геноме мармозетки, так и у человека. Оставшиеся 29% представляли уникальные последовательности.

Десять из них были консервативны среди геномов человека, шимпанзе, мыши и крысы, а три других были консервативны между ДНК человека и шимпанзе. Для того, чтобы подтвердить высокую степень консервативности этих последовательностей между человеком и мармозеткой экспериментально, была проведена ПЦР-амплификация и секвенирование соответствующих локусов для трёх таких последовательностей. Оказалось, что действительно все отсеквенированные локусы показывали высокую степень консервативности между геномами со средним значением межвидовой гомологии 95%, что говорит о примерно 4-кратном понижении средней скорости мутирования для этих локусов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные результаты убедительно свидетельствуют о том, что метод MDR может быть полезен для улучшения качества самых разных библиотек, получаемых при реассоциации ДНК, включая вычтенные или нормализованные геномные и кДНК-библиотеки. Хотя в наших экспериментах нуклеаза Surveyor оказалась незначительно более эффективной, чем Mung Bean, в других случаях последняя может быть также весьма полезна. В частности, обработка Mung Bean может помочь при гибридизации кДНК, когда образуется значительное количество несовершенных дуплексов при отжиге друг на друга в целом негомологичных последовательностей с похожими нуклеотидными мотивами. Поэтому, для рутинного применения можно рекомендовать смесь обеих нуклеаз. Метод также может значительно упростить решение задачи экспериментального поиска эволюционно консервативных последовательностей в несеквенированных геномах. Указанные особенности позволяют надеяться на широкую применимость метода для нужд молекулярной генетики.

4. Материалы и методы

4.1 Образцы геномной ДНК

Образцы геномной ДНК, использованные в ходе данной работы, были получены из 20 индивидуальных образцов плаценты человека, 18 проб крови человека, а также проб крови человекообразных обезьян, с использованием реактивов Genomic DNA Purification Kit (Promega, США), либо были получены напрямую из Германского Центра Приматологии от проф. Герхарда Хунсманна (Gerhardt Hunsmann).

4.2 Олигонуклеотиды

Все использованные в данной работе олигонуклеотиды были синтезированы В. К. Потаповым и Н. В. Скапцовой (ЛСФГЧ ИБХ РАН) на ДНК синтезаторе ASM-102U DNA (Биосан, Новосибирск, Россия). Структуры олигонуклеотидов приведены в соответствующих опубликованных статьях или далее в тексте раздела.

4.3 Приготовление ДНК Трейсера и Драйвера для метода TGDA

Рестрикция геномной ДНК человека и шимпанзе, лигирование супрессионных адапторов и ПЦР-амплификация фланкирующих ретроэлементы областей генома была проведена в соответствии с протоколом, опубликованном в (283).

Структура использованных супрессионных адапторов: A1A2, 5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'; a1, 5'-ACCGCCCTCCG-3'; A1, 5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3'; A2, 5'-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'.

Структура LTR-специфичных праймеров, использованных для селективной амплификации: Т1, 5'-gggctgggggacggtcaggt-3'; T2, 5'- gacacagtaac(a/g)gtctgatctc-3'; T3, 5'- ccagcccgacacccgtaaa-3'.

Структура L1-специфичных праймеров, использованных для селективной амплификации: T1, 5'-TTAGTGGGTGCAGCGCACCAG-3'; T2, 5'-CATATGTAACTAACCTGCACAATGT-3'.

1 нг аликвоты ампликонов человека амплифицировались в соответствии с процедурой `step-out PCR' с двумя наборами праймеров: A (0.01 мM A1A2, 0.2 мM A2, 0.2 мM T2) или с набором B (0.01 мM A2T2, 0.2 мM A2, 0.2 мM A1), программа ПЦР: 15 циклов х (95oC -15'', 57oC - 10'', 72oC - 1`30''). Полученные образцы Трейсеров А и Б (по 150 нг в случае фланков как LTR, так и L1), а также образцы Драйвера (начальный ампликон ДНК шимпанзе, 3000 нг для фланков LTR и 4600 нг для фланков L1) обрабатывались нуклеазой ExoIII (Promega, США) по отдельности при 16oC в следующих условиях: фланки LTR, Трейсер А - 20 единиц ExoIII,10 минут (удаление 40 концевых нуклеотидов); Трейсер Б - 20 единиц, 12 минут (удаление 60 нуклеотидов); Драйвер, 400 единиц, 10 минут (удаление 40 нуклеотидов); фланки L1, Трейсер А - 20 единиц ExoIII,12 минут (удаление 60 концевых нуклеотидов); Трейсер Б - 20 единиц, 15 минут (удаление 80 нуклеотидов); Драйвер, 500 единиц, 12 минут (удаление 60 нуклеотидов).

В случае фланков LTR смешали по отдельности по 15 нг обработанных нуклеазой Трейсеров А и Б с 1500 нг обработанного Драйвера. В случае фланков L1 смешали отдельно по 12 нг обоих Трейсеров с 2300 нг Драйвера. Полученные образцы ДНК очистили дробной экстракцией фенолом и хлороформом, переосадили этанолом и растворили в 5 мкл (в первом случае) и в 1 мкл (во втором случае) гибридизационного буфера (0.5 M NaCl/50 mM Hepes, pH 8.3/0.2 mM EDTA).

4.4 Вычитающая гибридизация

Образцы Трейсер А/Драйвер и Трейсер Б/Драйвер смешали, денатурировали ДНК 10 минут при 95oC и гибридизовали 14 часов при 65oC. Конечную гибридизационную смесь разбавили буфером pH 8.3, содержащим 50mM NaCl/5mM Hepes, 0.2mM EDTA. 1 мкл разбавленной смеси ПЦР-амплифицировали с 0.4 мM праймером A1 при условиях: 1) 72oC в течение 6 минут для заполнения концов образовавшихся ДНК; 2) (95oC -15'', 65oC - 10'', 72oC - 1`30''), х15 циклов.

4.5 Создание библиотек и дифференциальный скрининг фланков повторяющихся элементов

Продукты ВГ были клонированы в E. coli штамма DH5б с использованием набора реактивов “TA-cloning system” (Promega). По 480 индивидуальных клонов из библиотек фланков LTR и L1 были упорядочены в 96-луночные плашки.

Дифференциальный скрининг проводился только для библиотеки фланков LTR. ДНК вставок клонов упорядоченной библиотеки амплифицировали с праймером А1 и параллельно наносили на два набора нейлоновых мембран Hybond N (Amersham, США). Мембраны гибридизовали с ампликонами фланкирующих последовательностей человека и шимпанзе, радиоактивно помеченных 32P с использованием “Prime-a-Gene labeling system” (Promega) при 68oC в соответствии со стандартным протоколом.

4.6 Определение первичной структуры клонов

Определение последовательности ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора ДНК Applied Biosystems 373 automatic DNA sequencer либо при помощи Центра Коллективного Пользования «Геном».

4.7 Анализ последовательностей ДНК

Поиск гомологий в базах данных GenBank проводился с помощью сервера BLAST at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), картирование последовательностей в геноме человека и анализ генного окружения проводили, используя программное обеспечение UCSC Human Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/goldenPath/hgTracks.html). Поиск копий U6 мяРНК и псевдогенов 5S рРНК, 4,5S рРНК, различных тРНК, белков L7, L7A, L23A, L10, L31, L28, 7SK, 7SL, малых ядрышковых РНК Е1, Е2, Е3, малых РНК hY1, CYCLO, псевдогенов XBR, XTR, малых ядерных РНК U1, U2, U3, U4, U5 в геноме человека осуществляли с использованием сервера BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBLAT). Идентификацию геномных повторов в исследуемых последовательностях проводили при помощи программы RepeatMasker (http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker; A.F.A. Smit & P. Green, неопубликованные данные). Консенсусные последовательности повторяющихся элементов генома человека брали из базы данных RepBase Update (http://www.girinst.org/server/RepBase/). Выравнивание последовательностей проводили с помощью программ ClustalW (335) и ClustalWin (автор Т. Городенцева, ЛСФГЧ, ИБХ РАН). Филогенетический анализ и построение деревьев автор осуществлял с использованием программ Vector NTI, DnaDist, DnaPars и Fitch пакета PHYLIP (336). Визуализация деревьев проводилась с помощью программы TreeView. Также автором использовалась программа GeneRunner для подбора необходимых праймеров.

4.8 ПЦР-анализ

Амплифицировали 40 нг матрицы, в качестве которой выступали геномные ДНК, с использованием уникальных геномных праймеров (концентрация 0,2 мкМ). Стандартными условиями проведения ПЦР являлись: ( 95oC - 15'', 60oC - 10'', 72oC - 1'30''), х 28 циклов, хотя в некоторых случаях температуру отжига праймеров подбирали индивидуально. Проведение ОТ-ПЦР анализа, в том числе и количественной ОТ-ПЦР, детально описывается нами в соответствующих публикациях (ссылки даются в каждом разделе).

4.9 Гибридизация с зондами на последовательности U6 мяРНК и L1

Зонд на последовательность U6 был получен в ходе геномной ПЦР с 0.2 мM U6-специфичными праймерами, прямым 5'_TGCTCGCTTCGGCAGC-3' и обратным 5'_AAAAATATGGAACGCTTCACG-3', матрица - 40 нг геномной ДНК плаценты человека, условия - (95oC - 15'', 65oC - 10'', 72oC - 20''), х 28 циклов.

Зонд на последовательность L1 получали при геномной ПЦР ДНК человека с 0.2 мM уникальными прямым 5'_GATTATCTAAATGACCTACTTGCAC-3' и обратным 5'_CCAGAAGAAGTATAGCATGTTCAC-3' геномными праймерами, фланкирующими 5'-укороченный элемент семейства L1PA2 длиной 1375 пн (код доступа в GenBank AC037430). Условия ПЦР - (95oC - 15'', 65oC - 10'', 72oC - 1'), х 28 циклов.

Зонды метили 32P с помощью реактивов `Prime-a-Gene labeling system' (Promega) и гибридизовали при 68oC по стандартному протоколу.

4.10 Образцы кДНК тканей человека

(плаценты, зрелой тератомы, семиномы, нормальной паренхимы яичка и двух лимфом) были любезно предоставлены Т. В. Виноградовой (ЛСФГЧ, ИБХ РАН) и проверены с использованием стандартных бета-актиновых праймеров.

4.11 Гибридизация ДНК для метода MDR

Растворяли 800 нг каждого из подготовленных гибридизуемых образцов ДНК в 8 µл 1x гибридизационного буфера, денатурировали образцы при 95°C в течение 10 минут, затем гибридизовали при 65°C или 85°C в течение 50 часов. Гибридизационную смесь разбавляли 80 µл буфера следующего состава: 50 mM NaCl, 5 mM HEPES, pH 8.3, 0.2 mM EDTA. В некоторых экспериментах, к гибридизационной смеси добавляли конкурентную фракцию ДНК CotA (Gibco BRL).

4.12 Заполнение концов гибридизованной ДНК

1 единица полимеразы AmpliTaq DNA polymerase использовалась для достройки концов 1 микрограмма гибридизованной ДНК, инкубация 20 минут при 72°C.

4.13 Обработка нуклеазами, чувствительными к неспаренным нуклеотидам

100 нг-аликвоты гибридизованной ДНК обрабатывали 1 µл нуклеазы Surveyor (Transgenomic, США) в 20 µл 1x буфера, поставленного производителем фермента, ночная инкубация при 42°C, или обработаны 0.1 ед. нуклеазы Mung bean (Promega) при 37°C в течение 15 мин. ДНК очищали смесью фенол-хлороформ и высаживали этиловым спиртом.

Использованные сокращения

РУССКИЙ РЕГИСТР

ВГ, вычитающая гибридизация

ИКП, инвертированные концевые повторы

кДНК, комплементарная ДНК

мРНК, матричная РНК

ОТ, обратная транскрипция

ОТ-ПЦР, reverse transcription polymerase chain reaction

ПААГ - полиакриламидный гель

ПДРФ, полиморфизм длин рестриктных фрагментов

ПЦР, полимеразная цепная реакция

ССП, эффект супрессии ПЦР

ЛАТИНСКИЙ РЕГИСТР

BAC, англ. bacterial artificial chromosome, искусственная бактериальная хромосома

CC, англ. coincidence cloning, метод клонирования совпадений

CHS, англ. covalently hybridized subtraction

DSN, англ. duplex-specific nuclease, дуплекс-специфичная нуклеаза

DSNP, англ. метод duplex-specific nuclease preference

EST, англ. expressed sequence tag

FRET, англ. fluorescence resonance energy transfer

GREM, англ. метод genomic repeat expression monitor

LTR, англ. long концевой repeat, длинный концевой повтор

MDR, метод mispaired DNA rejection

MOS, англ. метод mirror orientation selection

NGSCC, англ. метод non-methylated genomic sites coincidence cloning

ODD, метод упорядоченный дифференциальный дисплей

PEER, англ. метод primer extension enrichment reaction

RACE, англ. rapid amplification of cDNA ends, быстрая амплификация концов кДНК

RDA, англ. метод representative differences analysis, репрезентативный дифференциальный анализ

SAGE, англ. метод serial analysis of gene expression, серийный анализ генной экспрессии

SL, от англ. stem-loop, сковородоподобная структура, содержащая петлю и комплементарно спаренное основание («ручка» сковородки)

SNP, англ. single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм

SSCP, метод single-strand conformational polymorphism

SSH, англ. suppression subtractive hybridization, супрессионная вычитающая гибридизация

TGDA, метод targeted геномный difference analysis

TGDD, метод targeted genomic differential display

YAC, англ. yeast artificial chromosome, дрожжевая искусственная хромосома.

Общий список публикаций диссертанта

Исследовательские статьи:

1) E. Gogvadze, C. Barbisan, M.-H. Lebrun and A. Buzdin (2007) Tripartite chimeric pseudogene from the genome of rice blast fungus Magnaporthe grisea suggests double template jumps during long interspersed nuclear element (LINE) reverse transcription. BMC Genomics, 8(1):360

2) I. Kholodenko, R. Kholodenko, V. Sorokin, A. Tolmazova, O. Sazonova, A. Buzdin (2007) Anti-apoptotic effect of retinoic acid on retinal progenitor cells mediated by a protein kinase A-dependent mechanism. Cell Research, 17(2):151-62.

3) Buzdin A., Kovalskaya-Alexandrova E., Gogvadze E., Sverdlov E. (2006) At Least 50% of Human-Specific HERV-K (HML-2) Long Terminal Repeats Serve In Vivo as Active Promoters for Host nonrepetitive DNA Transcription. J Virol., 80(21):10752-62.

4) A. Buzdin, E. Kovalskaya-Alexandrova, E. Gogvadze, E. Sverdlov (2006) GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res., 34(9): e67.

5) I. V. Kholodenko, A. A. Buzdin, R. V. Kholodenko, J. A. Bibikova, V. F. Sorokin, V. N. Yarygin, and E. D. Sverdlov (2006) Mouse retinal progenitor cell (RPC) cocultivation with retinal pigment epithelial cell culture affects features of RPC differentiation. Biochemistry (Moscow) 71(7):767-74.

6) Kovalskaya, E., Buzdin, A., Gogvadze, E., Vinogradova, T., Sverdlov, E.D. (2006) Functional human endogenous retroviral LTR transcription start sites are located between the R and U5 regions. Virology, Mar 15; 346(2):373-378.

7) Gogvadze, E., Buzdin, A., Sverdlov, E. (2005) Multiple template switches during LINE directed reverse transcription is a general mechanism of the chimeric retroelement formation in mammals. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 31(1):82-89