Гормональная индукция ферментов

1

где Р_к, P_Na, Рг\ -- коэффициенты проницаемости для соответствующих ионов; _нар, „_ap, _{нар) вн}, _BH, _вн - концентрация ионов соответственно вне и внутри клетки.

Одним из достоинств уравнения Гольдмана является то, что с его помощью можно определить мембранный потенциал не только в покое, но и при возбуждении клетки. При этом необходимо знать коэффициент проницаемости для ионов. Если мембрана проницаема только для одного вида ионов, то P_Na = Pq = 0. Уравнение Гольдмана в данном случае примет вид уравнения Нернста. На основании экспериментальных и расчетных результатов А. Ходжкин и Б. Катц показали, что для аксона кальмара в состоянии покоя отношение коэффициентов проницаемости:

Р_к: P_Na: Р_с1= 1: 0,04: 0,45.

8.2.1.3 Потенциал действия

Мембранный потенциал нервного волокна обычно составляет от -70 до -90 мВ. При деполяризации аксолеммы сначала возникает местный процесс градуального изменения уровня ПП, который переходит в потенциал действия, или распространяющийся потенциал, при сдвиге МП в сторону деполяризации на 15-20%.

Потенциал действия -- это кратковременный регенеративный электрический потенциал, распространяющийся вдоль аксона или мышечного волокна и возникающий в соответствии с законом «все или ничего». Критическая деполяризация мембраны ведет к увеличению проницаемости для натрия, что обеспечивает появление восходящей фазы высоковольтной части ПД.

При длительной деполяризации натриевая проницаемость снижается, а калиевая возрастает, что обеспечивает нисходящую фазу ПД. К. С. Коул и Г.Дж. Кертис с помощью метода фиксации МП доказали, что при развитии потенциала действия наряду с изменением проницаемости происходит кратковременное увеличение электропроводности клеточной мембраны. По их данным, сопротивление мембраны аксона кальмара изменяется от 1000 Ом/см² в состоянии покоя до 25 Ом/см² в момент возбуждения, а у клетки водоросли -- от 1 МОм/см² до 500 Ом/см². Повышение электропроводности мембраны при возбуждении объясняют увеличением ее проницаемости для ионов. При генерации ПД происходит деполяризация мембраны -- падение уровня мембранного потенциала, а затем смена знака цитоплазматического заряда мембраны. При этом наружная поверхность мембраны обладает уже отрицательным суммарным зарядом, а внутренняя -- положительным. В целом амплитуда ПД может достигать 100 -- 120 мВ.

Усиление потока положительно заряженных ионов натрия, направленного внутрь клетки, уравновешивает концентрационный градиент, и поступление ионов Na в клетку прекращается. Избыточный отрицательный заряд на внутренней стороне мембраны исчезает, что обеспечивает перезарядку мембраны. Это изменение проницаемости мембраны для ионов отмечается в первой фазе потенциала действия -- фазе деполяризации. По данным А. Ходжкина, в это время отношение коэффициентов проницаемости мембраны аксона кальмара составляет Р_к: P_Na: Р_С - 1: 20: 0,45. При сравнении его с приведенным выше аналогичным соотношением в состоянии покоя видно, что для ионов К и С1 в первой фазе возбуждения проницаемость не изменилась, а для ионов Na она увеличилась в 500 раз за короткий промежуток времени. Затем возрастает проницаемость мембраны для ионов К, и усиливается диффузия этих ионов из клетки. Интенсификация потока ионов К, направленного из клетки наружу, приводит к уменьшению мембранного потенциала, что в свою очередь снижает проницаемость мембраны для ионов Na, и продолжается до тех пор, пока потенциал покоя не восстановится. После этого проницаемость для ионов К падает до исходной величины, а наружная поверхность мембраны снова приобретает положительный потенциал за счет вышедших в среду положительно заряженных ионов К. Фаза, в течение которой мембранный потенциал возвращается к уровню потенциала покоя, называется реполяризацией, она всегда более продолжительна, чем деполяризация. Таким образом, реполяризация мембраны возбудимой клетки осуществляется не в результате обратного перемещения ионов Na, а вследствие выхода из клетки эквивалентного количества ионов К. В ряде случаев проницаемость мембраны для ионов К после окончания возбуждения остается повышенной, что формирует фазу так называемой гиперполяризации.

Следовательно, формирование ПД обусловлено двумя ионными потоками через биологическую мембрану. Поток ионов Na внутрь клетки приводит к перезарядке мембраны, а противоположно направленный поток ионов калия -- к восстановлению исходного потенциала покоя. Потоки приблизительно равны по величине, но сдвинуты во времени, благодаря чему и становится возможным генерация ПД.

Р. Кейнс показал, что в гигантском аксоне за время одного ПД в клетку поступает 3,7 пмоль Na⁺ на 1 см² поверхности волокна. Примерно такое же количество ионов К выходит из клетки. Исходя из общего содержания ионов К и Na в клетке и их расхода на один ПД, А. Ходжкин подсчитал, что при экономном использовании энергии градиентов нервные клетки способны генерировать сотни тысяч импульсов без подзарядки своих мембранных «концентрационных батарей».

Поскольку процесс возбуждения скоротечен, т. е. занимает короткие интервалы времени, а между деполяризацией, проницаемостью и ионным током существуют положительные обратные связи, развитие ПД носит взрывоподобный характер. В связи с этим для изучения механизма возбуждения был разработан адекватный метод -- метод фиксации мембранного потенциала.

Метод фиксации потенциала позволяет непосредственно регистрировать ионные токи, текущие через мембрану при заданном уровне мембранного потенциала. Впервые он был применен К. С. Коулом, затем А. Ходжкиным, А. Ф. Хаксли и Б. Катнем. Сущность метода состоит в том, что мембранный потенциал на ограниченном участке мембраны смещают до некоторой новой величины и удерживают его с помощью электронной схемы с обратной связью, тем самым автоматически подавляя развитие ПД. Ток, протекающий через этот участок под влиянием приложенного напряжения, далее усиливается и фиксируется. Когда ПД распространяется по нервному волокну, через каждый его участок протекают токи, меняющиеся во времени, что сильно усложняет процесс регистрации. При использовании данного метода в гигантский аксон кальмара вводили металлическую проволоку, нивелируя таким образом различия в процессах, происходящих вдоль аксолеммы. В условиях фиксации потенциала ток, проходящий через мембрану 1_т, представляет собой сумму двух токов - I_it переносимого ионами через проводящие пути >^и емкостного тока 1_С, заряжающего или разряжающего электрическую емкость мембраны.

Метод фиксации потенциала позволяет быстро смещать мембранный потенциал и удерживать его на новом уровне. С помощью этого метода А. Ходжкин и А. Ф. Хаксли показали, что при деполяризации мембраны Na- и К-каналы ведут себя неодинаково: проводимость мембраны для ионов Na возрастает достаточно быстро, достигая максимума, затем она снижается, а проводимость мембраны для ионов К увеличивается медленнее, но удерживается в течение всего периода деполяризации нерва.

При изучении работы ионных каналов в условиях фиксации потенциалов нередко возникает необходимость введения в клетку веществ, взаимодействующих с ионными каналами или меняющих ионный состав внутриклеточной среды. В связи с этим был разработан метод внутриклеточной перфузии гигантского аксона кальмара, который заключается в удалении аксоплазмы и замещении ее раствором заданного состава. Перфузированный гигантский аксон кальмара сохраняет электрическую возбудимость и генерирует ПД. Результаты опытов на перфузированном аксоне подтвердили предположения о механизмах возникновения ПП и ПД. Внутриклеточная перфузия применяется и при работе с другими гигантскими нервными и мышечными волокнами беспозвоночных животных.

При изучении свойств ионных каналов мембраны тела нервной клетки также широко используют метод фиксации потенциала, особенно при исследовании гигантских униполярных нейронов моллюсков. Форма их тела приближается к сферической; от тела отходит один отросток. В опытах используют принцип точечной фиксации потенциалов. В тело нейрона вводят два микроэлектрода, один из которых служит для измерения мембранного потенциала, второй -- для пропускания тока. Для мембраны нейрона характерно наличие нескольких популяций потенциалзависимых ионных каналов, поэтому токи, текущие через различные типы ионных каналов, во время деполяризации мембраны, как правило, суммируются. Для их разделения необходимо изменить состав внутриклеточной среды. С этой целью был разработан специальный метод перфузии изолированных нейронов, заключающийся в следующем. К изолированной клетке подводится пипетка, которая плотно примыкает к мембране клетки. Затем мембрана разрушается, тем самым открывается доступ к внутреннему содержимому клетки, что создает возможность для внутриклеточной перфузии и одновременной фиксации потенциалов. Данный метод позволяет из токовых кривых, отражающих суммарную картину движения электрических зарядов через мембрану, выделить компоненты, характеризующие транспорт кальция.

Метод фиксации МП и перфузии применяют при изучении ионных каналов мембраны тела нервных клеток моллюсков, иейробласто-мы, нейронов спинальных ганглиев млекопитающих, ооцитов, миокарди-оцитов, мышечных клеток.

В последние годы получил широкое распространение метод фиксации потенциалов на микрофрагменте клеточной мембраны. Он позволяет регистрировать токи одиночных ионных каналов. Впервые эти токи были зарегистрированы Э. Неером и Б. Сакманном в 1976 г. Размер микрофрагмента мембраны находится на грани разрешения светового микроскопа. Основой для создания метода послужило обнаружение контакта клеточной мембраны с кончиком стеклянной микропипетки, в результате которого образуется электрически изолированный участок мембраны. Контакт мембраны с микропипеткой механически очень прочен: участок мембраны можно либо изолировать, либо разрушить и проникнуть таким образом в клетку. Важным условием образования гигаомного контакта между пипеткой и клеточной мембраной является освобождение клеточной поверхности от соединительной ткани. При методе «пэтч-клямп» используют ферментативно-диспергированные клетки или клеточные культуры.

Рис.26 Макротоки и микротоки при регистрации методом «пэтч-клямп»

8.2.2 Полный цикл потенциала действия

Спайк есть лишь часть цикла развития и генерации потенциала действия. Полный цикл ПД более сложен и имеет значительно большую протяженность во времени. За быстропротекающим спайком следуют более медленные и небольшие по амплитуде изменения уровня мембранного потенциала -- следовая гиперполяризация и следовая деполяризация. Они совпадают по времени с повышением и понижением уровня возбудимости клетки.

В структуру ПД входят локальный потенциал, спайк и следовые потенциалы. Локальные потенциалы подразделяются на:

-- локальный потенциал при генерации ПД;

-- возбуждающий постсинаптический потенциал;

-- ингибиторный постсинаптический потенциал;

-- генераторный рецепторный потенциал.

Рис.27 Потенциал действия и цикл изменений возбудимости в нерве:

1 -- местный процесс; 2 -- спайк; 3 -- отрицательный следовой потенциал; 4 -- положительный следовой потенциал; 5 -- период латентной суммации; 6 -- рефрактерный период; 7 -- период экзальтации; 8 -- субнормальный период; пунктирной линией обозначены уровень потенциала покоя и исходный уровень возбудимости

При развитии локального потенциала, так же как и при ПД, наблюдается снижение сопротивления и возбудимости плазматической мембраны клетки; различия заключаются в отсутствии в случае локального ответа порога абсолютной рефрактерности и распространении по закону «все или ничего».

В табл. 3.2 приведены временные характеристики ПД для миелиновых нервных волокон холоднокровных и теплокровных животных.

В отличие от спайка следовые потенциалы очень изменчивы. Считается, что изменения следовой части ПД отражают метаболические процессы, протекающие в возбудимом образовании во время возбуждения и после него, т. е. во время восстановления исходного состояния мембранного потенциала.

При генерации ПД в растении, так же как и в нервной клетке, возникают ионные токи: под влиянием деполяризации увеличивается проницаемость мембраны для ионов кальция в результате активации кальциевых каналов. Вход кальция активирует хлорные каналы, что сопровождается выходом ионов хлора и деполяризацией плазматической мембраны растительной клетки. Возникает восходящая фаза ПД. Деполяризация приводит к активации К-каналов, выходу ионов калия и в результате к реполяризации плазматической мембраны растительной клетки.

Таблица 18 - Характеристика потенциала действии в нераах холоднокровных и теплокронных животных, мс

9 Влияние гормонов на проницаемость клеточных мембран

Активность фермента, как уже указывалось, зависит не только от количества и свойств самого ферментного белка, степени насыщения его коферментом, но также от наличия активаторов, ингибиторов, доступности субстратов и других участников ферментативной реакции, что в значительной степени зависит от проницаемости клеточных мембран. Вопрос о проницаемости и ее регуляции выходит далеко за рамки настоящей работы. Поэтому целесообразно рассмотреть лишь отдельные стороны этой крайне важной и интересной проблемы.

Движение воды и других веществ через клеточную оболочку представляет собой динамический процесс, и живая клетка никогда не находится в равновесии с веществами окружающей среды. Существовало предположение, что переход веществ через мембраны клеток определяется только градиентом концентрации, т.е. переходом из среды с высокой концентрацией в среду с меньшей, концентрацией. В ряде случаев это соответствует действительности, но, как правило, происходит движение против градиента концентрации. Примером может служить концентрация калия в животных и растительных клетках, которая внутри клетки во много раз выше, чем в окружающей клетку среде. Перенос против градиента концентрации требует затраты энергии и называется активным транспортом.

Строение мембран клеток и субклеточных частиц во многом определяет свойства этих мембран. Мембраны состоят из двойного слоя молекул липидов, с обеих сторон покрытых белковыми молекулами. Белки мембран обладают особыми свойствами на отдельных участках;

па внешней поверхности клеточных мембран и в толще находятся некоторые ферменты. В целом клеточные мембраны представляют собой сложно организованные структуры, играющие важную роль в физиологии клеток. Наиболее общей функцией мембран является компартментация, т.е. разграничение отдельных частей клеток. Так как ферменты и их субстраты могут находиться в разных отделах, то функции мембран нередко принадлежит решающая роль. Примером компартментации могут служить лизосомы. Эти частицы содержат большое число ферментов, и повреждение или разрушение лизосомных мембран приводит к выходу ферментов в цитоплазму и последующему действию этих ферментов на компоненты клетки.

Ядерная мембрана и мембраны других субклеточных частиц, а также мембраны эндоплазматической сети тоже имеют липопротеидную структуру, а особенности каждой мембраны определяются свойствами и ролью тех частиц, которые эти мембраны отграничивают от клеточного содержимого. Функция этих мембран является очень важным компонентом физиологии клетки; достаточно упомянуть тот факт, что в мембранах внутриклеточных органелл локализован основной процесс обеспечения энергией -- дыхание.

Влияние гормонов на проницаемость клеточных мембран установлено давно. Menkin показал, что гормоны коры надпочечников подавляют увеличение проницаемости капилляров, вызываемое воспалительным экссудатом. Существует мнение, что противовоспалительное действие кортикостероидов в значительной степени связано с влиянием этих гормонов на проницаемость путем подавления реакции на воспалительный экссудат. Этот эффект связывают со стабилизирующим действием глюкокортикоидов на мембраны лизосом, в результате чего ферменты лизосом не выходят в клетку. Глюкокортикоиды оказывают защитное действие против воздействия многих факторов, повреждающих мембраны лизосом, например против ультрафиолетового облучения или токсического эффекта избытка витамина А.

Однако кортикостероиды стабилизируют не все мембраны. Введение крысам кортизона или дексаметазона в течение нескольких дней приводит к тому, что клетки печени, в норме не проницаемые для сахарозы, становятся проницаемыми для нее. При инкубации in vitro тимоцитов добавление кортизона в концентрации 10^-5 M резко снижает транспорт аминомасляной кислоты внутрь клеток.

Изменение проницаемости клеток матки вызывает эстрадиол. Интересные данные получены о влиянии ЛKTГ на проницаемость клеток надпочечников к сахарам, не подвергающимся в этих клетках обмену, в частности к D-ксилозе.

Таблица 19 - Объем распределения D-ксилозы-I-¹⁴C в надпочечниках интактных и гипофизэктомировапных крыс

Перенос D-ксилозы в ткань надпочечника значительно снижается после гипофизэктомии. Это позволяет думать о том, что одним из путей воздействия АКТГ является влияние на проницаемость клеток надпочечников.

Влияние на проницаемость установлено и в отношении других гормонов. СТГ, тироксин и тестостерон повышали скорость образования фосфолипидов в микросомах и митохондриях печени и семенных пузырьков крыс. Поскольку фосфолипиды являются компонентами мембран, такой эффект гормонов имеет важный биологический смысл.

При помощи микроэлектрода, введенного в ткань щитовидной железы кроликов, исследовали влияние ТТГ. Нашли, что введение этого гормона в среду перфузии щитовидной железы in situ повышало проницаемость клеток для ионов, особенно для ионов натрия.

С целью исследования механизма действия гормонов на клеточные мембраны в настоящее время широко применяют опыты на моделях мембранных систем. Инкубация меченых эстрадиола и прогестерона порознь и вместе, в водных растворах и в присутствии фосфатидилхолиповых липосом куриного яйца показала, что гормоны могут образовывать химические комплексы с компонентами мембран, причем характер связывания зависит от наличия одного или более гормонов в среде.

Рис.28 Влияние инсулина и фосфолиназы С на проницаемость клеточных мембран

Влияние гормонов на проницаемость и активный транспорт наиболее подробно исследовано на примере инсулина и альдостерона.

Инсулин. Хорошо известно, что инсулин значительно усиливает транспорт ионов, глюкозы и аминокислот через мембраны клеток. Изучение влияния инсулина на проницаемость мембран в значительной степени осложняется тем, что инсулин существует в нескольких формах, по-разному, вероятно, взаимодействующих с элементами клеток.

Регуляция транспорта глюкозы в клетки является одним из основных механизмов действия инсулина, который ускоряет поступление глюкозы в скелетные и сердечную мышцы. Фосфолипаза С бактериального происхождения и фосфолипаза А змеиного яда влияют на транспорт глюкозы и липолиз весьма сходно с инсулином. Известно также, что многие протеолитические ферменты оказывают инсулиноподобное действие па жировые клетки. На основании анализа этих факторов Rodbell и др. предложили гипотезу о влиянии инсулина на проницаемость клеточных мембран. Согласно этой гипотезе, инсулин вызывает изменение структуры липопротеидной мембраны клетки таким образом, что ламинарная форма переходит в мицеллярную; при этом происходит переориентировка полярных групп липидов. Образование мицеллярной формы высокоочищенных мембран из печени крыс в результате действия фосфолиназы С было показано при помощи электронной микроскопии. Сходное влияние инсулина и трипсина выявлено и в отношении транспорта глюкозы через мембраны клеток скелетных мышц, что позволяет предполагать о сходном изменении структуры клеточных мембран.

По мнению других авторов, взаимодействие инсулина с липонротеидными мембранами клеток вызывает их молекулярную перестройку, в результате чего происходит как бы раскрытие «каналов», по которым глюкоза поступает в клетки. В опытах in vitro установлено, что инсулин обладает высокой поверхностной активностью и легко проникает через мономолекулярные слои белков и липидов, вызывая агрегацию поверхностных молекул, аналогичную образованию мицелл. Другие белки таким действием не обладали. Не ясно, имеет ли физиологическое значение высокая поверхностная активность инсулина, но вполне возможно, что она может влиять на первичное взаимодействие гормона с поверхностью клетки. Возможно, при этом инсулин реагирует со специфическими белками мембраны таким образом, что S--S-группы гормона взаимодействуют с SH-группами белка мембраны.

Альдостерон. В отличие от других стероидных гормонов, обладающих широким спектром действия, альдостерон в физиологических концентрациях действует только на транспорт натрия и калия через эпителиальные структуры почек, слюнных и потовых желез, слизистой оболочки кишечника. Модель активного транспорта натрия через эпителиальные клетки представлена на рис. Согласно этой модели, Na+ пассивно входит со стороны слизистой поверхности клеточной мембраны и активно «выталкивается» из клетки в подслизистое межклеточное пространство. Однако пассивное проникновение натрия в клетку не является простой диффузией. Эта стадия характеризуется насыщающей кинетикой, что свидетельствует о том, что при поступлении Na в клетку он взаимодействует с одним или более компонентами клеточной мембраны. АТФ является донатором энергии, а натриевый насос обладает свойствами Na⁺+ K⁺ активируемой АТФ-азы. Молекула АТФ-азы является липопротеидной глобулой, погруженной в липидный слой клеточной мембраны. Фермент имеет «площадку» для присоединения фосфатной группы и центры для натрия и калия. За счет энергии АТФ молекула АТФ-азы претерпевает конформационные изменения, при которых и происходит транспорт ионов натрия. Считают, что альдостерон может ускорять перенос натрия 3 путями: 1) путем ускорения поступления натрия в клетку; 2) путем повышения активности натриевого насоса; 3) путем увеличения скорости синтеза АТФ и в результате этого увеличения местной концентрации донатора энергии.

Рис.29. Модель активного транспорта ионов натрия через слой эпителиальных клеток

По поводу преимущественного действия альдостерона на какой-либо из этих путей нет единодушного мнения. Sharp и Leaf считают, что альдостерон ускоряет поступление Na+ в клетку, а последующее увеличение активности натриевого насоса является вторичным следствием. Edelman и Fimognari полагают, что действие альдостерона на транспорт Na+ опосредовано через индукцию специфического белка, основная роль которого состоит в увеличении синтеза АТФ, необходимого для энергетического обеспечения транспорта натрия. Адреналэктомия у крыс приводит к постепенному снижению активности АТФ-азы в почках, причем введение альдостерона в физиологических дозах восстанавливает активность фермента. Однако, поскольку все механизмы, обеспечивающие перенос натрия через мембраны клеток, очень тесно связаны друг с другом, вряд ли эти разногласия можно считать принципиальными. Несомненно, что прямо или через посредство других механизмов альдостерон специфично регулирует движение Na+, что вызывает изменение распределения других ионов и воды. Участие цАМФ и аденилциклазы во влиянии гормонов на проницаемость биологических мембран

В связи с тем что многие стороны действия гормонов на процессы обмена веществ могут быть опосредованы через цАМФ, не исключена возможность влияния этого циклического нуклеотида на проницаемость клеточных и внутриклеточных мембран. В последнее время появились работы, свидетельствующие о такой возможности.

Добавление дибутирил-цАМФ к срезам печени крыс значительно повышало скорость транспорта аминокислот в клетки. Сходные данные были получены при исследовании перфузии печени животных и определении мембранных потенциалов при помощи внутриклеточных микроэлектродов. Введение в среду перфузии цАМФ или цГМФ вызывало значительную гиперполяризацию мембран, указывавшую на изменение проницаемости.

На состояние мембран клеток печени оказывал отчетливое влияние не только цАМФ, но цГМФ, а также глюкагон и изопротеренол. Изменение мембранного потенциала в этих опытах сопровождалось ускорением выхода ионов калия из клеток печени; при добавлении в среду перфузии цАМФ повышалось трансмембранное движение ионов натрия. Аналогичные данные были получены и при перфузии печени адреиалэктомировапных крыс: цАМФ, цГМФ в концентрации по 5х10^-4 М, а также глюкагон вызывали изменение трансмембранного потенциала клеток печени. Этот эффект сопровождался изменением транспорта Na+ и К+: сначала наступало снижение, затем повышение. В ответ на введение цАМФ и глюкагона увеличивался выход Ca²+ из клеток печени. Интересно, что добавление в среду перфузии дексаметазопа не влияло ни на мембранный потенциал, пи на движение ионов.

Таблица 20 - Изменение мембранного потенциала клеток перфузируемой печени крыс при добавлении в среду перфузии цАМФ и гормонов

Величина мембранного потенциала выражена.в милливольтах* Различие контроля и опыта во всех опытах статистически достоверно.

Рис.30 Схема локализации и функционирования аденилциклазы в клетке

Влияние цАМФ на проницаемость было показано и на других модельных системах -- на мочевом пузыре жабы и на фрагментах мембран микросом мозга быка. Считают также, что изменение проницаемости клеточных мембран связано с механизмами синаптической передачи в нервной системе, лежащей в основе кратковременной памяти.

Очень важен вопрос о роли аденилциклазы в процессах изменения проницаемости биологических мембран и переноса компонентов ферментативных реакций в клетку и ее различные отделы. Как уже указывалось, адеиилциклаза является сложным липопротеидным ферментом, функция которого состоит в катализе образования цАМФ из АТФ. Согласно современным представлениям, адеиилциклаза «встроена» в клеточные мембраны. Каталитическая субъединица этого фермента, отвечающая за образование цАМФ, локализована на внутренней поверхности мембраны, а регуляторная субъединица-- на наружной. На наружной же поверхности мембраны локализован фермент АТФ-аза, катализирующий дефосфорилирование АТФ с образованием АДФ.

Тесная связь аденилциклазы со структурными компонентами мембран привела к предположению о том, что она может принимать участие в изменениях проницаемости, обусловленной гормональным воздействием. Под воздействием гормона меняется конформация регуляторной субъединицы аденилциклазы; последняя, будучи тесно связанной с мембраной, может вызвать изменение структуры мембран, результатом чего явится изменение проницаемости.

Одним из возможных путей гормональной регуляции активности ферментов является изменение проницаемости клеточных мембран, а также контроль активного транспорта отдельных веществ. Изменение проницаемости биологических мембран происходит под воздействием многих гормонов. Наиболее известным является влияние инсулина на транспорт глюкозы, аминокислот и некоторых ионов через клеточные мембраны. Полагают, что инсулин связывается с липопротеидными компонентами мембран, вызывает переориентацию полярных липидов, что приводит к изменению конформации мембраны и в результате этого к изменению проницаемости. Лучше исследовано влияние альдостерона на регуляцию транспорта ионов натрия и калия через эпителиальные структуры почек, экзокринных желез и слизистой оболочки кишечника. Возможно, что действие альдостерона на транспорт ионов не является прямым, а осуществляется при посредстве особого белка.

Очень интересный вопрос -- возможное участие цАМФ и цГМФ в.регуляции проницаемости клеточных мембран. Эта регуляция, вероятно, имеет место при действии таких гормонов, как глюкагон и катехоламины. Большое значение имеет также аденилциклаза, участвующая в регуляции проницаемости двумя путями: путем катализа образования цАМФ и в качестве составного элемента клеточных мембран.

10 Особенности гормональной регуляции при некоторых физиологических и патологических состояниях

Многообразие гормонов в организме животных и человека, воздействие гормонов на все виды процессов обмена веществ позволяют считать, что эти регуляторы играют важную роль как в поддержании гомеостаза, так и в развитии и ликвидации патологических процессов. В связи с этим целесообразно рассмотреть некоторые особенности гормональной регуляции в условиях нормы и патологии.

Старение. Представляет большой теоретический и практический интерес исследование характера изменения активности ферментов в ответ на гормоны у животных различного возраста. Как уже указывалось, активность многих ферментов резко возрастает сразу после рождения или в первые часы жизни. Глюкагон индуцирует тирозин-аминотрансферазу в печени крыс за 2 дня до рождения, цАМФ - через 4 дня после рождения, а глюкокортикоиды - сразу после рождения. В первые дни после рождения степень индукции тирозин-амино-трансферазы одинакова для глюкагона и кортизола, но в возрасте 50 дней изменение активности фермента при введении глюкагона значительно ослабевает. Активность многих ферментов сразу после рождения достигает величин, превышающих уровень нормы для взрослых, затем снижается до относительно постоянных величин. В качестве примера можно назвать глюкозо-6-фосфатазу, пируваткарбоксилазу, тирозин-аминотрансферазу. Начальное повышение ферментативной активности может быть следствием не только повышенной гормональной индукции, но также «незрелости» в этот период систем, ведающих распадом ферментных белков. В связи с тем, что с возрастом может меняться скорость синтеза и секреции гормонов, интенсивность распада гормонов в тканях и чувствительность периферических тканей к гормонам, можно ожидать изменения активности ферментов в ответ на гормоны при старении. Базальная активность большинства ферментов в тканях с возрастом меняется сравнительно мало; исключение составляет резкое снижение активности лактатдегидрогеназы в сердце, а также в мозге, скелетных мышцах и печени крыс. Некоторое снижение активности аденилциклазы в печени крыс с возрастом показали Bitensky и др.. Активность катепсина в печени старых крыс, наоборот, значительно выше, чем в печени молодых животных.

В процессе старения в миокарде крыс возрастает активность цитохромоксидазы, фосфофруктокиназы и моно-аминоксидазы.

Активность триптофаноксигеназы в печени крыс с возрастом, по данным одних авторов, повышается, по данным других -- не меняется. Индукция этого фермента у крыс разного возраста кортизоном дает одинаковые величины повышения активности, но у месячных животных повышение продолжается 4 ч, а у 12-месячных - 6 ч. Активность триптофаноксигеназы в печени молодых кроликов при введении триптофана возрастает в 7-15 раз, а у старых животных - только в 2 раза.

Скорость индукции б-глицерофосфатдегидрогеназы печени в ответ на введение трийодтиронина была одинаковой у старых и молодых крыс.

Интересные данные получили В. В. Фролькис и сотр. о характере гормональной индукции у старых крыс.

Введение кортизола в малой дозе сильнее индуцирует тирозин-аминотрансферазу у старых крыс, а введение гормона в большой дозе более эффективно у взрослых крыс. Различными были и величины максимального прироста активности тирозин-аминотранс-феразы в печени животных разного возраста. По данным В. В. Фролькиса, этот прирост при дозах корти-зола 1, 3 и 5 мг на 100 г массы составлял у старых крыс 66, 40 и 25%, а у взрослых животных 44, 84 и 102% соответственно. При длительном введении корти-зола угнетение индукции тирозин-аминотрансферазы наступало у старых крыс скорее, чем у взрослых. Эти данные свидетельствуют о наличии качественных различий в гормональной индукции ферментов у животных различных возрастных групп. Нередко базальная активность и изменение активности ферментов у молодых и старых животных одинаковы, однако различия могут выявиться при разных дозах индукторов; кроме того, особенно важна дискоординация регуляции, т. е. различное изменение активности отдельных ферментов.С возрастом изменяется также ответ ферментов и на другие индукторы, помимо гормонов. Изменение активности глюкокиназы печени при скармливании глюкозы значительно нарушается у старых крыс. Величина глюкозной индукции может быть восстановлена до нормы молодых животных введением инсулина в больших дозах.

С целью выяснения механизмов, лежащих в основе возрастных изменений регуляции ферментативной активности, исследовали скорость синтеза и распада ферментов в тканях животных различного возраста.

Таблица 21 - Влияние пола и возраста на скорость синтеза и распада каталазы у крыс

В почках с возрастом снижается как скорость синтеза каталазы, так и скорость ее распада; в печени имеется небольшая тенденция к повышению обеих констант.

Zeelon и др. исследовали активность и свойства фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы в тканях Turbatrix aceti. Эти нематоды являются удобным объектом исследования ввиду короткого времени жизни и возможности выращивания синхронизованной популяции. Активность фермента была максимальной от 8-го до 18-го дня жизни, а затем снижалась; t у₂ ^в возрасте 7 дней составлял 40 ч, а в возрасте от 28 до 48 дней -- 200 ч. Авторы считают, что с возрастом в тканях могут накапливаться ферменты со сниженной или утраченной каталитической активностью. Эти «дефектные» молекулы фермента могут образоваться на стадиях после завершения синтеза пептидной цепи. Наряду с такими молекулами синтезируются и обычные, полностью активные молекулы, так что популяция фермента становится очень гетерогенной. Трудно сказать, в какой степени эти данные применимы для объяснения особенностей регуляций активности ферментов у высших животных. Несомненно, однако, что с возрастом изменяется не только интенсивность биосинтеза белков, но и ответ системы на регуляцию. Известно, что биосинтетическая активность полисом, выделенных из печени крыс, значительно увеличивается после добавления фракции цито-зола. Величина этого стимулирующего эффекта зависит от возраста животных и значительно меньше, если фракция цитозола выделена из печени старых крыс. Следует напомнить также, что у животных ферменты регулируются несколькими гормонами, количество и соотношение которых могут меняться с возрастом.

Беременность. Поскольку беременность сопровождается значительной перестройкой гормонального статуса, то естественно ожидать изменений активности индуцибельных ферментов. Это можно иллюстрировать на примере тирозин-аминотрансферазы и триптофаноксигеназы.Активность тирозин-аминотрансферазы в печени беременных крыс была значительно выше, чем у небеременных, и достигала максимального повышения на 19-й день беременности.

Таблица 22 - Активность тирозин-аминотрансферазы в печени и почках крыс, в плаценте и печени эмбриона

Активность выражена в микромолях п-оксифенилпиру-вата на 1 г сухой массы за 100 мин. Преднизолон вводили внутрибрюшинно за 5 ч до опыта; адреналэктомию проводили за 2--3 дня до опыта.

Индукция тирозин-аминотрансферазы в печени беременных крыс была выражена сильнее, чем в печени небеременных.

Goodland, Clark исследовали динамику изменения активности триптофаноксигеназы в печени беременных крыс. Начиная с 12-- 13-го дня беременности активность фермента заметно возрастала и на 18-й день примерно в 4 раза превышала величины активности у небеременных животных. Перед родами происходило некоторое снижение, но норма была превышена в 2--2'/г раза. Интересно, что ограничение пищи, которое вызывало снижение активности триптофаноксигеназы у неберемепных животных, не влияло на ферментативную активность в печени при беременности.

По всей вероятности, состояние беременности сопровождается повышением «чувствительности» ферментных систем к гормонам и некоторым снижением «чувствительности» к другим индуцирующим воздействиям.

Эндокринная патология. Любая эндокринная патология связана либо с недостаточным, либо с избыточным поступлением гормонов, либо с нарушением нормального соотношения отдельных гормонов. Простейшей моделью эндокринных заболеваний является удаление той или иной железы или введение избытка соответствующих гормонов. Наиболее простым случаем является противоположное изменение активности фермента после удаления железы или введения избытка гормонов этой железы, как это имеет место в отношении гистидиндез-аминазы.

Таблица 23 - Влияние тиреоидных гормонов на активность гистидиндезаминазы в печени крыс

Хорошо известным примером изменения ферментативной активности в тканях при экспериментальной патологии является резкое снижение активности глюкокиназы в печени и увеличение фосфоеиолпи-руваткарбоксикиназы в почках животных при аллоксановом диабете. Однако при эндокринной патологии у человека нередко не находят четко выраженных изменений активности ферментов. Причиной этого является, вероятно, сложное взаимодействие различных гормонов, а также интеграция эффекта гормонов с другими регуляторами ферментативной активности. Учитывать эти факторы необходимо для правильной трактовки механизмов патогенеза. В качестве примера можно привести данные Л. И. Геллера о значительном увеличении содержания тирозина в крови у больных сахарным диабетом -- до 3-4,3 мг% при норме 2±0,2 мг%. Повышение количества тирозина, являющегося субстратом тирозин-аминотрансферазы, может оказывать стабилизирующее влияние на фермент и тем самым приводить к увеличению его активности. Другим примером является влияние кортизола и пиридоксина на обмен триптофана у людей. Введение кортизола повышало выведение метаболитов триптофана у мужчин, получавших нагрузку триптофаном, причем это повышение касалось производных кинуренина. Совместное с кортизолом введение пиридоксина нормализовало экскрецию метаболитов триптофана.

Хорошо известно, что в основе болезни Иценко --Kyшинга лежит гиперсекреция кортикостероидов, возникающая в результате избыточного поступления АКТГ из гипофиза, а в ряде случаев и из опухолей, образующих АКТГ. В свою очередь длительное избыточное содержание кортикостероидов в организме приводит к нарушению нормального соотношения активности различных ферментов. Так, определенное значение может иметь увеличение количества и активности катепсинов в лизосомах печени после введения глюкокортикоидов.

Для патогенеза диабета большое значение имеет влияние инсулина на биосинтез белка в тканях. Как уже указывалось, известно влияние инсулина на различные стадии биосинтеза. Поэтому вполне естественны попытки нормализации нарушенных процессов синтеза белка при сахарном диабете.

При аллоксановом диабете в печени кроликов значительно снижается интенсивность образования аминоацил-тРНК. Введение одного инсулина животным хотя и повышает образование аминоацил-тРНК, но не восстанавливает процесса до нормальных величин; совместное введение с инсулином препаратов РНК приводит к полной нормализации. Хотя механизм действия экзогенно вводимых препаратов РНК еще неясен, но хороший эффект их введения вместе с инсулином заслуживает внимания.

Рис.31 Влияние длительного введения кортизола на активность тирозин-аминотрансферазы в печени крыс. Кортизол вводили внутрибрюшинно по 5 мг на 100 г массы в день.

Эндокринная патология, как уже указывалось, может быть результатом нарушенной рецепции гормонов. Примером является синдром тестикулярной феминизации, при котором снижается связывание андрогенов с рецепторными белками органов-мишеней и нарушается обычное воздействие гормонрецепторного комплекса па начальные стадии биосинтеза белка в ядрах клеток.

В связи с гипотезой об участии цАМФ в качестве посредника действия гормонов очень интересен вопрос о роли этого нуклеотида в патогенезе эндокринных заболеваний. В качестве примера можно назвать псевдопаратиреоз -- редкое заболевание, при котором паратгормон не стимулирует образования цАМФ в тканях органов-мишеней. Однако цАМФ имеет, вероятно, значение и в патогенезе неэндокринных заболеваний. Так, например, холерный токсин необратимо активирует аденилциклазу, в результате чего в слизистой оболочке кишечника образуются избыточные количества цАМФ; вероятно, с этим связана характерная для холеры потеря жидкостей и электролитов организмом. Предполагается также участие цАМФ в развитии бронхиальной астмы, психических и других заболеваний.

Тесно связан с вопросом нарушения активности ферментов при эндокринной патологии вопрос о значении длительного введения гормонов при гормональной терапии.

Введение крысам кортизона в течение 22 дней приводило к постепенному снижению активности ряда ферментов и скорости синтеза РНК в печени, повышенных после однократного или в течение нескольких дней введения гормона. Активность фермента быстро возрастала через 5 ч, оставалась повышенной в течение 3-6 дней введения гормона и затем постепенно снижалась; на 22-й день активность превышала норму лишь в 1,4 раза. Такие же закономерности получены в отношении двух ферментов глюконеогенеза -- глюкозо-6-фосфатазы и фруктозо-1,6-дифосфатазы. Если животным, длительно получавшим кортизол, вводили инсулин, то синтез РНК в печени снова возрастал. Возможно, длительное введение кортизола вызывало такие изменения в клетках печени, которые препятствовали либо рецепции гормона, либо воздействию гормона на процесс транскрипции при последующих введениях кортизола. Длительное введение инсулина аналогичным образом подавляло повышение синтеза информационной и рибосомной РНК в печени крыс в ответ на очередное введение этого гормона.

У старых крыс длительное введение кортизола вызывало подавление индукции тирозин-аминотрансферазы в условиях, еще оптимальных для индукции у молодых животных. Эти данные имеют большое значение как для выяснения роли гормонов в патогенезе различных заболеваний, так и для вопросов гормональной терапии.

Гормональная регуляция активности ферментов при канцерогенезе. Известно, что некоторые штаммы перевиваемых гепатом у крыс содержат большинство, если не все, ферментов нормальной печени и по морфологической картине очень близки к ткани печени. Такие опухоли получили название «гепатом с минимальными отклонениями» и широко используются в качестве моделей для исследования индукции ферментов при канцерогенезе. Особенно много работ проведено на гепатоме Морриса 5123, которая растет медленно, но обладает характерными для злокачественного роста особенностями; исследовали также и быстрорастущие гепатомы, например гепатому Новикова, а также ферменты в других опухолях.

При определении базальной активности ферментов в ткани гепатом нашли отклонения от их активности в ткани печени. Активность каталазы, цистеиндесульфгидразы и триптофаноксигеназы в гепатоме 22 у мышей была очень низка в отличие от нормальной печени. В ткани гепатомы Новикова не удалось обнаружить активности триптофаноксигеназы, тирозин-аминотрансферазы, фенилала-нингидроксилазы, цистеиндесульфгидразы, треонин- и серин-дегидратаз, гистидазы, п-оксифенилпируватгидро-ксилазы; активность аргиназы и глутаминсинтетазы была снижена, а аспартат-карбамоилтрансферазы, наоборот, повышена. Значительно снижалась интенсивность обмена тирозина в печени мышей при экспериментальном лейкозе, а также в ткани различных вариантов саркомы Иосиды у крыс. В процессе канцерогенеза, вызванного введением крысам диэтилнитрозоамина, происходило снижение активности аланин-аминотрансферазы в гиалоплазме и митохондриях печени; активность аспартат-аминотрансферазы претерпевала волнообразные колебания и была наиболее повышена через 5-6 дней введения канцерогена.

Особенно большой интерес представляют работы по исследованию индукции ферментов в ткани гепатом и сравнение ее с характером индукции в прилегающей ткани печени.

В табл. приведены данные о влиянии введения кортизона и триптофана животным с различными типами гепатом на активность триптофаноксигеназы в ткани гепатомы и в печени опухоленосителя. Каждый индуктор вводили внутрибрюшинно по 2 раза с интервалом в 3 ч и определяли активность фермента через 3 ч после второго введения. У части животных за несколько дней до опыта производили адреналэктомию.

Таблица 24 - Активность триптофаноксигеназы в ткани гепатомы и в печени крыс-опухоленосителей

Гормональная и субстратная индукция в печени крыс-опухоленосителей сохранена, но отсутствует в ткани опухолей. Адреналэктомия снижает величину ответа фермента на триптофан в ткани печени, но в ткани опухоли адреналэктомированных животных индукция ни гормоном, ни триптофаном не проявляется. Характерно также наличие различий в активности триптофаноксигеназы в опухолях различного типа. В ткани гепатомы 46 у мышей сохранялся ответ триптофаноксигеназы на введение кортизона.

Увеличение содержания белка в рационе до 90%, приводящее к характерному повышению активности многих ферментов в печени, не влияло на активность триптофаноксигеназы в гепатоме 5123. Заметно была снижена величина индукции этого фермента преднизолоном в ткани печени крыс с миеломой различных типов. Величина ответа триптофаноксигеназы на кортизол в печени заметно снижалась при скармливании крысам канцерогенной диеты с диметиламиноазобеизолом. Это снижение развивалось задолго до возникновения опухолей.

В отличие от триптофаноксигеназы активность тирозин-аминотрансферазы в гепатоме 5123 была значительно выше, чем в ткани печени этих же животных, но также не изменялась при введении кортизона или субстрата. Вместе с тем адреналэктомия значительно снижала активность тирозин-аминотрансферазы в ткани гепатомы и у таких животных введение кортизона отчетливо повышало ферментативную активность. В других опухолях, например в ткани различных типов саркомы Иосиды, активность тирозин-аминотрансферазы была ниже, чем в печени хозяина, и в некоторых типах опухоли увеличивалась после введения кортизола в течение 7 дней.

В процессе развития гепатом у мышей линии СзНА терялось регулирующее влияние тиреоидных гормонов на ферменты обмена глюкозо-6-фосфата в ткани печени.

Имеются данные, свидетельствующие о повышении чувствительности ферментов в ткани опухоли к гормонам. Примером такого рода является значительно более резкое увеличение активности аденилаткиназы в ткани гепатомы Новикова после введения крысам кортизола по сравнению с изменением активности фермента в ткани печени. Значительно сильнее, чем у интактных крыс, повышалась активность аланин-аминотрансферазы в гиалоплазме и митохондриях печени животных, получавших канцероген диэтилнитрозамйы.

Интересные закономерности отметил В. С. Ильин при сопоставлении влияния денервации и развития опухоли на активность и распределение ферментов в цитоструктурах печени. Снижение величины нервной импульсации и утрата нервного контроля в процессе малигнизации приводят к «возврату» активности и распределения ферментов в клетках к эмбриональному уровню, а также к утрате реактивности клеток к действию ряда факторов, регулирующих синтез этих ферментов в интактной печени.

Таблица 25 - Величины t¹/₂ информационных РНК для ряда ферментов в гепатоме Реубер Н-35 и в печени крыс-опухоленосителей

При исследовании скорости синтеза и распада каталазы в гематоме 5123 нашли, что скорость распада фермента в ткани гепатомы не меняется, но скорость синтеза заметно снижается.

Таблица 26 - Константы скорости синтеза и распада каталазы в ткани гепатомы 5123, в печени и почках крыс

По всей вероятности, большое значение в изменении гормональной и других видов индукции ферментов в канцерогенезе имеет изменение изоферментного спектра в ткани опухоли.

В табл.27 приведены данные о содержании двух изоферментов серин-дегидратазы в ткани гепатомы Морриса 7800 и в печени крыс при индукции высокобелковым рационом.

Общая активность серин-дегидратазы в ткани гепатомы выше, чем в печени; различно и соотношение изоформ I и II. Адреиалэктомия сдвигает соотношение изоферментов серин-дегидратазы в ткани опухоли, приближая его к норме, а индукция белком не влияет на соотношение изоферментов и почти не изменяет общей активности фермента в ткани опухоли. Поскольку, как уже упоминалось, изофермент I индуцируется корти-костероидами, а изофермент II -- глюкагоном, эти данные свидетельствуют о нарушении гормональной регуляции изоферментного состава серин-дегидратазы в ткани опухоли.

Таблица 27 - Количество изоферментов I и II и активность серин-дегидратазы в печени и гепатоме у крыс

После скармливания крысам З-метил-4-диметиламино-азобензола через 2-3 мес при выраженной гиперплазии печени происходит изменение изоферментного спектра гексокипазы, альдолазы и пируваткиназы с преобладанием характерного для эмбрионального состояния изоформ этих ферментов. При развитии гепатом содержание эмбриональных изоферментов становится особенно высоким. Следует упомянуть очень интересную гипотезу В. С. Шапота о значении изменений спектра ферментов и белков с родственными функциями в малигнизирующихся тканях. Изменение изоферментного состава и соотношения других белков с близкими или идентичными функциями является, возможно, следствием одних и причиной других регуляторных расстройств в малигнизирующейся ткани.

Возможно, что определенное значение имеет нарушение процессов рецепции гормонов в ткани опухолей, так