Гормональная индукция ферментов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

по медицине

"Гормональная индукция ферментов"

2009

1 Гормональная индукция ферментов

Изменение условий внутренней или внешней среды организма неминуемо приводит к изменениям обмена веществ, результатом которых является адаптация обмена к новым условиям. Большая группа адаптации у животных включает в себя эволюционные изменения структур и функций, возникших путем мутаций и селекции. Это генетические адаптации, возникающие в течение нескольких поколений и связанные с изменением генотипа целого вида. Другая группа адаптации имеет место в пределах жизни одного индивида. Явление такого рода известно у бактерий как ферментная адаптация, или индуцированный синтез ферментов. Под термином «индукция» принято понимать увеличение скорости синтеза ферментного белка. Вещество, вызывающее индукцию, является индуктором, а система, образующая фермент,-- индуцибельной; образовавшийся под таким воздействием фермент называют индуцированным. Такая терминология наиболее принята в настоящее время, хотя наряду с термином «индукция» используют еще и термин «адаптация» в применении к ферментам.

Поскольку понятие «адаптация» имеет широкий физиологический смысл, то предпочтительнее обозначать увеличение количества какого-либо фермента под влиянием того или иного воздействия термином «индукция».

Наиболее подробно индукция ферментов исследована на примере индукции в-галактозидазы. При выращивании на среде, не содержащей лактозы, клетки Е. coli практически не содержат фермента; после добавления к среде лактозы или других галактозидов бактериальные клетки начинают с большой скоростью синтезировать в-галактозидазу. Максимальная скорость синтеза фермента достигается не сразу, а спустя определенный лаг-период, продолжительность которого зависит от возраста культуры, состава среды, температуры и других условий. Установлено, что в результате индуцирующего воздействия происходит усиление биосинтеза фермента под влиянием индуктора, являющегося субстратом данного фермента. Этот феномен имеет большое практическое значение: например, индукция фермента пенициллиназы у некоторых микроорганизмов при лечении пенициллином.

Вероятно, каждое изменение физиологических условий вызывает изменение количества или активности ферментов и других биологически активных белков в тканях. У животных явления «метаболической адаптации», конечно, гораздо более сложные, чем у микроорганизмов, и именно они составляют основу регуляции обмена, о биохимическом смысле которой известно еще недостаточно.

Давно известны изменения ферментативной активности у животных в ответ на определенные воздействия. Weinland, А. А. Вальтер и И. П. Павлов показали увеличение скорости секреции отдельных ферментов поджелудочной железы в зависимости от преобладания в пище тех или иных компонентов: например, увеличение секреции амилазы и лактазы при высокоуглеводном или протеиназ при высокобелковом рационе. Позднее это было подтверждено другими авторами.

Первые данные были получены в отношении двух ферментов: триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы. Эти ферменты являются катализаторами для первых этапов превращения аминокислот триптофана и тирозина в организме животных по следующим путям:

Обе аминокислоты в организме животных подвергаются биологическому распаду и по другим путям, причем в результате образуются такие биологически активные соединения, как никотиновая кислота, серотонин, мелатонин, адреналин, тироксин, тирамин, меланины ". Пути превращения триптофана и тирозина, первые этапы которых катализируют соответственно триптофаноксигеназа и тирозин-аминотрансфераза, в валовом отношении представляют большую часть превращения этих аминокислот в организме животных. Основными конечными продуктами распада по этим путям являются для триптофана антраниловая, оксиаитраниловая и никотиновая кислоты, для тирозина -- гомогентизиновая и ацетоуксусная кислоты.

Сущность гормональной индукции заключается в том, что активность обоих ферментов в печени животных зна-. чительно возрастает после введения кортизона или гидрокортизона; максимум активности наблюдают через 4--5 ч после введения гормонов, а через-18--20 ч эта активность снижается до исходного уровня.

В табл. 1 приведены данные относительно влияния кортикостероидов на активность триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы. Увеличение активности ти-розин-аминотрансферазы в печени крыс зависело от дозы кортизола; максимальное изменение активности фермента наблюдали после введения 10 мг на 100 г массы. Повышение активности триптофаноксигеназы обнаружено и у людей, получавших гидрокортизон. Это показало увеличение количества метаболитов триптофана в моче и прямое определение активности фермента в ткани, полученной при пункции печени. Активность триптофаноксигеназы у людей повышалась также и после введения эстрогенов. Ответ тирозин-аминотрансферазы и триптофаноксигеназы на кортикостероиды был получен не только после введения гормонов животным, но и при добавлении гормонов в среду, в которой перфузировали изолированную печень крыс. Активность тирозин-аминотрансферазы в перфузируемой печени повышалась не только под действием глюкокор-тикоидов, но также под влиянием глюкагона и инсулина, однако кортизол вызывал максимальное по величине повышение активности.

Таблица 1 - Кортикостероидная индукция триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы

Рис.1. Изменение активности тирозин-аминотрансферазы в печени крыс в ответ на варьирующие дозы гидрокортизона.

На абсциссе -- концентрация гормона в миллиграммах на 100 г массы тела; на ординате -- активность фермента в единицах на 1 мг белка.

Добавление дексаметазона к среде, в которой инкубировали изолированные клетки печени крыс, также приводило к заметному повышению активности фермента. Кортикостероидная индукция тирозин-аминотрансферазы была получена и в опытах с культурами клеток гепатомы. Индукция фермента дексаметазоном в концентрации 5 -10^-5 М представлена на рис. удаление гормона из среды вызывало быстрое снижение активности.

Повышение активности триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы в ответ на введение кортикостероидов было настолько хорошо воспроизводимым, что некоторые авторы предлагают использовать определение активности этих ферментов в качестве точного и чувст вительного показателя секреции глюкокортикоидов. Поскольку увеличение количества эндогенных кортикостероидов характерно для реакции стресса, то можно было ожидать, что в условиях, ведущих к развитию этой реакции, активность указанных ферментов будет повышена. Действительно, травма, облучение, введение аминокислот, нуклиотидов, некоторых белков и даже таких инертных веществ, как бентонит и целит, вызывают увеличение активности обоих ферментов у интактных, но не у адренал-эктомированных животных.

Рис.2. Индукция тирозин-аминотрансферазы кортикозолом, инсулином и глюкагоном в изолированной перфузируемой печени крыс.

Рис.3. Индукция тирозин-аминотрансферазы в клетках гепатомы при инкубации их в присутствии дексаметазона в концентрации 10-⁷М.

Таблица 2 - Индукция тирозин-аминотрансферазы у интактных и адреналэктомированных крыс

При инкубации переживающих срезов печени крыс с кортизолом в различных концентрациях активность тирозин-аминотрансферазы изменялась следующим образом.

Таблица 3

Таким образом, наибольшее увеличение активности фермента обнаруживается при концентрации кортизола 10-⁶ М. Эта концентрация превышает физиологические величины «покоя», но находится в пределах стрессовых концентраций кортикостероидов.

Таблица 4 - Активность тирозин-аминотрансферазы в печени различных позвоночных после введения кортизола в течение 5 дней

Результаты исследования кортикостероидной индукции тирозин-аминотрансферазы у различных видов животных представлены в табл.4

Как видно из данных табл.4. у амфибий и рыб тирозин-аминотрансфераза почти не отвечает на кортизол. Очевидно, гормональный механизм регуляции этого фермента возникает на определенной стадии эволюционного развития. В отличие от тирозин-аминотрансферазы активность триптофаноксигеназы в печени морской свинки не меняется после введения кортизола.

Большой интерес представляет становление гормонального контроля ферментов в онтогенезе. С момента рождения исчезают регуляторные влияния организма матери и у новорожденного устанавливаются новые регуляторные механизмы. При этом значительно меняется активность ферментов. Для большинства ферментов гормональная индукция появляется в первые часы или дни жизни животного. Генетическая информация, необходимая для образования каждого фермента, имеется в клетках тканей эмбриона, но не проявляется фенотипически до момента рождения.

Активность глюкокиназы в печени эмбрионов крыс, морских свинок и кроликов отсутствует и проявляется вскоре после рождения. Ответ этого фермента и тирозин-аминотрансферазы на АКТГ в печени крыс возрастает в период от 2-го до 18--24-го месяца жизни. Развитие реактивности гексокина-зы печени кроликов к глюкокортикоидам совпадает с усилением образования этих гормонов и перестройкой обмена веществ при переходе эмбриона к постнатальному существованию. Активность тирозин-аминотрансферазы в печени кролика возрастает в 2--4 раза при рождении, причем такой же эффект дает кесарево сечение. У эмбрионов морских свинок активность этого фермента в печени не проявляется, но достигает нормы взрослого животного в первые сутки после рождения. Глюко-кортикоиды способны индуцировать тирозин-аминотранс-феразу в печени животных сразу же после рождения, а глюкагон -- за 2 дня до рождения. При выращивании культуры печени эмбрионов крыс в первые 12 ч ответ тирозин-аминотрансферазы на добавление кортикостероидов очень невелик, но постепенно активность возрастает и затем остается повышенной до тех пор, пока стероиды не будут удалены из среды. При инкубации кусочков эмбриональной печени крыс в среде для культуры тканей происходит спонтанная активация тирозин-аминотрансферазы, которая возрастает от добавления в среду кортизола или глюкагона. Активность триптофаноксигеназы в печени кролика увеличивается в 10 раз в первые сутки после рождения, а у крыс она очень низкая до возраста 2-3 нед. В регенерирующей печени крыс ответ триптофаноксигеназы на введение кортизона выражен слабее, чем в печени интактных животных; изменен характер индукции в регенерирующей печени и другого фермента -- тирозин-аминотрансферазы.

В исследованиях по гормональной регуляции активности ферментов обычно определяли влияние того или иного гормона на активность одного фермента. Поскольку фермент обычно катализирует одну определенную реакцию, то исследовали превращение субстрата по какому-либо одному пути. Мы попытались выяснить характер влияния гормонов на все возможные пути биологического распада какого-либо одного субстрата. В качестве модели были выбраны ферменты, катализирующие распад незаменимой аминокислоты треонина, распад которого в организме животных происходит по трем путям.

Рис.4. Схема альтернативных путей распада аминокислоты треонина в организме животных.

Реакция I состоит в дезаминировании треонина, катализируется треонин-дегидратазой и продуктами ее являются б-кетомасляная кислота и НЗ₃. Реакция II заключается в расщеплении треонина на ацетальдегид и глицин и катализируется треонинальдолазой. Реакция III -- декарбоксилирование треонина с образованием аминоацетона и СОг, катализируется треонин-дегидрогеназой. Все 3 фермента находятся в печени, причем треонинг-дегидратаза и треонин-альдолаза являются растворимыми ферментами, а треонин-дегидрогеназа локализована в митохондриях.

Данные об активности 3 указанных ферментов в печени интактных, адреналэктомированных и получавших в течение 3 дней кортизон крыс представлены в табл. 4. Как видно из данных табл. 4, адреналэктомия снижала активность всех 3 ферментов, а введение кортизона наиболее резко повышало активность треонин-дегидратазы, слабо - треонин-альдолазы и практически не влияло на активность треонин-дегидрогеназы:

Рис.5. Влияние кортикостероидов на активность L-треонин-дегидратазы в печени белых крыс. Активность фермента у интактных контрольных животных принята за 100%.

Поскольку треонин-дегидратаза имеет большое значение для глюконеогенеза, представляло интерес более подробно исследовать кортикостероидную индукцию этого фермента. Для этого интактным и адреналэктомиро-ванным крысам в течение 3 дней вводили кортизон, триамцинолон или преднизолон, затем животных забивали и в центрифугатах гомогената печени определяли активность треонин-дегидратазы.

Таблица 5 - Активность треонин-дегидратазы, треонин-альдолазы и треонин-дегидрогеназы у адреналэктомированных и интактных крыс, получавших в течение 3 дней по 5 мг кортизона внутримышечно

Рис.6. Индукция кортизоном пролиноксидазы в печени крыс.

Оказалось, что как кортизон, так и синтетические кортикостероиды значительно повышали активность треонин-дегидратазы, причем значительно больше у адренал-эктомированных, чем у интактных, животных.

Сходные данные были получены и при исследовании кортизоновой индукции пролиноксидазы в печени крыс. Введение интактным и адреналэктомированным животным по 1 мг кортизона в день в течение 12 дней повышало активность фермента у адреналэктомированных животных в большей степени, чем у интактных. Аналогичные данные приведены в литературе для тирозин-аминотрансферазы.

Причина большей чувствительности ферментов у адреналэктомированных животных к индукции гормонами еще неясна. Возможно, что удаление надпочечников, при котором происходит удаление из организма и других, помимо глюкокортикоидов, стероидных гормонов обусловливает большую «чувствительность» ферментов к глюко-кортикоидам. Это, в частности, подтверждается тем фактом, что введение адреналэктомированным крысам дезоксикортикостерон ацетата снижает величину ответа тирозин-аминотрансферазы на кортизол больше, чем при введении интактным крысам.

Рис.7. Индукция тирозин-аминотрансферазы в печени крыс после введения кортизола интактным и адреналэктомированиым животным.

Возможно также, что адреналэктомия приводит к снижению образования специфических репрессоров, тормозящих синтез индуцибельных ферментов.

Величина повышения активности фермента до известной степени пропорциональна дозе гормона, что было отчетливо показано на примере тирозин-аминотрансферазы

Таблица 6 - Влияние кортизола и ДОКА на активность тирозин-аминотрансферазы в печени интактных и адреналэктомированных крыс

Рис.8. Влияние введения преднизолона и последующей его отмены на активность алании-амииотрансферазы в печени крыс. 1-- вводили по 4 мг гормона в день; 2-- вводили по 2 мг гормона в день; стрелки -- прекращение введения гормона. На абсциссе -- длительность введения гормона в сутках; на ординате -- активность фермента в единицах на печень.

Это обнаружено также и для аланин-амино-трансферазы -- фермента, индукцию которого вызывали введением преднизолона в течение 8 дней. После прекращения введения стероида активность фермента медленно снижалась до исходных величин. Кортизоловая индукция триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы у молодых и старых крыс имеет одну и ту же величину.

Одним из проявлений гормонального контроля является наличие различий в активности ферментов в зависимости от пола. Примеры такого различия приведены на рис., где изображена сравнительная активность 5 ферментов у самцов и самок крыс. Известны половые различия активности ферментов и у людей. Например, активность щелочной фосфатазы в лейкоцитах взрослых женщин па 50% больше, чем в лейкоцитах мужчин. Необходимо еще учитывать такие периоды, как половое созревание и беременность, которые значительно меняют количество гормонов в организме и вследствие этого -- активность ферментов в тканях. Приведенные примеры далеко не исчерпывают всего многообразия гормонального контроля активности ферментов. Данные о влиянии гормонов на активность ферментов представлены в табл.6.

Рис.9. Активность тирозип-амипотрансферазы, феиилаланин-пируват-аминотрансферазы, оксидазы п-.оксифенилпировииоград-пой кислоты, оксидазы гомогептизиновой кислоты, кинуреиназы, киуренин-аминотрансферазы и гистидазы в печени самцов и самок крыс.

Таким образом, активность подавляющего числа ферментов находится под контролем тех или иных гормонов, причем нередко эта активность является результирующей действия нескольких гормонов. Однако само понятие «активность ферментов» является сложным.

Активность фермента определяется большим числом факторов, которые схематически можно разделить на 3 группы.

1. Количество самого ферментного белка в клетке.

2. Наличие факторов, изменяющих скорость ферментативной реакции.

3. Доступность субстратов ферментов и скорость удаления продуктов реакции, зависящие от проницаемости.

Большое число данных, полученных к настоящему времени, свидетельствует о широкой изменчивости активности ферментов в организме при различных физиологических или патологических состояниях, что определяет высокую пластичность и приспособляемость обмена веществ в клетке к меняющимся условиям среды существования.

Одними из биологических регуляторов, обеспечивающих адаптацию обмена веществ, являются гормоны.

К настоящему времени получено очень большое число данных относительно гормонального контроля активности различных ферментов. Наиболее подробно характер этого контроля исследован в отношении некоторых ферментов обмена аминокислот.

Эти исследования проведены на целостном организме, изолированных органах. и на культурах тканей и клеток. Установлено, что реакция стресса также сопровождается изменением ферментативной активности, которая, вероятно, и лежит в основе адаптационного синдрома. Гормональный контроль активности ферментов возникает на определенной стадии эволюционного развития и имеет возрастные и половые особенности.

Основной задачей является выяснение механизмов, определяющих изменение активности ферментов под влиянием гормонов.

2 Влияние гормонов на биосинтез ферментов

Одним из важнейших факторов, определяющих активность ферментов в тканях, является их количество, которое в свою очередь зависит от скорости синтеза и скорости распада. Немутантные, т. е. не связанные с качественным изменением генетического аппарата, изменения количества фермента в клетке служат наиболее общим проявлением индукции фермента. Хорошо известно, что содержание фермента в клетке подвергается значительным колебаниям при различных физиологических и патологических условиях. Особенно выражены изменения количества ферментов в печени под влиянием трех важнейших стимулов: гормонов, питания и окружающей среды.

Уже в первых работах по гормональной индукции ферментов были получены данные в пользу того, что повышение активности фермента под влиянием гормона является следствием увеличения количества молекул фермента. Основанием для такого заключения послужили исследования, показавшие увеличение включения меченых аминокислот в белки и ферменты печени после введения кортикостероидов.

После введения крысам кортикостерона значительно возрастает включение ¹⁴С-валина в белки гиалоплазмы и микросом печени. Увеличение включения меченых аминокислот в белки наблюдали после введения животным и других гормонов. Тироксин стимулирует включение метки in vivo и in vitro; СТГ эффективен при добавлении к среде, которой перфузировали печень крысы; инсулин стимулирует включение меченых аминокислот в белки и синтез альбумина в изолированных клетках печени крыс при добавлении гормона в среду инкубации. Примеров такого рода можно привести много.

Более прямые данные относительно увеличения количества ферментных белков под воздействием гормонов получены при использовании иммунохимических методов определения количества индуцированного фермента. В основном они получены для триптофаноксигеиазы и тирозин-аминотрансферазы.

В табл.7 приведены результаты определения активности и количества антигенреактивиой триптофаноксигеиазы крыс через 4 ч после кортикостероидной индукции.

Таблица 7 - Активность и количество триптофаноксигеиазы в гиалоплазме клеток печени крыс через 4 ч после внутрибрюшинного введения кортизона в дозе 10 мг/кг массы

Рис.10. Сопоставление иммунохимического определения количества тирозин-аминотрансферазы и активности фермента в печени крыс в разные сроки после введения кортизола. На правой ординате -- количество фермента в импульсах выражали величиной в минуту в выделенном ферменте Х10³ на 1 мг общего растворимого белка печени; на левой ординате активность в микромолях п-оксифенилпирувата, образовавшегося на 1 мг белка. На абсциссе -- время, часы.

Как видно из данных табл.7 определение активности фермента и его количества дает хорошо совпадающие величины в смысле кратности увеличения после введения гормона. Аналогичные данные получены и в отношении тирозин-аминотрансферазы после введения животным кортизола, а также при иммуиохимиче-ском определении количества этого же фермента в культуре клеток гепатомы, инкубированной с дексаметазоном.

Большое число исследований посвящено снятию гормональной индукции ферментов ингибиторами биосинтеза белка и РНК. Некоторые из них приведены в табл.

В течение первых суток после рождения пуромицин тормозил быстрое увеличение активности триптофанок-сигеназы в печени новорожденных морских свинок. Мы также получили данные относительно торможения гормональной индукции треонин-дегидратазы ингибиторами биосинтеза белка.

Введение этионина значительно снижало кортизоно-вую индукцию у интактных и полностью подавляло ее у адреналэктомированных животных. Индукция триамци-нолоном полностью предупреждалась также введением отечественного антибиотика аурантина, относящегося к группе актиномицинов и по аминокислотному составу, близкому к актиномицину С.

Результаты, полученные с помощью включения меченых аминокислот, иммунохимических методов и с использованием ингибиторов, свидетельствуют о том, что в результате гормональной индукции происходит увеличение скорости синтеза ферментов. Поскольку все ферменты являются белками, то синтез фермента -- частный случай биосинтеза белка вообще. Для решения вопроса о том, на какой стадии биосинтеза белка может осуществляться гормональная регуляция, целесообразно рассмотреть схему биосинтеза белка в ее общих чертах.

Структура белка определяется ДНК. Молекула ДНК имеет вид двойной спирали, состоящей из двух цепей. Каждая из цепей составлена из 4 видов дезоксирибонуклеотидов, в состав каждого нуклеотида входят фосфатные группы, сахар -- дезоксирибоза и азотистое основание. Участок молекулы ДНК, определяющий структуру отдельного белка, представляет собой ген, или цистрон. Начальным этапом передачи информации, закодированной в гене, является транскрипция, которая представляет собой образование особого вида рибонуклеиновой кислоты - так называемой информационной, или матричной РНК - Молекулы различных типов РНК, как и молекулы ДНК, состоят из нуклео-тидов; нуклеотиды РНК отличаются от нуклеотидов ДНК тем, что в них нет тимина, характерного для ДНК, и содержится урацил, которого нет в ДНК. Кроме того, нуклеотиды РНК содержат другой сахар -- рибозу, а не Дезоксирибозу, как нуклеотиды ДНК. Молекула мРНК представляет собой в отличие от молекулы ДНК одну цепь и образуется на одной из двух цепей ДНК, как на матрице. Последовательность ыуклеотидов образовавшейся мРНК соответствует последовательности дезокси-рибонуклеотидов данного гена, т. е. мРНК является как бы «копией» гена. Образование мРНК происходит при участии специального фермента -- РНК-полимеразы. Образовавшаяся мРНК переходит из ядра в цитоплазму клетки и там соединяется с особыми частицами -- рибосомами. Рибосомы состоят из особой рибосомной РНК и белка и являются центральным узлом белок-синтезирующей «машины» клетки. Именно на рибосомах происходит «сборка» аминокислот в белок, структура которого «задана» специфической для данного белка мРНК. Структура и функционирование рибосомы особенно интересны ввиду центральной роли рибосом в биосинтезе белка. Рибосома состоит из 2 неравных частей. При процессе трансляции рибосомы собираются в полисомы -- агрегаты, состоящие из нескольких рибосом и одной молекулы мРНК- В цитоплазме всегда присутствуют рибосомы, их субъединицы и полисомы. Около 80% рибосом цитоплазмы связано с мембранами эндоплазматической сети, эти рибосомы наиболее активно участвуют в биосинтезе белков.

Аминокислоты, из которых «собирается» белок, также предварительно проходят ряд подготовительных стадий. Сначала каждая аминокислота «активируется» за счет реакции с молекулой АТФ, а затем «активированная» аминокислота соединяется с транспортной РНК, причем для каждой аминокислоты существует специальная тРНК- Последняя является наиболее низкомолекулярной из всех типов РНК.

Реакция присоединения аминокислот к тРНК катализируется особыми ферментами -- аминоацил-тРНК-син-тетазами, причем для каждой аминокислоты имеется «собственный» фермент. В таком виде, будучи как бы «привязанной» к своей тРНК, аминокислота поступает к рибосомам, где и происходит последовательное соединение аминокислот между собой с образованием полипептидной цепи. Последовательность аминокислот в этой цепи, закодированная в мРНК, определяется тем, что каждый участок мРНК взаимодействует с соответствующей тРНК. Этот процесс, называемый трансляцией, схематично принято разделять на 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию образования полипептидной цепи. Образовавшийся белок освобождается из рибосомы и приобретает законченную трехмерную структуру. Пептидная цепь приобретает наиболее устойчивую конфигурацию, определяемую термодинамическими принципами.

Эта схема синтеза белка в живой клетке была составлена на основании данных, полученных в исследованиях на вирусах и бактериях, и вначале механически перенесена на клетки высших животных. Хотя последовательность стадий биосинтеза одинакова, переход от бактериальной к животной клетке связан со значительным усложнением генетического аппарата и всей биосинтетической «машины». В качестве примера можно привести данные о количестве ДНК в клетках различных видов организмов, показывающие, что в ходе эволюции имеется тенденция к увеличению содержания ДНК в клетках.

Таблица 8 - Содержание ДНК в клетках различных организмов

В клетках животных ДНК в основном локализуется в ядре и лишь небольшое количество ее - в митохондриях; в период интерфазы ДНК находится в виде хроматина, а в период деления клетки -- в виде хромосом.

В целом различия в организации и функционировании генетического аппарата у бактерий и высших животных сводятся к следующему.

1. Бактериальная хромосома является одной «голой» молекулой ДНК; у высших животных хромосома представляет собой сложный комплекс, который содержит белки и РНК.

2. Клетки млекопитающих содержат значительно больше ДНК, чем бактериальная клетка; число генов в клетках животных также больше, чем в бактериальных, хотя различия не так велики, как в содержании ДНК- В бактериальной клетке число генов составляет 3-4х10³, а в клетке высших животных -- до 5х10⁴.

3. ДНК высших организмов содержит большие участки с повторяющимися последовательностями нуклеотидов, чего нет у бактерий.

4. В дифференцированных клетках высших животных большая часть генома неактивна; возможно, что в соматических клетках неактивна целая хромосома.

5. Информационные РНК у бактерий являются поли-цистронными, т. е. «копиями» нескольких цистронов, и каждая несет информацию для нескольких белков, в животных клетках обнаружены пока только моноцистронные мРНК.

6. В бактериальной клетке процессы транскрипции и трансляции не разделены, в клетках высших животных транскрипция локализована в ядре, а трансляция -- в цитоплазме.

7. У животных в отличие от бактерий при транскрипции происходит образование очень больших и лабильных молекул РНК, которые подвергаются распаду тут же, в ядре. Функция этого типа РНК еще недостаточно ясна. По всей вероятности, часть молекул Д-РНК являются предшественниками мРНК; возможно, что Д-РНК играет какую-то роль в функционировании ядра клетки.

8. В бактериальной клетке мРНК очень лабильны и быстро распадаются, а рибосомы довольно стабильны; в животной клетке, наоборот, мРНК стабильны, а рибосомы очень лабильны.

Все это свидетельствует о большей сложности процесса биосинтеза белков у животных.

Как уже указывалось, в ядре клеток животных ДНК связана с различными белками. В первых исследованиях этого вопроса особенно большое значение придавали гистонам -- белкам основного характера, локализованным почти полностью в ядрах. Полагали, что гистоны являются специфическими репрессорами синтеза РНК, т. е. тормозят процесс транскрипции, образуя комплексы с ДНК.

В последующих работах возникло сомнение в исключительной роли гистонов. Однако функции гистонов, несомненно, очень важны: гистоны являются структурными элементами хромосом и, возможно, защищают последние от повреждения и распада.

Таким образом, регуляция биосинтеза белков, в том числе ферментов, может осуществляться путем контроля состояния генома, процесса транскрипции, транспорта информационных РНК из ядра в цитоплазму, синтеза других типов РНК, контроля процесса трансляции на всех его стадиях, а также влияния на состояние рибосом. Целесообразно рассмотреть данные по возможному влиянию гормонов на всех этих этапах более подробно.

Влияние гормонов на состояние и функционирование генома. Влияние гормонов на матричную активность хроматина, т. е. на способность синтеза РНК на матрице ДНК, было показано in vivo и in vitro. Введение крысам кортизола приводило к увеличению матричной активности хроматина ядер печени на 30%; аналогичный эффект оказывали кортикостероиды и при инкубации с изолированными ядрами клеток печени in vitro. Сходные данные в отношении матричной активности хроматина матки после введения крысам эстрадиола получил Barker, причем активация сопровождалась изменением скорости синтеза специфического ядерного белка. Для выяснения возможности прямого действия гормонов на гены, т. е. на ядерную ДНК, были проведены исследования с изолированными ядрами и с ДНК, выделенной из ядер клеток различных тканей. Эти исследования не дали однозначных результатов. Так, при инкубации кортизона, кортизола или кортикостерона с препаратами очищенной нативной ДНК, выделенной из ядер печени крыс, не наблюдали связывания стероидов с ДНК, а также изменений кривых тепловой денатурации и спектров поглощения в ультрафиолетовом свете этих препаратов ДНК. Однако имеются данные и другого рода. Показано связывание различных стероидов с синтетическими полинуклеотидами, расщепление однонитевой ДНК, выделенной из мозга мышей или тимуса теленка, при добавлении к этим препаратам ДНК кортизона, а также значительные изменения УФ-спектра ядер, выделенных из печени и тимуса крыс при инкубации их с низкими концентрациями кортизола. Эти результаты указывают на возможность влияния гормонов на структуру хроматина.

Поскольку определенную роль в функционировании генома играют гистоны, то возможно влияние гормонов на биосинтез ферментов при посредстве этих белков. Действительно, в литературе имеются данные такого рода. Адреналэктомированные крысы почти все погибали через 3--4 ч после введения 10 мг гистонов на 100 г массы; если гистоны вводили вместе с кортизоном, то все крысы выживали. Гистоны, выделенные из тимуса теленка, отчетливо тормозили индукцию триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы в печени адреналэктомировакных мышей. Это действие было выражено максимально при введении гистона вместе с кортизолом и проявлялось слабее, если гистоны вводили через 15, 30 или 60 мин после введения кортизола. Обнаружена отчетливая корреляция между скоростью ацетилирования гистонов в печени крыс после введения кортизола и индукцией тирозин-аминотрансферазы; ацетилирование гистонов повышалось также in vitro в бесклеточных препаратах матки крыс после добавления эстрадиола. Аналогичные данные получены в отношении фосфорилирования гистонов. Уже через 15 мин после введения крысам глюкагона значительно увеличивалась скорость фосфорилирования гистонов, достигавшая максимума через 1--2 ч.

Считают, что фосфорилирование гистонов изменяет характер их взаимодействия с ДНК, результатом чего является изменение скорости синтеза РНК и далее ферментов. Обнаружено также связывание меченых стероидных гормонов с гистонами in vivo и in vitro, в то время как другие белки в этих же условиях почти не связывали гидрокортизона.

Большое число работ посвящено возможности регуляции гормонами активности РНК-полимеразы -- фермента, катализирующего образование информационных и других РНК на матрице ДНК- Активность этого фермента изменяется при изменениях физиологического состояния, обусловленных гормонами: в ядрах клеток молочной железы мышей она возрастает при беременности или после введения пролактина; в ядрах почек мышей снижается после кастрации и возрастает в результате введения тестостерона; в ядрах тимуса крыс значительно понижается после введения кортизола. Особенно детально исследовано влияние кортико-стероидов на активность РНК-полимеразы в ядрах клеток печени крыс. В ядрах клеток печени эмбрионов и новорожденных крысят активность этого фермента очень низка, после рождения постепенно повышается и достигает нормы взрослой крысы к 15-20-му дню жизни. В повышении активности РНК-полимеразы в постнатальном периоде очень важную роль играют гормоны коры надпочечников.

Таблица 9 - Влияние глюкокортикоидов на активность РНК-полимеразы в ядрах клеток печени крыс на различных стадиях постнатального развития¹

Введение этих гормонов вскоре после рождения почти не влияет на активность РНК-полимеразы, но с 13-го дня жизни кортикостероиды вызывают резкое увеличение активности. Интересно, что у адреналэктомированных крыс увеличение активности РНК-полимер азы выражено значительно сильнее, чем у интактных животных.

Увеличение активности РНК-полимер азы в ядрах клеток печени крыс наступало уже через 30 мин после введения кортикостероидов. Это гораздо более ранний эффект гормональной индукции, чем в отношении других ферментов.

Максимум индукции РНК-полимеразы наступает через 3 ч, а тирозин-аминотрансферазы -- через 5-6 ч. После введения овариэктомированным крысам эстрадиола наиболее ранним эффектом этого гормона было повышение активности РНК-полимеразы II -- фермента, катализирующего синтез Д-РНК в ядрах матки. Как и для других ферментов, ингибиторы биосинтеза РНК и белка блокировали кортикоидную индукцию РНК-полимеразы. Таким же тормозящим действием обладали и гистоны.

Таким образом, одним из возможных путей гормональной регуляции биосинтеза может быть влияние на РНК-полимеразу. Торможение ингибиторами биосинтеза белка свидетельствует о том, что это влияние направлено на регуляцию биосинтеза фермента. В связи с этим очень интересны данные Talwar и др.. Авторы путем гельфильтрации выделили из гомогената матки крыс фракцию, которая тормозила активность РНК-полимеразы. Преинкубация этой фракции с эстрадиолом частично снимала ингибирующий эффект. Возможно, что указанная фракция содержала специфический репрессор РНК-полимеразы, а при связывании с эстрадиолом происходила дерепрессия. Можно предположить, что подобным образом кортикостероиды могут связываться с аналогичными репрессорами РНК-полимеразы в клетках печени, в результате чего возрастает синтез РНК, необходимой для биосинтеза ферментных белков. Однако данные Talwar и др. не были подтверждены другими авторами.

Влияние гормонов на синтез различных видов РНК и на процесс транскрипции. Накопилось много данных, свидетельствующих о том, что гормоны стимулируют синтез всех видов РНК. Увеличение синтеза ядерной РНК было показано для клеток печени после введения крысам кортизола и для клеток матки после введения эстрадиола; адреналин стимулировал синтез РНК в ядрах клеток эмбриона цыпленка; паратгормон значительно повышал синтез РНК в костной ткани. Увеличение синтеза ядерной РНК после введения гормонов предшествовало гормональной индукции триптофаноксигеиазы и тирозин-аминотрансферазы. При фракционировании РНК, синтезированной после введения кортикостероидов, нашли, что повышался синтез рРНК, тРНК, а также Д-РНК-

Поскольку информация для синтеза белков и в том числе ферментов передается при помощи мРНК, особый интерес представляет выяснение возможности гормонального контроля синтеза именно этого типа РНК- Такую возможность предположили благодаря данным, показавшим, что введение гормонов повышает синтез РНК, по своим свойствам близкой к мРНК- Это было показано для клеток печени животных после введения кортизола или инсулина, для клеток матки после введения эстрадиола и для других тканей.

В ткани яйцевода кур эстрогены вызывают индукцию синтеза специфического белка -- овальбумина. Семидневным цыплятам в течение 16 дней вводили синтетический эстроген диэтилстильбэстрол, затем из полисом яйцевода выделили РНК и в бесклеточной белоксинтезирующей системе иммунохимически показали образование овальбумина. Аналогичные данные были получены Schimke и др.. В этих исследованиях цыплятам вводили в течение первых 10 дней жизни по 1 мг эстрадиола в день, затем проводили вторичное введение эстрогена в течение 3 дней. Активность мРНК для овальбумина резко возрастает при первой и еще более при вторичной стимуляции эстрогенами. У взрослых петухов введение эстрадиола индуцировало синтез в печени белка, специфичного для желтка яйца -- липовителлина, что сопровождалось индукцией соответствующей мРНК. Аналогичные данные получены и для млекопитающих. Из печени крыс, получавших кортизол, выделили мРНК, которая при добавлении in vitro к бесклеточной белоксинтезирующей системе вызывала увеличение синтеза тирозин-аминотрансферазы.

Наконец, совсем недавно из печени получавших глюкокортикоиды. крыс выделили и частично очистили мРНК для триптофаноксигеиазы. Авторы считают свои результаты прямым доказательством гормонально обусловленного увеличения количества мРНК, кодирующей синтез этого индуцибельного фермента.

Таким образом, с большей долей вероятности можно считать, что гормоны могут увеличивать синтез ряда ферментных и других белков при посредстве ускорения синтеза мРНК, кодирующих эти белки.

Известно, что мРНК У животных гораздо более устойчивы, чем у бактерий; время полураспада мРНК в тканях животных, по данным ряда авторов, составляет от 1 до 80 ч. Гормоны могут влиять на биосинтез ферментов не только через увеличение количества специфических мРНК, но и путем снижения скорости их распада. Так, время полураспада РНК микросом печени интактных крыс составляет 4,7--4,9 дня, а после введения кортизона по 5 мг/100 г массы в течение 3--7 дней увеличивалось до 7,4--8,4 дня. Известно, что активность одного из ферментов печени крыс -- сс-глицерофосфатдегидрогеназы -- снижается при гипотиреозе и возрастает после введения тироксина. Возможно, это является отчасти результатом того, что ti/₂ мРНК для данного фермента в норме равно 5,5 дня, а при гипотиреозе составляет 3,5 дня.

Показано снижение распада микросомной РНК в печени крыс после введения кортизона в дозе 5 мг/100 г массы. Таким образом, установлена возможность увеличения синтеза или снижения распада мРНК в тканях животных при гормональной индукции ферментов. При сравнении действия андрогенов и эстрогенов Н. А. Юдаев и Б. В. Покровский показали возможность серьезных качественных различий в действии этих двух групп гормонов на индукцию биосинтеза РНК в матке крыс.

Существует единодушное мнение о том, что гормоны контролируют синтез другого типа РНК, участвующий в биосинтезе белка-- рибосомной РНК. Синтез рРНК происходит также в ядре; вначале в ядрышке синтезируется высокомолекулярный предшественник рРНК, который в ядрах расщепляется и образует рРНК2видов.' Эти 2 вида рРНК в ядре же комплексируются с белками, образуя большую и малую «половинки» рибосомы, которые затем переходят в цитоплазму. В цитоплазме происходит «сборка» рибосом и образование полисом, на которых и протекает процесс трансляции. Увеличение количества рРНК после введения гормонов показано многими авторами.

Наконец, имеются данные относительно гормонального контроля синтеза тРНК. Это показано для ткани печени и семенных пузырьков крыс после введения кортизола и тестостерона, для печени кур после введения эстрогенов, печени крыс после введения СТГ. Адреналэктомия заметно снижает, а введение кортизола повышает образование тРНК для лизина, лейцина и аланина в печени кроликов.

Таким образом, гормональная регуляция охватывает синтез всех 3 основных типов РНК: информационной, рибосомной и транспортной.

Влияние гормонов на рибосомы и процесс трансляции.

С данными о гормональном контроле синтеза рибосомной РНК хорошо согласуются результаты исследований относительно влияния гормонов на структуру и функцию рибосом. Хорошо известное анаболическое действие СТГ заключается в известной мере в стимуляции биосинтеза различных белков. Добавление СТГ к среде перфузии печени крыс in situ приводит к усилению активности рибосом; гипофизэктомия у крыс значительно снижает количество рибосом в ткани сердца. Тиреоид-эктомия также значительно понижает активность рибосом. Аналогичные данные получены и в отношении других гормонов: альдостерона, тестостерона, кортикостероидов, инсулина. В большинстве случаев после введения гормонов увеличивалось количество рибосом, сдвигалось соотношение между рибосомами и полисомами в сторону преобладания числа полисом, а также увеличивалось число рибосом, связанных с мембранами цитоплазматической сети, т. е. более активных в отношении их биосинтетической функции.

Имеются данные об увеличении активности ферментов, активирующих аминокислоты в тканях органов-мишеней после введения эстрогенов, андрогенов и кортикостероидов.

Добавление тироксина in vitro в концентрации 6,6 Ч Ю^-5 М к системе лизированных ретикулоцитов кролика стимулировало полный синтез в-цепей гемоглобина, причем наиболее отчетливо была выражена стимуляция стадии терминации. При синтезе б-цепей обнаружили стимуляцию тироксином терминации тех цепей, синтез которых уже был начат in vivo, но тироксин не влиял на инициацию новых б-цепей. Авторы считают, что первичным эффектом тироксина является стимуляция биосинтеза белка на поздних стадиях элонгации, стадии терминации или освобождения цепей, а стадия инициации может ускоряться вторично -- вследствие улучшения условий для протекания более ранних стадий. По мнению Palmiter, при индукции синтеза специфических белков в яйцеводе кур наиболее выражено влияние эстрадиола на стадии инициации и элонгации. Опыты с добавлением дексаметазона к культуре клеток гепатомы крыс показали, что индукция тирозин-аминотрансферазы являлась скорее всего результатом стимуляции стадии инициации в биосинтезе этого фермента.

Эти данные свидетельствуют о том, что гормоны могут влиять на процесс образования пептидной цепи белка на всех его стадиях, т. е. на процесс трансляции в целом.

Особенности действия ингибиторов и феномен «супериндукции» ферментов. Как уже указывалось, большое число данных относительно влияния гормонов на биосинтез ферментов и вообще белков получено с помощью использования ингибиторов различных стадий процесса биосинтеза. В табл. приведены основные ингибиторы и указаны реакции, которые они тормозят.

Чаще всего использовали актиномицин D, тормозящий действие РНК-полимеразы и как следствие этого -- образование мРНК- Однако в опытах с торможением гормональной индукции с помощью этого ингибитора обнаружен «парадоксальный» эффект актиномицина D, а затем и других ингибиторов, в частности пуромицина. Это парадоксальное действие заключается в том, что если актиномицин D вводили некоторое время спустя после гормона, то получали не торможение активности фермента, а, наоборот, увеличение и большее, чем от введения одного гормона. Этот феномен получил название «супериндукции». Была показана супериидукция триптофанокси-геназы и тирозин-аминотрансферазы, если актиномицин D или пуромицин вводили животным через 4--5 ч после введения кортизола; супериидукцию щелочной фосфатазы в лейкоцитах кролика наблюдали после введения прогестерона и актиномицина D. Аналогичные данные получены и в отношении глицерофосфатдегидрогеназы в печени крыс при воздействии трийодтиронина: после введения актиномицина D на высоте индукции активность фермента увеличивалась еще больше. Супериндукция после введения актиномицина D была показана и для эстрогеновой индукции овальбумина, кональбумина и других белков в ткани яйцевода цыплят.

Мы обнаружили супериндукцию трсонин-дегидратазы в печени крыс после введения актиномицина D на фоне введения триамцинолона; интересно, что у ад-реналэктомированных животных супериндукция была выражена сильнее, чем у интактных.

При обсуждении причин парадоксального действия ингибиторов биосинтеза белка, приводящего не к подавлению, а к усилению гормональной индукции ряда ферментов и белков, было выдвинуто несколько объяснений этого интересного феномена. Кеппеу и др. считают, что причиной супериндукции может быть замедление распада фермента после введения актиномицина D, вследствие чего общее количество активного белка увеличивается. По мнению Tomkins и др., в цитоплазме имеется специальный репрессорный белок, который задерживает синтез фермента в ответ на введение гормона; актиномиции D в свою очередь тормозит синтез этого респрессора и таким образом приводит к супер индукции. Schimke и др., Palmiter и Schimke па основании исследования гормональной регуляции синтеза овальбумина и других белков в яйцеводе кур пришли к мнению, что актиномицин D вызывает повышение абсолютной скорости синтеза овальбумина за счет снижения общего синтеза РНК, вследствие чего возрастает доля стабильной мРНК, кодирующей синтез овальбумина. Имеются также данные о влиянии актиномицина D на скорость распада РНК, в том числе и мРНК, на транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, а также о наличии цитотоксического действия этого антибиотика безотносительно к его влиянию на обмен РНК-

В целом данные, полученные с использованием актиномицина D, надо обсуждать с большой осторожностью и с учетом многообразия действия этого антибиотика.

Основные теории о местах приложения действия гормонов на биосинтез ферментов и других белков. Гипотеза о возможности гормональной регуляции синтеза ферментов путем прямого воздействия гормонов на генетический аппарат была впервые выдвинута Karlson и др. на основании данных, полученных с экдизоном. Экдизон является стероидным гормоном, стимулирующим линьку и метаморфоз насекомых. Введение экдизон а личинками комаров Chironomus tentans вызывает вздутия в отдельных локусах гена, что можно наблюдать при микроскопическом исследовании гигантских хромосом в слюнных железах. Эти пуффы появляются через 15 мин после введения экдизона; их наблюдали и без введения экдизона, в процессе естественного развития личинок. По мнению авторов, пуффы представляют собой места интенсивного синтеза мРНК, кодирующей фермент ДОФА-декарбоксилазу, который участвует в склеротизации кутикулы. Гормон связывается с репрессором и на освободившемся участке гена начинается образование указанной мРНК. Для клеток тканей животных, однако, нет таких же прямых доказательств непосредственного воздействия гормонов на геном, но о возможности влияния на процесс транскрипции свидетельствуют уже рассмотренные данные об активизации

РНК-полимеразы, усилении матричной активности хроматина, стимуляции синтеза мРНК- Поэтому можно полагать, что и у животных гормональный контроль биосинтеза ферментов и других белков может осуществляться на стадии транскрипции.

Другой гипотезой механизма гормональной регуляции биосинтеза белков является влияние гормонов преимущественно на процесс трансляции, вернее на стадии биосинтеза после транскрипции. Эту гипотезу впервые выдвинули Garrcn и др., Tomkins и др.. Она была развита в последующих работах этих и других авторов. Согласно этой гипотезе, гормоны, в частности стероидные, связывают лабильный белковый репрессор, который тормозит процесс трансляции мРНК в рибосомах. Синтез этого белкового репрессора относительно более чувствителен к актиномицину D, чем синтез мРНК для ряда ферментов, что хорошо объясняет парадоксальное' действие актиномицина D. В исследованиях па культуре клеток гепатомы крыс Tomkins и др. подробно исследовали динамику индукции тирозин-ами-нотрансферазы. Добавление к среде дексаметазона в концентрации IX Ю^-7 М приводило к увеличению скорости синтеза фермента и повышению его концентрации в клетках. После удаления дексаметазона из среды инкубации наступал период «деиндукции» продолжительностью около 4 ч. В этот период скорость синтеза фермента снижалась почти до исходной, а концентрация его еще значительно превышала исходные величины. Если в период деиндукции добавляли актиномицин D, то не отмечали снижения ни скорости синтеза, ни концентрации индуцированной тирозин-аминотрансферазы. Авторы считают эти данные серьезным подтверждением гипотезы о посттранскрипционном гормональном контроле индукции ферментов. Особенности действия различных гормонов на активность разных ферментов могут проявиться и во влиянии на процессы биосинтеза. При исследовании гормональной индукции тирозин-аминотрансферазы в культуре клеток генатомы Н-35 Lee и др., Reel и др. пришли к выводу о том, что механизмы индукции фермента кортизолом и инсулином различны: кортизол, по мнению авторов, влияет главным образом па транскрипцию, а инсулин -- на трансляцию, хотя нельзя исключить воздействия обоих гормонов на обе стадии биосинтеза.