В отличие от классических молекулярных беконов, которые детектируют лишь нуклеиновые кислоты, каталитические молекулярные беконы могут применяться для детекции более широкого спектра анализируемых веществ.

В частности, методы, нацеленные на детекцию ионов металлов (например, ионов двухвалентного свинца (169)) основаны на наблюдении, что практически все ДНКzymes, обладающие нуклеазной активностью при положении субстрата in trans, обладают сходной структурой, состоящей из каталитического кора ДНКzyme, фланкированного двумя субстрат-узнающими плечами. На основе типичного ДНКzyme, названного "8-17", удалось создать высокочувствительный и точный сенсор ионов Pb2+. Пара флуорофор-гаситель располагается пространственно близко, при этом флуорофор находится на 5'-конце субстрата, а гаситель - на 3'-конце фермента, и дополнительная молекула гасителя навешена на 3'-конец субстрата (дополнительная копия гасителя требуется для супрессии фоновой флуоресценции) (170). При этом фермент становится каталитически активен лишь в присутствии ионов свинца. Метод двойного гасителя позволяет получить сенсор, работающий при более широком спектре температур с высоким отношением сигнала к фону.

Если удастся создать структуру каталитического бекона, которая будет оптимизирована для быстрого оборота молекул субстрата, эта группа методов станет хорошей альтернативой методам детекции целевых последовательностей, основанным на ПЦР амплификации, или даже методам определения неорганических ионов. Однако же, на настоящий момент этот подход всё ещё находится на стадии развития и пока что далёк от рутинного применения.

Интересно, что молекулярные беконы могут быть доставлены непосредственно внутрь живой клетки либо при помощи обычных реагентов, применяемых для трансфекции, либо (более эффективно) при введении холестерольной группы на конец стебля шпильки бекона. Такой зонд, проникающий сквозь клеточную мембрану, может быть использован как превосходный биосенсор для мониторинга in-vivo в режиме реального времени экспрессии генов на уровне РНК и последующей судьбы клеточных транскриптов (130, 171).

3.3 Сковородоподобные ДНК-зонды для микрочиповой гибридизации

Не секрет, что точность детекции мутаций при помощи стандартной микрочиповой гибридизации с линейными зондами часто является неудовлетворительной (172), и требуются альтернативные подходы (рассмотрено в главе 6). Сковородоподобные ДНК-зонды, характеризующиеся повышенной точностью дискриминации неспаренных нуклеотидов, нашли своё применение для создания технологии ДНК-микрочипов с повышенной чувствительностью и точностью обнаружения однонуклеотидных замен. Имеющие форму шпильки зонды прикрепляют к поверхности твёрдого носителя (способ прикрепления - за последовательность петли или же за основание стебля шпильки - зависит от конкретной экспериментальной задачи) (124, 138, 173) (152, 174) (Рис. 5a). Зонды могут быть иммобилизованы, например, с помощью биотин-стрептавидиновой системы (138, 152, 174), или же ковалентно связаны с носителем при помощи различных химических агентов (124, 173, 175).

Иммобилизованные ДНК или ДНК-PNA (peptide nucleic acid) химерные беконы позволяют детектировать немеченые комплементарные последовательности в гибридизационной смеси (например, РНК, кДНК, или ПЦР ампликоны) (174, 176). SL ДНК зонды с обращённым в раствор основанием шпильки демонстрируют двукратное повышение скорости гибридизации и повышенную стабильность дуплекса зонд-целевая последовательность относительно линейных зондов (138). Также была предложена изящная методика, комбинирующая гибридизацию и энзиматическое лигирование SL ДНК зонда для детекции мутаций в одноцепочечных таргетных ДНК (Рис. 4.5) (124). Следует, однако, заметить, что технология микрочипов с использованием сковородоподобных ДНК зондов находится в стадии раннего развития.

Рисунок 3.5. Подход сопряжённых гибридизации и лигирования для детекции целевой последовательности с использованием нанесённых на микрочип молекулярных беконов.

3.4 Заключение

На настоящий момент, сковородоподобные ДНК зонды широко применяются для множества областей молекулярной биологии и биомедицины. Их преимуществами являются: (i) повышенная специфичность распознавания зонд-целевая последовательность и (ii) возможность проведения нескольких экспериментов в одной пробирке и мониторинга результатов в режиме реального времени.

Методы, сочетающие ДНК SL зонды с другими модулями (рибозимы и ДНКzymes, неорганические наночастицы, и др.) и новыми технологическими решениями (например, микрочипами, продвинутыми оптическими технологиями) в будущем, вероятно, будут широко применимы для исследовательских целей и для молекулярной диагностики. Наконец, стратегия молекулярных беконов, особенно в комбинации с технологией аптамеров, предоставляет новые возможности для исследования ДНК-белковых взаимодействий. Например, меченный с помощью FRET молекулярный бекон - аптамер может связываться со специфическим белковым биомаркером, platelet-derived growth factor (PDGF) (177). Такой сенсор может детектировать целевой белок начиная с концентрации 10 нг PDGF на микрограмм белка культуральной среды (177).

В целом, успех этой быстро эволюционирующей группы методов ежегодно находит отражение по крайней мере в 40 патентах и 50 статьях в реферируемых международных научных журналах.

4. Нормализация библиотек кДНК

Количество копий различных индивидуальных мРНК в транскриптоме клетки может различаться на несколько порядков. Это соотношение разных типов транскриптов сохраняется и в кДНК. Методы нормализации позволяют выравнивать представленность транскриптов в библиотеках. Нормализованные библиотеки кДНК используются для функционального скрининга кДНК и для поиска новых генов, транскрибируемых на относительно низком уровне. В этой главе рассмотрены методы нормализации, основанные на гибридизации ДНК или РНК.

4.1 Введение

Исследование пулов мРНК позволяет лучше понимать генетическую регуляцию многих биологических процессов. Современные методы позволяют находить дифференциальные мРНК, исследовать их пространственно-временную регуляцию в организме и, наконец, приближаться к пониманию функций закодированных в них белков. Масштабный анализ клеточной мРНК (транскриптома) стал чрезвычайно популярным в последнее десятилетие (Guigo et al. 2000).

В эукариотической клетке, мРНК составляет 1-5% от общей массы РНК, при этом количество экспрессирующихся генов варьирует от десятков до десятков тысяч. Кроме того, количество копий мРНК на тот или иной экспрессирующийся ген может различаться на несколько порядков. Как правило, 5-10 основных «генов домашнего хозяйства» дают ~20% от общей массы РНК, 500-2000 генов, транскрибируемых на промежуточном уровне, составляют 40-60% массы транскриптома, а 10000-20000 слабо транскрибируемых генов - 20-40% мРНК mass (Alberts et al. 1994).

Методы исследования мРНК, как правило, связаны с манипуляциями не с мРНК, а с комплементарной ДНК (кДНК). На настоящее время разработаны методы, позволяющие создавать репрезентативные библиотеки кДНК из крайне малых количеств тотальной РНК (0.1-1 мг).

К библиотекам кДНК, как правило, предъявляются следующие требования: они должны быть репрезентативными, то есть содержать копии всех или практически всех транскриптов, имеющихся в образце. В случае библиотек, полученных при помощи ПЦР, это требование ограничивает количество циклов. Обычно, для этих целей используют не более 25 циклов ПЦР; в противном случае, библиотеки получаются нерепрезентативными (Matz 2002).

Во-вторых, для многих целей требуется кДНК, обогащённая полноразмерными последовательностями. Например, секвенирование полноразмерной кДНК позволяет предсказывать полную аминокислотную последовательность соответствующего белка. Более того, функциональный скрининг библиотек целесообразно проводить именно для полноразмерных кДНК.

Наконец, часто бывает важно минимизировать искажение соотношения различных типов транскриптов в кДНК, так, чтобы оно как можно точнее соответствовало бы соотношению в исходной мРНК. И наоборот, для некоторых задач концентрации индивидуальных типов кДНК должны быть выравнены.

Методы, позволяющие уменьшить преобладание «мажорных» транскриптов и увеличить содержание «минорных» в библиотеках кДНК, называются методами нормализации кДНК. Библиотеки, в которых различия в концентрации мажорных и минорных генов меньше, чем таковые для исходных образцов мРНК или кДНК, называются нормализованными. В идеальном случае, в такой библиотеке концентрации всех транскриптов равны.

Нормализованные библиотеки кДНК, как правило, используются для поиска новых генов, транскрибируемых на низком уровне. Исходная частота встречаемости кДНК слабо транскрибируемого гена может быть менее 2Ч10-6, тогда как в идеально нормализованной библиотеке она будет выше ~ в 25 раз (Soares et al. 1994). Поэтому, так называемое «полное» секвенирование нормализованных библиотек (с 5-кратным клональным перекрытием) подразумевает секвенирование на порядок меньшего числа клонов по сравнению с обычной библиотекой кДНК. Уменьшается также и количество анализируемых клонов при функциональном скрининге библиотек кДНК.

4.1.2 Оценка эффективности нормализации

Для контроля за эффективностью нормализации, целесообразно проводить сравнение концентраций мажорных и минорных транскриптов в библиотеках до и после стадии нормализации. Для этого можно использовать количественную ПЦР в реальном времени или гибридизацию по Саузерну. Чем более эффективно прошла нормализация, тем меньше разница между содержанием транскриптов различных типов.

В качестве альтернативы можно проводить масштабное секвенирование клонированных библиотек кДНК с последующим анализом содержания присутствующих в них транскриптов. Каждый индивидуальный транскрипт будет представлен n копиями, где n - это положительное целое число. Полезно бывает графически отобразить соотношение между числом индивидуальных транскриптов (генов) и значениями n. Чем ближе получившаяся гистограмма к нормальному распределению по Пуассону, тем более эффективной следует признать нормализацию.

4.2 Основные подходы к нормализации библиотек кДНК

Первый подход основан на физическом выделении всех транскриптов в равных количествах из исходных библиотек кДНК. Теоретически, для этого можно использовать соответствующую денатурированную геномную ДНК, иммобилизованную на твёрдом носителе (Weissman 1987). Насыщающая гибридизация такого набора, дополненная последующим выделением связанной кДНК, приводит к созданию нормализованной библиотеки. Поскольку практически все гены представлены в геноме одной или несколькими копиями, то и количество загибридизовавшейся кДНК будет более-менее одинаковым для всех транскриптов. Впрочем, в такой системе невозможно исследовать минорные транскрипты, поскольку для них невозможно достичь концентраций, при которых гибридизация с иммобилизованной геномной ДНК действительно была бы насыщающей.

Второй подход основывается на последовательных денатурации-гибридизации двуцепочечных молекул кДНК или гетеродуплексов мРНК/ первая цепь кДНК. Для каждого отдельного транскрипта, скорость гибридизации будет пропорциональна квадрату его концентрации. Таким образом, чем выше исходная концентрация индивидуального типа кДНК, тем больше молекул реассоциируют (образуют дуплекс) за определённый отрезок времени. Тогда после стадии денатурации-реассоциации, библиотека кДНК будет состоять из двух типов молекул: (1) фракция двуцепочечной кДНК, и (2) фракция одноцепочечной кДНК, содержащая различные индивидуальные типы кДНК в существенно выровненных концентрациях (Young and Andersen 1985; Galau et al. 1977).

Для этой группы методов, критической стадией является последующее разделение вышеупомянутых фракций. Эффективное решение этой технически нетривиальной задачи было предложено лишь в последние годы (Zhulidov et al. 2004).

Для разделения фракций одно- и двуцепочечной кДНК, можно применять следующие подходы: физическое разделение (а), селективная амплификация (б), а также энзиматическая деградация пула двуцепочечной кДНК (в).

(а) Физическое разделения осуществляют с помощью колоночной хроматографии на гидроксиапатитовом сорбенте (Ko 1990; Soares et al. 1994), при иммобилизации первых цепей кДНК на гранулах твёрдофазного носителя (Sasaki et al. 1994; Tanaka et al. 1996), или же с помощью биотинилирования исходной РНК (Carninci et al. 2000). Эти методы обладают тремя общими недостатками: они трудоёмки, требуют больших количеств исходного материала и слабо воспроизводимы.

(б) Селективная амплификация нормализованной кДНК основана на эффекте супрессии ПЦР ((Lukyanov et al. 1996); см. Главу 2). Такой подход применим лишь для библиотек фрагментированных кДНК и нерационален при функциональном скрининге библиотек.

Способ энзиматической деградации двуцепочечной фракции (в), по-видимому, является наиболее прогрессивным. Фермент (или смесь соответствующих ферментов) гидролизует двуцепочечную фракцию кДНК, оставляя одноцепочечную кДНК интактной. Фермент должен быть активен при высокой температуре (60-70°C), что позволит при его использовании минимизировать фоновый гидролиз кДНК, связанный с образованием участков вторичной структуры в составе одноцепочечных молекул. Гидролиз при помощи смеси частощепящих (узнающих 4-нуклеотидный мотив в составе дуплкса ДНК) рестриктаз оказался низко эффективным (Coche and Dewez 1994). Недавно для этих целей был применён новый фермент - дуплекс-специфичная нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба (DSN) (Shagin et al. 2002). На настоящий момент, DSN-нормализация представляется предпочтительным подходом при создании нормализованных библиотек кДНК (Zhulidov et al. 2004). Этот метод рассматривается подробнее в следующем разделе главы.

4.2.1 Создание нормализованных библиотек, обогащённых полноразмерными кДНК, с использованием дуплекс-специфичной нуклеазы (ДСН-нормализиция)

Этот подход схематически изображён на рисунке 4.1. Метод включает в себя денатурацию и последующую реассоциацию двуцепочечной кДНК, фланкированной адапторными последовательностями. После этого гибридизационную смесь обрабатывают дуплекс-специфичной нуклеазой из гепатопанкреаса камчатского краба (DSN) для избирательной деградации двуцепочечных молекул, образовавшихся при гибридизации. Одноцепочечная фракция, содержащая транскрипты в относительно выровненных концентрациях, остаётся в растворе и подлежит дальнейшей ПЦР амплификации (Zhulidov et al. 2004; Zhulidov et al. 2005).

В ходе выравнивания используются стандартные условия реассоциации, разработанные для метода супрессионной вычитающей гибридизации ((Diatchenko et al. 1996); Глава 2). Рекомендовано использование формамидного буфера согласно Carninci и др. (Carninci et al. 2000), что позволяет предотвратить образование вторичных структур в составе одноцепочечной фракции кДНК.

Метод основан на избирательной деградации двуцепочечной фракции под действием DSN. DSN характеризуется сильным предпочтением к расщеплению дуплексов ДНК-ДНК и ДНК-РНК по сравнению с одноцепочечными ДНК и РНК, независимо от длины дуплекса. Фермент стабилен при широком диапазоне температур и демонстрирует оптимальные показатели активности при 55-65OC (Shagin et al. 2002), что позволяет использовать его при высоких температурах, препятствующих образованию нежелательных вторичных структур в составе одноцепочечной фракции.

Заключительная стадия DSN-нормализации - это ПЦР амплификация нормализованной одноцепочечной фракции. Для того, чтобы преодолеть хорошо известный эффект ПЦР селекции, благодаря которому предпочтительно амплифицируются более короткие фрагменты ДНК, используются два основных подхода. Во-первых, используются энзиматические системы для ПЦР амплификации длинных фрагментов, одинаково хорошо амплифицирующие длинные и короткие фрагменты (Barnes 1994), а во-вторых, средняя длина продуктов ПЦР частично регулируется эффектом супрессии ПЦР ((Shagin et al. 1999); Глава 2)

Адапторные последовательности вводятся на концы кДНК как описано ранее в Главе 2 (Zhu et al. 2001).

Рисунок 4.1. Схема DSN-нормализации. Чёрные линии показывают мажорные транскрипты, серые - минорные. Прямоугольниками обозначены адапторные последовательности.

5. Клонирование совпадений: эффективный метод экспериментального выделения общих последовательностей

Метод клонирования совпадений (англ. Coincidence cloning) (КС) нацелен на поиск фрагментов ДНК, общих для сравниваемых образцов. Сравниваться могут образцы кДНК, геномной ДНК, как клонированные, так и неклонированные. Метод основан на клонировании идентичных или почти идентичных последовательностей, принадлежащих различным пулам фрагментированной геномной ДНК или кДНК, при этом отбрасываются дифференциальные последовательности. Ранние версии метода КС были не очень эффективны. Наиболее серьёзным недостатком являлась низкая селективность метода, так что получающиеся библиотеки содержали большую долю последовательностей, уникальных для одного из сравниваемых образцов. Современная модификация КС позволяет преодолеть это препятствие при помощи эффекта селективной супрессии ПЦР. Следующей важной проблемой является “неспецифическая” гибридизация между неортологичными геномными повторами или короткими фрагментами сходной последовательности, что приводит к получению химерных клонов, занимающих значительную часть библиотеки (до 60%, когда речь идёт о сложных геномных смесях). Важным усовершенствованием техники стало использование нуклеаз, специфичных для неспаренных участков в дуплексах, для обработки гибридов. При этом расщепляются несовершенные дуплексы, тогда как правильные нехимерные гетеродуплексы оказываются наиболее широко представлены в итоговой смеси (до 96% и более).

5.1 Введение

В отличие от вычитающей гибридизации, нацеленной на поиск дифференциальных последовательностей, метод, названный “клонирование совпадений” (КС) был разработан для поиска фрагментов ДНК, общих для исследуемых образцов. Согласно Ребекке Девон и Энтони Бруксу, которые были среди ранних разработчиков метода, “понятие клонирование совпадений включает в себя множество разных методик, целью которых является выделение последовательыностей ДНК, встречающихся в двух исходных образцах. Это могут быть образцы геномной ДНК или кДНК. Если это геномная ДНК, то в итоге будет получена смесь, обогащённая полезными маркерными последовательностями, присутствующими в обоих источниках. Если это один образец геномной ДНК и один - кДНК, то в результате получится смесь, содержащая гены, принадлежащие данному геномному локусу ” (73).

Сравнив фрагменты геномной ДНК с фрагментами упорядоченных геномных библиотек (например, отдельных BAC, космид, а также их перекрывающихся контигов), можно отобрать и идентифицировать геномные фрагменты, принадлежащие данному локусу. Для этого необходимо специфично пометить оба типа сравниваемой фрагментированной ДНК (например, лигировать разные концевые адапторные олигонуклеотиды), смешать образцы, денатурировать и гибридизовать ДНК, а затем выделить фракцию дуплексов, имеющих обе специфичные метки (“гетерогибриды”, сформированные общими для сравниваемых образцов последовательностями). Эта последняя стадия является краеугольным камнем всей процедуры, поскольку эффективное выделение фракции правильных гибридных дуплексов является залогом создание КС библиотеки, действительно обогащённой общими последовательностями (Рис. 5.1).

Рисунок 5.1. Общая схема клонирования совпадений. Правильное выделение гетеродуплексов образец 1 - образец 2 является ключевой стадией всех методов, основанных на CC.

Существуют три основных подхода к дискриминации гомо- и гетерогибридов. Первый из них (англ. cloning selection) основан на фланкировании ДНК исходных образцов (образец А и образец Б) различными рестриктными сайтами (например, сайты могут быть введены в состав лигированных концевых адапторов). Обработка продуктов гибридизации соответствующими рестриктазами позволяет лигировать гетерогибриды в вектор, предварительно расщеплённый таким образом, чтобы содержать пару требуемых липких концов. Второй подход (физическое разделение) использует иммобилизацию одного из образцов ДНК на твёрдом носителе (например, ДНК образца А, прикреплённая к магнитным гранулам). После гибридидзации, прикреплённая фракция, содержащая одноцепочечные молекулы А, гомогибриды А, а также гетерогибриды А/Б, отделяется от жидкофазной фракции, содержащей все остальные типы молекул. Далее прикреплённая фракция амплифицируется в ходе ПЦР с праймерами, специфичными для линкеров, фланкирующих ДНК Б, что приводит к более-менее специфичной амплификации гетерогибридов А/Б. Третий способ основан на селекции гетерогибридов исключительно в ходе ПЦР. К ДНК A и Б лигируют различные олигонуклеотидные линкеры, проводят гибридизацию, и амплифицируют продукты с парами А- и Б- специфичных праймеров.

Ранние версии технологии КС были достаточно низкоэффективны и не получили широкого распространения. Наиболее серьёзным их недостатком была низкая селективность, приводящая к невысокому содержанию гетерогибридных клонов в библиотеках. Эту проблему удалось решить, когда Ажикина и соавторы впервые применили подход селективной супрессии ПЦР (Глава 2; (10)) для повышения эффективности КС (74-76).

Следующей проблемой стала “неспецифическая” гибридизация между не-ортологичными повторяющимися элементами или короткими последовательностями сходной структуры, что приводит к образованию впечатляющей фракции химерных клонов (до 60% при гибридизации сложных геномных смесей, таких, как геномная ДНК млекопитающих). Химерные клоны заметно осложняют анализ библиотек, поскольку (а) часто бывает сложно отличить химеры от «истинных» гибридов, особенно в случае анализа несеквенированных геномов и (б) требуется больший объём работ по секвенированию библиотек. Недовно в нашей работе (77) было предложено решение этой проблемы, основанное на обработке гибридов нуклеазами, специфично расщепляющими ДНК по позициям неспаренных нуклеотидов (как одиночных нуклеотидов, так и протяжённых петлевых районов). При этом расщепляются несовершенные дуплексы (в основном химеры), тогда как фракция совершенных дуплексов сильно обогащается в итоговой смеси (до 96% клонов и более).

Кроме того, при использовании метода КС следует принимать в расчет кинетические параметры гибридизации (см. Главы 1 и 7). При гибридизации сложных смесей ДНК, скорость реассоциации уникальных фрагментов будет крайне мала. В частности, при сложности смеси свыше 5x108 пн (соответствует геномам арабидопсиса и дрозофилы), кинетика гибридизации становится лимитирующим фактором реассоциации (45). Для улучшения параметров гибридизации можно использовать повышенное время гибридизации, более высокие концентрации ДНК, более длинные фрагменты ДНК в смеси, а также некоторые другие приёмы (подробнее рассмотрено в Главе 7).

Последней проблемой является крайне низкая скорость реассоциации уникальных фрагментов ДНК. Скорость реассоциации каждого фрагмента ДНК пропорциональна квадрату его концентрации; значит, геномные повторы, представленные ~10 (некоторые псевдогены), ~1000 (многие семейства эндогенных ретровирусов млекопитающих), или ~1000000 (ретротранспозоны человека Alu) копий, будут реассоциировать, соответственно, в 102 -, 106 - и 1012 раз быстрее, чем уникальные последовательности. Следует учесть, что ~99% реассоциация сложных смесей может потребовать годы (!), а при использовании разумных сроков гибридизации (~дни), появляется огромный фон повторяющихся последовательностей. В последнем случае, огромное большинство двуцепочечных молекул в растворе представлено повторами, тогда как уникальные последовательности, в основном, остаются в виде незагибридизовавшихся одноцепочечных молекул. Примечательно, что специфичный для приматов ретротранспозон Alu был открыт именно при клонировании совпадений в последовательностях нескольких сравниваемых геномов (178, 179). Итак, истинное содержание различных геномных последовательностей в библиотеках КС, как правило, искажается.

Ситуацию с перепредставленностью повторов можно частично разрешить при добавлении в гибридизационную смесь избытка конкурирующей фракции ДНК, обогащённой геномными повторами (180). Такие конкурирующие агенты являются, как правило, фракциями бысто реассоциирующей ДНК, очищенной от одноцепочечной ДНК на гидроксиапатитовых колонках. Эти фракции, например, ДНК человека “Cot A” и “Cot B” фирмы Gibco BRL (США), могут быть использованы для существенного снижения фона повторяющихся элементов в библиотеках КС. Для этого исходная ДНК, подлежащая гибридизации, фрагментируется, помечается (лигированием адапторных последовательностей, включением биотина или других сигнальных молекул), денатурируется и гибридизуется с избытком конкурентной ДНК, взятой в 100-1000-кратном весовом избытке.

Основная часть повторов при этом загибридизуется с конкурентной ДНК. На следующей стадии, важно отделить “правильные” гибриды (образованные фрагментами исходной ДНК) от дуплексов с конкурентной ДНК и одноцепочечной ДНК. Для этого можно использовать систему селективной ПЦР амплификации или биотин-стрептавидиновую систему. Наши эксперименты показали, что использование фракции Cot A в 100-кратном весовом избытке снижает количество клонов, содержащих геномные повторы, с ~93% до 76-78% библиотеки при гибридизации смеси геномной ДНК человека (77). Замечу, что повторяющиеся элементы занимают около двух третей геномной ДНК человека (49, 50).

Для оценки эффективности клонирования совпадений, используется показатель, называемый enrichment factor (фактор обогащения). Он рассчитывается как частное относительного весового содержания целевых последовательностей в итоговой смеси к их относительному весовому содержанию в наиболее сложном из исходных образцов ДНК (73).

5.2 Селекция гетеродуплексов на стадии клонирования

Метод основан на предварительном мечении образцов ДНК различными лигированными олигонуклеотидными адапторами, несущими разные рестриктные сайты. Например (Рис. 5.2), образец A помечен рестриктными сайтами NotI, а Б - HindIII. Образцы смешивают, денатурируют и гибридизуют. После достройки концов, смесь обрабатывают рестриктазами, и фрагменты, порезовшиеся по обоим сайтам, клонируют в плазмидный вектор с соответствующими липкими концами. Теоретически, при этом клонироваться в E. coli должны только гетерогибриды А и Б. При помощи данного подхода, можно достичь значений фактора обогащения порядка 10-20 (178). Впрочем, минусом метода является высокий уровень клонирования побочных продуктов, в основном гомогибридов А или Б, лигированных в неполностью расщеплённый вектор по одному рестриктному сайту, а также клонирование большого количества химерных дуплексов (73).

Рисунок 5.2. Вариант техники клонирования совпадений, основанный на селективном клонировании гетеродуплексов по уникальной комбинации концевых рестриктных сайтов, отличающейся от рестриктных сайтов в гомодуплексах.

5.3 Физическое разделение гибридных молекул

Чтобы улучшить разделение гибридов, один из образцов ДНК можно иммобилизовать на твёрдую подложку (например, ДНК A, связанная с нейлоновым фильтром или с магнитными гранулами через биотинилированный праймер).

Перед гибридизацией, фракция геномных повторов в обоих образцах может быть блокирована избытком фракции Cot А. После гибридизации (Рис. 5.3), иммобилизованная фракция (содержащая молекулы типа A и гетерогибриды A/Б) отделяется от растворимой фракции. Здесь крайне важно правильно подобрать условия гибридизации и отмывки. Твердофазная фракция подлежит ПЦР амплификации с праймерами, специфичными для адапторов Б, что приводит к предпочтительной амплификации гетерогибридов A/Б. По сравнению с предыдущим подходом, значение фактора обогащения сильно возрастает для этой группы методов (~1000) (181, 182), но остаётся недостаточным для воспроизводимого анализа редкопредставленных последовательностей (73). Несмотря на дальнейшее развитие этой группы методов (183), выделение фракции гетерогибридов остаётся нетривиальной задачей, a проблема образования химерных гибридов и вовсе не решается. Клонирование совпадений таким способом не стало популярным методом среди научного сообщества. Эффект ПЦР супрессии, описанный далее, существенно улучшил метод и сделал стадию селекции гетерогибридов простой, эффективной и быстрой.

Рисунок 5.3. Селекция гетеродуплексов, основанная на (1) иммобилизации ДНК A на твёрдом носителе (магнитные гранулы) и (2) ПЦР с использованием комбинации праймеров, специфичных для образцов А и Б.

5.4 Подходы, основанные на ПЦР

Подходы, основанные на эффекте супрессии ПЦР (СП), были недавно созданы в работах Ажикиной и коллег (74-76). СП позволяет амплифицировать целевые последовательности и при этом репрессирует амплификацию фоновых фрагментов (см. Главу 2) (184). ПЦР эффективно проходит лишь в случае, когда происходит эффективный отжиг как праймера на адапторную последовательность, так и целевого праймера.

Рисунок 5.4 представляет упрощённую модель использования метода клонирования совпадений для поиска эволюционно консервативных последовательностей, присутствующих в обоих сравниваемых геномах (77). Геномную ДНК человека и обезьяны Нового Света мармозетки Callithrix pigmaea фрагментируют частощепящей рестриктазой, к полученным фрагментам лигируют два различных набора супрессионных адапторов. Образцы смешивают, денатурируют и гибридизуют, а затем достраивают концы дуплексов ДНК полимеразой (Рис. 5.4). Затем смесь обрабатывают нуклеазами, специфичными к неспаренной ДНК, для расщепления химерных гибридов (представленных частичными дуплексами) (см. Главу 7). На следующей стадии, смесь амплифицируют в ходе ПЦР с праймерами, специфичными к последовательности супрессионных адапторов, что приводит к селективной амплификации гибридов ДНК человека и Callithrix pigmaea. В результате авторам удалось создать библиотеку, высоко обогащенную эволюционно консервативными последовательностями, общими для геномов человека и Callithrix pigmaea.

Рисунок 5.4. Принцип метода mispaired DNA rejection (MDR). Обычно в ходе ПЦР амплифицируются не только целевые совершенные дуплексы идентичных последовательностей, но также и значительное число фоновых химерных дуплексов, обычно представляющих собой продукты гибридизации по последовательностям геномных повторов. Добавление нуклеаз, чувствительных к несовершенным гибридам, позволяет селективно расщеплять фоновые химерные дуплексы, тем самым, обогащая библиотеку целевыми последовательностями.

Следующим успешным подходом, основанным на клонировании совпадений, стал метод, названный “Non-метилированная genomic sites coincidence cloning (NGSCC)”, который применяется для поиска последовательностей, принадлежащих интересующему геномному локусу и содержащих неметилированные динуклеотиды CpG. В этом случае, сложность гибридизационной смеси не столь высока, как при полногеномной гибридизации, и обработка нуклеазами, чувствительными к несовершенным дуплексам, не требуется. Методика основана на фрагментации исходной геномной ДНК метил-чувствительной рестриктазой (Рис. 5.5). Для дальнейшего упрощения сравниваемых образцов ДНК, они обрабатываются частощепящей рестриктазой, нечувствительной к метилированию, например AluI. В итоге, длины получившихся фрагментов оказываются в рамках оптимума для эффективной ПЦР амплификации, то есть менее 1.5 тпн. Затем к липким концам, образованным метил-чувствительным ферментом, и к тупым концам, созданным AluI, лигируют разные супрессионные адапторы. В ходе дальнейшей ПЦР избирательно амплифицируются лишь фрагменты, имеющие неметилированный динуклеотид CpG с одной стороны и рестриктный сайт AluI с другой стороны.

Получившийся ампликон гибридизуют с образцом ДНК интересующего геномного локуса (авторы исследовали профиль метилирования локуса D19S208-COX7A1 19 хромосомы человека длиной около 1 млн пар оснований), который предварительно фрагментируют и к которому лигируют третий тип супрессионных адапторов. В ходе дальнейшей ПЦР, амплифицируются лишь неметилированные CpG-содержащие фрагменты, относящиеся к геномному локусу D19S208-COX7A1. Секвенирование получившихся библиотек, созданных для нормальной и раковой ткани, позволило авторам впервые создать крупномасштабную полную карту ткане- и опухоль- специфичных участков метилирования протяжённого геномного локуса (75). Позднее, те же авторы предложили комбинацию метода NGSCC с серийным анализом генной экспрессии (англ. serial analysis of gene expression, SAGE). Эта новая техника получившая название “RIDGES”, гораздо более информативна, чем NGSCC, поскольку на выходе получают в 10-20 раз больше информации о неметилированных сайтах с одного отсеквенированного клона (74).

Рисунок 5.5. Метод NGSCC. (A) Селективная амплификация фрагментов Alu I-Hpa II/Hha I. Горизонтальными линиями обозначена геномная ДНК и ДНК космидных контигов. Сайты узнавания Alu I и Hpa II/Hha I обозначены буквами ``A и ``H '', соответственно. Супрессионные адапторы A и H изображены как белые прямоугольники в своей общей (внешней) части, и по-разному в своей внутренней части, различающейся для разных рестриктных сайтов. (Б) Клонирование совпадений с использованием селективной супрессии ПЦР. Фрагменты, уникальные для одного из образцов, обозначены пунктиром и прерывистой линией. Общие фрагменты обозначены непрерывной линией. Супрессионные адапторы B и C изображены в виде черных и белых прямоугольников.

Метод клонирования совпадений используется не только для анализа геномной ДНК. В частности, недавно опубликованная техника, названная genomic repeat expression monitor (GREM) использует клонирование совпадений пре-амплифицированных геномных участков, фланкирующих повторяющиеся элементы с 3' конца, и набора 5'-концевых фрагментов кДНК. В результате получают гибридную библиотеку геномная ДНК/кДНК, обогащенную транскрипционно-активными повторами. Это позволяет создавать исчерпывающие полногеномные карты геномных повторов, обладающих промоторной активностью (78, 185). GREM применяли для исследования активности длинных концевых повторов (LTR) эндогенных ретровирусов человека (19). Метод включает в себя три основных стадии (Рис. 5.6): (а) синтез полноразмерной библиотеки кДНК с 5' концом, помеченным специальным олигонуклеотидным адаптором, (б) селективная ПЦР амплификация геномных фланков повторяющихся элементов, и (в) гибридизация фланков геномных повторов с кДНК и последующая ПЦР амплификация гетеродуплексов геномная ДНК-кДНК.

Рисунок 5.6. Схема метода GREM. Метод включает три основные стадии: (1) полногеномная амплификация геномной ДНК, фланкирующей повторяющиеся элементы (здесь обозначены как HS LTR) с 3' конца. Обработка ампликона экзонуклеазой ExoIII продуцирует 5'-выступающие концы, нужные на третьей стадии. (2) Синтез библиотеки кДНК. кДНКs маркируется по позиции транскрипционного старта РНК адапторным олигонуклеотидом (CS) при помощи эффекта “cap-switch”. кДНКs расщепляется рестриктазой Alu I, не имеющей сайтов узнавания в составе HS LTR. Этот шаг предотвращает амплификацию последовательностей LTR, транскрибируемых насквозь с вышележащего экзогенного промотора. (3) Ампликон геномной ДНК (1) гибридизуют с 5'-помеченными кДНК (2). Выступающие концы ДНК заполняют ДНК полимеразой, а получающиеся гибриды (ELT) амплифицируют в ходе ПЦР с праймерами, специфичными к последовательностям фланкирующего адаптора и 5' концевого тага кДНК.

Полученные ампликоны клонируют и секвенируют. При этом каждый гетеродуплекс содержит 3' концевой фрагмент геномного повтора, фланкирующую ДНК и адапторную последовательность. GREM позволяет характеризовать промоторную активность как на качественном, так и на количественном уровне, поскольку число гетеродуплексов каждого типа линейно коррелирует с транскрипционной активностью соответствующих промоторов.

5.5 Краткое заключение

Использование эффекта ПЦР супрессии сделало клонирование совпадений предпочтительным методом для целого ряда экспериментальных задач, включающих нахождение общих последовательностей. Введение стадии обработки гибридизационной смеси нуклеазами, чувствительными к несовершенным дуплексам, существенно повышает достоверность CC, что особенно важно при анализе сложных смесей, например, геномных ДНК млекопитающих. То, что за один эксперимент сравнивают лишь два образца, кажется важным ограничением, но объединение нескольких образцов ДНК в два пула может являться частичным решением проблемы. Клонирование совпадений предоставляет преимущества при решении следующих задач: (1) поиск общих транскриптов в исследуемых образцах тканей (например, для поиска генов, ко-экспрессирующихся в опухолях), (2) для экспериментального картирования известных или неизвестных транскриптов на последовательности геномных контигов, (3) для полногеномной идентификации транскрипционно активных геномных повторов, для их картирования и количественной характеристики транскрипционной активности, (iv) для поиска метилированных или неметилированная динуклеотидов CpG на протяжённых участках геномов, и, наконец, (5) для быстрого поиска эволюционно консервативных последовательностей из сравниваемых геномов.

6. Гибридизация ДНК в растворе для детектирования мутаций

Эта группа методов нацелена прежде всего на поиск небольших (порядка единиц нуклеотидов) различий между сравниваемыми образцами ДНК. Детекция мутаций и полиморфизмов привлекает постоянно растущий интерес, прежде всего, благодаря связи с исследованием нормальных функций генов, белков, некодирующих РНК, причин развития наследственных заболеваний, а также различий в спектре индивидуального ответа на условия среды. Множество однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) не вредны сами по себе, но связаны с фенотипами, ассоциированными с болезнями или особенностями ответа на лекарственные препараты, что позволяет использовать их в популяционно-генетических и ассоциативных исследованиях. За последние годы были найдены миллионы SNP. Однако же, это количество ничтожно по сравнению с реальным числом SNP и других мутаций, присутствующим в геномах. Многие методы поиска мутаций быстро и эффективно показывают само наличие мутации в исследуемой области, но при этом не позволяют охарактеризовать ее и найти точную локализацию; другие подходы позволяют проводить точное картирование мутаций, но при этом гораздо более сложны в исполнении и ресурсоёмки. В этой главе будет рассмотрена группа новых подходов, комбинирующих высокую производительность, относительную дешевизну, надёжность и при этом детальную характеризацию мутаций.

6.1 Введение

В отличие от вычитающей гибридизации, которая нацелена на поиск относительно длинных дифференциальных фрагментов, эта группа методов создана для идентификация очень коротких, порядка единиц нуклеотидов, различий между сравниваемыми образцами ДНК. Детекция мутаций и полиморфизмов становится всё более важной задачей в области молекулярной генетики. Мутации вызывают генетическую вариабильность среди живых существ, в частности, врождённые болезни и предрасположенность к некоторым побочным эффектам лекарств. Изучение мутаций позволяет понять нормальные функции генов, белков, некодирующих РНК, причины многих болезней, а также многообразие физиологических ответов на условия среды. Множество мутаций не вредны сами по себе, но связаны с генотипами, ассоциированным с болезнями. Это подстёгивает крупномасштабные исследования по ассоциации полиморфизмов и популяционной генетике. Более того, общепризнанна важность SNP как важных диагностических маркёров для детекции опасных и лекарственно-устойчивых штаммов микроорганизмов.

На настоящий момент известны миллионы SNP, но это количество ничтожно в сравнинии с реальным их числом в человеческих популяциях. Поэтому, разработка методов детекции мутаций, подразумевающах возможность определять различия в структуре ДНК с точностью до нуклеотида, при этом недорогих и ~100% эффективных - это одна из основных задач сегодняшней молекулярной генетики. Идеальный метод позволял бы детектировать мутации в больших фрагментах ДНК, картировать их с точностью до нуклеотида, был бы чувствителен, точен и производителен. Этот идеал ещё не достигнут, и используется множество самых разнообразных методик, имеющих свои недостатки и преимущества.

Поиск мутаций наиболее часто проводится при помощи секвенирования по Сэнгеру, что часто считается чуть ли не единственно верным подходом. Действительно, огромная масса новых мутаций, в основном SNP, была недавно открыта при биоинформатическом анализе имеющегося материала по секвенированию геномов и транскриптомов.

Однако же, масштабное секвенирование не всегда доступно при анализе большого количества образцов, и требуются иные подходы. Возможно, в будущем всё заменит собой усовершенствованная форма пиросеквенирования (186, 187), но на настоящий момент используется множество других техник крупномасштабного сканирования мутаций. Все они основаны на том, что молекула ДНК, содержащая мутацию, в составе гетеродуплекса с ДНК дикого типа, содержит одно или несколько неспаренных оснований в позиции мутации (Рис. 6.1).

Рисунок 6.1. При гибридизации с ДНК дикого типа, мутантная ДНК образует гетеродуплекс с одним или более неспаренными основаниями. Именно эти неспаренные основания и «ловятся» большинством методов скрининга мутаций.

Таким образом, когда вместе гибридизуются мутантные и нормальные цепи ДНК, образуется два типа несовершенных дуплексов. Например, в случае замены T>C, в двух гетеродуплексах будут наблюдаться неспаренные варианты T- G и C-A. Детекция и правильное картирование таких неспаренных нуклеотидов и являются ключевым звеном поиска мутаций. Неспаренные нуклеотиды можно идентифицировать прямо или опосредованно с помощью разнообразных химических, энзиматических и физических подходов. Следует отметить, что определение новой мутации обязательно требует стадии секвенирования, по крайней мере для подтверждения полученных результатов. Но в этом случае направленно секвенируют небольшой участок ДНК, а не огромный локус, как в случае, когда мутации находят в ходе масштабных проектов по секвенированию. В результате, альтернативные методы позволяют уменьшить стоимость детекции мутации на один порядок величины и более. Ричард Коттон, один из ведущих учёных в этой области, пишет: “Изобретена куча таких методов, каждый из них имеет свои особенности… Все эти методы постоянно усовершенствуются своими создателями и пользователями, так что жизнь тех, кто озабочен поиском мутаций, потихоньку улучшается, хотя пока и не видно волшебного универсального метода, который бы решил все проблемы в ближайшем будущем” (188).

Большая часть таких методов детекции мутаций основаны на ПЦР и на образовании гетеродуплексов между ДНК дикого типа и мутантными цепями. Вкратце, химические подходы используют химическое расщепление или модификацию по позиции неспаренных нуклеотидов, Энзиматические основаны на энзиматическом узнавании неспаренного участка (с последующим связыванием, расщеплением, модификацией или лигированием ДНК по неспаренным позициям), а физические методы ищут различия между физическими свойствами совершенных и несовершенных дуплексов.

6.2 Химические методы

Химические подходы к детекции мутаций (см. обзоры Коттона (188) и Тэйлора (189)) основаны на химических модификациях неспаренных нуклеотидов с последующим расщеплением непосредственно по позиции модифицированных оснований. Метод химического расщепления, способный детектировать практически все неспаренные основания, был разработан в 1988 Коттоном и коллегами (190) и был впоследствии применён для диагностики многих наследственных заболеваний.

В настоящее время этот подход, изображенный на рисунке 6.2, включает ПЦР амплификацию интересующего геномного локуса либо участка кДНК, с матриц ДНК дикого типа и исследуемых образцов, которые могут содержать мутации (на рисунке - замена T>C). После смешения, денатурации и гибридизации фрагментов, они обрабатываются реагентами, модифицирующими неспаренные основания. В случае, рассмотренном на рисунке, модификации предпочтительно пройдут по позициям неспаренных нуклеотидов С и Т. Для модификации цитозиновых оснований используется гидроксиламин (NH2OH), а неспаренный Т раньше модифицировали тетроксидом осмия (OsO4), а сейчас для этого используют менее токсичный раствор перманганата калия (KMnO4) с добавлением хлорида этиламмония (191). Таким образом, если помечены все четыре цепи (присутствующие в составе двух гетеродуплексов), шансы детектировать мутацию удваиваются. Впрочем, приблизительно в трети случаев по позиции неспаренного участка T-G, основание Т является нереактивным, видимо, благодаря особенностям контекста окружающей последовательности (188). Модифицированная ДНК затем одновременно расщепляется пиперидином, очищается и анализируется либо в полиакриламидном геле, либо в ходе капиллярного электрофореза.

Рисунок 6.2. Метод химического расщепления для детекции мутаций. На изображённом примере, мутантный образец отличается от ДНК дикого типа единичной заменой T>C substitution. В отличие от энзиматических подходов, химическое расщепление позволяет проводить двойную детекцию этого типа мутаций, что сильно повышает чувствительность обнаружения.

Главное преимущество этого подхода - практически 100% эффективность детекции мутаций в исследуемой ДНК и возможность точной локализации мутации (Рис. 6.2) в случае, когда контрольная ДНК и образец дифференциально окрашены (например, с помощью флуоресцентных реагентов). Самые серьёзные недостатки - большое количество стадий и использование вредных для здоровья реактивов. Техника была значительно усовершенствована, когда стали осуществлять химическое расщепление на твёрдой подложке: сначала, используя биотинилированные праймеры, заякоривали ДНК на стрептавидиновых гранулах (192), а затем перешли на неспецифическое связывание ДНК с силиконовой подложкой (193). При работе с твердофазной ДНК сильно упрощаются многочисленные стадии отмывки. Вариант силиконовой подложки предпочтительнее, поскольку он дешевле и не ограничивает количество меченных цепей ДНК. Следующее усовершенствование метода - мультиплексность (192), когда ДНК нескольких анализируемых локусов наносится на одну и ту же дорожку геля или в тот же капилляр (при этом используя различные флуорофоры как метки).

Метод используется во многих лабораториях, и можно привести успешные примеры его использования. Например, в 2004 он был применён для поиска мутаций в гене онкосупрессора p53 в группе из 89 пациентов с раком груди, при этом обнаружили три ранее неизвестные мутации в белок-кодирующей последовательности (194).

Впрочем, метод химического расщепления гораздо менее популярен, чем подход, основанный на энзиматическом узнавании, видимо, из-за большей сложности и токсичности используемых реагентов. При этом по чувствительности и точности детекции мутаций, химическое расщепление оказывается гораздо более надёжным методом, чем энзиматический подход, согласно экспериментам Дибли и соавторов (195) характеризующийся относительно высоким фоном.

6.3 Энзиматические методы

Этот группа методов гораздо более разнообразна, чем техники химического расщепления несовершенных дуплексов. Энзиматические подходы можно разделить на три основные группы: (1) использующие нуклеазное расщепление неспаренных нуклеотидов в гетеродуплексах (196), (2) основанные на аллель-специфичной ПЦР и (3) использующие связывание неспаренных участков некоторыми белками. Первая группа методов используется чаще всего из-за своей относительной простоты, хорошей воспроизводимости результатов и возможности точной локализации неизвестных мутаций, если такие попадаются в исследуемых образцах.

6.3.1 Нуклеазное сканирование мутаций

Сейчас известно множество самых разнообразных нуклеаз, как в плане строения, так и в плане активности и субстратной специфичности. Некоторые из них уже нашли применение для нужд биомедицины, некоторые пока нет (например, недавно открытый фермент, расщепляющий ДНК тетраплексной структуры (197)). Нуклеазные методы поиска мутаций основаны на том, что некоторые нуклеазы могут связывать и избирательно гидролизовать двуцепочечную ДНК по положениям неспаренных нуклеотидов. В зависимости от используемых нуклеаз, эти техники можно подразделить на три группы: (1) использующие резольвазо-подобные эндонуклеазы, (2) основанные на действии рестриктаз и нуклеаз, специфичных к одноцепочечной ДНК или РНК, и (3) использующие искусственные нуклеазы.

6.3.1.1 Эндонуклеазы, подобные резольвазам

Резольвазы бактериофагов - T7 эндoнуклеаза I и T4 эндонуклеаза VII, способны гидролизовать двуцепочечную ДНК по положениям неспаренных нуклеотидов. В 1995, три различные группы исследователей одновременно опубликовали одну и ту же идею использования резольваз для обнаружения мутаций (198-200). Резольвазы - это важная группа ферментов, катализирующих разрешение разветвлённых предшественников при созревании фаговой геномной ДНК. Их действие нацелено на точки ветвления, перегибы и другие отклонения в структуре двуцепочечной ДНК. Ферменты наносят разрывы вблизи таких неканонических структур (199). Например, T4 конецoнуклеаза VII стала первым обнаруженным ферментом, способным разрешать крестообразные структуры Холлидея. Фермент режет в двух местах: с 3' от точки основания неканонической структуры, и по другой цепи - с отступом в 6 нуклеотидов (200).

В 1990 году Козак и Кемпер в модельных экспериментах с синтетическими олигонуклеотидами показали, что T4 эндонуклеаза VII режет также по позициям единичных неспаренных оснований (201). Позднее, Юил и соавторы показали, что такое расщепление сильно зависит от того, какие именно нуклеотиды неспарены: пары G-A и G-G узнаются хуже, чем другие пары неспаренных нуклеотидов (200). Однако же, как показано в работах Машал и др.. (198), использование комбинации T4 эндонуклеазы VII с T7 эндонуклеазой I позволяет эффективно расщеплять все возможные варианты, включая даже короткие, порядка нескольких нуклеотидов, петлевые участки. Расщепление T4 эндонуклеазой VII успешно использовали для обнаружения новых полиморфизмов, обусловленных вариабильным числом тандемных повторов (202). При этом может происходить также и фоновое расщепление (около 20% активности фермента), возможно, связанное с образованием динамических вторичных структур ДНК в растворе (203)). Специфичность фермента удалось увеличить на два порядка при применении оптимизированных условий реакции (204).