Гормональная индукция ферментов

как нередко рецепторы опухолевой ткани теряют специфичность в отношении связывания гормонов.

В связи с важным значением цАМФ в действии гормонов представляет интерес выяснение роли этого пуклео-тида в нарушении регуляции при канцерогенезе. О возможности изменения концентрации цАМФ свидетельствует изменение активности адеиилциклазы при канцерогенезе. Добавление к рациону крыс канцерогенов приводило к изменению свойств адеиилциклазы, которое заключалось в том, что активность фермента в ткани опухоли почти не менялась при введении адреналина и глюкагона. Эти данные хорошо согласуются с тем фактом, что содержание цАМФ в опухолях резко снижается: например, в ткани гепатомы Морриса количество этого нуклеотида составляет всего 10% от нормы.

Влияние ионизирующего облучения на индукцию ферментов. Давно было показано, что общее облучение животных приводит к значительному увеличению интенсивности окисления триптофана и тирозина в печени животных. Триптофан-оксигеназа в печени облученных животных не теряла

способности к индукции кортикостероидами, в To время как при введении субстрата индукция значительно снижалась. Ядра клеток печени облученных крыс обладали более высокой активностью РНК-полимеразы, чем в контроле. Однако введение за 4 ч до опыта 5 мг/100 г массы кортизона меньше повышало активность фермента, чем у необлученных животных. Вероятно, облучение нарушает ответ триптофаноксигеназы на субстрат путем угнетения синтеза специфической мРНК.

При исследовании интенсивности окисления тирозина в печени облученных животных было показано, что адре-налэктомия снимала эффект облучения, вызывающий повышение активности ферментов распада тирозина. Облучение животных совместно с введением тирозина приводило к значительно большему повышению окисления тирозина, чем после одного облучения. У адреналэктомированных облученных крыс введение тирозина не оказывало такого действия, как у интактных. Таким образом, эффект тирозина у облученных животных также зависит от пермиссивного действия кортикостероидов, но субстратная «индукция» сохранена.

Изменение физиологического состояния животных или развитие патологических процессов сопровождается изменениями гормональной регуляции активности ферментов, носящими количественный и качественный характер.

Кортикоидная индукция тирозин-аминотрансферазы или беременности выражена сильнее, чем у небеременных животных. Кроме того, имеет место и качественное изменение характера индукции при беременности: активность триптофаноксигеназы в печени не снижается в условиях ограниченного приема пищи.

Сложный характер имеют изменения гормональной и других видов регуляции ферментативной активности при старении. Они выражаются более длительным периодом индуктивного повышения активности в ответ на кортизон, уменьшением величины активности триптофаноксигеназы после введения субстрата, изменением зависимости величины индукции от дозы кортикостероидов, а также скорости синтеза и распада ферментов. Увеличение лаг-периода адаптивного ответа ферментов на гормоны может определяться одним или двумя следующими механизмами.

1. Нарушением начала процессов, отвечающих за увеличение количества молекул фермента.

2. Образованием модифицированных или отличных от обычных типов форментных белков с измененными каталитическими свойствами, обусловливающими изменение длительности лагпериода индукции. Замедление процессов, ведущих к увеличению количества ферментов, может быть результатом влияния либо на повышение синтеза, либо на замедление распада, либо на то и другое. Наиболее вероятно накопление ошибок в цитоплазматической белоксинтезирующей системе, однако ни в одной работе не показано пока изменения точности включения аминокислот в белок по мере старения. Причиной изменения характера индукции ферментов при старении может быть образование наряду с обычными молекулами фермента «дефектных» молекул, имеющих отличные от обычного фермента каталитические свойства. В результате индукция может привести к образованию очень гетерогенной популяции фермента, что выражается в ином характере ответа па тот или иной индуктор.

Эндокринная патология изменяет активность многих ферментов. Однако дело осложняется суммацией или антагонизмом влияния различных гормонов в целостном организме. Важная роль в нарушении регуляции при эндокринной и неэндокринной патологии принадлежит цАМФ, а также изменению специфичности рецепции или количества рецепторов гормонов.

Интересные данные получены при исследовании длительного введения гормонов. В этих условиях тирозин-аминотрапсфераза в печени постепенно теряла способность повышать активность в ответ на очередное введение кортизола; однако введение другого гормонального индуктора приводило к повышению активности фермента, потерявшего способность отвечать на кортизол. Вероятно, эти результаты очень важны для тактики гормональной терапии, так как позволяют предусмотреть возможный результат замены одного гормона другим.

Рассмотрение характера гормональной регуляции ферментов при канцерогенезе является сложной проблемой, требующей специального рассмотрения, и далеко выходит за пределы настоящей работы. Следует лишь подчеркнуть, что даже в гепатомах «с минимальными отклонениями», по набору ферментов и морфологической структуре мало отличающихся от интактной печени, значительно изменена индукция ферментов гормонами и другими факторами. Эти изменения состоят, например, в исчезновении индукции ряда ферментов в ткани некоторых гепатом при сохранении индукции в ткани печени животного-опухоленосителя. В других опухолях, наоборот, может быть повышена «чувствительность» ферментов к гормональной индукции.

Одной из причин изменения ответа ферментов на гормоны может быть изменение величин периода полураспада информационных РНК, что показано для мРНК, кодирующих синтез триптофаноксигеназы, треонин-дегидратазы, тирозин-аминотрансферазы, орнитин-аминотрансферазы и тимидинкиназы. Большое значение для нарушений регуляции ферментов в опухолях имеет изменение изоферментного спектра опухолевых тканей.

Таким образом, гормональная и другие виды индукции ферментов могут значительно меняться при развитии патологического процесса или изменении физиологического статуса.

11 Гормональная регуляция скорости распада, стабильности и конформации ферментов

При рассмотрении возможных механизмов влияния гормонов на активность ферментов основное внимание обычно уделяют индукции, т. е. увеличению скорости синтеза ферментов. При этом часто из поля зрения выпадает или игнорируется тот факт, что сами ферменты, как и все другие белки организма, подвергаются постоянному распаду. Кроме того, нередко забывают о том, что существует большое число различных механизмов, меняющих активность уже синтезированных ферментов. Поэтому очень важно учитывать не только скорость синтеза, но и скорость распада фермента, т.е. количество активного фермента будет определяться соотношением скоростей этих двух процессов. В связи с этим очень важным является изучение влияния гормонов на скорость распада, стабильность ферментов и на изменения конформации, определяющие как устойчивость фермента к распаду, так и поддержание оптимальной для действия фермента структуры.

Скорость распада белков принято характеризовать величиной полураспада -- 1/2. Величину t V₂ определяют по включению в белки радиоактивных аминокислот, вводимых либо однократно, либо повторно; в последнее время широко используют метод двойной изотопной метки, при котором вводят аминокислоты, содержащие 2 метки -- ³H и ¹⁴C Для определения скорости распада белков используют также ингибиторы биосинтеза белка и РНК- Однако ни один из методов определения скорости распада ферментов в организме не дает абсолютно достоверных результатов. Наиболее часто используемое введение меченых аминокислот имеет тот недостаток, что меченая аминокислота подвергается in vivo превращениям в процессе обмена. Определение активности фермента во времени после введения пуромицина или циклогексимида теоретически должно бы давать величину скорости распада фермента, так как синтез фермента снят ингибитором. Однако применение ингибиторов биосинтеза белка также имеет серьезные ограничения, потому что эти ингибиторы могут изменять скорость распада некоторых ферментов. Поэтому при определении Ь/₂ различными методами могут быть получены расходящиеся результаты. Наиболее целесообразно использовать сочетание нескольких методов определения.

Определение t 1/2 показало широкую вариабельность этих величин как для различных белков, так и для одного и того же белка у различных видов животных. Например, t 1/2 альбумина плазмы крови у различных животных составляет: мышь--1,2; крыса -- 2,5, кролик -- 5,7, собака --8,2, корова --20,7.

Еще большее разнообразие представляют величины t'/₂ для различных ферментов и белков у одного и того же вида.

Время полураспада ферментов варьирует от нескольких минут до 100 дней. Различия в величинах t V₂ одного и того же фермента, полученные разными авторами, можно объяснить, вероятно, использованием различных методов определения времени полураспада фермента, а также возможной зависимостью этого показателя от физиологического состояния животных.

Более детальное представление об интенсивности распада ферментов в тканях животных дает определение констант распада и сопоставление их с константами синтеза. Обе эти константы определяют по включению меченых аминокислот в данный фермент.

Константы скоростей синтеза и распада 5 изофермеитов лактатдегидрогеназы различны в разных тканях: так, в сердце, где преобладает ЛДГ-1 распад изоформы 1 наиболее низок, а синтез высок; в скелетной мышце и печени, где преобладает ЛДГ-5, такие же отношения характерны для изоформы 5. Величина t 1/2 для ЛДГ-5 в скелетной мышце составляет 138, а для ЛДГ-1-13 дней. В то время как скорость распада ферментов широко варьирует, скорость синтеза может быть одинаковой. Это показано для тирозин-аминотрансферазы, триптофаноксигеназы, аланин-аминотрансферазы и аргиназы.

Очень важен вопрос о том, какие механизмы определяют распад ферментов в организме животных. Под термином «распад белка» подразумевают необратимое изменение молекул белка, сопровождающееся потерей, характерной для данного белка функции; в случае ферментов -- это необратимая потеря активности и антигенности. Вопрос о механизмах распада белка в организме исследован мало, и наши знания о контроле этих процессов находятся в зачаточном состоянии.

Наиболее простой концепцией является предположение о том, что молекула фермента распадается по мере «старения». Однако это предположение не дает ответа на вопрос о том, какие изменения происходят с данным белком и какими факторами эти изменения вызываются. Поскольку молекула одного и того же фермента может претерпевать различные конформационные изменения, возможно, что некоторые из конформационных состояний наиболее способствуют распаду белка под влиянием каких-то факторов. Такими факторами могут быть неспецифические протеиназы, специфические инактивирующие белки и ферменты лизосом. Возможно также, что первой стадией распада фермента является денатурация.

Schimke и др. исследовали природу системы, отвечающей за распад триптофаноксигеназы in vivo, и пытались сопоставить эти данные со стабильностью препаратов фермента in vitro. Простейшей системой, способной вызвать потерю каталитической активности и антигенных свойств фермента, являются срезы печени. Распад триптофаноксигеназы in vivo является сложным активным процессом, который происходит в метаболически активной ткани печени. Стабильность очищенных препаратов фермента в значительной степени соответствует, хотя и не аналогична полностью, устойчивости фермента in vivo. Возможно, что распад триптофаноксигеназы и других ферментов осуществляется при помощи специфических протеиназ. На такую возможность указывают

Benson и Young, показавшие, что циклогексимид повышал активность тирозип-аминотрансферазы в печени взрослых крыс при введении in vivo. В данном случае происходило торможение синтеза белка, специфически влияющего на распад тирозин-аминотрансферазы, и что повышение устойчивости последней с избытком перекрывало возможное торможение ее синтеза, производимое циклогексимидом. Эта точка зрения получила экспериментальное подтверждение в работах Katunuma и др. Японские авторы открыли 3 новых фермента, которые вызывают специфическую инактивацию белковой части ферментов, содержащих в качестве коферментов ПЛФ, НАД или ФАД. Эти инактивирующие ферменты обнаружены в тонком кишечнике, печени и мышцах крыс и каждый фермент «работает» строго специфично, не расщепляя другие ферменты или белки.

Не исключена возможность, что определенную роль в распаде тканевых ферментов играют протеиназы лизосом, так как существует прямая связь между химической стабильностью белков и их устойчивостью к гидролитическому действию ферментов лизосом. Неясно, действуют ли ферменты лизосом непосредственно на тканевые ферменты или же на пептиды, образовавшиеся в результате протеолиза под влиянием уже упоминавшихся специфических инактивирующих ферментов. Несомненно, что очень большое значение имеет конформация молекулы фермента, которая облегчает или, наоборот, затрудняет действие ииактивирующих ферментов. И, наконец, инактивация фермента может происходить и без распада, только путем перехода в неактивную коиформацию, достаточно устойчивую к распаду.

Существует также мнение о том, что распад ряда сложных ферментов происходит в результате отщепления ко-фермента, вызывающего такие изменения белковой части фермента, вследствие которых последний становится более чувствительным к протеиназам или инактивирую-щим агентам. Кроме того, диссоциация кофактора, приводящая к образованию агрегированной формы апофермента, может быть сигналом для синтеза специфического деградирующего фермента или транспорта его к месту распада фермента. Пока еще неясно, имеет ли место in vivo диссоциация кофактора, которую легко получить на очищенных ферментах. Если это так, то возможно наличие веществ, способных снижать диссоциацию кофермента из холофермепта, и действие таких веществ должно быть сходно с действием индукторов.

При рассмотрении влияния гормонов на скорость биосинтеза, ферментов без учета их возможного воздействия на распад может возникнуть неверное представление о величине индукции, если не учитывать различия в периоде полураспада ферментов. Это можно пояснить следующим примером.

Предполагается, что скорость синтеза четырех ферментов-- А, Б, В и Г -- под влиянием какого-либо воздействия возрастает в 10 раз, а Ъ/₂, составляющий 1; 5; 10 и 50 ч соответственно, не меняется. В этом случае скорость достижения максимальной активности будет зависеть от величины ti/₂ и будет различной для этих 4 ферментов. Если определять активность ферментов через короткое время после воздействия, то можно сделать неверный вывод о том, что эффект воздействия относительно специфичен для фермента А.

На абсциссе - время в сутках; на ординате - кратность увеличения активности.

Так как в этот период активность его возрастает примерно в 9 раз, а фермента Г - только в 1,4 раза. Однако при учете изменений' активности за более длительный период очевидно, что величина воздействия сходна-для всех рассмотренных ферментов. Эти теоретические предположения были подтверждены экспериментальными данными относительно влияния кортизона па активность 4 ферментов азотистого обмена. Адреналэктомироваиным крысам вводили по 10 мг кортизона каждые 8 ч в течение 4 дней и определяли активность триптофаноксигеназы, тирозин-амииотраисферазы, аланин-аминотрансферазы и аргиназы в печени. Видно, что активность триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы быстро возрастала в первые 4-8 ч; активность аланин-аминотрансферазы и аргиназы увеличивалась в более поздние сроки. Через 4 ч после введения кортизона активность ферментов увеличивалась: триптофаноксигеназы в 9,6 раза, тирозин-аминотрансферазы в 3,3 раза, аланин-аминотрансферазы в 1,4 раза, аргиназы в 1,1 раза.

Рис.32. Временная зависимость повышения активности триптофаноксигеназы, тирозин-аминотрансферазы, аланин-аминотранс-феразы и аргиназы в печени крыс после введения кортизона.

На абсциссе - время в сутках; на ординате - кратность увеличения активности.

При учете Uf₂ следует, что кортизон повышает активность всех 4 исследованных ферментов примерно одинаково. Следовательно, различная скорость ответа ферментов на кортизон обусловлена не их различной «чувствительностью» к гормону, а разной скоростью распада этих ферментных белков. Поэтому для суждения о том, индуцируется ли данный фермент какими-либо гормонами, необходимо исследовать ответ фермента как через несколько часов, так и через несколько дней после введения гормона.

Таблица 28 - Скорость синтеза ферментов азотистого обмена в печени крыс, после введения кортизона в период максимума индукции

Однако в этих работах не учитывается возможность того, что гормоны могут влиять не только на скорость синтеза, но и на Iv₂ апофермсптов. Между тем в последние годы получены данные, свидетельствующие о возможности такого влияния. В первую очередь это касается индукции тирозин-аминотрансферазы. Boctor и Grossman определяли t V₂ этого фермента в печени адреналэктомированных крыс до введения гормона, на максимуме повышения активности в ответ на введение триамцинолоиа и в период снижения активности. Индукция тирозин-аминотрансферазы имеет 3 фазы: 1) лаг-период; 2) интенсивный синтез фермента; 3) инактивация индуцированного фермента.

Величины t V₂ тирозин-аминотрансферазы были до индукции 6,1 ч на максимуме индукции--11,7 ч, после индукции--1,7 ч.

Очевидно, после индукции, в 3-ю фазу, фермент гораздо более стабилен, чем в базальных условиях или на максимуме индукции. Возможно, что в период 2-й фазы наибольшая устойчивость фермента связана с торможением синтеза специфических инактиваторов, а повышенная лабильность фермента в 3-ю фазу является результатом интенсивного синтеза этих инактиваторов.

Очень сходные с этими данными величины 1/2 тирозин-аминотрансферазы получены и в других работах. Так, Grossman и Mavrides также нашли величину t 1/2 равной 1,7 ч, но не только в период инактивации, но и в период индукции. Civen и др. получили аналогичные данные при инкубации срезов печени крыс с кортизолом in vitro: величина Uf₂ тирозин-аминотрансферазы в срезах печени до воздействия гормона была 3,7 ч, а после контакта с гормоном --11,1 ч. При перфузии печени установили, что добавление инсулина в среду перфузии значительно задерживало распад тирозин-аминотрансферазы. Показано также влияние на величины Ь/₂ ферментов СТГ и эстрогенов. Влияние гормонов па время полураспада ферментов не ограничивается тканью печени, но распространяется и на многие другие, в частности на ткань молочной железы.

Некоторые примеры влияния гормонов t V₂ ферментов приведены в табл.29.

Таблица 29 - Влияние изменения гормонального статуса животных на величины Uj₂ некоторых ферментов

Заслуживает внимания тот факт, что t у₂ триптофаноксигеназы - фермента, наиболее изученного в отношении гормональной индукции, не меняется после введения кортикостероидов. Причина этого интересного факта еще не выяснена.

Результаты определения влияния гормонов на интенсивность распада или инактивации ферментов позволяют более точно оценить величину гормональной индукции ферментов. Так, например, введение кортизола крысам повышает активность серип-дегидратазы в печени в 4 раза, а алаиип- и аспартат-аминотрапсфераз - в 2,8 раза. Так как t 1/2 аланин-аминотрансферазы после введения кортизола практически не меняется, то увеличение активности может быть целиком отнесено за счет синтеза и кратность его повышения равна 2,8. Для аспартат-ами-нотраисферазы 1/2 после введения гормона уменьшается примерно вдвое и. следовательно, синтез этого фермента возрастает в 5,6 раза. В отношении серин-дегидратазы, 1/2 которой после введения кортизола повышается в 1,5 раза, скорость синтеза возрастает в 2,7 раза.

Все эти данные усилили интерес к исследованию влияния гормонов на физико-химические свойства ферментов, -так как некоторые свойства ферментных белков могут, по всей вероятности, определять распад ферментов in vivo. Segal, Kim и др. полагают, что существует определенная корреляция между стабильностью ферментов in vitro и скоростью распада их in vivo. Поскольку Яг₂ ферментов зависит от состояния молекулы последних, очень важной стороной вопроса гормональной регуляции активности ферментов является влияние гормонов на пространственную структуру, т. е. на конформацию ферментов.

Наибольшее количество данных получено в отношении глутаматдегидрогеиазы - фермента, катализирующего обратимое окислительное дезаминирование глутаминовой кислоты с образованием б-кетоглутаровой кислоты и аммиака. Этот фермент широко распространен в тканях животных и имеет большое значение ввиду центральной роли глутаминовой кислоты в обмене аминокислот.

Кристаллическая глутаматдегидрогеназа, выделенная из печени крупного рогатого скота, представляет собой тетрамер, т. е. белок, состоящий из 4 субъединиц. Кристаллический фермент обладает на 98% активностью в отношении глутаминовой кислоты и небольшой аланиндегидрогеиазной активностью, т.е. способностью катализировать дезаминирование аланина до пировиноградной кислоты и аммиака. В растворе полимерная форма, относительная молекулярная масса которой около 1 млн., находится в равновесии с двумя мономерными формами, одна из которых обладает и глутамат-, и аланиндегидрогеиазной активностью, а другая - в основном аланиндегидрогеиазной активностью. Работами Yielding, Tomkins, Talal и др., Tomkins и др. установлено, что добавление к раствору глутаматдегидрогеназы природных или синтетических женских половых гормонов в низких концентрациях приводит к изменению ферментативной активности: резко снижается глутаматдегидрогеназная и возрастает аланин-дегидрогеназпая активность. Как было показано при помощи исследования седиментации в ультрацентрифуге, гормоны вызывают дезагрегацию формы а на субъединицы и сдвигают равновесие в сторону преобладания формы с, в результате чего возрастает аланиндегидрогеназная активность.

Рис.33. Влияние эстрогенов на конформацию и активность глутамат-дегидрогеназы. Объяснение в тексте.

Engel и Scott исследовали влияние кортикостерона in vitro на активность глутаматдегидрогеназы, выделенной из печени быка. Эти авторы нашли, что уже малые концентрации кортикостерона повышали активность фермента, причем тестостерон тормозил действие кортикостерона, а 11-эпикортикостерон был неэффективен. На активность кристаллической глутаматдегидрогеназы оказывал влияние и тироксин в концентрации IX*10^-5 М, причем эффект его был сходен с действием эстрогенов.

В наших исследованиях установлено влияние кортико-стероидов in vitro на активность треонин-дегидратазы, выделенной из печени овцы. Активность первого препарата была в 100 раз, а второго -- в 140 раз выше активности в исходном гомогенате печени. Как видно из данных, представленных на рис. преднизолон и кортизон повышали активность фермента in vitro, но в значительно меньшей степени, чем при введении животным in vivo. Разумеется, результаты относительно влияния гормонов на активность ферментов in vitro следует трактовать очень осторожно по ряду причин. Во-первых, не исключена возможность неспецифического действия молекул гормонов на ферментные белки; во-вторых, в опытах in vitro трудно, а зачастую и невозможно моделировать условия, обеспечивающие протекание ферментативных реакций в целостном организме. Тем не менее изменение структуры фермента под действием гормона может быть одним из путей регуляции активности ферментов in vivo.

Рис.34 Влияние кортизона и преднизолона на активность 2 препаратов треонин-дегидратазы, выделенных из печени овцы. Активность препаратов, инкубированных без гормонов, принята за 100%· Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37°С. Концентрация преднизолона составляла IO^-7M₁ кортизона--1.25Х 10^-5M.

Известно, что глюкокортикоиды тормозят, а инсулин снимает это торможение активности гексокиназы - одного из ключевых ферментов углеводного обмена. Гексоки-иаза катализирует реакцию:

Гексокиназа и глюкокиназа отличаются тем, что глюкокиназа значительно более специфична для глюкозы, но «работает» при более высокой концентрации глюкозы, чем гексокиназа. Реакция, ведущая к образованию глюкозо-6-фосфата, является начальной реакцией гликолиза и вовлекает глюкозу в энергетический обмен организма.

В своих работах В. С. Ильин и соавт. исследовали молекулярное взаимодействие глюкокортикоидов с гексо-киназой. Гексокиназа была выделена в кристаллическом виде из дрожжей; фермент состоит из 4 субъединиц с относительной молекулярной массой по ~24 000 и содержит 4 свободные SH-группы. Для выяснения механизма действия инсулина и кортизона на гексокиназу авторы использовали тиоловый ингибитор Н-этилмалеимид, специфически связывающий SH-группы.

Таблица 29 - Действие кортизона и инсулина на активность дрожжевой гексокиназы в условиях связывания свободных SH-rpynn фермента

Как видно из данных табл., кортизон тормозит активность гексокиназы, а инсулин снимает это торможение. Действие кортизона проявляется и после связывания SH-группы фермента, однако для действия инсулина необходимы свободные SH-группы. Эти данные позволили предположить, что инсулин взаимодействует с гексокиназой путем образования химической связи между SH-группами фермента и S--S-группами гормона:

Предположение об образовании молекулярного комплекса гексокиназы с инсулином было подтверждено выделением этого комплекса при электрофорезе на агаровом геле. Таким образом, по этой гипотезе инсулин является аллосте-рическим эффектором гексокиназы, вызывающим такие изменения конформации молекулы фермента, которые приводят к потере способности отвечать торможением активности в ответ на глюкокортикоиды. По всей вероятности, аллостерическим является влияние инсулина и на активность пируватдегидрогеназы в тканях животных. Этот фермент существует в двух формах: активной и неактивной. Внутрибрюшииное введение инсулина крысам уже через 15 мин сдвигало равновесие между обеими формами фермента в жировой ткани от 56,7±11,1% активной формы в контроле до 102,3±7,2% после инсулина; добавление инсулина in vitro сдвигало содержание активной формы с 31,6±5,2 до 74,1±14,3 миллиединиц/г ткани. Эта гипотеза не исключает возможности того, что антагонизм различных гормонов и, в частности, кортизона и инсулина может проявляться на других уровнях регуляции: например, биосинтеза апоферментов. Больший интерес представляет возможность разностороннего воздействия гормонов на активность ферментов.

Существует еще один аспект вопроса относительно влияния гормонов на конформацию ферментов: имеются ли различия в пространственной структуре ферментов, синтезированных в организме при различном обеспечении его гормонами? Известно, что белки с одной и той же последовательностью аминокислот, т. е. с одинаковой первичной структурой, могут иметь различные свойства, например по чувствительности к денатурирующим агентам, по термостабильности и т. д. Гормональное влияние на стадии образования третичной и четвертичной структуры ферментов является еще одной возможностью гормонального контроля активности ферментов. К сожалению, данные такого рода немногочисленны.

Показано, что введение тироксина крысам меняет спектральные свойства цитохрома Р-450 в печени, что сопровождается повышением способности Р-450 к связыванию некоторых фармакологических средств, например гексобарбитала и пирамидона. При исследовании иммунохимических свойств тирозин-аминотрансферазы, индуцированной дексаметазоном, инсулином или сывороткой крови, в клетках культуры гепатомы in vitro не нашли различий в свойствах фермента, синтезированного в ответ на эти индукторы. Однако известно, что иммунохимически идентичные ферменты могут отличаться по ряду свойств. Например, аминолевулинатдегидратаза печени у эмбрионов мышей, иммунохимически идентичная ферменту печени взрослых животных, отличается от него по температурной стабильности и устойчивости к трипсину. В связи с этим представляло интерес более подробно исследовать свойства ферментов, синтезированных при различном гормональном статусе.

Мы изучали влияние введения кортикостероидов на некоторые свойства треонин-дегидратазы в печени крыс. Фермент выделяли из печени интактных крыс, адренал-эктомированных и интактных, но получавших кортизол, и подвергали очистке. Двустороннюю адреналэктомию производили одномоментно под эфирным наркозом и животных брали в опыт через 5 дней, когда содержание кортикостероидов в организме минимальное. Кортизол вводили внутримышечно по 2 мг/100 г массы раз в день в течение 5 дней. Активность треонин-дегидратазы определяли по приросту б-кетобутирата после инкубации фермента с L-треонином и выражали в микромолях кетобутирата на 1 мг белка в час. Схема очистки фермента приведена в табл.30.

Таблица 30 - Очистка треонин-дегидратазы из печени интактных крыс%

По такой же схеме получены препараты фермента из печени получавших кортизол и из печени адреналэктомированных крыс. Активность этих препаратов фермента в 200-500 раз превышала исходную.

На рис. приведены данные о стабильности препаратов треонин-дегидратазы, выделенной из печени трех указанных групп животных. Препараты хранили при температуре -20° С и периодически определяли ферментативную активность на протяжении 3 мес. Активность свежеполученного фермента принимали за 100%, а последующие величины выражали относительно этой исходной активности. Как видно на рис.35, активность треонин-дегидратазы, выделенной из печени интактных и получавших кортизол крыс, быстро снижается в первые 2 нед и продолжает снижаться далее, составляя через 12 нед всего 10-15% от исходной активности. Совершенно иные результаты получены в отношении фермента, выделенного из печени адреналзктомированных крыс в период максимальной недостаточности кортикостероидов в организме. В этом случае ферментативная активность вначале также снижалась, хотя максимальное снижение составляло всего 20%. В последующие сроки, начиная с 5-6-й педели, активность фермента постепенно увеличивалась, а через 12 нед это увеличение составляло уже около 30%. Эти данные наводят на мысль о том, что после адреналэктомии синтезируется фермент, имеющий несколько отличную конформацию от фермента, синтезированного в условиях физиологического или избыточного количества кортико-стероидов в организме. В связи с этим интересны данные Diamondstone, что после 5-недельного хранения препаратов тирозин-аминотрансферазы, выделенной из печени интактных крыс, получавших Ь-тирозии + Ь-метионин, в них обнаруживали низкомолекулярный компонент, обладающий ферментативной активностью, которого не было в свежеполученном препарате. Возможно, что в данном случае происходит перестройка молекулы фермента таким образом, что молекулы приобретают несколько иную конформацию -- конформеры фермента.

Рис.35 Изменение активности треонин-дегидратазы, выделенной из печени интактных, интактных и получавших кортизол и ад-реналэктомированных крыс при хранении препаратов ферментов при -20°С. На абсциссе -- время хранения препарата, недели; на ординате -- ферментативная активность в процентах к активности свежевыделенного препарата.

С целью более детального выяснения отличия ферментных белков, синтезированных в различных гормональных условиях in vivo, сравнивали устойчивость препаратов треонин-дегидратазы к действию протеолитических ферментов. Препараты фермента, выделенные из печени трех групп животных, инкубировали 1-3 ч при температуре 37° С в присутствии трипсина или проназы в отношении протеиназа: треоиин-дегидратаза, равном 1:50или 1:20. Затем осаждали белки и определяли степень гидролиза по приросту оптической плотности при 280 нм. Поскольку данные, полученные с трипсином и проназой, носят однозначный характер, они были объединены.

Рис.36 Влияние проназы на активность треонин-дегидратазы, выделенной из печени интактных, адреналэктомированных и интактных, получавших кортизол животных. На абсциссе -- время инкубации в часах; на ординате -- активность фермента в процентах к активности в пробе без проназы.

Полученные результаты свидетельствуют, что в одних и тех же условиях протеолиза фермент, выделенный из печени адреналэктомированных крыс, значительно более устойчив к действию протеиназ, чем фермент из печени интактных или получивших кортизол животных. Чтобы сопоставить данные по протеолизу с влиянием на ферментативную активность, были поставлены следующие опыты. Препарат треонин-дегидратазы инкубировали в обычных для определения активности условиях в течение 1, 2 и 3 ч и к половине проб добавляли проназу в соотношении проназа: треонин-дегидратаза, равном 1:20. Затем осаждали белки и определяли активность треонин-дегидратазы по приросту продукта реакции, а-кетобутирата.

Активность в присутствии проназы выражали в процентах к активности без проназы, принятой за 100. Полученные данные представлены на рис. Наиболее устойчивым к действию проназы оказался препарат треонин-дегидратазы, выделенный из печени адреналэктомированных крыс. Активность этого препарата очень мало снижалась за 1 ч инкубации с проназой и через 3 ч составляла еще 40% от исходной активности. В противоположность этому активность треонин-дегидратазы из печени йнтактных и «кортизоловых» крыс наиболее резко падала в присутствии проназы в течение первого часа, а через 3 ч инкубации не превышала 10% своего контроля. Эти результаты свидетельствуют о различной устойчивости препаратов фермента к протеолизу.

Очень интересные данные получили Н. П. Мертвецов и др. в отношении тирозин-аминотрансферазы. Как было показано ранее ими и другими авторами, после введения животным кортизола происходит индукция двигающегося к аноду изофермента тирозин-аминотрансферазы, в то время как количество «катодного» изофермента практически не меняется. Н. П. Мертвецов и др. показали различную чувствительность к протеиназам этих изоферментов тирозин-аминотрансферазы. При инкубации с проназой активность Б-формы снижалась в 7-8 раз, а К-формы не более чем на 50%. Эти данные хорошо согласуются с результатами наших исследований по протеолизу треонин-де-гидратазы, выделенной из печени животных с различным гормональным статусом.

Сходные результаты были получены В. Н. Чесноковым и др. в отношении индукции гексокиназы инсулином: изоформа, индуцируемая этим гормоном, оказалась значительно более чувствительной к действию трипсина, чем изоферменты гексокиназы, не отвечающие на инсулин.

Интересно, что при индукции тирозин-аминотрансферазы в культуре клеток гепатомы крыс нашли, что в процессе индукции термолабильный компонент фермента модифицируется таким образом, что становится менее чувствительным к прогреванию.

В опытах in vitro показано, что кортизол, кортизон и кортикостерон усиливали гидролиз альбумина и окси-гемоглобииа трипсином на 10-200%. Кроме того, как указывалось выше, ряд авторов показали наличие в тканях животных специфических протеиназ, расщепляющих пир идокса левые ферменты. Эти же авторы нашли, что один из пиридоксалевых ферментов -- орнитин-трансамииаза после обработки специфической протеиназой гораздо более легко, чем нативная, подвергается действию трипсина. В связи с этим, можно предположить, что одной из причин различной устойчивости данного фермента к протеиназам in vitro может быть большая или меньшая степень воздействия на фермент специфических протеиназ in vivo, количество которых также может находиться под гормональным контролем. Однако наиболее существенным фактором в любом случае является конформация ферментного белка.

Рис.37 Электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле препаратов треонин-дегидратазы, выделенных из печени интактных, интактных, получавших кортизол, и адреналэктомированных крыс. Стрелка означает положение красителя, по скорости движения которого следили за ходом разделения.

В препаратах треонин-дегидратазы из печени адреналэктомированных крыс обнаруживается 6 фракций, а в препаратах фермента из печени интактных и «кортизоловых» крыс -- по 4 фракции; различна и скорость движения отдельных фракций.

Для треонин-дегидратазы бактерий показано наличие четвертичной структуры: фермент, выделенный из Clostridium tetanomorphum, состоит из 8 субъединиц, а выделенный из Salmonella typhimurium -- из 4 субъединиц. Треонин-дегидратаза животных тканей изучена в этом отношении еще не достаточно. До сих пор пет единого мнения, является ли серии- и трсонин-дегидратаза одним ферментом или это различные ферменты. Имеются данные о существовании двух изоферментов серин-дсгидратазы, один из которых индуцируется глюкагоиом, а другой -- глюкокортикоидами. Препараты треонин-дегидратазы, полученные в наших опытах, также обладали серии-де-гидратазной активностью. При определении обеих активностей в ходе очистки фермента из печени трех уже упоминавшихся групп животных были получены данные, представленные на рис.

Рис.38 Определение серии и треонин-дегидратазной активности в процессе выделения и очистки препаратов треонин-дегидратазы из печени интактных, адреналэктомированных и интактных, получавших в течение 5 дней по 5 мг кортизола, животных. На абсциссе--стадии очистки; на ординате -- отношение удельной активности для субстрата треонина к удельной активности для субстрата серина.

На нем графически показано отношение удельных активностей фермента для треонина и для серина на отдельных стадиях выделения и очистки фермента из печени интактных, адреналэктомированных и получавших кортизол крыс. Видно, что в печени интактных крыс это отношение составляет 1,16, в печени адреналэктомированных-- 0,86 и в печени «кортизоловых» -- 2,14. В ходе очистки соотношение активностей становится все более близким и для препаратов с высокой степенью очистки оно практически одинаково для всех трех групп, составляя около 0,60. Таким образом, возможно, что кортизол индуцирует в большей степени треонин-дегидратазу или один из изофермеитов, обладающих преимущественно треонии-дегидратазной активностью. В ходе выделения и очистки фермента эта форма либо частично распадается, либо каким-то образом модифицируется и более чистый фермент имеет одинаковое отношение треонин-серин-дегидратазной активности для всех трех групп животных. Однако свойства этого высокоочищенного фермента различны в зависимости от недостаточного или избыточного количества кортикостероидов, при котором происходил синтез фермента. Этим данным пока еще трудно дать исчерпывающее объяснение. Наиболее вероятным является предположение о различии в конформации апофермента, являющемся следствием влияния гормонов на посттранскрипционном уровне, скорее всего на стадии завершения образования третичной структуры ферментного белка.

Наконец, есть данные о возможности влияния гормонов на каталитическую «эффективность» ферментов. В этих исследованиях клетки HeLa культивировали в среде, к которой добавляли преднизолон или кортизол в концентрации 1х10^-6 Через 12-24 ч после добавления гормонов активность щелочной фосфатазы в клетках возрастала в 5-20 раз. Тщательный иммунохимический анализ и данные по включению ¹⁴С-лейцина в ферментный белок показали, что повышение активности не сопровождалось увеличением скорости синтеза щелочной фосфатазы; не снижалась и скорость распада фермента. Поскольку щелочная фосфатаза является металлоферментом, содержащим Zn²+, определяли содержание Zn²+ в «индуцированном» ферменте. Оказалось, что под влиянием гормонов содержание Zn²+ в ферменте не изменялось, но связывание Zn²+ с белком «индуцированной» фосфатазы отличалось от связывания с исходным апо-ферментом. Повышение каталитической эффективности щелочной фосфатазы происходит не в результате повышения скорости синтеза самого фермента, а вследствие образования под влиянием гормонов особого модификатора фермента. Этот модификатор изменяет конформацию или физико-химические свойства щелочной фосфатазы таким образом, что повышается активность каждой молекулы, в результате чего снижается потребность в энергетическом обеспечении при ферментсубстратном взаимодействии. Модификатор может взаимодействовать либо с только что синтезированным ферментом, либо с полипептидом, еще связанным с полисомами.

Эти очень интересные данные подчеркивают важность данного аспекта гормональной регуляции -- влияния гормонов на конформацию и физико-химические свойства белковой части ферментов.

Помимо влияния гормонов на скорость синтеза ферментов, очень важным аспектом гормональной регуляции является воздействие гормонов на скорость распада, стабильность и конформацию ферментов.

Скорость распада в организме различных белков, в том числе ферментов, широко варьирует. Например, время полураспада орнитин-декарбоксилазы в печени составляет около 10 мин, а глицеральдегидфосфатдегидрогеназы в скелетной мышце -- около 100 дней. Механизмы, определяющие распад ферментов in vivo, выяснены еще недостаточно. Для ферментов, имеющих в своем составе пиридоксальфосфат, показано наличие специфических инактивирующих протеиназ, локализованных в тонком кишечнике, печени и мышцах животных. Возможно, что определенную роль играют гидролитические ферменты лизосом, освобождающиеся из этих субклеточных частиц при повреждении мембран.

Достоверно установлено, что гормоны могут влиять на скорость распада ферментов, увеличивая или уменьшая ее. В отношении тирозин-аминотрансферазы показано, что период полураспада наиболее высок на максимуме кортикостероидной индукции и минимален в период спада ферментативной активности. В базальных условиях величина полураспада составляет около 6 ч. Такие изменения имеют, вероятно, большое физиологическое значение, способствуя «убиранию» избытка фермента после окончания индукции. Сопоставление периода полураспада фермента со скоростью его синтеза позволяет более правильно судить о гормональном воздействии на тот или иной фермент, так как именно соотношение скоростей синтеза и распада определяет реальное количество ферментного белка.

Большое значение имеет также влияние гормонов на пространственную структуру ферментных белков. Это влияние особенно хорошо показано на примере действия эстрогенов на изменение четвертичной структуры глутаматдегидрогеназы, сопровождающееся изменениями активности; аналогичный эффект установлен и для тироксина. Гормоны могут являться аллостерическими эффекторами ферментов, образуя гормонферментные комплексы.

Влияние гормонов на конформацию ферментных белков проявляется, вероятно, как на уровне уже синтезированного фермента, так и в период его синтеза, освобождения с полисомы или сразу же после этого. О такой возможности, в частности, свидетельствуют различия физико-химических свойств треонин-дегидратазы, образовавшейся в печени животных при недостаточном или избыточном содержании кортикостероидов в организме. В этом же плане можно рассматривать и влияние гормонов, приводящее к увеличению каталитической эффективности ферментов без увеличения скорости синтеза ферментного белка, как это показано в отношении щелочной фосфатазы.

В целом влияние гормонов на состояние молекул ферментов может иметь очень большое физиологическое значение в смысле поддержания гомеостаза. Данные по этому вопросу еще сравнительно немногочисленны, но область исследования является перспективной.

12 Влияние гормонов на биосинтез коферментов. "Кофакторная" индукция

Многие ферменты имеют в своем составе не только белковую часть, но и низкомолекулярное соединение (кофермент, или простетическую группу), причем ферментативной активностью обладает только комплекс апофермента с коферментом. Поскольку гормоны могут воздействовать на активность ферментов и через коферменты, целесообразно рассмотреть данные, имеющиеся по этому вопросу.

При исследовании механизма действия гормонов в организме возник вопрос, не являются ли сами гормоны прямыми, непосредственными участниками ферментативных реакций, например в качестве коферментов, и не является ли такое участие главным физиологическим эффектом гормонов. Накопленные к настоящему времени данные позволяют в целом отрицательно ответить на этот вопрос. Тем не менее следует остановиться на работах двух групп исследователей -- Villee и соавт. и Talalay и соавт., так как эти работы привлекли в свое время большое внимание и послужили толчком для расширения исследований механизма действия гормонов. Основой гипотезы этих авторов явилось предположение, что эстрогены непосредственно участвуют в переносе водорода между двумя видами пиридиннуклеотидов: никотинамид-адениндинуклеотидом и никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфатом. Оба пиридиннуклеотида являются коферментами оксидоредуктаз, катализирующих реакции типа:

НАДФ-Н₂ + НАД НАДФ +НАД-Н₂

Рис.39 Участие эстрогенов в качестве коферментов окислительно-восстановительных реакций в тканях животных

Реакции этого типа очень распространены в клетках и играют важную физиологическую роль в процессах обмена веществ и образования энергии.

По мнению Villee и соавт., первичное действие эстрогенов состоит в активации реакции I, в ходе которой освобождается большое количество энергии, используемой в первую очередь для биосинтеза нуклеиновых кислот и белка.

Согласно гипотезе Talalay и соавт., эстрадиол непосредственно участвует в переносе H₂ между НАД и НАДФ, являясь коферментом специфичной дегидрогеназы. При этом сам гормон из гидроксильной формы переходит в кетоформу и обратно. Из плаценты человека была выделена и очищена в 2500 раз 17 в-оксистероиддегидрогеназа, которая катализировала перенос H+ между НАД и НАДФ и, по мнению авторов, отвечала за стимулируемый эстрадиолом транспорт H⁺ между этими двумя пиридиннуклеотидами. Данные Talalay и соавт. встретили возражения других авторов, которые отделили дегидрогеназную активность от трансгидрогеназной.

В настоящее время гипотеза Villee и Talalay не поддерживается большинством авторов с точки зрения универсальности для физиологической роли эстрогенов, но участие эстрогенов в транспорте H+ не вызывает сомнения. Роль эстрогенов в переносе H+ очень важна в таких тканях, как плацента, при исследовании которой получены основные данные, легшие в основу рассмотренной гипотезы.

13 "Кофакторная" индукция ферментов и роль гормонов

Активность тирозин-аминотрансферазы в печени крыс с экспериментальным Вб-авитаминозом значительно снижена и составляет всего 50-75% нормы. Кортизоловая индукция у таких животных сохраняется - введение кортизола повышает активность фермента примерно в 6 раз. Поскольку коферментом тирозин-аминотрансферазы является фосфорилировашюе производное витамина В₆-пиридоксальфосфат, то представляло большой интерес исследовать взаимоотношение кофермента и кортикостероидов в индукции данного фермента.

Greengard и Gordon впервые показали "кофакторную" индукцию тирозин-аминотрансферазы. Адренал-эктомированным крысам через 5-8 дней после операции вводили внутримышечно пиридоксии в различных дозах однократно или повторно, затем забивали их через различные промежутки времени и определяли активность фермента.

А активность тирозип-амипотрансферазы увеличивалась максимально после введения пиридоксина 2 раза по 100 мг. В опытах на интактных крысах получены аналогичные данные. Пуромицин значительно тормозил, а ак-тиномицин D не влиял на пиридоксиновую индукцию фермента. Аналогичные данные получили Holten и др., которые, однако, отметили торможение кофакторной индукции тирозин-аминотрансферазы и от введения актиномицинa D.

Интересные мысли о взаимодействии гормонов с ко-ферментом тирозин-аминотрансферазы пиридоксальфосфатом высказали Black и Axelrod. Авторы показали, что норадреналин снижает активность тирозин-аминотрансферазы in vivo и in vitro. При введении in vivo подавление активности фермента от норадреналина было особенно резко выражено в те часы суток, когда ферментативная активность была максимальной. Кроме того, норадреналин полностью блокировал пиридоксиновую индукцию тирозин-аминотрансферазы при совместном введении с пиридоксином. В опытах in vitro норадреналин образовывал прочный комплекс с ПЛФ. Эти данные позволили авторам предположить, что норадреналин конкурирует с белком тирозин-аминотрансферазы за ПЛФ и это составляет основу тормозящего эффекта гормона.

Мы отмечали наличие кофакторной индукции треонин-дегидратазы. Интактным и адреналэктомированным крысам вводили пиридоксин внутрибрюшигшо из расчета 100 мг/100 г массы в день, кортизол -- внутримышечно по 2,5 мг/100 г массы в день или кортизол вместе с пиридоксином в течение 3 дней. Затем крыс забивали и в гомогенате печени или в надосадочной фракции гомогената определяли активность треоиин-дегидратазы. Активность фермента У интактных животных, составлявшая 16,7 мк моль а-кстобутирата на 1 г белка за 30 мин, принята за 100%, а остальные величины рассчитывали к этому контролю.

Как видно на рис. у интактных животных пиридоксин вызывал отчетливое увеличение ферментативной активности; у адреналэктомированных животных индукции пиридоксином не было. Однако совместное введение пиридоксина с кортизолом адреналэктомированным крысам приводило к значительно большему повышению активности фермента, чем у интактиых животных; по-видимому, для проявления кофакторной индукции треонин-дегидратазы в отличие от тирозин-аминотрансферазы необходимы кортикостероиды.

Рис.40 Влияние введения пиридоксина на активность треонин-деги-дратазы в печени интактных (1) и адреналэктомированных (2) крыс

14 Влияние гормонов на биосинтез коферментов и содержание их в тканях

Поскольку активность сложных ферментов зависит от количества коферментов, то одним из путей воздействия гормонов па активность ферментов могут быть изменения содержания коферментов.

Снижение содержания ПЛФ в митохондриях печени крыс показано также in vitro при инкубации их с 5Х10-⁵ M L-тироксина.

Поскольку ферменты, имеющие в качестве кофактора ПЛФ, весьма многочисленны и катализируют такие основные реакции обмена, как переаминирование, влияние гормонов на синтез и обмен ПЛФ представляет особенно большой интерес.

Образование ПЛФ происходит путем фосфорилирования пиридоксина, пиридоксаля и пиридоксамина за счет АТФ, причем это фосфорилирование катализируется пиридоксалькиназой. Фосфаты пиридоксина и пиридоксамина окисляются в ПЛФ при посредстве специфических оксидаз, кофактором которых является флавинмо-нонуклеотид.