Гормональная индукция ферментов

Рис.14. Схема, иллюстрирующая активацию протеинкиназы через посредство цАМФ

Зависимые от цАМФ и цГМФ протеинкиназы широко распространены в природе, поэтому их функции, вероятно, очень важны. Имеются данные о том, что фосфорили-рование имеет большое значение для биосинтеза белков. Так, в аденогииофизе обнаружили свободную и связанную с мембранами специфическую, активируемую цАМФ протеинкиназу, которая стимулировала фосфорилирование белков рибосом. Полисомы, выделенные из щитовидной железы быка и инкубированиые с циклическими нуклеотидами, обладали повышенной функциональной активностью. Интересно, что добавление цГМФ повышало включение метки в полисомы на 118-126%, а добавление цАМФ -- только на 16-24%.

Возможно, что фосфорилировапие рибосомных белков является одним из путей регуляции биосинтеза белков аденогипофиза на уровне трансляции. О возможном участии цАМФ свидетельствует торможение актииомицином D увеличения активности серин-дегидратазы в печени крыс в ответ на введение цАМФ. Местом приложения действия цАМФ в процессе биосинтеза ферментов является скорее всего стадия терминации, т. е. освобождение только что синтезированного пептида из полисомы. Цикло-АМФ стимулирует синтез киназина и структурных белков в митохондриях печени крыс.

Установлена важная роль цАМФ в процессах биосинтеза кортикостероидов в коре надпочечников, в секреции инсулина, кальцитонипа, в передаче нервного возбуждения в клетках центральной нервной системы и в других физиологических процессах.

В последние годы получили большое развитие работы о роли циклического аденозинмонофосфата в качестве «универсальных» посредников реакции клетки на действие гормонов.

Показано присутствие цАМФ практически во всех тканях многоклеточных организмов, причем концентрация этого нуклеотида очень низка и довольно постоянна в условиях гормонального «покоя». Введение многих гормонов повышает количество цАМФ в тех тканях, которые отвечают на эти гормоны. Инсулин, простагландины, мелатонипы и катехоламины, вызывающие стимуляцию б-адренорецепторов, снижают концентрацию цАМФ в тканях, па которые эти гормоны действуют. Такая корреляция между физиологическим эффектом гормона и изменением содержания цАМФ позволяет сделать вывод, что действие гормонов в ряде случаев опосредовано путем изменения количества цАМФ в клетке. Участие цАМФ в гормональной индукции ферментов убедительно показано на примере индукции тирозин-аминотрансферазы в печени адрепалэктомированных крыс, которым вводили дибутирил-цАМФ и глюкагон. По всей вероятности, цАМФ является посредником действия глюкагона на биосинтез ряда ферментов в печени; действие кортикостероидов, видимо, не опосредовано через нуклеотид. Возможно также, что через цАМФ опосредовано, хотя бы частично, влияние голода, инсулина и диабета на активность некоторых ферментов в печени.

Рис.15. Участие цАМФ в гормональной регуляции обменных процессов.

Действие цАМФ в качестве эффектора ферментов заключается в основном в активации протеинкиназы -- фермента, катализирующего фосфорилирование киназы, фосфорилазы и других белков. Фосфорилирование белков, по всей вероятности, является очень важным звеном для ряда процессов, в частности для биосинтеза белка. Влияние на биосинтез белков лежит, возможно, в основе участия цАМФ в регуляции таких процессов, как липолиз, биосинтез кортикостероидов, секреция инсулина, передача нервного возбуждения и др.

5 Интеграция гормональной регуляции с другими факторами, влияющими на активность ферментов

Поскольку в целостном организме на активность ферментов помимо гормонов, влияет большое число других различных факторов, очень важно выяснить их взаимодействие с гормональной регуляцией ферментативной активности.

Роль пищевой регуляции активности ферментов и ее связь с гормональной регуляцией. Среди регуляторов активности ферментов самым «мощным» наряду с гормонами является характер питания. Работами С. Я. Капланского и его сотрудников установлено, что белковая недостаточность, развивающаяся при содержании животных на рационах с 3% белка, приводит к нарушению функций многих ферментных систем, катализирующих важнейшие процессы обмена. Восстановление этих функций является необходимым условием для ликвидации всех последствий белковой недостаточности, часто сопутствующей многим заболеваниям. Однако восстановление активности ферментных систем печени в этих случаях нередко происходит очень медленно даже при введении в организм большого количества полноценных белков или аминокислотных препаратов. В последующих работах было показано, что нормализация активности некоторых ферментных систем печени может быть значительно ускорена при введении животным гормонов щитовидной железы и коры надпочечника.

Рис.16 Влияние длительности голодания на активность серин-дегидратазы в печени интактных и адреналэктомировапных крыс.

В многочисленных работах показано изменение активности ферментов при голодании. Schmidinger и Kroger изучали влияние длительности голодания на активность серин-дегидратазы в печени интактных и адреналэктомированных крыс. Голодание значительно повышало активность серин-дегидратазы, причем более резко у адреналэктомировапных крыс. Введение Голодающим животным кортизона по 1--4 мг/100 г массы вызывало еще большее увеличение активности фермента в печени адреналэктомировапных крыс. Интересные данные в отношении серии-дегидратазы были получены Straub и др. в опытах на гипофизэктомиро-ванных крысах. Животных после операции содержали на безбелковой диете, после чего переводили на голодание ё течение 36 ч. Некоторым животным вводили внутрибрюшинно фракцию свиного гипофиза, обладающую способностью активировать липолиз.

Очевидно, индукция фермента при голоде связана с действием гормонов, так как введение липотропина отчетливо усиливало индуцирующее влияние голодания. Об участии гормонов в индукции серин-дегидратазы голодом свидетельствует также тот факт, что удаление поджелудочной железы у крыс снимает эффект голодания.

Таблица 16 - Активность серин-дегйдратазы в печени крыс

Группа животных	Активность серин-дегидратазы, " мкмоль пирувата/мг белка/ч
Физиологический рацион	1,5
Безбелковая диета	0,2
Голодание, 36 ч	18,6
Голодание + внутрибрюшинно липотропная фракция	30,9

Индукция голодом показана и для других ферментов, в частности для аргиназы печени крыс.

В настоящее время особенно большое внимание уделяется вопросам влияния высокого содержания белка в рационе на ферментативную активность и выяснению роли гормонов в белковой индукции ферментов.

При содержании животных на рационах с высоким содержанием белка значительно возрастает активность аргиназы и аргининсинтетазы, серин-дегидратазы, аспартат-аминотрансферазы, глюкозо-6-фосфа-тазы, тирозин-аминотрансферазы, трип-тофаноксигеназы, орнитин-аминотрансферазы в печени животных. Предварительная гипофизэктомия снижает белковую индукцию серин-дегидратазы, асиартат- и тирозин-аминотрансфераз и глюкозо-6-фосфатазы. Введение триамцинолона и кортизона задерживает увеличение активности ориитип-аминотрансферазы в печени крыс при содержании животных на диете с 60% белка.

Мы сопоставляли гормональную и белковую индукцию треонин-дегидратазы. Животных содержали на рационах с 24% или 80% белка в течение 5 дней; отдельным животным вводили внутримышечно кортизон по 2,5 мг/100 г массы также в течение этих же 5 дней. Кроме того, такие же опыты провели и на адреналэктомированных крысах, которых переводили на высокобелковый рацион через 5 дней после операции. Как видно на рис. увеличение содержания белка в рационе вызывает значительное увеличение активности треонин-дегидратазы в печени, а совместное воздействие 80% белка в диете и введения кортизона дает максимальную индукцию. Величина максимальной индукции примерно одинакова у интактных и адреналэктомированпых крыс. Интересно, что индуцирующий эффект высокобелкового рациона был гораздо выше у адреналэктомировапных, чем у интактных животных. Большую индукцию белком пищи аланип-аминотрансферазы у адреналэктомированпых крыс отмечал также Freedland. Вероятно, зависимость величины белковой индукции ферментов от гормонального статуса животных является общим правилом, распространяющимся и па другие эндокринные железы, помимо надпочечников. Об этом, в частности, свидетельствуют результаты исследований К. Н. Мясо-едовой о белковой индукции фермента гистидин-дезамииазы. Этот фермент катализирует первый этап превращения незаменимой аминокислоты гистидина в уроканиновую кислоту и аммиак.

Рис.17. Влияние 80% белка в пищевом рационе и введения кортизона на активность треонин-дегидратазы в печени интактных и адреналэктомировапных крыс.

К.Н. Мясоедова показала, что у тиреоидэк-томированных крыс величина белковой индукции гораздо больше, чем у интактных животных, хотя характер зависимости активности фермента от содержания белка в рационе был однотипным.

Установлено влияние режима питания и гормонов на изоферменты серин-дегидратазы. Inoue и Pitot показали, что в печени крыс этот фермент присутствует в виде 2 изоферментов - I и II. Активность фермента в целом и соотношение его изоферментов значительно меняются в зависимости от характера питания и гормонов.

Сходные с белковой индукцией данные были получены при индукции ферментов гидролизатами белков и смесями аминокислот, вводимых перорально. Значительное увеличение ферментативной активности после введения гидролизата казеина было показано для серин-дегидратазы и тирозин-аминотрансферазы, причем индукция была хорошо выражена у адреналэктомированных крыс, а совместное введение гидролизата казеина и кортизола давало суммацию эффектов этих индукторов. Мы попытались сравнить характер индукции треонин-дегидратазы гидролизатом лактальбумина у интактных и адреналэктомированных крыс. Животным вводили через зонд в желудок гидролизат лактальбумина по 1 г 2 раза в день в течение 1 или 3 дней, забивали через 5 ч после последнего введения и определяли активность треонин-дегидратазы в гомогенатах печени. Данные представлены в табл.17

Таблица 17 - Влияние введения гидролизата лактальбумина peros на активность треонин-дегидратазы в печени крыс

Группа животных	Активность фермента
Интактные	16,7
Гидролизат, 1 день	36,3
То же, 3 дня	78,4
Адреналэктомия	12,1
Адреналэктомия + гидролизат, 1 день	26,5'
То же, 3 дня	27,5

Как видно из данных табл.17, у адреналэктомированных крыс ответ фермента на введение гидролизата белка был заметно слабее, чем у интактных; увеличение срока введения до 3 дней не вызывало дальнейшего повышения ферментативной активности, как это имело место у интактных животных. Вероятно, для треонин-дегидратазы индукция гидролизатом белка опосредована, хотя бы частично, через гормоны коры надпочечников.

Сходное с гидролизатом казеина действие оказывало введение смесей аминокислот, что было показано для гистидиндезаминазы, серин-дегидратазы и других ферментов. Особенно резкое увеличение активности серин-дегидратазы, орнитин-аминотрансферазы, гистидиндезаминазы, тирозин-аминотрансферазы и триптофаноксигеназы в печени крыс после введения смеси аминокислот наблюдали в том случае, если животные предварительно получали рацион, недостаточный по содержанию белка.

При выяснении возможных механизмов индукции ферментов в ответ на введение аминокислот было сделано несколько предположений. Одно из них заключается в том, что аминокислоты не только являются «строительным материалом» для биосинтеза ферментов, но активно воздействуют на «биосинтетическую машину» клетки. Подтверждением этому является увеличение количества полисом в печени после введения полной смеси аминокислот животным; такой же эффект получен и при перфузии печени крыс средой, содержащей полную смесь аминокислот. Возможно, что местом биосинтеза белка, на котором проявляется эффект аминокислот, является связывание рибосом с РНК. Интересно, что не все аминокислоты одинаково индуцируют ферменты: например, при исследовании индукции серин-дегидратазы и фосфоглицератдегидрогеназы в печени крыс белками и аминокислотами пищи Mauron и др. пришли к выводу, что «активными» аминокислотами являются метионин, триптофан, треонин и серии. Особая роль триптофана в индукции ферментов и биосинтеза белка рассмотрена ниже.

Большое число работ посвящено исследованию влияния углеводных компонентов пищи и особенно роли глюкозы в регуляции активности ферментов. Интересные данные получили Н. А. Юдаева и М. Б. Лебедева в отношении фермента глюкозо-6-фосфатазы. Глюкозо-6-фосфатаза катализирует образование глюкозы из глюкозо-6-фосфата и является последним ферментом в цепи образования глюкозы.

З.Б. Юдаев и М.Б. Лебедева показали, что активность глюкозо-6-фосфатазы в печени крыс значительно возрастает после двухдневного содержания животных на рационе с 80% сахарозы. Удаление надпочечников мало влияет на активность фермента, но резко снижает величину ответа на высокосахарозную диету. Введение кортизона в малых дозах, не влияющих на ферментативную активность, полностью восстанавливает индукцию фермента сахарозной диетой. Эти результаты, очень наглядно показывающие важную роль надпочечных желез в индукции' ферментов пищевыми факторами, были подтверждены исследованиями других авторов.

В табл. 17 приведены данные о роли гормонов надпочечников и щитовидной железы в индукции глюкозо-6-фосфатазы в печени крыс высокобелковым или высокофруктозным рационами, скармливаемыми животным в течение 5 дней. Как видно из этих данных, кроме гормонов коры надпочечника, гормоны щитовидной железы принимают участие в индукции глюкозо-6-фосфатазы при высоком содержании фруктозы или белка в диете.

Значительная индукция высокофруктозным рационом показана и для аргиназы печени крыс.

Выяснение роли глюкозы в индукции ферментов различными факторами представляет особенно большой интерес. Этот интерес вызывается тем обстоятельством, что глюкоза является репрессором, т. е. значительно тормозит продукцию ферментов у бактерий. Репрессорный эффект глюкозы был показан и у животных. Добавление глюкозы к гидролизату казеина, вводимому в желудок, предупреждало повышение активности серин-дегидратазы и орнитин-амииотрансферазы в печени крыс. Глюкоза тормозила также индукцию гистидиндезаминазы и уроканиназы в печени крыс смесью аминокислот и кортизоловую индукцию аспартат-аминотрансферазы в печени неполовозрелых крыс-самцов. Интересно, что у половозрелых крыс-самцов глюкоза, наоборот, усиливала индуцирующий эффект кортизона в отношении аминотрансфераз печени. Эти результаты говорят о важности состояния энергетического обеспечения тканей для феномена индукции ферментов.

Имеются данные относительно индукции ферментов жирами пищи, но роль гормонов в этом случае почти не исследована.

Таким образом, представленные данные четко указывают на важную роль взаимодействия гормонов с пищевыми факторами в индукции ферментов. Однако природу этого взаимодействия и первичность влияния того или иного индуктора установить часто очень трудно. Peraino на основании анализа собственных исследований и данных литературы предлагает схему взаимоотношения различных регуляторов в индукции 4 ферментов.

Конечно, для других ферментов взаимоотношения могут быть совершенно иными; не исключена возможность того, что и в отношении этих же ферментов появятся новые данные. Для серин-дегидратазы спорным представляется второстепенная роль кортизона. Уже упоминавшиеся данные Inoue и Pitot свидетельствуют о наличии двух изоферментов серин-дегидратазы, один из которых индуцируется кортизоном, а другой -- глюкагоном. В связи с этим вероятнее, что глюкокортикоиды принимают непосредственное участие в индукции этого фермента.

Одним из возможных механизмов индукции ферментов пищевыми факторами является усиление секреции гормонов при действии этих факторов. Действительно, при высокобелковом рационе повышается секреция глюкагона, при голодании снижается секреция инсулина; изменяется, вероятно, секреция и других гормонов. Однако это предположение не объясняет пищевой индукции ферментов после удаления отдельных эндокринных желез. Кроме того, вряд ли можно сводить к одному механизму влияние такого мощного стимула, как состав пищи. Необходимо учитывать многие другие возможности.

Определенную роль, возможно, играет увеличение поступления аминокислот, могущих быть использованными для биосинтеза белковой части ферментов. Несомненно, введение белков, углеводов и аминокислот влияет на функцию белоксинтезирующего аппарата клетки. В пользу этого говорит усиление дезагрегации полисом в печени крыс при голоде и снятие ее скармливанием глюкозы. В последнее время появились данные о влиянии пищевой индукции на скорость распада ферментов в организме.

После перевода крыс с рациона, содержащего 70% белка, па рацион с 8% белка время полураспада аргиназы в печени снижалось с 5 до 3 дней. Скармливание 90% фруктозы в рационе повышало активность и снижало Ь/₂ малатдегидрогеназы в печени крыс. Взаимоотношения состава диеты и некоторых гормонов во влиянии на период полураспада 3 ферментов приведены в табл. Как видно из данных и кортизол и тироксин влияют на изменение tV₂ при переводе животных с одного режима питания на другой.

Одной из причин изменения ty₂ ферментов может быть изменение активности специфических протеиназ, разрушающих эти ферменты. Действительно, Katunuma и др. показали зависимость активности этих протеиназ от характера питания.

Таблица 18 - Влияние диеты и гормонов на величины полураспада 3 ферментов в печени крыс

Изменение диегы	Гормон	Ссрин-дегид-ратаза	Аланин-ами-нотраисфераза	Аспартат-аминотранс-фераза
Гл -s- Каз		30	35	37
Г л -J- Каз	Кортизол	44	34	20
Гл -S- Каз	Тироксин	22	25	32
Каз -> Г л	' --	28	33	60
Каз -S- Гл	Кортизол	40	27	41
Каз -> Гл	Тироксин	20	27	86
Каз -S- Фр	--	26-30	72-80	52-76

Условные обозначения: Гл-> Каз: 90% глюкозы 4 дня, затем 90% казеина 5 дней; Каз Гл: наоборот; Каз Фр: 90% казеина 5 дней, затем 90% фруктозы 4 дня

Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что гормонам принадлежит важная роль в регуляции ферментативной активности пищевыми факторами.

Взаимосвязь гормонов с субстратной «индукцией» ферментов. В первых работах, посвященных исследованию индукции триптофапоксигеназы и тирозин-аминотрансфера-зы, было постулировано существование 2 видов индукторов: кортикостероидов и субстратов. Это предположение было основано на том, что активность обоих указанных ферментов возрастает после введения триптофана и тирозина.

Как видно из данных триптофан индуцирует триптофапоксигеназу у адреналэктомироваиных, а тирозин - тирозин-аминотрансферазу только у интактных крыс; однако совместное введение любого субстрата с кортизолом приводит к повышению активности в большей степени, чем субстрата и гормона порознь.

Е. Ф. Ефимочкииа показала, что увеличение активности триптофаноксигеназы в печени крыс происходит не только после внутрибрюшинного введения триптофана, но и после приема per os, а также в опытах с инкубацией срезов печени крыс in vitro. В последующих работах было высказано предположение, что влияние субстрата на активность триптофаноксигеназы является истинной индукцией, т. е. связано с увеличением биосинтеза ферментного белка. Однако в дальнейшем Schimke и др. убедительно доказали, что увеличение активности триптофаноксигеназы после введения субстрата не является истинной индукцией, а связано со стабилизацией фермента и снижением скорости его распада. О стабилизации свидетельствовал тот факт, что фермент, выделенный из печени животных, получавших триптофан, более устойчив к денатурирующим воздействиям и к протеиназам, чем фермент из печени интактных крыс.

Триптофаноксигеназа является сложным ферментом, имеющим в своем составе гематиновый кофактор. Повышение ферментативной активности после введения субстрата складывается из 2 механизмов: 1) активации путем насыщения апофермента гематиновым кофактором; 2) накопления фермента вследствие его стабилизации.

Субстратная стабилизация триптофаноксигеназы может осуществляться путем прямого воздействия триптофана на конформацию фермента, изменяющуюся таким образом, что фермент становится устойчивым к инактивации или распаду. Данные Schimke были подтверждены в работах других авторов. Shore И др. нашли, что Vf₂ триптофаноксигеназы в печени крыс составляет в контроле 1,3 ч, а после введения триптофана в дозе 100 мг/100 г массы равна:

через 2 ч -- 25,9 ч

» 3 » -- 5,5 »

» 4 » -- 4,1 »

» 8 » -- 3,3 »

В целом влияние кортикостероидов и триптофана на активность триптофаноксигеназы можно объяснить следующими данными. Введение животным гидрокортизона приводит к увеличению активности фермента вследствие увеличения скорости его синтеза; триптофан вызывает повышение стабильности фермента, а совместное введение гормона и субстрата обусловливает интеграцию этих механизмов, в результате чего ферментативная активность возрастает особенно резко.

В последнее время снова возник вопрос о том, что хотя действие триптофана связано со стабилизацией триптофаноксигеназы, но не ограничивается одной стабилизацией и эта аминокислота играет особую роль в регуляции активности и других ферментов, субстратом которых она не является. Предположение об особой роли триптофана возникло впервые при изучении индукции ферментов смесями аминокислот. Для многих ферментов было установлено, что исключение из смеси аминокислот именно триптофана резко снижало или полностью снимало индуцирующий эффект аминокислот. Совсем недавно было показано, что триптофан принимает участие в гормональной индукции триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы. В этих опытах адреналэктомированных- крыс 3 дня содержали на рационе с 12,5% белка, после этого крысы голодали 12 ч, а затем в желудок вводили L-триптофан и животных забивали.

Результаты показывают, что активность тирозин-аминотрансферазы в печени крыс после введения триптофана резко возрастала и была максимальной через 6 ч после введения аминокислоты в дозе 0,2 г па 1 кг массы тела. Для выяснения взаимосвязи гормональной и триптофановой регуляции авторы поставили следующие опыты. Адреналэктомированным крысам однократно внутрибрюшинно вводили по 5 мг кортизона и через 5 ч в желудок вводили L-триптофан в дозе 100 мг/100 г массы. Определение активности тирозин-аминотрансферазы и триптофаноксигеназы показало, что триптофан вызывал дальнейшее повышение активности, которое продолжалось в период, когда у животных, получавших один кортизон, активность ферментов уже возвращалась к исходным величинам.

Рис.18. Влияние введения L-триптофана на активность индуцированных кортизоном тирозин-аминотрансферазы и триптофаноксигеназы в печени адреналэктомировапных крыс. Стрелкой указан момент введения триптофана

Иммунохимическим методом и по включению ¹⁴С-вали-на в ферментный белок установили, что введение триптофана задерживало распад тирозин-аминотрансферазы. Авторы полагают, что триптофан играет особую роль в регуляции синтеза белков, в том числе и ферментных, в печени. Возможно также, что триптофан может влиять, помимо стабилизации и активации, и на синтез триптофаноксигеназы.· Это последнее предположение основано на ряде интересных фактических данных. Введение крысам смеси, содержащей все аминокислоты, кроме триптофана, приводило к значительному снижению количества полисом в печени, а введение триптофана в желудок мышей сдвигало профиль рибосом печени в сторону преобладания полисом. Кроме того, при недостаточности триптофана в пище заметно снижалось содержание триптофановой тРНК- Это снижение было выражено гораздо сильнее, чем уменьшение количества других тРНК при содержании животных на диетах с недостатком других аминокислот. После введения триптофана значительно повышалось включение предшественников в ДНК-подобную РНК ядер печени адреналэктомированиых крыс и интактных мышей.

Не исключена возможность определенной роли субстратной регуляции и в гормональной индукции тирозин-аминотраисферазы. Косвенным подтверждением этого является повышение активности фермента у молодых адреналэктомированиых крыс через 24 ч после введения L-тирозииа, а также зависимость ответа фермента на введение тирозина от функционального состояния щитовидной железы.

Установлено также, что гормоны влияют на содержание аминокислот в печени. Введение адреналэктомированным крысам 5 мг/кг кортизона приводило через 4 ч к следующим изменениям количества некоторых аминокислот в печени:

тирозин --31

глутаминовая кислота +33

аспарагиновая кислота +12

аланин +53

Поскольку все эти аминокислоты являются субстратами соответствующих ферментов, указанные изменения могут влиять на активность этих ферментов при посредстве «субстратной индукции».

6 Взаимосвязь влияния гормонов на активность ферментов с некоторыми компонентами внутренней и внешней среды организма

Поскольку активность ферментов в клетках зависит от многих факторов внутренней среды, то влияние на количество и соотношение этих факторов является дополнительной возможностью гормональной регуляции. Наиболее ярким примером может служить действие альдостерона на обмен электролитов и воды в организме, а также специфический контроль парат-гормоном и тирокальцитонином обмена кальция и фосфора. Внутриклеточная концентрация ионов определяет протекание очень многих процессов; например, она может изменять функциональную активность генома. Высокая концентрация ионов может стимулировать контролируемый андрогенами и эоурогенами синтез РНК в ядрах клеток половых органов крыс. Особенно важна роль ионов кальция, которые необходимы для активности многих ферментов.

Не исключена возможность взаимодействия гормонов с ионами металлов, многие из которых являются компонентами ферментных систем. Такая возможность установлена для тироксина, образующего комплексы с ионами меди, магния,. марганца, кобальта и цинка. Показано, что содержание меди в печени новорожденных крысят выше, чем у взрослых, а активность триптофаноксигеназы, наоборот, очень низкая и возрастает заметно к двухнедельному возрасту, когда количество Cu²+ снижается. Адреналэктомия у взрослых крыс приводит к повышению содержания Cu²+ в печени и снижению его в почках. Возможно, действие кортикоидов на баланс меди в печени опосредовано через влияние на синтез специфических белков, управляющих обменом меди. Инсулин в дозах, вызывающих коматозное состояние, увеличивает содержание меди в костях, мышцах, почках и мозге и снижает ее количество в печени, крови и поджелудочной железе кошек. Так или иначе одним из путей гормональной регуляции ферментативной активности может быть изменение ионного состава среды клетки.

На величину гормональной индукции ферментов оказывает влияние бактериальная флора кишечника. Katunurna и др. показали, что гормональная индукция тирозин-аминотрансферазы у «стерильных» крыс происходит слабее, чем у крыс, выращенных в обычных условиях. Для выяснения роли бактериальной флоры у готобиоптов проводили очистку бактериальной флоры кишечника обычных крыс и полученный бактериальный экстракт вводили отдельно или вместе с гормонами. Оказалось, что сам БЭ индуцировал тирозин-аминотрансферазу с максимумом через 5 ч; при введении БЭ+триамцинолон адренал-эктомированным крысам активность фермента возрастала в 20-30 раз, а после введения одного стероида -- только в 10 раз. На индукцию тирозин-аминотрансферазы глюкагоном или инсулином БЭ не оказывал влияния. При дальнейшей очистке БЭ авторы пришли к выводу, что влияющий на гормональную индукцию бактериальный фактор является полипептидом и его относительная молекулярная масса составляет от 1500 до 12000.

Данные относительно взаимодействия гормонов с другими регуляторами представляют также очень большой интерес, так как в целостном организме активность ферментов является результирующей разнообразных воздействий. Однако по этому вопросу не удается создать законченную картину вследствие отрывочности наших знаний в этой области.

Некоторые аспекты взаимосвязи гормональной и нервной регуляции активности ферментов. Хорошо известно, что активность ферментов изменяется в зависимости от функционального состояния центральной нервной системы и периферической иннервации. Данных в этой области очень много и рассмотрение их не входит в задачу настоящей работы. Однако необходимо иллюстрировать хотя бы несколькими примерами связь гормональной и нервной регуляции ферментативной активности.

Schimazu исследовал значение некоторых отделов гипоталамуса в регуляции триптофаноксигеназы - одного из наиболее изученных в отношении гормональной регуляции ферментов. Производили электростимуляцию различных участков гипоталамуса у кроликов длительностью по 20 с, каждые 5 мин в течение 20 ч. Затем животных забивали и в печени определяли активность триптофаноксигеназы.

Как видно из данных, раздражение симпатической области гипоталамуса вызывало большее повышение ферментативной активности, чем раздражение парасимпатической области.

Различное увеличение активности триптофаноксигеназы после стимуляции разных областей сопровождалось различным насыщением апофермента кофактором: после стимуляции симпатической области 53% апофермента было насыщено кофактором, а после стимуляции парасимпатической области - только 18%.

Интересен вопрос о характере гормональной индукции ферментов в тканях, лишенных нервной импульсации. Различные ткани реагируют по-разному на денервацию; очень «реактивны» мышцы и печень.

Многократное введение кортизола вызывает у крыс с денервированной печенью гораздо более резкое повышение активности аланин- и аспартат-аминотрансфераз, чем в печени интактных животных. Денерация икроножной мышцы у крыс приводит к значительному увеличению скорости синтеза глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у самок, но не влияет на активность этого фермента у самцов. Кастрация замедляет увеличение активности фермента после денервации, а введение эстрадиола восстанавливает эффект денервации. Интересно, что после денервации возрастает в основном количество той изоформы глюкозо-6-фосфатде-гидрогепазы, которая наиболее чувствительна к индукции гормонами. В отличие от влияния на ферментные белки денервация снижает синтез общих белков мышц и повышает скорость их распада.

Приведенные примеры свидетельствуют о важной роли нервной регуляции, которая может усиливать или ослаблять гормональную индукцию ферментов.

7 Сезонные и суточные изменения активности ферментов; роль гормонов

Длительное время не поддавались объяснению противоречия в данных различных авторов, полученных при определении активности одного и того же фермента. Некоторую ясность внесли в этот вопрос работы, показавшие, что ферментативная активность в тканях животных меняется в зависимости от времени года и от времени суток. В качестве примера можно привести сезонные колебания активности пролиноксидазы и триптофаноксигеназы в печени крыс. Активность этих ферментов подвержена сезонным колебаниям; для пролипоксидазы она максимальна весной и наиболее низкая зимой, для триптофаноксигеназы имеет волнообразный характер с повышением летом и зимой и снижением весной и осенью. По данным Braidman и Rose, в апреле--мае активность триптофаноксигеназы составляет 5,1+0,7 мкмоль, а в сентябре -- ноябре 3,3+0,4 мкмоль кинуренина на 1 г печени в час. Это различие является статистически достоверным.

Многие ферменты имеют характерные суточные ритмы. Особенно подробно исследовали суточный ритм активности тирозин-аминотрансферазы. Potter и др. показали, что максимальная активность фермента отмечается в период от 20-го до 23-го часа. Непрерывное освещение крыс в течение 3 недель нарушало нормальный ритм. Исследование суточных колебаний активности тирозин-аминотрансферазы в зависимости от гормонального статуса животных было проведено Shambauch и др.

У интактных крыс в соответствии с данными других авторов активность была максимальной примерно в 22 ч, плато -- в период от 8-го до 16-го часа. Адреналэктомия сдвигала пик активности на 24 ч; у животных с удаленным гипофизом активность в целом была значительно снижена, но слабый пик все же проявлялся в 22 ч. Ти-реоидэктомия, наоборот, резко повышала активность в 22 ч с последующим резким снижением в 24 ч. При определении суточного ритма содержания кортикостероидов в крови крыс нашли, что максимальное количество приходится на время 16-18 ч. Поскольку максимум кортикостероидной индукции этого фермента наступает через 4-6 ч после введения стероидов, можно считать пик активности в 22 ч результатом индукции в ответ на максимальное поступление гормонов в печень. Однако на основании одного только совпадения во времени трудно судить о причине и следствии; вероятно, определенную роль играют и другие факторы. Возможно, что какое-то значение имеют суточные колебания концентрации тирозина в крови. По данным Shambauch и др., содержание тирозина в печени крыс составляло по приводимой схеме.

После введения интактным крысам тироксина в 10 ч было 523 мкг/г белка, кортикостерона -- 297 мкг/г белка, а в 22 ч -- 121 и 177 мкг/г белка соответственно.

Суточные изменения содержания тирозина обнаружены также в крови людей. Предполагают, что суточный ритм активности тирозин-аминотрансфсразы индуцируется аминокислотами пищи и что в этой индукции участвуют гормоны коры надпочечников.

Интересные данные получены в отношении суточного ритма оксиметилглутарил-КоА-редуктазы у крыс. У здоровых животных активность этого фермента имела четкий суточный ритм с максимумом в 24 ч. Диабет резко снижал ферментативную активность и почти полностью снимал суточные колебания, а введение инсулина восстанавливало и активность, и циркадный ритм фермента. Введение глюкагона и кортизола значительно снижало величину максимума в 24 ч. Поскольку данный фермент участвует в биосинтезе холестерина, изменения его активности и суточного ритма при диабете могут быть связаны с возникновением сердечно-сосудистой патологии, часто сопутствующей диабету.

Wurtmann и др. нашли, что количество одного из нейромедиаторов -- норадреналина -- ритмично меняется в эпифизе, слюнных железах и моче крыс на протяжении суток. На основании этих данных авторы считают, что нервная система участвует в функционировании суточного ритма тирозин-аминотрансферазы при посредстве катехоламинов. Показано наличие суточных ритмов и для других ферментов: триптофаноксигеназы, аденилциклазы, гидроксилазы тирозина, трансамидииазы.

Сезонные й суточные изменения активности ферментов, играющие важную роль в адаптации процессов обмена к различным условиям среды, являются одной из сторон многообразия гормональной регуляции активности ферментов.

Очень важным аспектом гормональной регуляции активности ферментов является участие гормонов в индукции ферментов другими, помимо гормонов, факторами. Среди этих факторов особенно большое значение принадлежит белкам, аминокислотам и углеводам, поступающим с пищей.

Высокое содержание белка в рационе приводит к значительному увеличению активности многих ферментов. Тот факт, что белковая индукция имеет место и у адреналэктомировапных животных, говорит об ее известной независимости от гормонов коры надпочечников. Однако величина белковой индукции" зависит от эндокринного статуса животных, а совместное введение белка и.кортикостероидов дает суммацию эффекта для ряда ферментов. Индукция ферментов в тканях может быть вызвана введением гидролизатов белков или смесей аминокислот, а также увеличением содержания в пище углеводов -- сахарозы, фруктозы и др. Для такого вида индукции также имеет значение содержание гормонов в организме. Особенно наглядно это видно на примере пермиссивного действия кортикостероидов при индукции глюкозо-6-фосфа-тазы в печени животных рационом с высоким содержанием сахарозы.

Регуляция активности осуществляется путем влияния не только на скорость биосинтеза ферментов, но также и на скорость их распада. Такое влияние присуще как гормонам, так и компонентам пищи, особенно белку. Это обстоятельство подчеркивает важность учета состояния питания при исследовании влияния гормонов на активность ферментов.

Одним из путей регуляции ферментативной активности является «субстратная» индукция. Эта индукция заключается в стабилизации ферментов в результате изменения конформации ферментного белка. Роль субстратов в механизмах гормональной индукции изучена еще недостаточно. Наиболее исследован триптофан, который, являясь субстратом триптофаноксигеназы, играет важную роль в регуляции активности и других ферментов.

Одним из возможных путей эффекта триптофана может быть воздействие его и па биосинтез ферментных белков.

Мало изучен вопрос относительно влияния гормонов на активность ферментов посредством изменения ионного состава и других компонентов внутренней среды клетки, хотя имеются данные о возможности такого влияния.

Не вызывает сомнения участие гормонов в сезонных и суточных изменениях активности, установленных в отношении ряда ферментов.

В целом гормоны являются непременными участниками регуляторных воздействий различных факторов на ферментативную активность.

8 Основные функции клетки

8.1 Проницаемость и транспорт веществ в биологических мембранах

Одна из важнейших функций биологической мембраны заключается в обеспечении обмена ионов и молекул между клеткой и окружающей средой. С позиций термодинамики клетка -- открытая система, непрерывно обменивающаяся веществом и энергией с окружающей средой. Способность биологических мембран пропускать через себя различные вещества называется проницаемостью. Данный раздел биофизики посвящен динамике входа веществ в клетку и выхода из нее, механизмам распределения веществ между клеткой и средой в состоянии покоя и при функционировании. Изучение проницаемости клеток имеет большое значение, поскольку с данной функцией связаны практически все процессы жизнедеятельности клетки: метаболизм, генерация и проведение биопотенциалов, секреция, рецепция и т.д. Изучение процессов проницаемости имеет также большое практическое значение для биологии, сельского хозяйства, медицины, фармакологии и токсикологии.

8.1.1 Методы изучения проницаемости

Для исследования проницаемости клеточных мембран в настоящее время применяют ряд физико-химических методов: объемные, индикаторные, методы аналитической и коллоидной химии, метод определения электропроводности, метод меченых атомов, регистрация флуоресценции, радиоспектроскопия и др.

Наиболее простые осмотические методы исследования проницаемости мембраны основаны на регистрации изменений объема клеток при помещении их в гипер- или гипотонические растворы. Когда клетки помещают в гипертонический раствор, то вследствие выхода из них воды объем их уменьшается, а по мере поступления вещества в клетку разность осмотического давления снижается и она восстанавливает свой первоначальный объем. По скорости восстановления объема клеток судят о скорости проникновения в них веществ. Для объективной оценки этих процессов существуют некоторые дополнительные процедуры: взвесь клеток центрифугируют и либо определяют суммарный объем взвеси с помощью гематокрита, либо оценивают динамику изменения светопропускания или показателя преломления клеток. К недостатку данного метода относится возможность применять его для работы с ограниченным кругом объектов. При исследованиях проницаемости таких веществ можно использовать лишь их высокие концентрации.

Индикаторные методы основаны на изменении окраски клеточного содержимого при поступлении определенных веществ. Суть метода заключается в том, что сначала в клетку вводят хромофор, а затем помещают ее в раствор с исследуемым веществом и наблюдают изменение окрашивания. Недостатки данной группы методов связаны с тем, что малые концентрации красителей трудно обнаружить, а большие токсичны; кроме того, большая часть красителей в клетке, как правило, включается в метаболизм, что искажает результаты исследования. Очевидно, что осмотический и индикаторный методы позволяют получить только качественный ответ, но не используются для количественной оценки изменения проницаемости мембраны.

Весьма надежны в исследованиях проницаемости химические методы, основанные на непосредственном анализе состава внутриклеточного содержимого. Однако эти методы сложны, и число объектов, для которых они применимы, ограничено.

В некоторых случаях проницаемость определяют методом кондуктометрии. Исследование электрических параметров клеток и компонентов плазмы крови и других тканей проводят с помощью широкополосного синфазного моста переменного тока, что обеспечивает максимальную чувствительность и независимость плечевого коэффициента от частоты подаваемого электрического тока. Вспомогательные плечи моста образованы вторичными обмотками широкополосного высокочастотного трансформатора. Отношение вспомогательных плеч составляет 1:20. Амплитуда тестирующего сигнала не должна превышать 100 мВ, частотный диапазон -- от 0,2 до 1000 кГц.

Одним из наиболее адекватных способов исследования проницаемости клетки является метод меченых атомов, который позволяет с помощью радиоактивных и стабильных изотопов исследовать перераспределение и транспорт ионов и различных веществ. Исследуемое вещество «метят», включая в его молекулы радиоактивные атомы. Если данное вещество представлено атомами или ионами, то их можно заменить радиоактивными или стабильными изотопами данного элемента. После поступления меченого вещества в клетку оно регистрируется с помощью счетчиков радиоактивных частиц. Поскольку радиоактивность клетки пропорциональна количеству поступившего в нее вещества, данный метод дает количественные результаты. При наблюдении выхода вещества из клеток в среду предварительно вводят меченое вещество путем микроинъекции или выращивания объекта исследования в среде, содержащей меченое вещество. Затем определяют выходящие из клетки потоки данного вещества. Данный метод точный и пользуется большой популярностью. Он позволяет вводить в клетку исследуемое вещество в низких концентрациях, не нарушающих ее жизнедеятельность, изучать проницаемость не только молекул чужеродных клетке или ядовитых веществ, но и соединений, входящих в состав клеток и межклеточной жидкости организма. С помощью изотопного метода удается дифференцировать потоки вещества из среды в клетку и обратно. Особая ценность его в том, что он удобен для исследования входа и выхода веществ в активных условиях.

Для работы со стабильными изотопами в биофизике широко используется метод масс-спектрометрии.

Большая часть имеющихся на сегодня сведений о механизмах движения ионов через биологические мембраны, генерации биоэлектрических потенциалов, распространении возбуждения была получена именно с помощью метода меченых атомов.

8.1.2 Пассивный и активный транспорт веществ через мембрану

Поступление нейтральных молекул и ионов в клетку осуществляется за счет пассивного и активного транспорта. Пассивный транспорт не связан прямо с затратой химической энергии; он осуществляется в результате диффузии веществ в сторону меньшего электрохимического потенциала. Активный транспорт происходит при затрате химической энергии АТФ или переносе электрона по дыхательной цепи митохондрий. Большое значение для жизнедеятельности клеток имеет явление сопряженного транспорта веществ и ионов, которое заключается в том, что перенос одного вещества против электрохимического градиента обусловлен одновременным переносом другого вещества в направлении снижения электрохимического градиента.

Рис.19. Пассивный перенос ионов через мембраны: а -- все биологические мембраны; 6 -- возбудимые цитомембраны нервных и мышечных волокон; в -- модельные мембраны в присутствии ионофорных антибиотиков



Рис.20. Активный перенос ионов при работе транспортных АТФ-аз: а -- мембраны саркоплазматического ратикулума; б -- цитоплазматические мембраны; в -- энергосопрягающие мембраны митохондрий, хлоропластов и бактерий

Рис.21. Сопряженный транспорт ионов и веществ через мембраны: а -- апикальная мембрана клеток эпителия; б -- внутренняя мембрана митохондрий; в -- поток электронов по дыхательной цепи

8.1.2.1 Пассивный транспорт

Различают следующие виды пассивного транспорта веществ в клетках и тканях: диффузия, осмос, фильтрация.

Диффузия

Диффузия -- основной механизм пассивного транспорта веществ, обусловленный наличием концентрационного градиента. Различают несколько видов диффузии:

· простая диффузия, когда диффундирующее вещество движется по градиенту через мембрану, не образуя комплекса или проникая через канал;

· ограниченная диффузия, когда ион, проходящий через мембрану, подвергается воздействию заряженных групп белков, находящихся в канале и ограничивающих скорость поступления вещества в клетку;

· облегченная диффузия, осуществляемая с помощью так называемых переносчиков -- белков или молекулярных комплексов, обладающих специфическим сродством к определенным веществам.

Простая диффузия -- это самопроизвольный физический процесс проникновения вещества из области высокой в область меньшей его концентрации в результате теплового хаотического движения молекул. Математическое обоснование процесса диффузии впервые дал А. Фик. Согласно первому закону Фика поток диффузии прямо пропорционален гоалиенту концентрации dC/dx:

где J -- количество молей вещества, перенесенного за единицу времени, моль/см^-2, с¹; D -- коэффициент диффузии, см²/с; С -- концентрация; ч -- координата.

Таким образом, поток вещества при диффузии -- это количество вещества, диффундирующего за единицу времени через данную площадь. Градиент концентрации -- изменение концентрации вещества на единицу длины в направлении диффузии. Знак «минус» в правой части уравнения означает, что диффузия происходит из области большей концентрации вещества в область меньшей. Коэффициент диффузии зависит от природы вещества, температуры и характеризует его способность к диффузии. Для низкомолекулярных неэлектролитов коэффициент диффузии D = 10⁵ см²/с.

Диффузия осуществляется в следующих основных случаях:

· перенос ионов или вещества в неперемешиваемых слоях вблизи мембраны;

· транспорт неэлектролитов через мембрану.

Обычно при исследовании проницаемости клеточной мембраны концентрационный градиент определить трудно, поэтому для описания диффузии вещества через нее пользуются более простым уравнением:

где С_вн, С_нар -- количество вещества соответственно по разные стороны мембраны, моль; С -- коэффициент проницаемости, аналогичный коэффициенту диффузии, но зависящий не только от природы вещества и температуры, но и от свойств мембраны.

В общем случае нестационарной диффузии концентрация вещества в любой точке может меняться со временем:

Профиль концентрации, достигаемый к моменту времени t, характеризуется параметром х:

В стационарном состоянии, когда dC/di = 0, выполняется условие AC/dx - const, и в данном случае профиль изменения концентрации вещества линеен.

Проникновение растворенных частиц, обладающих электрическим зарядом, через клеточную мембрану зависит от ее концентрационного и электрического градиентов. Поэтому при противоположно направленном электрическом градиенте перенос ионов может осуществляться в направлении, противоположном концентрационному градиенту. При наличии этих двух движущих сил транспорт ионов осуществляется по электрохимическому градиенту.

Облегченная диффузия имеет большое значение для функционирования клетки. Установлено, что скорость проникновения в клетку глюкозы, глицерина, аминокислот и некоторых других веществ не имеет линейной зависимости от их концентрации. Причем при определенных концентрациях скорость их проникновения значительно выше, чем при простой диффузии. Эта особенность объясняется тем, что в данном случае наблюдается не простая, а облегченная диффузия, механизм которой заключается в следующем. Вещество самостоятельно диффундирует через мембрану, но скорость диффузии намного возрастает, если молекулы этого вещества образуют комплекс с молекулами переносчика, который хорошо растворяется в липидах. На поверхности мембраны молекулы А соединяются с молекулами X и в виде комплекса АХ проникают в клетку. Далее молекулы А освобождаются, а молекулы переносчика диффундируют к наружной поверхности мембраны и связываются с новыми молекулами А. Диффузия с участием переносчика, как и простая, происходит до тех пор, пока концентрация по обе стороны мембраны не станет одинаковой. Если количество вещества в среде повысить так, что при этом израсходуются все молекулы вещества X, то скорость диффузии при дальнейшем повышении концентрации вещества А увеличиваться не будет. В общем случае кинетика облегченной диффузии подчиняется уравнению Михаэлиса -- Ментэна:

где/_тах -- максимальный поток; 5_нар -- наружная концентрация переносимого вещества; К_т -- константа Михаэлиса -- Ментена.

Данный тип диффузии осуществляется с помощью как подвижных, так и фиксированных в мембране переносчиков. На рис. представлена схема, иллюстрирующая процесс облегченной диффузии, а на рис. показана зависимость скорости простой и облегченной диффузии от концентрации транспортируемых молекул. В ионном канале цепь фиксированных переносчиков может выстилать изнутри пору канала и молекула проникающего вещества в этом случае передвигается от одного участка цепи к другому. Участие переносчика в осуществлении данного механизма диффузии подтверждается конкуренцией между веществами при их проникновении в клетку. Так, поступление глюкозы в мышечные волокна уменьшается при введении в среду арабинозы или маннозы. Данная конкуренция обусловлена тем, что при добавлении в среду этих Сахаров в равной мере используются молекулы переносчика и это затрудняет транспорт глюкозы. Если переносимое вещество образует прочный комплекс с переносчиком, то соединение последнего с другими веществами исключается и перенос одного из веществ будет осуществляться максимально быстро. Предполагается, что данный механизм лежит в основе действия известных ингибиторов транспорта пентоз и гексоз -- флоридзина и флоретина.

Рис.22. Схема одного из вариантов облегченной диффузии

Белок может существовать в двух различных конформационных состояниях: «понг» -- когда участки для связывания переносимого вещества А открыты с наружной стороны бислоя; «пинг» -- когда те же участки открыты с другой стороны. Этот процесс полностью обратим, но при более высокой концентрации вещества А с наружной стороны бислоя с белком-переносчиком будет связываться большее количество молекул в первом состоянии, что приведет к транспорту вещества А по градиенту его концентрации.

В настоящее время природа молекул-переносчиков, облегчающих диффузию, неясна, хотя ряд авторов предполагают, что это комплексы, растворимые в липидах клеточной мембраны. Особенности кинетики проникновения веществ с помощью переносчиков указывают на ее сходство с каталитическим процессом, аналогичным ферментативной реакции. Поэтому облегченную диффузию принято также считать каталитической, где роль фермента-катализатора играет вещество, облегчающее диффузию. Как и ферменты, эти переносчики не могут вызвать процессы, невозможные по термодинамическим условиям, т. е. перенос вещества против градиента, но ускоряют проникновение веществ через мембрану по сравнению с обычной диффузией.