Гормональная индукция ферментов

Разновидностью облегченной диффузии является так называемая обменная диффузия, при которой переносчик образует соединение с диффундирующим веществом и перемещается с ним от одной поверхности мембраны к другой, где молекула переносчика освобождается, ее место занимает другая молекула того же вещества и комплекс переносится обратно. При работе переносчиков в случае обменной диффузии концентрация вещества по обе стороны мембраны не изменяется. Существование обменной диффузии было доказано методом меченых атомов на эритроцитах, митохондриях и др.

Рассматривая функции белков-переносчиков в процессе диффузии, как правило, отмечают 2 основных способа переноса веществ:

· унипорт -- перенос, в котором белки переносят растворенное вещество с одной стороны мембраны на другую;

· котранспорт -- перенос, когда транспорт одного вещества зависит от одновременного переноса другого вещества в том же направлении или в противоположном. Так, поступление Сахаров в бактериальные клетки осуществляется посредством симпорта протонов и молекул сахара, а по принципу антипорта работает Na, Са-обменник.

В качестве примера симпорта можно привести переносчик глюкозы из мембран эритроцитов, а также лактопермеазу из Е. Coli. Переносчик глюкозы охарактеризован наиболее полно из всех белков, катализирующих диффузию D-глюкозы через мембрану. Очищенный переносчик из эритроцитов представляет собой гликопротеины с относительной молекулярной массой, равной 55 ООО. Он может находиться в мембране в виде димера. Если судить по данным об аминокислотной последовательности, то переносчик должен иметь 12 трансмембранных d-спиральных участков. Переносчик легко встраивается в фосфолипидные везикулы.

Ингибиторами переносчиков глюкозы являются флоретин и цитохалазин, которые связываются с ним в стехиометрии 1:1.

Между переносчиком глюкозы из клеток млекопитающих и некоторыми транспортными системами бактерий наблюдается значительная гомология. Гомология существует также с переносчиками, осуществляющими симпорт Н⁺-арабинозы и Н⁺-ксилозы. Переносчик глюкозы из мембраны эритроцитов не транспортирует Н⁺ и не способен к транспорту против градиента глюкозы.

Одной из основных структур, ответственных за перенос лактозы через биологические мембраны, является лактопермеаза. Последнюю можно изучать в цитоплазматических мембранных везикулах. Этот белок имеет относительную молекулярную массу, равную 46 500. Функциональной единицей в мембране является мономер. Хотя имеются данные, указывающие на существование димерной формы. Полагается, что лактопермеаза имеет 12 или 14 трансмембршшых d-спиралей. Впервые модель строения лактопермеазы предложена Кабаком.

Особенности транспорта лактозы с участием лактопермеазы достаточно хорошо изучены.

1. Пермеаза имеет одно или более мест связывания для протона и одно для лактозы. Эти места бывают поочередно обращены к переплазматической и цитоплазматической сторонам мембраны. Соответствующий конформационный переход является лимитирующей стадией процесса. Максимальная скорость транспорта равна 25 -- 50 с^-1. При наличии трансмембранного протонного электрохимического потенциала К_т для лактозы составляет 80 мкмоль; место связывания протона характеризуется высоким рК_а, поэтому большую часть времени протонировано. При = 0 значение К_т для лактозы гораздо выше -- 15 -- 20 ммоль.

2. Транспорт лактозы обязательно сопровождается транспортом Н⁺ со стехиометрией 1:1.

3. Конечным результатом транспорта является перенос через би-слой положительного заряда. Следовательно, важную роль в установлении равновесия и скорости транспорта играют трансмембранный электрический потенциал и разность протонного химического потенциала. В бактериальных мембранах транспорт веществ, в частности мальтозы, может осуществляться через специализированные структуры -- порины. Порины образуют поры, которые функционируют как молекулярные сита, опосредуя диффузию небольших гидрофильных молекул через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. Относительная молекулярная масса поринов варьирует от 28000 до 48000. В мембране они присутствуют в виде тримеров.

Наиболее полно к настоящему времени изучены 4 вида поринов из Е. Coli. Их характерная черта -- образование наполненного водой трансмембранного канала. Порины прочно связаны с липополисахаридами и с пептидогликаном. Однако эти соединения не являются необходимыми для функционирования поринов. Образуемые последними каналы различаются как по размерам, так и по селективности. Селективность определяется наличием внутри или около входа в канал заряженных аминокислотных остатков. Электронно-микроскопические исследования показали, что порины могут образовывать один большой канал или три независимых. Главной функцией поринов, и особенно порина Lamb, является стимуляция накопления мальтозы в клетке.

В 1960-х гг. были обнаружены ионофоры -- небольшие гидрофобные молекулы, способные растворяться в липидных бислоях и повышать их проницаемость для ионов. Многие ионофоры синтезируются микроорганизмами и обладают свойствами антибиотиков. Различают два класса ионофоров -- подвижные переносчики ионов и каналообразующие ионофоры. Ионофоры первого класса переносят ионы через углеводородную область мембраны, и их активность связана с собственной диффузией через мембрану. К этой группе принадлежат валиномицин, нигерицин, нонактин, кальциевые ионофоры -- А23187 и иономицин. Ко второй группе транспортных антибиотиков относятся каналообразователи, формирующие канал, который пронизывает мембрану. В начале транспорта ион входит в него на одной стороне мембраны, диффундирует по нему и выходит на другой. Стимуляция транспорта ионов по этому механизму не связана с движением самого антибиотика-каналообразователя в мембране. К этой группе относятся грамицидин А, полиеновые антибиотики.

Очень широкое применение в биологии и медицине нашел ионофор валиномицин -- полимер, повышающий проницаемость мембраны для ионов калия. Он обладает кольцеобразной структурой с последовательно трижды повторяющимися четырьмя остатками. Наружные группы циклической молекулы валиномицина контактируют с гидрофобной областью липидпого бислоя, а за счет В1гутренних групп полярной части молекулы один ион калия связывается с шестью атомами кислорода. Важно, что валиномицин связывает ионы К предпочтительнее, чем ионы Na. Это обусловлено тем, что дегидратация иона К требует меньшей затраты энергии, чем дегидратация иона Na. Примечательно, что молекула валиномицина обладает трансмембрашюй подвижностью и процесс присоединения иона К ступенчатый. В ходе связывания иона молекулы воды гидратной оболочки постепенно вытесняются кислородными атомами антибиотика, что снижает активационный барьер связывания и высвобождения иона. Поэтому валиномицин присоединяет и высвобождает ион К⁺ многократно.

Среди каналообразующих белков наиболее хорошо изучен транспортный антибиотик грамицидин А-- полипептид, состоящий из 15 аминокислотных остатков. Он образует трансмембранный канал при наличии двух молекул. Этот димер имеет спиральную структуру и формирует канал, окруженный полярными группами пептидов, а карбоксильные группы образуют кратковременные координационные связи с катионом в момент его прохождения по каналу.

Грамицидиновые каналы катионселективны при оценке их избирательной проводимости была обнаружена такая последовательность проводимости для одновалентных катионов: К⁺> Cs⁺> Rb⁺> NH₄⁺ > > Tl⁺ >Li⁺. Проводимость плоской БЛМ, содержащей небольшое количество грамицидина А, непостоянна: для ионов Na она меняется во времени ступенчато, что объясняется спонтанным образованием каналов. В зависимости от состава липидов и других условий время жизни грамицидинового канала составляет от 30 мс до 60 с. В течение 1 с по одному каналу может пройти 10⁷ ионов, в то время как скорость транспорта с подвижным переносчиком составляет 1 ООО ионов за 1 с.

Осмос и фильтрация

Для клеточных мембран характерна полупроницаемость, т. е. способность пропускать одни вещества и не пропускать другие. Молекула воды проходит сквозь клеточные стенки в результате различий гидростатического давления и осмоса. Осмос -- это процесс перемещения молекулы воды через полупроницаемую мембрану из области меньшей концентрации растворенного вещества в область большей. Сила, вызывающая движение растворителя, называется осмотическим давлением. Осмотическое давление раствора зависит от количества растворенных ионов и температуры. В соответствии с уравнением Вант-Гоффа осмотическое давление раствора прямо пропорционально концентрации растворенного вещества и абсолютной температуре раствора:

где ч -- изотонический коэффициент, зависящий от степени диссоциации электролита и показывающий, во сколько раз увеличивается количество растворенных частиц при диссоциации молекул; для неэлектролитов i=l, для электролитов i > 1; R -- газовая постоянная.

Гидравлическая проводимость мембраны в данном случае определяется из соотношения:

где С -- гидростатическое давление в клетке; L_p -- гидравлическая проводимость; / -- поток воды.

Предполагается, что осмотическое давление обусловлено воздействием на мембрану молекул растворителя. Число молекул растворителя, достигающих мембраны со стороны раствора, меняется, так как часть площади поперечного сечения мембраны занята частицами растворенного вещества. Исходя из этого, можно считать, что осмос представляет собой диффузию молекул растворителя. Скорость осмотического переноса воды через мембрану можно найти из уравнения

где am/at -- количество воды, проходящей через мембрану площадью 5 за единицу времени; К -- коэффициент проницаемости; Р_вн, Р_нар -- осмотическое давление соответственно по одну и другую сторону мембраны.

Обычно вода проникает в клетку до тех пор, пока не выровняется осмотическое давление между клеткой и средой. Перенос воды может также осуществляться путем фильтрации, происходящей главным образом при наличии градиента гидростатического давления. Фильтрация -- это процесс проникновения жидкости через поры какой-либо перегородки под действием гидростатического давления. Скорость фильтрации находят из уравнения Пуазейля, описывающего течение жидкости по капилляру под давлением:

где dV -- объем фильтруемой жидкости; г -- радиус каждой поры; Р_вн, Р_нар -- давление соответственно на конце и в начале поры; / -- длина поры; ш -- вязкость жидкости.

Поступление воды в клетку связано с набуханием последней и растяжением ее стенки. Поэтому при исследовании осмоса учитывают модуль объемной упругости клетки, определяемый по закону Гука:

где V -- объем клетки.

Величину е находят с помощью микрокапиллярного зонда и датчика тургорного давления по сдвигу С при инъекции в клетку порции жидкости известного объема. Величину L_p находят по скорости изменения тургорного давления в гидростатических и осмотических опытах. Коэффициенты отражения для разных веществ определяют по отношению сдвига С тургорного давления к вызвавшему этот сдвиг изменению осмотического давления среды:



Фильтрация и осмос играют большую роль в процессе обмена воды между кровью и тканью. Осмотическое давление крови человека равно 760 - 780 кПа.

Механизмы транспорта ионов и веществ в клетку

Несмотря на различия молекулярной структуры и физико-химических свойств веществ, поступающих в клетку, существуют только два основных пути их проникновения через клеточную мембрану:

· за счет растворения в липидах мембраны;

· через каналы клеточной мембраны, которые соединяют цитоплазму клетки с внешней средой.

Еще в 1895 г. Е. Овертон доказал зависимость проникающей способности веществ от их растворимости в липидах. Аналогичные данные были получены Р. Колландером, который установил, что растворимость вещества в оливковом масле пропорциональна проницаемости его в клетку. Важным фактором, влияющим на проницаемость веществ через мембрану, является размер их молекул. Так, вещества с одинаковым коэффициентом растворимости, но отличающиеся размерами и формой проникают в клетку с различной скоростью. Из двух одинаковых по размеру, но разных по растворимости в липидах веществ, например пропиленгликоля и мочевины, первый в 20 раз быстрее проникает в клетку, поскольку лучше растворяется в липидах.

В связи с проведенными исследованиями Е. Овертон сформулировал следующие эмпирические законы:

· проницаемость клеточных мембран для органических молекул уменьшается по мере повышения в последних количества функциональных групп;

· проницаемость клеток для органических молекул возрастает по мере роста в последних числа метиловых, этиловых и фенильных групп.

Существуют, однако, вещества, поведение которых не подчиняется указанным закономерностям. Так, вода, обладая растворимостью, аналогичной растворимости тиомочевины, проникает в клетку в 200 раз быстрее. Такими же свойствами обладают метанол и формамид. Эти факты Р.Колландер объяснил тем, что плазматическая мембрана пронизана порами, которые могут пропускать только мелкие молекулы. Таким образом, в настоящее время рассматривают два пути диффузии молекул:

· гидрофильный, когда молекула воды проходит сквозь поры, сформированные интегральными белками мембраны;

· связанный с возникновением кинков -- лабильных структур в углеводородной области мембраны.

Как уже упоминалось, функцию ионных каналов можно сравнить с функцией ферментов. Например, для переноса ионов К иэ водной среды в липидный матрикс мембраны необходима энергия, составляющая 250 кДж/моль. Однако энергетический барьер, который должен преодолеть ион К при транспорте через плазматическую мембрану, реально составляет только 20 кДж/моль. Это объясняется тем, что ионная проницаемость клеточных мембран обеспечивается ионными каналами, представляющими собой интегральные белки. Для большинства ионных каналов характерны явления избирательности, насыщения и блокирования. При функционировании конформационные изменения молекул, формирующих структуру и окружение канала, переводят их из закрытого состояния в открытое и наоборот. Активация канала обусловлена либо сдвигом величины мембранного потенциала, либо взаимодействием участка молекулы канала с определенными химическими веществами, либо специфическим фосфорилированием белков.

В первом случае каналом управляет электрическое поле мембраны. Структура, реагирующая на изменение напряженности поля, переносит электрический заряд и называется сенсором напряжения. Во втором случае управление осуществляют связанные с каналом рецепторы, взаимодействующие с определенным химическим веществом, что способствует открыванию канала. В третьем случае взаимодействие химического вещества с рецептором мембраны вызывает появление в клетке вторичного посредника -- цАМФ или диацилглицерин, активирующего соответствующие протеинкиназы, которые фосфорилируют белки ионных каналов. При этом происходит переход каналов в открытое состояние. Через различные каналы за 1 с может проходить от 10^б до 10⁹ ионов.

Одной из важных особенностей каналов клеточных мембран является их способность отличать ионы различного знака и химической природы. Выяснение природы селективности -- основной ключ к пониманию молекулярных механизмов электрической активности клеток. Для объяснения селективной проницаемости ионов было выдвинуто несколько гипотез. Одна из них, принадлежащая Л. Михаэлису, состоит в том, что каналы, заполненные водой, обладают суммарным отрицательным зарядом, который препятствует переносу в них анионов. С другой стороны, в 1941 г. Е. Дж. Конвей и П. Дж. Бойль на основании данных о проницаемости скелетных мышечных волокон у амфибий для ионов К и С1 пришли к выводу, что поры не заряжены и проницаемость мембраны зависит только от диаметра ионов в гидратированном состоянии. В настоящее время их теория «сита» для гидратированных ионов представляет в основном исторический интерес, так как не согласуется со многими экспериментальными данными. Так, например, известно, что радиусы ионов К, Rb и Cs в гидратированном виде одинаковы, а проницаемость для иона К значительно больше, чем для ионов РЬ и Cs.

В связи с проблемой селективности каналов определенный интерес представляет гипотеза Л. Дж. Муллинза о механизмах ионной проницаемости биологических мембран, учитывающая размер пор мембраны. В данном случае считается, что ион лишь тогда способен пройти через пору, когда его собственный радиус, суммированный с размером одного слоя гидратированной ионом воды, будет соответствовать радиусу поры. Стенки норы, взаимодействуя с проникающим ионом, как бы дополняют гидратную оболочку, что способствует переходу иона из водного раствора в мембрану. В отличие от предыдущих эта точка зрения предполагает наличие пор различной величины.

Итак, различия между каналами и переносчиками заключаются в том, что:

· у названных транспортных систем разная пропускная способность: канал пропускает около 10⁷ ионов в 1 с, а переносчик -- около 10* ионов в 1 с;

· проводимость, обусловленная переносчиками, сильнее зависит от вязкости липидного бислоя и температуры, чем проводимость каналов;

· разная проводимость в зависимости от концентрации транспортируемого иона.

В настоящее время для объяснения высокой проницаемости мембран часто используют положения электростатической теории, электродиффузионной теории и теории абсолютных скоростей реакции. Постулируется возможность описания переноса иона через мембрану с помощью определения величины так называемого активационного барьера.

Согласно электростатической теории энергия переноса иона определяется по формуле

где N = 6 · 10²³ моль^-1; ж -- заряд иона; е = 1,6 · 10~¹⁹ Кл; е₀ = 8,8 ч ч 10¹² Ф/м; ен, е_в -- диэлектрическая проницаемость соответственно мембраны и воды.

Так как в воде энергия иона понижена, а в мембране высокая, то скорость переноса иона зависит от ее величины. Ионофоры понижают величину барьера за счет образования комплекса с ионом и увеличения эффективного радиуса этого комплекса при сохранении заряда иона, а также за счет образования пор с относительно высокой величиной диэлектрической постоянной.

Г. Эйзенман применил данную теорию для описания транспорта иона в канале, учитывая как энергетику самого переносчика, так и наличие заряженных анионных группировок в поре канала. Если энергия заряженной группировки незначительна, то ее хватает лишь для дегидратации проникающих ионов с большим ионным радиусом. В случае, когда анионная группировка создает сильное электрическое поле, дегидратация и образование комплекса наблюдаются для ионов, имеющих малый кристаллический радиус.

Теория электродиффузии постулирует положение о том, что транспорт иона через мембрану определяется его электрохимическим потенциалом:

где м -- электрохимический потенциал; мп -- стандартный электрохимический потенциал; Ф -- температура; Е -- потенциал.

Пассивный транспорт в данном случае осуществляется в направлении снижения электрохимического потенциала. При равновесии, когда м, = м, выполняется соотношение

В мембранах с толщиной менее 10 нм потенциал меняется линейно в зависимости от расстояния до нее. В случае, когда dE/dx = const, поток через мембрану описывается уравнением:

где С -- коэффициент проницаемости.

Тогда диффузия через мембрану ионов К, Na, CI приводит к созданию мембранного потенциала, величина которого определяется градиентами и проницаемостью мембраны для этих ионов.

Для определения направленности и возможности осуществления пассивного транспорта есть несколько критериев, один из них -- соотношение Уссинга, или критерий пассивного транспорта: согласно электродиффузионной теории, если ионы движутся пассивно и независимо, то односторонние потоки в мембране связаны уравнением:

Следует отметить, что проблема избирательной проницаемости для ионов остается пока одной из малоисследованных в мембранологии.

8.1.2.2 Активный транспорт

Под активным транспортом в биофизике клетки понимают перенос неэлектролитов и ионов против химического или электрохимического градиента. Активный транспорт непосредственно связан с энергетическими затратами и, как и пассивный, подчиняется кинетике насыщения. Отличие активного транспорта от пассивного заключается именно в наличии стадии, сопряжешюй с трансформацией энергии. В настоящее время принято говорить о первично-активном и вторично-активном транспорте.

Первично-активным называется транспорт, осуществляемый транспортными АТФ-азами за счет энергии гидролиза АТФ. Вторично-активный транспорт -- это процесс, источником энергии для которого служит градиент ионов, возникший, например, в ходе первично-активного транспорта. Типичный пример первично-активного транспорта -- активный транспорт ионов с помощью АТФ-аз. Функция насосов заключается в переносе ионов через мембрану против электрохимического градиента за счет энергии гидролиза АТФ. В соответствии с этим АТФ-азы -- ионные насосы, обладающие аденозинтрифосфатфосфо-гидролазной активностью. Все транспортные АТФ-азы прокариотических и эукариотических клеток можно разделить на три типа: С, V и F.

Общим свойством АТФ-аз Р-тпипа является способность образовывать ковалентный фосфорилированный интермедиат в активном центре. К ним относятся Na, К-, Са- и Н-АТФ-азы плазматических мембран. Ранее АТФ-азы Р-типа называли ферментами Е,/Е₂-типа. Однако номенклатуру изменили, потому что существуют и другие ферменты, не имеющие отношения к транспорту ионов, которые также могут находиться в конформациях Е, и Е₂.

Ионотранспортирующие АТФ-азы V-mana относятся к мембранно-связанным структурам. Они обнаруживаются в вакуолях дрожжей и тонопластах растений, лизосомах, секреторных гранулах и т. д. АТФ-азы V-типа широко распространены, но изучены недостаточно. Им присущи 3 основных свойства: они являются переносчиками протона; в ходе каталитического цикла образуют ковалентный фосфорилированный интермедиат; представляют собой высокомолекулярные мультисубъединичные комплексы.

АТФ-азы F-muna, выделенные из мембран бактерий, хлоропластов и митохондрий, содержат как водорастворимую часть состоящую из

нескольких субъединиц и обладающих каталитической активностью, так и гидрофобную часть F₀, участвующую в транслокации Н⁺.

Кинетику потока ионов при активном транспорте можно описать уравнением:

где /_тах = С₀Р/2; С -- коэффициент проницаемости комплекса ионо-переносчика; -- концентрация ионов по разные стороны мембраны; К -- константа диссоциации комплекса.

При / = 0 получаем соотношение:

из которого следует, что предельная концентрация иона, которую может создать насос, определяется отношением констант диссоциации комплекса данного иона с переносчиком, а активный транспорт иона осуществляется в направлении более низкой константы его связывания ферментом.

Na, К-АТФ-аза

Na, К-АТФ-аза -- одна из наиболее важных и широко распространенных транспортных систем в клетках животных и растений, обеспечивающая перенос через клеточную мембрану ионов Na и К. Активный их транспорт имеет огромное физиологическое значение: в состоянии покоя на него затрачивается более 30% энергии клетки; транспорт ионов Na и К необходим для поддержания электрической возбудимости нервных и мышечных клеток, а также регуляции Na/Ca-обмена.

Фермент, расщепляющий АТФ, впервые открыл Дж. Скоу в 1957 г. в мембранной фракции нервов краба. В дальнейшем этот фермент, называемый также транспортной или плазматической Na, К-АТФ-азой, был обнаружен во всех животных и растительных тканях. Na, К-АТФ-аза -- это липопротеиновый комплекс, функции которого связаны с конформационными перестройками белковых молекул. Сведения об относительной молекулярной массе Na, К-АТФ-азы весьма разноречивы, что связано с разными методами выделения и степенью очистки фермента. В среднем общая относительная молекулярная масса фермента составляет 270 000. Таким образом, Na, К-АТФ-аза -- многокомпонентная система, тетрамёр, составленный из двух а- и двух в-субъединиц. Субъединица б больше субъединицы в. Компонента б осуществляет гидролиз АТФ и связывание стероидов, а в-субъединица, относительная молекулярная масса которой составляет 40 000, содержит углеводные группы. Обе субъединицы

связаны поперечными мостиками. Предполагается, что ос-субъединицы контактируют между собой, а в-субъединицы пространственно разделены.Каждая ос-субъединица пронизывает мембрану насквозь. Углеводные цепи в-субъединиц расположены на наружной стороне мембраны.

Na, К-АТФ-аза «откачивает» ионы натрия из клетки и «закачивает» ионы калия в нее за счет энергии гидролиза молекул АТФ. Фермент проявляет максимальную активность при наличии в среде ионов Na, К и Mg. Процесс описывается следующей суммарной реакцией:

Дж. Скоу предположил, что Na, К-АТФ-аза является интегральным белком, а расщепление АТФ обеспечивает энергией активный транспорт ионов Na и К. Гипотеза была подтверждена следующими экспериментальными данными: уровень ферментативной активности коррелировал с числом транспортируемых ионов; как Na, К-АТФ-аза, так и Na-насос прочно связаны и одинаково ориентированы в плазматической мембране; изменение соотношения ионов Na и К в клетке оказывает одинаковое действие на АТФ-азную активность и скорость транспорта этих ионов; сердечные гликозиды являются специфическими ингибиторами Na, К-АТФ-азы и Na-насоса. В 1960 г. П. Колдвэллом было доказано, что источником энергии для функционирования натриевого насоса служит гидролиз АТФ. А. Ходжкии в экспериментах на гигантском аксоне кальмара подтвердил наличие АТФ-зависимого выведения ионов. В гигантский аксон вводили радиоактивный изотоп Na и исследовали динамику выхода ионов. После блокирования цианидом синтеза АТФ откачка натрия прекращалась, но полностью возобновлялась после введения в аксон АТФ. Такого же эффекта можно добиться при инъекции в аксон беспозвоночных аргининфосфата, а в экспериментах с нервами позвоночных -- креатинфосфата. В опытах на тенях эритроцитов было также доказано, что для активации АТФ-азы и транспорта ионов Na и К через мембрану требуется определенное соотношение концентрации ионов Na и К внутри клетки и только наличие в ней АТФ служит эффективным субстратом для активации Na, К-АТФ-азы.

Оуабаин и другие стероидные ингибиторы подавляют активность АТФ-азы при экстраклеточном воздействии на эритроциты. Каким же образом АТФ обеспечивает активный транспорт ионов Na и К? В присутствии ионов Na и Mg АТФ фосфорилиру-ет Na, К-АТФ-азу. Участком фосфорилирования служит остаток аспартата фермента. В присутствии иона К происходит гидролиз фосфорилированного промежуточного продукта Е -- Ф_н. Для процесса дефосфорилирования не требуется ни ион Na, ни ион Mg:

В процессе функционирования насос принимает по крайней мере две разные конформации -- Е, и Е₂. Всего же в транспорте ионов Na, К и сопряженном с ним гидролизе АТФ участвуют не менее четырех конформационных форм фермента: Е; Е, - Ф_н; Е₂ - Ф_н; Е₂.

Несмотря на большое количество данных о структуре Na, К-насоса, механизм его действия изучен недостаточно. Особый интерес вызывает модель, в соответствии с которой к структуре белка предъявляются следующие требования:

· в молекуле белка должна быть полость такой величины, чтобы в ней помещались небольшие молекулы или ионы;

· белок должен существовать в двух конформациях, причем в одной полость должна быть открыта со стороны, обращенной внутрь клетки, а в другой -- со стороны, обращенной наружу. Эти конформации должны иметь разное сродство к транспортируемым компонентам.

С помощью схемы, представлешюй на рис. можно проследить всю последовательность конформационных превращений фермента, переноса ионов и обеспечение этих процессов за счет энергии АТФ. Справедливость такой модели подтверждается двумя экспериментами, показавшими, что ионы натрия «запускают» фосфорилирование, а ионы калия -- дефосфорилирование. Оба эти процесса стабилизируют первую и вторую конформационные формы фермента. Перемещение нескольких атомов молекулы белка на 0,2 нм может изменить ориентацию полости и сродство к ионам Na и К. Отметим, что при гидролизе одной молекулы АТФ происходит перепое трех ионов натрия и двух ионов калия. Следовательно, работа насоса генерирует электрический ток через мембрану. Максимальное число оборотов АТФ-азы составляет 100 с^-1. ₀

Особенно важно то, что действие Na, К-АТФ-азы обратимо, и в модельной системе фермент может синтезировать АТФ из АДФ и Ф_н.

Гипотетически такой синтез может происходить лишь в условиях резкого увеличения ионных градиентов, что возможно лишь при инкубации эритроцитов в среде с высокой концентрацией натрия и низкой концентрацией калия.

Са-АТФ-аза

Существуют два типа Са-АТФ-аз: одна из этих ферментативных систем обеспечивает выброс Са²⁺ из клетки в межклеточную среду, другая -- аккумуляцию ионов Са из цитоплазмы во внутриклеточное депо. Примером первого типа может служить Са-насос эритроцитов, второго -- Са-насос саркоплазматического ретикулума. Они оба способны создавать более чем 1 000-кратный градиент Са²⁺ на своих мембранах, регулируя в клетке уровень иона Са, который обусловливает многие стороны жизнедеятельности клетки. Са-АТФ-аза активируется низкими концентрациями Са²⁺ с К_а -- 10~⁷ ммоль/л, а высокий уровень Са²⁺ тормозит ее активность.

Очищенный фермент не теряет своей активности в среде с фосфолипидами или детергентами, обладающими сходным гидрофильно-липофильным коэффициентом и характеризующими распределение вещества между полярной и неполярной фазами. Структурной единицей фермента является мономер с относительной молекулярной массой 100 ООО -- 150 ООО, способный объединяться в олигомерные комплексы в мембране. Каждый мономер содержит два Са²⁺-связывающих центра и один АТФ-связывающий, способный к обратимому фосфорилированию от АТФ в среде с Са²⁺ и Mg²⁺ и от Ф_н -- в среде с Mg²⁺. Обнаружены два вида ферментов, превращение которых сопровождается переносом Са²⁺ с одной стороны мембраны на противоположную, а в обратную сторону осуществляется перенос двух протонов. Ниже представлена суммарная схема процесса:

Из схемы видно, что стехиометрия транспорта Са²⁺/АТФ равна 2, причем Са-насос может использовать энергию многих других субстратов для транспорта Са²⁺, хотя и с разной молекулярной активностью. Оуабаин и олигомин -- специфические ингибиторы Na, К-АТФ-азы, и АТФ-азы митохондрий не блокируют Са-АТФ-азу. Она ингибируется рутениевым красным, ванадатом и рядом SH-реагентов.

К, Н-АТФ-аза

К, Н-АТФ-аза слизистой оболочки желудка и кишечника нечувствительна к оуабаину, ионам Na и бикарбонату, но ингибируется фторидом, дициклогексилкарбодиамидом, Н-этилмалеимидом, Жз²⁺ и Ва²⁺, а оптимальный рН равен 7,5. В процессе гидролитического цикла фермент образует фосфорилированный интермедиат, который быстро распадается под влиянием иона К и более стабилен при его отсутствии. В замкнутых мембранных препаратах наблюдается активация К, Н-АТФ-азы валиномицином, что свидетельствует о наличии «замаскированных» центров. Количество замкнутых везикул, ориентированных К-центрами внутрь, может составлять от 30 до 100%. Фермент К, Н-АТФ-аза специфичен по отношению к субстрату. Он гидролизует АТФ с высокой скоростью: очищенные препараты обладают активностью до 110 мкмоль АТФ на 1 мг белка в 1 ч; гуанозинтрифосфат и цитидинтрифос-фат гидролизуются со скоростью, в 7-9 раз меньшей, а инозинтри-фосфат не гидролизуется вообще. К, Н-АТФ-аза -- олигомерный белок. В очищенных препаратах фермента выделяются два пептида с относительной молекулярной массой 84000-100000, а также минорные белковые компоненты. Активность фермента зависит от липидного окружения и физико-химического состояния бислоя. Стехиометрия транспорта составляет 4Н⁺/1АТФ. С. И. Бонтинг предполагал участие ферментной системы в регуляции уровня повышенной кислотности желудочного сока. Вероятно, аналогичные К, Н-АТФ-азы функционируют в мембранах бактерий.

В 1965 г. была обнаружена другая аниончувствительпая АТФ-аза в микросомах слизистой желудка лягушек. Гидролиз АТФ этой системой активизировался двумя анионами и сопровождался их транспортом через мембршгу. Тиоцианат, ингибирующий транспорт анионов, подавлял и АТФ-азную активность. Предполагается, что обнаруженная активность отражает процесс, который протекает в клетках, секретирующих соляную кислоту.

В цитоплазме

Н₂0 + С0₂ -» карбоангидраза -» Н⁺ + НСО_э.

В мембране

Таким образом, в секретирующих клетках может накапливаться соляная кислота, а вне их -- бикарбонат-ион, регулирующий рН среды.

Аниончувствительные АТФ-азы обнаружены в выделительной ткани, поджелудочной железе, клетках мозга и асцитных клетках. Они найдены как в митохондриальной фракции, так и во фракции ПМ. Анионные АТФ-азы этих двух фракций различались по чувствительности к олигомицину, кверцетину, ауровертину D.

В табл. 17 приводятся важнейшие свойства мембранных АТФ-аз, транспортирующих различные катионы. В транспорте органических веществ участвуют и другие механизмы. Создаваемый активным транспортом электрохимический градиент ионов Na обеспечивает энергией транспорт аминокислот и Сахаров в животных клетках. Многие активные транспортные процессы непосредственно не зависят от гидролиза АТФ, но сопряжены с потоком ионов по электрохимическому градиенту, т. е. являются вторично-активным транспортом. Во многих животных клетках ионы Na и глюкоза связываются со специфическим транспортным белком и одновременно проникают в клетку.

Таблица 17 - Транспортные АТФ-азы

Фермент	Тип клеток	Локализация	Функция
Na, К-АТФ-аза	Большинство животных и растительных клеток	Плазматическая мембрана	Поддерживает высокую внутриклеточную концентрацию К
Н-АТФ-аза	Обкладочные клетки слизистой желудка	Плазматическая мембрана
Н-АТФ-аза	Животные н растительные клетки, бактерии	Внутренняя мембрана митохондрий, внутренняя мембрана хлоропластов, плазматическая мембрана	Секретирует Н* в желудочный сок
Са-АТФ-аза	Животные клетки	Плазматическая мембрана	Участвует в окислительном фотосинтетическом фосфорилировании АДФ до АТФ
		Саркоплазматический ретикулум	«Выкачивает» Са из клеток, способствуя их накоплению в цитозоле
			Способствует накоплению Са2* в цистернах сарко-плазматического рстикулума, вызывая расслабление мышц

Мембранный липидный бислой непроницаем для значительного количества полярных молекул, для транспортировки которых в плазматических мембранах имеется большое число специфических транспортных белков, формирующих транспортные пути через липидный бислой. Они называются белками-переносчиками. Последние облегчают диффузию растворенного вещества через бислой. Другие белки испытывают ряд конформационных изменений, вызываемых гидролизом АТФ или связыванием ионов, в результате чего способны работать как насосы, транспортируя ионы против электрохимического градиента.

Хемиосмотическая теория Митчелла

На возможность создавать высокие концентрации протонов в клетках при протекании реакции окисления впервые обратил внимание в 50-х гг. XIX в. Р. Дэвис при обсуждении вопроса о механизме секреции кислоты клетками желудка. Допустим, реакции, о которых шла речь, протекают так, что электроны удаляются из раствора, тогда окисление любой органической молекулы приведет к появлению в этом растворе протонов. П. Митчелл в 1961 г. предложил идею хемиосмотического энергетического сопряжения в дыхательной цепи. Для понимания принципа хемиосмотического сопряжения необходимо знать следующие положения:

· внутренняя мембрана митохондрии, где происходят окислительно-восстановительные реакции дыхания, непроницаема для протонов. В то же время мембрана хорошо проницаема для воды и благодаря электролитической диссоциации запас протонов в водных растворах неограничен;

· внутренняя мембрана митохондрии асимметрична: одни компоненты дыхательной цепи контактируют с матриксом, другие расположены внутри мембраны, третьи контактируют с межмембранным пространством;

· разрушение мембраны не препятствует окислению НАД-Н кислородом и даже ускоряет дыхание. Энергетическое сопряжение при этом полностью прекращается: происходит разобщение процессов переноса электронов и запаса энергии. Для разобщения необязательно полностью разрушать мембрану, достаточно, сохраняя ее структуру, добавить вещества, резко повышающие проницаемость мембраны для протонов.

Для того чтобы понять принцип хемиосмотического сопряжения, предложенного Митчеллом, рассмотрим в качестве примера химический генератор, применяющийся в технике. Представим себе сосуд, разделенный перегородкой, проницаемой для воды и непроницаемой для каких-либо ионов. В перегородку вмонтирован проводник электричества, торцевые поверхности которого, обращенные к раствору, покрыты каким-нибудь катализатором. При подаче в один отсек Н₂, а в другой 0₂ на поверхности перегородки будет происходить следующий процесс: в одном отсеке Н₂ --» 2Н⁺ + 2е. Протоны останутся в растворе, так как перегородка непроницаема для ионов. Электроны по проводнику перейдут на противоположную поверхность, и тогда

О + 2е + + 2Н⁺ -* Н₂0 + ОН".

Суммарный результат процесса контролируемого окисления водорода кислородом заключается в том, что перегородка окажется заряженной и возникнет градиент концентрации протона. Именно за счет тока протонов работает молекулярный механизм, синтезирующий АТФ.

Каждый из трех комплексов, составляющих дыхательную цепь, работает так, что перенос электронов по его простетическим группам сопровождается переносом протонов через сопрягающую мембрану.

8.2 Биоэлектрические явления

Биоэлектрические явления -- это клеточные процессы, сопровождающиеся перераспределением и транспортом электрических зарядов, обусловленные присутствием в клетках фиксированных и подвижных электрических зарядов.

В настоящее время принято классифицировать биоэлектрические явления на следующие типы:

· биоэлектрический потенциал -- электрический потенциал плазматической мембраны клетки, источником которого являются электрохимические градиенты различных ионов. Условно различают биоэлектрический потенциал покоя -- стационарная разность электрического потенциала между цитоплазмой и внеклеточной жидкостью в состоянии функционального покоя клетки и потенциал действия -- быстрые изменения мембранного потенциала при функционировании;

· окислителыю-восстановительный потенциал -- разность потенциалов, возникающая в процессе окислительно-восстановительной реакции переноса электронов от донора к акцептору;

· электрокинетический потенциал -- разность потенциалов, возникающая в системе при механическом движении фаз. В данном типе различают:

а) электрофорез -- движение дисперсной фазы по отношению к дисперсионной среде в электрическом поле;

б) электроосмос -- движение жидкости через пористую перегородку под влиянием внешнего электрического поля;

в) потенциал течения -- потенциал, возникающий между жидкой фазой и стенками сосуда при движении жидкости;

г) потенциал оседания -- потенциал, который возникает в гетерогенной среде под влиянием силы тяжести между верхними и нижними слоями системы.

8.2.1 Физико-химические основы возникновения биопотенциалов

8.2.1.1 Физико-химические процессы формирования мембранного потенциала

Формирование мембранного потенциала обусловлено совокупностью электрических процессов на границе раздела фаз: трансмембранным потенциалом и потенциалом мембраны, а также явлениями, определяющими формирование двойного электрического слоя вокруг мембраны и поверхностного заряда.

Теория двойного электрического слоя была развита в исследованиях Г. Гуи и Р.А. Чапмена в 1910 году. Она постулирует, что распределение ионов в области заряженной поверхности мембраны определяет:

-- электростатическое притяжение;

-- тепловое движение ионов.

В случае теплового движения ионов их концентрация вблизи поверхности мембраны соответствует закону Больцмана:

где R -- газовая постоянная; Ф -- абсолютная температура.

Профиль потенциала в области двойного слоя рассчитывается по уравнению Пуассона -- Больцмана:

Поверхностный заряд мембраны не может быть измерен, и, как правило, регистрируют параметр, близкий к нему, -- дзета-потенциал, который возникает при движении слоя гидратированных ионов и пропорционален поверхностному заряду мембраны.

Трансмембранный потенциал клетки определяется из уравнения Нернста:



Межфазовый скачок потенциала возникает только в случае, когда коэффициенты распределения катионов и анионов различны. Величина данного потенциала определяется соотношением

где А_пн, Л_нар -- коэффициенты распределения иона соответственно между мембраной и окружающей средой.

Понятие «биоэлектрические потенциалы» довольно общее и констатирует только различия величины потенциала между экстраклеточ-пой и внутриклеточной средой. Однако в клетке существует совокупность различных биоэлектрических потенциалов, не только между ее внутренним содержимым и окружающей средой, но и между возбужденным и невозбужденным участками одной и той же клетки или органа. Возникновение разности потенциалов обусловлено неравномерным распределением ионов между клеткой и окружающей средой.

Для объяснения механизма неравномерного распределения ионов по обе стороны мембраны Ф. Доннан предложил модель, в которой два раствора разделены мембраной, проницаемой для воды и электролитов, но непроницаемой для крупных молекул. В наружный отсек «а» помещают раствор электролита хлористого калия, во внутренний отсек «б» -- протеината калия. В отсеке «б» хлор отсутствует и по градиенту концентрации проникает в него. Исходно растворы были электронейтральными. В отсеке «б» электронейтральность поддерживается тем, что движение ионов хлора сопровождается движением ионов калия. К моменту равновесия в отсек «б» проникает ч ионов калия и ч ионов хлора, в результате содержание ионов калия в нем составляет С + х, а ионов хлора -- х; в отсеке «а» эти показатели равны С--ч. Ф. Доннан показал, что при равновесии произведения концентрации ионов, способных к диффузии, по обе стороны мембраны равны:

Состояние системы, при котором выполняется это условие, называется доннановским равновесием.

Рис.23. Доннановское равновесие. Мембрана, разделяющая растворы, непроницаема для ионов белка, но пропускает остальные ионы

После простых преобразований определим величину ч как равновесную концентрацию ионов, прошедших через мембрану и способных к диффузии. Разумеется, для этого необходимо знать начальный уровень ионов по обе стороны мембраны:

Равновесие Доннана выведено при условии электронейтральности обоих растворов. Однако если с одной стороны мембраны раствор электролита более концентрирован, чем с другой, то возникает поток воды и создается избыточное гидростатическое или осмотическое давление. В растительной клетке осмотическое давление выше, чем в окружающей среде, но от разрыва ее предохраняет плотная клеточная стенка. Такой защитный механизм вполне пригоден для неподвижных растений, но не подходит для животных клеток. В процессе эволюции был выработан другой механизм: недостаток электролитов в наружной среде компенсируется присутствием соли -- NaCl. Мембрана малопроницаема для ионов Na, поэтому Na⁺, содержащийся в окружающей клетку среде, является основным фактором, уравновешивающим осмотическое давление внутриклеточных анионов.

Диффузия ионов через мембрану создает разность электрических потенциалов. При диффузии молекулы вещества направляются по концентрационному градиенту -- «вниз по склону». Можно вычислить скорость транспорта вещества или работу, необходимую для предотвращения его переноса. В данном случае рассматривается выход ионов К из клетки. Работа А_х будет равна:

Здесь обозначение А_х принято потому, что движение иона по концентрационному градиенту обусловлено химической силой. По мере развития диффузии ионов калия из клетки ионы хлора проникают в клетку также по концентрационному градиенту. Противоположные заряды притягиваются, что заставляет ионы калия стремиться в клетку вслед за ионами хлора. На преодоление этой электрической силы требуется работа А_э

где F -- постоянная Фарадея, Кл/моль; Е -- разность электрических потенциалов, возникающая вследствие разделения зарядов по обе стороны мембраны, В.

Когда в системе устанавливается равновесие, то суммарный поток вещества становится равным пулю и сила «выталкивания» иона из клетки уравновешивается противоположно направленной электрической силой.

Диффузионный потенциал Е часто определяют с помощью уравнения Нернста

Американский нейробиолог Г. М. Шеперд считал, что если читатель из всей биофизики клетки хочет запомнить только одно уравнение, то пусть это будет уравнение Нернста, необходимое для понимания совокупности электрических процессов в клетке.

В качестве примера определим Е_к для аксона кальмара при комнатной температуре. В этом случае 2,3 RT/F составляет 58 мВ, концентрация ионов калия в наружной и внутренней среде равна соответственно 40 и 400 ммоль. Тогда:

где Е -- потенциал, при котором поток данного иона через мембрану прекращается. Потенциал Е часто называют мембранным, поскольку он формируется на мембране.

После физико-химического вступления перейдем к рассмотрению механизма формирования собственно биоэлектрических потенциалов -- потенциала покоя и потенциала действия.

8.2.1.2 Потенциал покоя

Как отмечалось выше, в возникновении биоэлектрических потенциалов решающая роль принадлежит потенциалам, обусловленным несимметричным, неравномерным распределением ионов между клеткой и средой. Гипотезу механизма возникновения потенциалов в живой клетке впервые предложил Дж. Бернштейн в 1912 г. Он рассматривал протоплазму как свободный раствор электролитов и считал, что мембрана в состоянии покоя проницаема лишь для ионов К и непроницаема для ионов Na. В этих условиях возникает разность электрических потенциалов.

В последующие годы предпринималось множество попыток проверить гипотезу Бернштейна, однако это оказалось возможным лишь после того, как были разработаны методы измерения регистрации внутриклеточных потенциалов, исследовано содержание и состояние ионов в протоплазме и прослежены с помощью меченых атомов и микроэлектродов потоки ионов через мембрану. Для мембранной теории генерации биопотенциалов исключительно важное значение имел факт, что большая часть ионов К в протоплазме находится в свободном состоянии, т. е. протоплазма в соответствии с предположением Бернштейна представляет собой свободный раствор этих ионов. А. Ходжкин и Р. Кейнс, используя радиоактивный изотоп, доказали, что в гигантском аксоне кальмара не менее 90% внутриклеточного калия свободно диффундирует и перемещается в протоплазме под действием электрических сил так же, как и во внешней среде. Так, например, в скелетных мышцах коэффициент активности ионов К, измеренный с помощью микроэлектродов, оказался близким к коэффициенту активности этих ионов в водном растворе. Концентрация ионов К внутри клетки в 10-20 раз выше, чем снаружи. Избыток положительных зарядов ионов К внутри клеток компенсируется в основном органическими анионами. Содержание неорганических анионов в клетках сравнительно небольшое, но их вклад значителен.

Итак, между внутренней и наружной поверхностями клеточной мембраны гигантского аксона кальмара существует разность электрических потенциалов -- потенциал покоя, которую можно измерить с помощью микроэлектрода, введенного в клетку. Обычно микроэлектроды делают из тонких стеклянных трубочек, заполненных концентрированным раствором КС1. Сопротивление такого электрода высоко и составляет 10⁶ -- 10⁸ Ом.

Рис.24 Схема экспериментальной установки для исследования аксона кальмара методом фиксации потенциала

Потенциал мембраны устанавливается на определенном уровне с помощью источника напряжения. Для его регистрации используют усилитель, соединенный с усилителем обратной связи. С помощью последнего через мембрану пропускают ток, компенсирующий ионные токи при данном значении фиксированного потенциала; этот ток измеряют на сопротивлении

Механизмы, способствующие возникновению биопотенциалов, в основном были изучены на крупных клетках -- гигантских аксонах кальмара, клетках водоросли Chara, гигантских нейронах пиявки Hirudo и др. Размеры этих клеток велики и составляют от 5 мкм до 1 мм, что важно для надежной регистрации ПП. На базе большого экспериментального материала было установлено, что цитоплазма клетки в состоянии покоя всегда имеет отрицательный потенциал по отношению к потенциалу межклеточной жидкости. ПП у различных клеток составляет от -50 до -125 мВ. В частности, потенциал покоя гигантского аксона кальмара меняется в пределах от -50 до -75 мВ, мышечных волокон сердца лягушки -- от -61 до -82 мВ. Самый высокий потенциал покоя обнаружен у клеток водоросли Nitella -- от-100 до -125 мВ.

Калиевый механизм возникновения потенциала покоя подтверждают данные, получаемые при варьировании экстраклеточной концентрации калия. При изменении наружной концентрации калия наблюдается закономерное изменение величины потенциала покоя в широких пределах в соответствии с уравнением Нернста. В частности, когда концентрация калия в среде соответствовала его уровню в клетке, потенциал покоя равнялся 1гулю.

Рис.25 Зависимость потенциала покоя гигантского аксона кальмара от концентрации К⁺ в среде

Величины К⁺ представлены в логарифмическом масштабе. При 4 *С потенциал покоя подчиняется не уравнению Нернста, а уравнению Гольдмана. При 17 °С, когда работает система активного транспорта Na⁺ и К⁺, потенциал покоя ближе к рассчитанному по уравнению Нернста, чем при 4 "С, когда Na, К-АТФ-аза неактивна

В состоянии покоя клеточная мембрана проницаема не только для ионов К, но и для ионов Na и С1. Таким образом, ПП клеток представляет собой результат суммы электродвижущих сил, генерируемых этими тремя ионами. Проникновение иона Na из окружающей среды внутрь клетки по концентрационному градиенту несколько уменьшает ПП. Диффузия через мембрану ионов С1, содержание которых в межклеточной жидкости большинства тканей выше, чем в клетках, вызывает некоторое увеличение мембранного потенциала. Следовательно, для более точного вычисления ПП необходимо введение дополнительной поправки на диффузию ионов не только К, но и Na и С1. Уравнение Нернста позволяет выразить мембранный потенциал только приблизительно, и хотя получаемые величины близки к реальным, для более точного расчета применяют так называемое обобщенное уравнение Гольдмана: