Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов
Потенциал и основные границы применения гибридизации нуклеиновых кислот. Использование сковородоподобных олигонуклеотидов как гибридизационных проб. Клонирование совпадений: эффективный метод экспериментального выделения общих последовательностей.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | диссертация |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 18.11.2018 |
| Размер файла | 4,3 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
В геноме человека представлено около 2,000 HERV-K(HML-2) и их одиночных LTR, поэтому можно подсчитать, насколько смесь, содержащая только 5'-фланкирующие LTR последовательности, упрощена относительно исходной рестрицированной смеси геномной ДНК, и каких значений обогащения по фланкам чс (человек-специфичных) LTR можно ожидать в ходе ВГ. Сложность анализируемой смеси (С) зависит от количества геномных повторов (в нашем случае 2,000) и от частоты встречаемости в геноме рестриктных сайтов выбранной для фрагментации ДНК эндонуклеазы (в нашем случае примерно 1 сайт на 256 нуклеотидов). Таким образом, сложность нашей смеси составляет C= 256 x 2000 ~5x105 , что в 6000 раз меньше сложности человеческого генома.
Это приводит к драматическому (3.6x107) возрастанию скорости гибридизации упрощённой ДНК в сравнении с исходной рестрицированной смесью геномной ДНК. Массовым концентрациям трейсера и драйвера, соответственно, 1.5 нг и 150 нг в 1l, которые были использованы в данной работе, соответствуют молярные концентрации индивидуальных фрагментов в смеси 5x10-12 для трейсера и 5x10-10 для драйвера. При значении R=106, можно ожидать 20-кратное обогащение после 14 часов гибридизации. Важно подчеркнуть, что в случае использования неупрощённой смеси рассчётное значение обогащения составляет пренебрежимо малую величину.
Для того, чтобы проверить, насколько эти теоретические данные согласуются с реальностью, мы нашли экспериментальное значение обогащения результирующей смеси по фланкам чсLTR: мы определяли концентрацию фланкирующей последовательности известного чсLTR из локуса 19q13.2 (258) в исходном трейсере и в смеси, полученной в ходе ВГ. При этом, если метод TGDA работает, должно было происходить обогащение смеси по этой последовательности.
Действительно, в случае использования матрицы смеси после вычитания, видимый чс ПЦР продукт появлялся на 4 цикла раньше, чем в случае использования исходного трейсера, что свидетельствует о 16-кратном обогащении вычтенной библиотеки фланками чсLTR. Это значение хорошо согласуется с теоретически ожидаемым (~20-кратное обогащение), что свидетельствует о том, что приведённое выше уравнение верно описывает происходящие при TGDA процессы и может быть успешно применено для прогнозирования эффективности использования метода.
Дальнейший анализ полученной библиотеки, обогащённой фланками чс LTR, включал в себя определение первичной структуры вставок в 55 случайно выбранных клонах и экспериментальную проверку специфичности для генома человека соответствующих LTR. Все вставки содержали ожидаемые фрагменты LTR, что свидетельствует о высокой специфичности селекции на первой стадии TGDA. Длины фланкирующих LTR областей варьировали от 49 до 385 нуклеотидов, средняя длина составляла 138 нуклеотидов. Для 46 из этих последовательностей в базах данных GenBank были найдены гомологичные протяжённые последовательности, содержащие полноразмерные LTR. 29 из 46 клонов содержали уникальные вставки, 10 клонов встретились дважды, одна последовательность была найдена в 3 клонах, ещё одна - в 4-х. В сумме были идентифицированы 36 независимых последовательностей. Мы проверяли специфичность внедрений соответствующих LTR или провирусов HERV-K с помощью ПЦР с матриц геномной ДНК человека и других высших приматов (см. Рис. 1.2.2).
Рисунок 1.2.2. Схема ПЦР-анализа LTR-содержащих локусов генома человека. (I) LTR-содержащий локус, (II) LTR- несодержащий локус. Буквы (А) и (Б) обозначают различные примеры такого ПЦР-анализа. Дорожки 1, 2: матрица - ДНК человека 3, 4: матрица - ДНК шимпанзе, 5: матрица - ДНК гориллы, 6, 7: матрица - ДНК орангутана.
Выводы о наличии или отсутствии одиночных LTR в соответствующих геномных локусах делали на основании результатов ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими исследуемое внедрение ретроэлемента. При этом ДНК, содержащая LTR в соответствующем локусе, должна давать продукт примерно на 970 пн длиннее, чем продукт, полученный с матрицы, не содержащей LTR.
В случае, когда сайт интеграции содержал полноразмерный провирус HERV-K(HML-2) (размером около 10 тпн), мы проводили три ПЦР-амплификации с геномными праймерами G1, G2, и с LTR-специфичными праймерами T1 и T3. Присутствие провируса в анализируемом сайте приводит к успешной ПЦР-амплификации с парами праймеров G1+T1 и G2+T3, но не G1+G2. И наоборот, полученные продукты амплификации с праймерами G1+G2, но не G1+T1 или G2+T3 обозначают отсутствие провируса в этом локусе (данные не представлены).
Подводя итоги, в 55 случайно отобранных клонах мы нашли 23 чс последовательности. Эти 23 последовательности были представлены 33 клонами, что свидетельствует о том, что чс последовательности занимают ~60% полученной библиотеки.
Кроме того, мы провели дифференциальную дот-блот гибридизацию ПЦР-амплифицированных вставок из 288 клонов с тотальными зондами на LTR-фланкирующие последовательности человека и шимпанзе. Результаты дифференциальной гибридизации представлены на Рис. 1.2.3. 150 клонов (52%) гибридизовались только с “человеческим” зондом, но не с зондом на фланки LTR шимпанзе, что хорошо согласуется с представленной выше оценкой 60%. Мы отсеквенировали вставки 6 случайно отобранных дифференциальных клонов, 4 из них являлись повторениями ранее охарактеризованных чс клонов из нашей библиотеки, а 2 новых вставки имели гомологичные последовательности в GenBank и были идентифицированы нами как чс при помощи геномных ПЦР со специфическими LTR-фланкирующими праймерами.
Рисунок 1.2.3. Пример дот-блот гибридизации клонов с зондами, полученными на LTR-фланкирующие участки человека и шимпанзе. Окружностью обведены клоны, содержащие фланки чс LTR, согласно данным ПЦР-анализа; квадратом обведены клоны, содержащие фланки LTR, присутствующих также в геноме шимпанзе.
Всего нами было найдено в библиотеке 25 чс LTR, 23 из них были идентифицированы впервые. Полученная с помощью TGDA библиотека содержала 60% клонов, несущих вставки, специфичные для генома человека. Экспериментально наблюдаемое значение обогащения по целевым последовательностям хорошо согласуется с теоретически ожидаемым (~16- и 20-кратное, соответственно).
По материалам работы была опубликована статья:
Buzdin, A., Khodosevich, K., Mamedov, I., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2002) A technique for genome-wide identification of differences in the interspersed repeats integrations between closely related genomes and its application to detection of human-specific integrations of HERV-K LTRs. Genomics, 79(3):413-422.
1.3 Метод Diffir: дифференциальная гибридизация фланков геномных повторов на фильтре
Метод, названный «Differences in the integration sites of low and medium copy number interspersed repeats technique » (DiffIR), был разработан для тех же целей, что и TGDA, и применён для того же объекта - семейства эндогенных ретровирусов человека HERV-K (HML-2), для поиска специфичных для генома человека интеграций этих ретроэлементов. Метод можно использовать для идентификации любых дифференциальных внедрений геномных повторов при сравнении близкородственных геномов. Принцип DiffIR - комбинирование селективной амплификации геномных фрагментов, фланкирующих исследуемую группу повторов, и дифференциальной гибридизации клонов полученных библиотек.
При этом стадия селективной амплификации, включающая в себя фрагментацию геномной ДНК частощепящей эндонуклеазой рестрикции (в данном случае AluI), лигирование супрессионных адапторов и nested ПЦР, абсолютно идентична первому этапу TGDA, поэтому подробно останавливаться на ней нет необходимости. Получающиеся ампликоны клонируют в плазмидный вектор и анализируют при помощи дифференциальной гибридизации (Рис. 1.3.1). Зондами для гибридизации служат те же ампликоны фланков геномных повторов, но полученные с использованием других супрессионных адапторов. Например, при поиске повторов, специфичных для генома человека, ДНК клонов, несущих вставки амплифицированных фланков повторов человека наносят на фильтр, а гибридизуют их с меченными ампликонами фланков человека и шимпанзе. Эти последние ампликоны получают с использованием других супрессионных адапторов - для того, чтобы одинаковые адапторные последовательности не вызывали «неспецифической» кросс-гибридизации клонов и зонда. Дифференциально гибридизующиеся клоны секвенируют и каким-либо независимым способом проверяют, действительно ли они уникальны для того или иного генома (например, при помощи локус-специфической ПЦР, как описано в прошлом разделе).
Рисунок 1.3.1. Схема метода DiffIR. Приложение метода включало в себя фрагментацию геномной ДНК человека и шимпанзе, лигирование супрессионных адапторов (стадия 1), селективную амплификацию, включающую nested ПЦР с праймерами, специфичными для повтора (Т1 и Т2 на рисунке), а также для адаптора (А1 и А2) - стадии 2, 3. Полученный ампликон клонируют в плазмидный вектор, клоны библиотеки переносят на фильтр и гибридизуют с меченными зондами, которые представляют собой аналогичным образом полученные ампликоны (но с использованием других супрессионных адапторов) из сравниваемых геномов (стадия 4). Дифференциальные клоны анализируют.
В модельном эксперименте искали уникальные для человека внедрения эндогенных ретровирусов HERV-K (HML-2). На фильтр наносили ампликон фланков человека и гибридизовали его с зондами на фланки человека и шимпанзе (рис. 1.3.2). Дифференциальные клоны секвенировали и анализировали.
При гибридизации сложность смеси была невысока: количество повторов данного типа в геноме человека оценивается как ~2000, и сложность составляла 250 (средний размер фрагментов, получаемых при рестрикции AluI) Ч 2000 = 5 Ч 105, что в среднем соответствует всего 10% сложности бактериального генома. Таким образом, кинетические параметры гибридизации благоприятствовали успеху. Для того, чтобы провести скрининг 95% из упомянутых 2000 последовательностей, необходимо проанализировать около 6000 клонов библиотеки, что представляется более чем посильной задачей для современного уровня техники геномных исследований. В ходе модельного эксперимента была проанализирована лишь небольшая часть библиотеки. При этом отсеквенировали 40 как дифференциальных, так и недифференциальных клонов. Все они содержали ожидаемые фрагменты адапторов и действительно являлись фланками эндогенных ретровирусов исследуемого семейства. Таким образом, эффективность селективной амплификации, как и в случае TGDA, близка к 100%.
Рисунок 1.3.2. Пример дифференциальной гибридизации с зондами на фланки ЭРВ человека и шимпанзе, меченными 32P. Справа приведены примеры локус-специфической ПЦР дифференциальных клонов (см. выше в тексте).
22 из отсеквенированных 40 клонов были дифференциальными и гибридизовались с зондами на фланки ЭРВ человека, но не шимпанзе. Локус-специфическая ПЦР показала, что 16 из этих 22 клонов действительно соответствовали человек-специфичным ЭРВ. Таким образом, специфичность дифференциальной гибридизации была оценена как 73%. Наличие ложно-дифференциальных клонов (6 из 22) может быть связано с появлением или исчезновением рестриктных сайтов в одном из сравниваемых геномов (для фрагментации геномной ДНК используются рестриктазы) и, соответственно, с артефактной недопредставленностью некоторых локусов в анализируемых ампликонах.
Очевидное преимущество метода - как и для TGDA, возможность анализа геномных повторов независимо от геномных баз данных.
По материалам работы была опубликована статья:
Mamedov, I., Batrak, A., Buzdin, A., Arzumanyan, E., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2002) Genome-wide comparison of differences in the integration sites of interspersed repeats between closely related genomes. Nucleic Acids Res., 30(14):e71.
1.4 Приложение методов TGDA и Diffir для молекулярной генетики человека
Если технические аспекты разработанных экспериментальных подходов были освещены выше, то в данном разделе будут рассмотрены приложения полученных таким образом данных для детального анализа чс ретроэлементов семейств L1 и HERV-K(HML-2). Работа выполнялась коллективом авторов, включавшим С. В. Устюгову, Е.В. Гогвадзе, К. В. Ходосевича, Ю. Б. Лебедева, Е.А. Ковальскую и А. А. Буздина, при деятельном участии акад. Е.Д.Свердлова. Автор диссертации делал экспериментальную работу и биоинформатический анализ данных, осуществлял непосредственное руководство продвижением исследований, а также выдвинул идею механизма образования химерных ретроэлементов. Химерные ретроэлементы грибов исследовались в сотрудничестве с Марк-Анри Лебраном и Кристель Барбизан из совместной лаборатории CNRS u фирмы Bayer (Лион, Франция).
1.4.1 Идентификация человек-специфичных инсерций эндогенных ретровирусов
Структурный анализ известных чс LTR. Проанализировав 23 последовательности человек-специфичных LTR, найденные нами, а также 18 чс LTR, найденные другими авторами (всего 41 последовательность), мы обратили внимание, что все они, за исключением одного LTR, обладают значительной структурной гомологией и формируют один кластер на филогенетическом древе. Значения внутригрупповой дивергенции варьировали от 0.1 до 3.5% со средним значением 2.3%. Один чс LTR (AC022567) сильно отличался от остальных 40 LTR (средняя дивергенция 6%) и поэтому не мог быть отнесён к той же группе. В соответствии с классификацией, опубликованной в (258), этот LTR принадлежит к группе II-T.
Основываясь на 40 последовательностях высоко гомологичных чс LTR, мы создали консенсусную последовательность (HS консенсус) для эволюционно молодого семейства HS (Рис. 1.4.1). Эта последовательность содержит 9 характеристических нуклеотидных позиций.
1 31 61
cons_HS TGTGGGGAAAAGCAAGAGAGATCAGATTGT TACTTGTTCTGTGTAGAAAGAAGTAGACAT AGGAGACTCCATTTTGTTATGTACTAAGAA
cons_HS-a .............................. .............................. ..............................
cons_HS-b .............................. .............................. ..................S...........
cons_II-N ****************************** ****************************** ******************************
cons_II-T .............................. .............................. ..............................
cons_II-V ............A................. .............................. ..............................
cons_II-B ****************************** ****************************** ******************************
cons_II-O ............A................. .............................. ..............................
91 121 151 +
cons_HS AAATTCTTCTGCCTTGAGATTCTGTTAATC TATAACCTTACCCCCAACCCCGTGCTCTCT GAAACRTGTGCTGTGTCAA-CTCAGAGTTR
cons_HS-a .............................. .............................. ...................-..........
cons_HS-b .............................. .............................. ...................-..........
cons_II-N **.....................A....C. ...G.......................... ...................A.....G...A
cons_II-T ....................K......... ...G.......................... ...................A.....G...A
cons_II-V ....................K......... ...G.......................... .................C.-.....G...A
cons_II-B **............................ ...G.......................... ...................-.....G...A
cons_II-O ....................G......... .G.....C...................C.. ..G................-.....G...A
181 211 241
cons_HS AATGGATTAAGGGCGGTGCAAGATGTGCTT TGTTAAACAGATGCTTGAAGGCAGCATGCT CCTTAAGAGTCATCACCACTCCCTAATCTC
cons_HS-a ....................R......... .............................. ..............................
cons_HS-b ....................A......... .............................. ..............................
cons_II-N .............TT......A........ .............................. ..............................
cons_II-T .............................. .............................. ..............................
cons_II-V ..............K............... .............................. ..............................
cons_II-B ..............T............... .............................. ..............................
cons_II-O ..............K.....R......... .............................. ..............................
271 + 301 331
cons_HS AAGTACCCAGGGACACAAA-AACTGCGGAA GGCCGCAGGGACCTCTGCCTAGGAAAGCCA GGTATTGTCCAAGGTTTCTCCCCATGTGAT
cons_HS-a ...................-.......... .............................. ..............................
cons_HS-b ...................-.......... .............................. ..............................
cons_II-N ...................-C......... .............................. ..............................
cons_II-T ...................-C......... .............................. ..............................
cons_II-V ...................-C......... .............................. ..........R...................
cons_II-B ...................-C......... .............................. ..............................
cons_II-O ...................AC......... .............................. ..............................
361 391 421
cons_HS AGTCTGAAATATGGCCTCGTGGGAAGGGAA AGACCTGACCRTCCCCCAGCCCGACACCCG TAAAGGGTCTGTGCTGAGGAGGATTAGTAA
cons_HS-a .............................. ..........G................... ..............................
cons_HS-b .............................. ..........R................... ..............................
cons_II-N ..................T........... ..........G................... .............................T
cons_II-T .............................. ..........G................... .............................T
cons_II-V .............................. ..........G................... .............................W
cons_II-B .............................. ..........G................... ..............................
cons_II-O .............................. ..........G................... ..............................
451 481 511
cons_HS AAGAGGAAGGAATGCCTCTTGCAGTTGAGA CAAGAGGAAGGCATCTGTCTCCTGCCTGTC CCTGGGCAATGGAATGTCTCGGTATAAAAC
cons_HS-a .............................. .............................. ..............................
cons_HS-b .............................. ..........................C... ..............................
cons_II-N ..........C................... ...........................A.. ....................C.........
cons_II-T ..........C................... .............................. ..............................
cons_II-V ..........C................... .............................. ..............................
cons_II-B ..........CC.--..-............ T........................T.... .......................G......
cons_II-O ............C................. .............................. .......................G......
+
541 + 571 601
cons_HS CCGATTGTATGCTCCATCTACTGAGATAGG GAAAAACCGCCTTAGGGCTGGAGGTGGGAC CTGCGGGCAGCAATACTGCTTTGTAAAGCA
cons_HS-a .............................. .............................. ..............................
cons_HS-b .............................. .............................. ..............................
cons_II-N .........C.T.................. .G..............C.........A... A.............................
cons_II-T .........C.T.................. .............................. A.............................
cons_II-V ...........T.................. .G............................ A.........................G...
cons_II-B ...........T.................. AG........................A... A...K...............Y.T...T...
cons_II-O ...........T.................. .G............................ A...................C.T...G...
631 661 + 691
cons_HS TTGAGATGTTTATGTGTATGCATATCTAAA AGCACAGCACTTAATCCTTTACATTGTCTA TGATGCAAAGACCTTTGTTCACGTGTTTGT
cons_HS-a .............................. .............................. ..............................
cons_HS-b .............................. .............................. ..............................
cons_II-N .............................. ............G..T.....TC....... .......G......................
cons_II-T .............................. ............R.........C....... ..............................
cons_II-V .......R...................... -..............T......C....S.R .......G..............S.....A.
cons_II-B ......................Y....... ...............T......C....... .......G....................A.
cons_II-O ............C......ATG........ -..............T......C....T.. .......G....................AC
721 + 751 + 781
cons_HS CTGCTGACCCTCTCCCCACAATTGTCTTGT GACCCTGACACATCCCCCTCTTCGAGAA-A CACCCACRRATGATCAATAAATACTAAGGG
cons_HS-a .............................. ............................-. .......AG.....................
cons_HS-b .............................. ............................-. .......G......................
cons_II-N T..................T.......... .....................CA.....-. ..............................
cons_II-T ...................T.......... .....................CG.....-. .......G......................
cons_II-V S........TY...T....T...A..Y.A. .....................C......-. ......AG......................
cons_II-B ..............T....T...A....A. ...................T.C......-. ......AGG.....................
cons_II-O .........T....T....T...A..C.A. .......C.............C......C. ......AT......................
811 841 871
cons_HS AACTCAGAGGCTGGCGGGATCCTCCATATG CTGAACGCTGGTTCCCCGGGTCCCCTTATT TCTTTCTCTATACTTTGTCTCTGTGTCTTT
cons_HS-a .............................. .............................. ..............................
cons_HS-b .............................. .............................. ..............................
cons_II-N ................A............. ................T..C********** ******************************
cons_II-T .............................. ....................C......... ..............................
cons_II-V ...........C.............R.... ....................********** ******************************
cons_II-B ...........C.............G.... .............................. ..............................
cons_II-O ...........C.............G.... ........C...C...T...C...T..T.. ............................C.
901 931 961 + 971
cons_HS TTCTTTTCCAAATCTCTCGTCCCACCTTAC GAGAAACACCCACAGGTGTGTAGGGGCAAC CCACCCCTACA
cons_HS-a .............................. .............................. ...........
cons_HS-b ......C.T..G........T......... ....................G......... ...........
cons_II-N ****************************** ****************************** ***********
cons_II-T ...........G........T......W.. ....................G......... ........T..
cons_II-V ........T..G......C.T......A.. ....................G......... ........T..
cons_II-B ****************************** ****************************** ***********
cons_II-O ...........G......A.T......A.. ....................G......... ........T..
Рисунок 1.4.1. Структурное выравнивание консенсусных последовательностей семейств LTR HS, HS-a, и HS-b с консенсусными последовательностями других относительно эволюционно молодых групп LTR HERV-K (HML-2). Диагностические позиции, специфичные для групп HS, затемнены и обозначены "+" (Позиции 176, 291, 553, 601, 683, 740, 772 и 969). Нуклеотидные замены, различающие группы HS-a и HS-b выделены жирным шрифтом и помечены стрелками. (*) обозначают отсутствие структурных данных. Для обозначения нуклеотидов была применена номенклатура IUPAC-IUB: R- A, G; Y- C, T; K- G, T; S- C, G; W- A, T.
Проведённый с помощью программы BLAST поиск выявил в геномных базах данных 273 полноразмерные (длиной ~970 пн) последовательности, от 100 дo 97% идентичные HS консенсусу. Мы выбрали этот диапозон идентичности, поскольку степень взаимной гомологии среди 40 LTR, использованных для создания консенсуса, варьировала от 99.8 дo 97.6% со средним значением 98.1%.
После того, как дублирующие друг друга контиги были отброшены, количество индивидуальных последовательностей LTR семейства HS составило 142 (Приведены в Табл. 1 раздела Supplementary Material на web сайте http://humgen.siobc.ras.ru). Единственный чс LTR из контига AC022567, который не мог быть отнесён к семейству HS (см. выше), не имел высокогомологичных (более 97%) последовательностей в геномных базах данных.
Для того, чтобы найти частоты встречаемости характеристических нуклеотидных позиций HS консенсуса во всех членах HS семейства, а также в LTR, не являющихся членами группы HS, мы сделали множественное выравнивание найденных в этой работе 142 HS и 89 известных не-HS LTR, опубликованных в статьях (258-263) (выравнивание помещено в разделе Supplementary Material на сайте http://humgen.siobc.ras.ru). Результаты чётко показывают, что 8 диагностических позиций консенсусной последовательности являются уникальными характеристиками семейства HS (Taбл. 1.4.1).
Таблица 1.4.1. Частота встречаемости диагностических нуклеотидных позиций консенсуса семейства HS в чс и не-чс LTR HERV-K (HML-2) .
a Диагностические нуклеотидные позиции консенсусной последовательности HS. Частоты встречаемости: б в известных 40 человек-специфичных LTR, в в 141 LTR семейства HS, г в 82 известных не человек-специфичных LTR HERV-K.
|
Д. П.a |
Ч. чсб, % |
Ч. HSв, % |
Ч. не чсг, % |
|
|
1. A (176) |
92 |
92 |
6 |
|
|
2. A (291) |
89 |
91 |
13 |
|
|
3. C (553) |
97 |
84 |
2 |
|
|
4. C (601) |
100 |
91 |
4 |
|
|
5. A (683) |
92 |
86 |
4 |
|
|
6. A (740) |
100 |
94 |
7 |
|
|
7. T (772) |
97 |
87 |
5 |
|
|
8. A (969) |
100 |
95 |
1 |
Разделение семейства HS на два подсемейства. Средняя внутригрупповая дивергенция LTR семейства HS, составляющая 2.3%, соответствует эволюционному возрасту группы в 8.7 миллионов лет, принимая значение скорости мутирования LTR 0.13% за миллион лет (264). Дальнейший анализ последовательностей представителей семейства HS позволил выделить в его составе два подсемейства, названные нами HS-a и HS-b, представленные, соответственно, 63% и 37% последовательностями LTR.
Подсемейство HS-a высоко гомологично консенсусной последовательности HS и характеризуется внутригрупповой дивергенцией 1.5%, что соответствует возрасту 5.8 миллионов лет. Все LTR семейства HS-a, для которых это известно, являются специфичными для генома человека.
Представители подсемейства HS-b несут 5 характеристических сцепленных однонуклеотидных замен в положениях 907, 909, 912, 921 и 950 консенсусной последовательности HS (см. Рис. 1.4.1).
Подсемейство HS-b эволюционно старше чем HS-a, для него значение внутригрупповой дивергенции составляет 2.6%, соответственно, возраст 10.3 миллиона лет. По крайней мере 3 члена подсемейства HS-b не являются человек-специфичными, а присутствуют также в геноме шимпанзе.
Интересно, что 86% всех провирусов HERV-K (HML-2), несущих HS LTR, обладают длинными концевыми повторами подсемейства HS-a, и только 14% провирусов содержат LTR HS-b. Следовательно, 13% из 89 представителей эволюционно более молодого подсемейства HS-a включено в состав провирусов, против всего 4% из членов более старой группы HS-b. Это может рассматриваться как пример временной инактивации эволюционно более старой группы эндогенных ретровирусов.
Эволюционная история семейства HS. Пик ретропозиционной активности этого семейства пришёлся на период после разделения предковых линий человека и шимпанзе, которое произошло, по разным оценкам, 4 - 6 миллионов лет назад. Примерно 90% представителей семейства HS специфичны для генома человека. Некоторые из них полиморфны в современной человеческой популяции (261, 263, 265), это свидетельствует о том, что члены HS семейства оставались транспозиционно активны вплоть до самого недавнего времени в эволюционной истории вида Homo sapiens, оставаясь, возможно, активными и поныне.
По всей вероятности, материнские последовательности HS семейства возникли в геноме общего предка линий гориллы, шимпанзе и человека около 10.7 миллионов лет назад, дав группу HS-b. Эта группа, оставаясь активной, 5.8 миллионов лет назад, то есть примерно во время расхождения предковых линий человека и шимпанзе, в свою очередь, дала начало более ретропозиционно активной группе HS-a, которая на настоящий момент составляет большую часть (63%) всего семейства HS. Интересно, что 5 сцепленных нуклеотидных замен, различающих группы HS-a и HS-b, лежат в регионе, ранее охарактеризованном как цис-негативный регулятор промоторной активности одного из LTR семейства HS-b (код доступа в GenBank L47334). Делеция 70 пар нуклеотидов из этого региона в 2 раза повысила промотерную активность соответствующего LTR (266). Более высокие темпы ретропозиции более эволюционно молодой группы HS-a могут являться следствием этих 5 мутаций в регионе негативного регулятора LTR.
Также интересно, что группа HS-b оставалась активной после расхождения линий предков человека и шимпанзе как в линии человека, так и в линии шимпанзе. Представители обеих групп HS-a и HS-b были ретропозиционно активны вплоть до относительно недавнего времени в эволюции человека. Это следует из трёх найденных на время проведения исследования примеров LTR, полиморфных в человеческой популяции: два представителя HS-a в составе провирусов HERV-K (HML-2) 113 (AY037928) и HERV-K (HML-2) 115 (AY037929) (251), и один одиночный LTR семейства HS-b (Z80898) (251).
Идентификация одного чс LTR, принадлежащего к семейству II-T, а не
HS (см. выше) свидетельствует о том, что по крайней мере три мастер-гена LTR HERV-K (HML-2), а именно HS-a, HS-b и II-T, были активны в эволюционной линии гоминид. Интеграции LTR вблизи генов или в даже в интронах генов могли существенно повлиять на их экспрессию. В свою очередь, изменения в экспрессии некоторых генов, особенно кодирующих регуляторные белки, могли повлиять на развитие эмбриона и, тем самым, принять участие в видообразовании человека.
Анализ чс LTR HERV-K (HML-2), картированных в интронах генов. С помощью сервера UCSC Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway), мы обнаружили 30 представителей семейства в интронах известных человеческих генов. Было установлено, что LTR в интронах генов имеют неслучайную ориентацию: в 29 из 30 генов LTR направлен в сторону, противоположную направлению транскрипции гена.
Это может быть объяснено тем, что внедрение LTR, обладающих сильным сигналом терминации транскрипции, в интроны генов в прямой ориентации вызывало бы преждевременную терминацию транскрипции этих генов, и, как следствие, приводило бы к их инактивации. Поэтому аллели, несущие в интронах LTR в прямой ориентации, должны были неизбежно отбрасываться в ходе эволюции генома человека. Сохранение аллеля, содержащего LTR в прямой ориентации в интроне flj20276 (см. Рис. 1.4.2), возможно, связано с инактивацией терминатора этого LTR. В некоторых генах внедрения чс LTR произошли в непосредственной близости от экзонов, что могло привести к плавному изменению экспрессии этих генов по механизму тканеспецифической антисмысловой регуляции (тканеспецефичность работы промотора и энхансера LTR HERV-K показана в работах (266-268)).
Рисунок 1.4.2. Схема расположения 10 человек-специфичных LTR в интронах генов. Жирными стрелками обозначено направление транскрипции генов, стрелками среднего размера - расположение HERV-K или их одиночных LTR.
Найденные в результате работы 134 специфичных для генома человека LTR HERV-K представлены в сводной таблице, доступной в Интернет по адресу http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable1.xls.
1.4.2 Идентификация человек-специфичных вставок ретроэлементов L1
Следующим объектом, для которого был применён метод TGDA, стало семейство ретротранспозонов L1, содержащее чс элементы, а также около 50 до сих пор активных представителей в геноме человека. Как и в случае HERV-K(HML-2), мы искали чс интеграции ретроэлементов. Работа проводилась в 2002-2003 годах, когда в базах данных не содержалось информации по геному шимпанзе, и единственным способом поиска чс элементов являлся экспериментальный анализ.
Поскольку подавляющее большинство L1 укорочено с 5' -конца, на первой стадии мы амплифицировали последовательности геномов человека (трейсер) и шимпанзе (драйвер), граничащие с 3'- концевыми районами L1(269).
Мы выбрали последовательность 3'-нетранслируемого участка (3'UTR) L1 как цель для подбора праймеров, направленных наружу от L1 (схема расположения праймеров представлена на Рис. 1.4.3), поскольку район 3'UTR L1 высоко вариабелен среди различных семейств L1 человека, будучи в то же время относительно консервативным для представителей молодых групп L1. Это делает возможным дискриминировать эволюционно молодые L1. Были подобраны праймеры на позиции 311-335 и 352-378 консенсусных последовательностей 3'UTR семейств L1Hs (оно же: L1PA1) и L1PA2 (270). Это позволило селективно амплифицировать 3'- фланкирующие участки L1 этих двух молодых семейств, некоторые представители которых в геноме человека известны как активные транспозоны.
Оценочное число членов этих двух семейств в ДНК человека составляет 17.600, или 3,4% всех человеческих L1 (270). Селективная амплификация фланкирующих их последовательностей позволяет получить смесь достаточно упрощённую для того, чтобы фрагменты реассоциировали за не слишком длительное для проведения эксперимента время. В этом исследовании при проведении ВГ использовались следующие условия: концентрация трейсера 1,9x10-12 M, концентрация драйвера 3,6x10-10 M, время реассоциации 14 часов. Согласно оценке, за это время должна пройти 99% реассоциация трейсера, а итогом должно стать 17-кратное обогащение ренатурировавших фрагментов трейсера фланками чс L1.
Продукты ВГ клонировали в E. coli, затем отсеквенировали последовательности вставок из 29 случайно отобранных клонов. Все вставки содержали ожидаемые фрагменты L1 семейств L1PA2 и L1Hs, что, как и в случае LTR HERV-K (HML-2), демонстрировало высокую селективность метода. Длины фланкирующих L1 последовательностей в составе клонов различались от 129 дo 621 нуклеотидов, со средней длиной 270 нуклеотидов. Поиск в GenBank позволил для 28 из этих фланков L1 обнаружить в базах данных гомологичные уникальные последовательности, в соответствующих локусах 9 из которых содержали полноразмерные L1 и 19 - 5'-укороченные.
Как и в случае LTR HERV-K(HML-2), с целью определения специфичности данных L1 для генома человека, проводился ПЦР-анализ (Рис. 1.4.3) со специфичными геномными праймерами (G1 и G2), фланкирующими интеграцию ретроэлемента, а также с праймером, специфичным для L1 (праймер T2).
Из 29 отобранных клонов видоспецифичность интеграции определили для 26 последовательностей, 24 из них были чс, а 2 клона содержались также в геноме шимпанзе. Это говорит о том, что чс последовательности содержатся приблизительно в 92% клонов библиотеки. Мы показали, что по крайней мере 3 последовательности L1 из 24 (13%) являются полиморфными в человеческой популяции. Три других клона из 29 не были охарактеризованы окончательно: не были получены продукты ПЦР с праймерами G1+G2, хотя результаты геномных ПЦР с парами праймеров G1+T2 свидетельствовали в пользу специфичности этих L1 для генома человека.
Для того, чтобы найти значение обогащения вычтенной библиотеки по чс последовательностям, мы определили значения обогащения библиотеки по последовательностям 4 фланков чс L1, найденных в этой работе (для этого использовались локусы 3q14 (AF496639), 15q21 (AF496640), 1p21 (AF496647) и 13q32 (AF496650)). Во всех случаях продукты ПЦР появлялись на 2 цикла раньше при использовании “вычтенной” матрицы, чем при использовании “невычтенной”, что свидетельствует о 4-кратном обогащении полученной библиотеки чс последовательностями.
Рисунок 1.4.3. (А) Схема анализируемого локуса Хq25 геномов человека и шимпанзе. На схеме представлены ожидаемые продукты ПЦР-амплификации, а также указано расположение указанных праймеров. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации с использованием праймеров Gfor/ Grev (Б), L1for/ Grev (В). Ч1, Ч2, матрица - ДНК человека; Ш1, Ш2, матрица - ДНК шимпанзе. По итогам ПЦР-анализа анализируемое внедрение L1 было признано специфичным для ДНК человека.
Это экспериментально полученное значение обогащения 4 существенно меньше рассчётного (17, см. выше), что, по-видимому, вызвано исходно высоким содержанием чс последовательностей в “невычтенном” трейсере. Действительно, ~92% клонов обогащённой библиотеки являются чс L1. Это обозначает, что примерно четверть исходной “невычтенной” библиотеки составляют чс L1.
Эти факты ((1) фракция ДНК, использованная для ВГ, содержала 3'-фланки приблизительно 17.600 L1, (2) обогащение вычтенной библиотеки чс последовательностями составило 4, (3) чс фланки L1 занимают примерно 92% клонов вычтенной библиотеки) позволили оценить суммарное количество чс интеграций L1 в ДНК человека как ~4000 (17600 x 1/4 x 0,92). Позднее, при прямом сравнении опубликованных последовательностей геномов человека и шимпанзе, эта оценка была скорректирована до ~1200 элементов (271).
Большинство найденных чс L1 (70%) являются 5'-укороченными транспозонами, что хорошо согласуется с данными, опубликованными Буассино и др. (272, 273) для представителей эволюционно молодой группы LINE человека L1-Ta (от англ. transcriptionnaly active), 34% которой составляют полноразмерные L1s против 66% укороченных. Такие значения гораздо выше, чем среднее содержание полноразмерных L1 в геноме человека (менее 1%) среди всего множества L1(269). Это свидетельствует в пользу того, что в ходе эволюции генома L1 подвергались направленным делециям, сходным с направленным удалением L1 из GC-богатых локусов генома, описанным в работе Овчинникова и др. (274). 17% L1 содержат инверсии и 26% (7 ретроэлементов) содержат трансдуцированные 3'-фланкирующие последовательности, вероятно захваченные при ретропозиции L1 (275, 276).
Все найденные в данной работе чс L1 принадлежали к группам L1PA2 и L1Hs. Лишь небольшая часть (26%) этих чс L1 принадлежала к группе Ta, которая известна как единственная транспозиционно активная в настоящее время группа L1. В этой работе нами было найдено внедрение L1, принадлежащего к группе L1PA2, которое является полиморфным в человеческой популяции. Следовательно, (i) по крайней мере два семейства L1 были активны в предковой линии человека после расхождения её с предковой линией шимпанзе и (ii) при поиске полиморфных интеграций L1 не следует ограничивать поиск группой L1 Ta.
Один чс L1 являлся представителем открытого в данной работе химерного семейства ретроэлементов U6-L1, детально описанного в следующем разделе.
1.4.3 Новое семейство химерных ретроэлементов эукариот
Пожалуй, наиболее неожиданным результатом анализа библиотеки чс внедрений L1 стало открытие нового семейства ретроэлементов, образованных при происходящей in vivo РНК-рекомбинации в ходе обратной транскрипции. Упомянутый механизм образования ретроэлементов впервые предложен коллективом авторов данной работы.
В ходе анализа полученной с помощью TGDA библиотеки чс L1-фланкирующих последовательностей, мы нашли один клон, соответствовавший внедрению ретроэлемента весьма необычной структуры, см. Рис. 1.4.4. Последовательность вставки была гомологична геномной ДНК человека хромосомного локуса 10p13 (код доступа в GenBank AL138764). Ретроэлемент представлял собой химеру полной копии U6 мя РНК с 3'-концевой частью L1. Последовательность ретротранскрипта была названа нами U6-L1 10p13. Её 5'-часть является полноразмерной последовательностью U6 мяРНК длиной 107 пн, 100% идентичная консенсусной последовательности человеческой U6 (взята из базы данных RepBase Update, http://www.girinst.org/server/RepBase/). Сразу за U6 следует 3'- концевая последовательность элемента L1 семейства L1Hs в прямой ориентации длиной 1324 пн. На своём 3'- конце эта последовательность несёт поли-А “хвост” длиной 40 пн. Химерный ретротранскрипт фланкирован прямыми повторами AAAAATGTTAAACCATGGGT длиной 20 пн.
Гексануклеотид TTAAAA, расположенный на 22 пн выше сайта интеграции U6-L1, идентичен последовательности T2A4, которую предпочтительно узнаёт эндонуклеаза L1 (L1-EN), инициирующая интеграцию L1 копий в соответствующие сайты генома (277, 278).
Рисунок 1.4.4. Схема строения химерного ретроэлемента U6-L1 из геномного локуса 10р13.
Предпринятый с помощью программы BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBLAT) поиск в геномных базах данных человека выявил 161 полноразмерную последовательность U6 мяРНК, от 85 дo 100% идентичную человеческой консенсусной последовательности U6.
105 из этих 161 последовательности представляли собой одиночные гены или псевдогены U6, из них 52% (55 последовательностей) фланкированы короткими (12-20 пн) прямыми повторами и несут поли-(А) на своих 3'-концах. Другие 56 (35%) последовательностей U6 являлись химерными ретротранскриптами, сходными с изображённым на Рис. 1.4.4. Все такие химеры U6-3'-L1 фланкированы прямыми повторами длиной 11-21 пн, что свидетельствует об интеграции химеры как единой последовательности. Как и у химеры U6-L1 10p13, все они имели рядом со своими 5'- концами либо гексануклеотид TTAAAA, либо его производные с однонуклеотидными заменами A/G либо T/C.
Перечисленные выше особенности сайтов интеграции химер свидетельствуют о том, что их внедрения в геном были произведены интеграционным аппаратом ретротранспозонов L1.
Далее встал вопрос, имеют ли все эти химеры U6-L1 общую предковую последовательность, либо же всякий раз они формировались заново, в ходе многих независимых событий. Существующие данные свидетельствуют в пользу второй гипотезы. Во-первых, структуры пограничных последовательностей на стыке U6- и L1- частей химер различаются во всех найденных химерах и, кроме того, L1-фрагменты разных элементов U6-L1 принадлежат к различным семействам L1, образованным разными мастер-генами.
Рисунок 1.4.5. Корреляция между дивергенциями U6 u L1 частей химерных ретроэлементов U6-L1 от соответствующих консенсусных последовательностей. Количество представителей ретротранскриптов каждого типа дано в скобках.
На Рис. 1.4.5 показана практически линейная корреляция между значениями дивергенции U6-фрагментов химер от консенсуса U6 и дивергенции L1-фрагментов химер от консенсуса соответствующей группы L1. Эти значения дивергенции отражают возраст соответствующих ретротранскриптов. Наиболее молодые и наименее дивергировавшие (различие с консенсусной последовательностью 0-2%) U6 элементы оказались объединены с представителями L1 молодых семейств - L1PA3, L1PA2 и L1Hs. Напротив, более (3_8%) дивергировавшие последовательности U6 соединены с членами более старых семейств L1 - L1PA4, L1PA5, L1PA6, L1PA7 и L1PA8.
Наконец, наиболее (8_15%) дивергировавшие и, значит, старейшие, U6- фрагменты химеризованы с членами старейших семейств L1 - L1PA10, L1PA13, L1PA14, L1MB, L1MA4. Эта корреляция также доказывает, что в ходе эволюции происходило много независимых событий объединения U6 и L1, и что разные мастер-гены L1, функционировавшие каждый в свой временной период, участвовали в химеризации и интеграции ретротранскриптов U6_L1. Возраст старейших семейств L1, входящих в состав химер, составляет по крайней мере 100 миллионов лет (279), что подразумевает длительную эволюционную историю образования элементов U6-L1.
Самым простым механизмом образования химер могла бы быть интеграция копий U6 вплотную к 5'- концам предсуществующих 5'- укороченных L1, или наоборот, интеграция L1 сразу за 3'-концом геномной копии U6. В обоих случаях внедрившийся элемент (т.е. U6 или L1) должен быть фланкирован прямыми повторами, один из которых должен лежать на границе фрагментов U6 и L1. Но ни один из 56 химерных элементов не имел в своём составе такого повтора.
Химеры могли также возникнуть при интеграции L1 на определённом расстоянии ниже внедрения U6, и последующей транскрипции, инициированной промотором U6 и терминированной на сигнале полиаденилирования L1, сплайсинге РНК между 3'_ концом U6 и сайтом в составе L1, и, наконец, обратной транскрипции и интеграции сплайсированной копии РНК. Хотя этот механизм и объясняет отсутствие повтора между частями U6 и L1, он слабо соответствует тому факту, что все U6-фрагменты химер объединены с L1-частями химер в разных точках последовательности L1. Чтобы объяснить наличие множества случайных точек объединения, необходимо допустить случайное распределение большого количества криптических акцепторных сплайс-сайтов вдоль последовательности L1. Кроме того, такой механизм подразумевает крайне неэффективную (280) транс-комплементацию химерного транскрипта белками ретропозиционно-компетентного L1.
Принимая во внимание изложенные выше особенности химер, более вероятным способом их образования представляется рекомбинация между РНК L1 и U6 с последующей интеграцией рекомбинантов. Такая рекомбинация могла бы произойти при смене матрицы с одной РНК на другую в ходе обратной транскрипции (см. Рис. 1.4.6), как это показано для рекомбинации генома ретровирусов. Критическую роль в этом механизме может играть белок p40, кодируемый ORF1 ретроэлементов L1. Для этого белка известна способность формировать рибонуклеопротеидные комплексы с РНК L1 и неспецифически связывать РНК и одноцепочечную ДНК. Белок может образовать комплекс между РНК U6, белками интеграционного комплекса и мРНК L1.
(Специфическое связывание р40 с определёнными последовательностями РНК также не следует исключать (281)). Такой вид рекомбинации мог играть важную роль в формировании генома путём комбинирования различных РНК с L1 с последующей интеграцией химерных продуктов в геном.
Образование химер происходило вплоть до самого недавнего времени в эволюционной истории человека, поскольку некоторые интеграции U6-L1 уникальны для генома человека. Кроме того, по крайней мере одна интеграция химеры U6-L1 является полиморфной в человеческой популяции (Рис. 1.4.7).
Рисунок 1.4.7. Инсерционный полиморфизм химерного ретроэлемента U6-L1.
Другие химерные семейства ретроэлементов. Для того, чтобы понять, является ли случай U6-L1 уникальным примером проходящей in vivo рекомбинации транскриптов с последующей интеграцией в геномную ДНК, мы провели анализ геномных баз данных с целью поиска новых химер, образованных фрагментами других псевдогенов. Для этого в геноме человека были идентифицированы 735 псевдогенов наиболее часто встречающихся типов (50), дивергировавшие от своих консенсусных последовательностей от 0 до 10%, и для них был проведён детальный структурный анализ.
Было установлено, что химерные ретротранскрипты, напоминающие U6-L1, могут образовываться и из других транскрибируемых компонентов генома (см. Табл. 1.4.2). Приведённые данные свидетельствуют, что геном человека содержит множество интеграций продуктов РНК-РНК рекомбинации разнообразных клеточных транскриптов. Найденное явление может являться ранее не известным важным механизмом образования новых генов путём комбинирования фрагментов уже существующих экспрессирующихся последовательностей.
Таблица 1.4.2. Результаты поиска химерных ретроэлементов среди наиболее распространённых в геноме человека семейств псевдогенов.
|
Тип РНК |
Всего |
Химеры |
Alu |
L1 |
мРНК |
|
|
5S rRNA |
40 |
3 (7,5%) |
2 (5%) |
1 (2,5%) |
- |
|
|
4,5S rRNA |
7 |
- |
- |
- |
- |
|
|
tRNA Asn |
24 |
- |
- |
- |
- |
|
|
L7 r.p. |
40 |
- |
- |
- |
- |
|
|
L7A r. p. |
21 |
- |
- |
- |
- |
|
|
L23A r. p. |
33 |
- |
- |
- |
- |
|
|
L10 r. p. |
34 |
- |
- |
- |
- |
|
|
L31 r. p. |
40 |
2 (5%) |
2 (5%) |
- |
- |
|
|
L28 r. p. |
7 |
- |
- |
- |
- |
|
|
7SK |
33 |
- |
- |
- |
- |
|
|
7SL (SRP) |
43 |
1 (2,3%) |
1 (2,3%) |
- |
- |
|
|
E1 snlRNA |
5 |
- |
- |
- |
- |
|
|
E2 snlRNA |
5 |
- |
- |
- |
- |
|
|
E3 snlRNA |
4 |
- |
- |
- |
- |
|
|
hY1 |
40 |
- |
- |
- |
- |
|
|
CYCLO |
33 |
- |
- |
- |
- |
|
|
XBR (a-fet.) |
2 |
- |
- |
- |
- |
|
|
XTR (a-fet) |
2 |
- |
- |
- |
- |
|
|
U1 snRNA |
40 |
- |
- |
- |
- |
|
|
U2 snRNA |
40 |
- |
- |
- |
- |
|
|
U3 snRNA |
40 |
8 (20%) |
- |
7 (17,5%) |
1 (2,5%) |
|
|
U4 snRNA |
20 |
- |
- |
- |
- |
|
|
U5 snRNA |
21 |
1 (4,8%) |
- |
1 (4,8%) |
- |
|
|
U6 snRNA |
161 |
56 (34,8%) |
? |
56 (34,8%) |
? |
|
|
Суммарно |
735 |
71 (9,6%) |
5 (0,7%) |
65 (8,8%) |
1 (0,1%) |
Затем поиск химерных ретроэлементов провели для всех остальных опубликованных геномных последовательностей. При этом двухчастные структуры, аналогичные вышеописанным (Рис. 1.4.8), обнаружили во всех геномах млекопитающих, а также в геноме одного паразитического нитчатого гриба: в сумме в ДНК человека, мыши, крысы и гриба Magnaporthe grisea нашли 82, 116, 66 и 31 химеру, соответственно (Табл. 1.4.3). Химеры состоят из ДНК копий клеточных транскриптов, либо непосредственно объединённых друг с другом, либо, чаще, объединённых с 3'-концевой частью ретроэлементов, относящихся к LINE (например, L1). Клеточные транскрипты, соответствующие химерам, относятся к мРНК белок-кодирующих генов, рибосомным РНК, малым ядерным РНК, а также 7SL RNA (Табл. 1.4.3).
Таблица 1.4.3. Сопоставление 5'- и 3'-концевых частей химерных ретроэлементов млекопитающих с известными последовательностями РНК.
|
Типa |
Количество и доляb |
Функцияc |
Локализация РНКd |
|||
|
Человек |
Мышь |
Крыса |
||||
|
5' -концевые части |
||||||
|
U6 |
66 (82%) |
111 (95%) |
61 (93%) |
мяРНК, сплайсинг |
Ядрышко, ядро |
Подобные документы
Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.
курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК. Обнаружение мутации в геномной ДНК при помощи блот-гибридизации с помощью меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. Исследование фрагментов ДНК при полимеразной цепной реакции.
учебное пособие [2,5 M], добавлен 11.08.2009Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).
презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая - ДНК, рибонуклеиновая - РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.
реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.
презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.
контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012Механизм действия и модификация антисмысловых олигонуклеотидов. Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени. Буферные растворы, использовавшиеся в работе. Электрофорез нуклеиновых кислот. Проведение полимеразной цепной реакции.
курсовая работа [1,3 M], добавлен 18.01.2013Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.
презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013История изучения нуклеиновых кислот как биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды, функции и значение в жизнедеятельности организма. Правила Чаргаффа. Первичная и вторичная структура ДНК. Особенности репликации у эукариот, ее разновидности.
презентация [533,6 K], добавлен 05.11.2014Объекты, полученные в результате клонирования. Метод "переноса ядра" как наиболее успешный из методов клонирования высших животных. Получение стволовых клеток, генетически совместимых с донорским организмом. Репродуктивное клонирование человека.
презентация [657,4 K], добавлен 21.04.2013
