Гормональная индукция ферментов

Регуляция биосинтеза изоферментов

Поскольку многие ферменты имеют множественные молекулярные формы, одним из путей гормональной регуляции может быть преимущественное увеличение какой-либо одной формы. Такая возможность действительно показана. Большое количество работ посвящено лактатдегидрогеназе - ферменту, имеющему 5 изоформ. Соотношение между этими изоферментами зависит от гормонального статуса животных. Введение эстрадиола значительно повышает содержание М-формы и мало влияет на содержание З-формы в матке, крыс. В. С. Ильин и М. С. Усатепко показали, что диабет резко снижает, а введение инсулина повышает содержание М-субъединиц в мышцах кролика, причем денервация усиливает эффект недостаточности инсулина. Кортизол значительно снижает содержание М-типа в красных мышцах кролика; такой же эффект оказывает введение эстрадиола и прогестерона в отношении лактат-дегидрогепазы яйцевода у кроликов. В хрусталике глаза кролика после введения кортизола повышалось количество М-типа, хотя общая активность фермента практически не менялась.

Показано также изменение изоферментного спектра гексокиназы в тканях крыс после введения кортизола. Как и в случае лактатдегидрогеназы, денервация мышц повышала чувствительность изоферментов гексокиназы к действию кортизола и инсулина. Длительное введение инсулина индуцировало в основном одну из изоформ гексокиназы. Кортизол вызывал изменение изоферментного спектра эстераз и тирозин-аминотрансферазы в печени крыс. Тирозин-аминотрансфераза печени крыс при разделении путем электрофореза в агаровом геле имела две формы: А-изофермент и К-изофермент. Введение животным кортизола вызывало резкое увеличение количества А-изоформы фермента и практически не влияло и а содержание в печени К-формы.

Интересные данные получены при исследовании ферментов аланин-аминотрансферазы, имеющих различную локализацию в клетках печени крыс. В пренатальный период активность фермента в растворимой фракции была очень низкой, а в митохондриях значительно выше; на 10-й день жизни активность была одинакова, а к 30-му дню активность в гиалоплазме более чем вдвое превышала активность в митохондриях. Показано также, что стресс значительно повышает активность аланин-аминотрансферазы в гиалоплазме печени крыс и несколько снижает ее в митохондриях. Биосинтез изоферментов может контролироваться различными гормонами.

Таблица 10 - Стимуляция биосинтеза изоферментов аланин-аминотрансферазы в митохондриях.и гиалоплазме печени плода крыс за 2 дня до рождения¹

* с < 0,01

Вопрос о гормональной индукции изоферментов еще далеко не ясен. В опытах на животных показано, что различные гормоны могут индуцировать те или иные изоферменты тирозин-аминотрансферазы. При индукции этого же фермента в культуре клеток гепатомы инсулином и дексаметазоном синтезировались не различные изоферменты, а одна и та же молекулярная форма тирозин-аминотрансферазы.

Исследование индукции тирозин-аминотрансферазы в культуре клеток гепатомы RLC--GAJ печени крыс кортикостероидами и инсулином выявило некоторые интересные особенности. Дексаметазон в концентрации 10^-5 М вызывал максимальное увеличение ферментативной активности через 12--20 ч контакта клеток с гормоном; инсулин индуцировал фермент только в том случае, если клетки предварительно инкубировали с дексаметазоном. Индукция дексаметазоном подавлялась актиномицином D, индукция инсулином была не чувствительна к актиномицину D, но тормозилась циклогексимидом. Вероятно, действие кортикостероидов связано с влиянием на транскрипцию, а инсулина -- на посттранскрипциоиные стадии. При разделении тирозин-аминотрансферазы на ионообменных колонках нашли 2 изоформы, причем индукция дексаметазоном вызывала повышение синтеза обоих, а индукция инсулином только одного изофермента.

Рассмотренные данные убедительно свидетельствуют о том, что гормоны оказывают выраженное влияние на биосинтез ферментов и других белков в чувствительных к гормонам тканях. Большинство гормонов обладает множественным действием, особенно гормоны, регулирующие рост, развитие и основные процессы обмена в тканях взрослых животных. Эта множественность определяется как специфичностью ответа ткани на гормоны, так и возможностью наличия многих точек приложения действия гормонов.

В отношении биосинтеза белка установлена возможность влияния гормонов как на стадии транскрипции, так и на посттранскрипционных этапах. На примере стероидного гормона насекомых -- экдизона отчетливо показана возможность прямого гормонального влияния на транскрипцию; данные такого рода для клеток животных носят более косвенный характер, но также свидетельствуют о возможности регуляции образования мРНК- Гормоны могут влиять и на стабильность мРНК, что также очень важно для процесса биосинтеза белка в целом. Можно считать доказанным, что гормоны влияют на синтез компонентов рибосом и функционирование этих основных «машин» биосинтеза белка. Характерно, что введение многих гормонов вызывает сдвиг профиля рибосом в сторону преобладания полисом, обладающих гораздо большей биосиптетической активностью, чем мономерные формы рибосом. Для некоторых гормонов установлено воздействие на активацию аминокислот, что также очень важно для процесса трансляции.

Большое значение имеет возможность регуляции гормонами синтеза различных молекулярных форм ферментов-- изоферментов. По всей вероятности, очень многие, если не все, ферменты гетерогенны и эта гетерогенность дает большие дополнительные возможности для регуляции активности ферментов.

Не исключена возможность влияния гормонов на биосинтез ферментов и при посредстве увеличения фонда свободных аминокислот, о чем будет сказано ниже.

3 Взаимодействие различных гормонов в регуляции ферментативной активности. Особенности действия отдельных гормонов

При анализе молекулярных процессов, регулируемых в живой клетке гормонами, обычно рассматривают действие одного гормона. Современные данные по гормональной регуляции биосинтеза ферментов и других белков основаны на фактах зависимости биосинтеза того или иного белка от гормона-индуктора. Однако обменные процессы в большинстве клеток отвечают на регуляторные воздействия нескольких, а зачастую и многих гормонов. Так, например, биосинтез белка в клетках печени находится под контролем гормонов щитовидной железы, кортикостероидов, СТГ, адреналина, инсулина, глюкагона и др.

Аналогичные отношения имеют место и для других тканей. Кроме того, как уже упоминалось, различна «специализация» гормонов: одни гормоны действуют избирательно на определенный процесс, другие обладают более широким и разнообразным действием.

Примером такой «специализации» применительно к ферментам является факт различного гормонального контроля серин-дегидратазы в печени: активность одной изоформы регулируется глюкагоном, а другой -- глюкокортикоидами.

В связи с этим очень существенно исследовать характер взаимодействия различных гормонов во влиянии их на те или иные ферментные системы, синергизм и антагонизм гормонов, особенности их действия в живом организме.

При индукции определенного фермента тем или иным гормоном этот гормон вводят обычно в количествах, превышающих «базальный» уровень секреции гормона. Такие же отношения, вероятно, имеют место и при эндогенном увеличении количества того или иного гормона. Изменение активности какой-либо ферментной системы при введении различных гормонов в одной и той же ткани может быть различным.

В качестве примера на рис. приведены изменения активности треонин-дегидратазы в печени крыс. Как видно из этих данных, кортизол и тироксин повышали, тестостерон снижал, а инсулин не оказывал влияния на базальную активность треонин-дегидратазы. Однако ответ фермента может быть другим, если одновременно вводить два или больше гормонов в индуцирующих дозах.

Наиболее исследованы в этом отношении кортикостероиды и инсулин. Большое число работ посвящено сравнению индукции тирозин-аминотрансферазы кортикостероидами и инсулином в культуре клеток гепатомы при добавлении гормонов к среде инкубации.

Инсулин, а еще в большей степени кортизол повышали активность тирозин-аминотрансферазы с максимумом через 8-12 ч после инкубации. Аналогичные данные на такой же культуре получены при добавлении дексаметазона в концентрации 10^-7 M или инсулина по 4 мкг/мл. Если инсулин добавляли к клеткам гепатомы 16 ч спустя после начала их инкубации с дексаметазоном, то наступало дальнейшее увеличение активности фермента, очень сходное с явлением супериндукции после введения актиномицина D. Физико-химические свойства тирозин-аминотрансферазы, индуцированной дексаметазоном или инсулином, были одинаковыми, что выявлялось при помощи иммунохимического исследования, путем электрофореза в полиакриламидгюм геле и по кривым тепловой денатурации. По всей вероятности, оба гормона повышали скорость синтеза одного и того же ферментного белка. После введения животным in vivo кортизол и инсулин также повышали активность тирозии-аминотрансферазы в печени. Однако при детальном исследовании индукции этими двумя гормонами выявлены интересные различия. Эти различия обнаруживались во влиянии на ацетилироваиие, фосфорилирование и метилирование гистонов -- процессов, связанных с биосинтезом белков на разных стадиях клеточного цикла. При введении инсулина начало ацетилирования и фосфорилирования гистонов предшествовало повышению синтеза РНК и тирозин-аминотрансферазы, а повышение метилирования сопровождало наиболее интенсивный синтез РНК- Кортизол вызывал лишь слабое повышение ацетилирования и позднее метилирования гистонов, максимум индукции фермента был через 4 ч. Таким образом, хотя оба гормона -- и кортизол, и инсулин -- индуцируют тирозин-аминотрансферазу в печени, но их механизмы индукции, как это проявляется во влиянии на модификацию гистонов, могут быть различными.

При введении крысам в течение нескольких дней кортизола вместе с инсулином установлено, что инсулин значительно подавлял кортикостероидную индукцию тирозин-аминотрансферазы. Кортизол вводили внутрибрюшинно по 5 мг/100 г массы в течение 3 дней, затем еще 3 дня за 3 ч до кортизола вводили по 2--3 единицы инсулина и забивали животных через 5 ч после последнего введения кортизола.

Таблица 11 - Влияние инсулина на кортикостероидную индукцию тирозин-аминотрансферазы в печени крыс

Подавление инсулином кортикостероидной индукции in vivo было показано для аланип- и аспартат-амино-трансфераз, серин-дегидратазы и треонин-дегидратазы. Интересно, что у адреналэктомированных животных супрессия инсулином была выражена заметно слабее, чем у интактных. Возможно, это отчасти зависело от значительно большей по величине кортизоловой индукции фермента у этих животных. Супрессорное действие инсулина хорошо согласуется с фактом повышения активности серин-дегидратазы в печени крыс при аллоксановом диабете.

Таким образом, индукция одного и того же фермента может быть вызвана более чем одним гормоном, как это показано при индукции тирозин-аминотрансферазы кортикостероидами и инсулином в клетках гепатомы. Введение инсулина вместе с кортизолом подавляет in vivo кортикостероидную индукцию тирозин-аминотрансферазы и других ферментов. Вероятно, причины такого различия следует искать в сложных гормональных взаимодействиях, существующих в целостном организме. Эти факты еще раз подчеркивают необходимость всестороннего исследования гормональной регуляции с использованием как простых моделей, так и опытов in vivo и тщательного сопоставления данных, полученных на различных объектах.

Большое число данных получено также при исследовании индукции ферментов кортикостероидами и глюкагоном. Оба эти гормона индуцируют многие ферменты в печени животных. Goswami и Boulekbache провели сравнительное исследование индукции серин-дегидратазы и тирозин-аминотрансферазы глюкагоном и кортизолом у крыс. Чтобы снять эффект эндогенных кортикостероидов, животных подвергали двусторонней адреналэктомии и через 6 дней вводили внутрибрюшинно по 6 мг кортизола, 300 мкг глюкагона или сначала кортизол, а через 30 мин -- глюкагон. Животных забивали через 47₂ часа после введения глюкагона. Некоторым животным вместе с кортизолом или вместе с глюкагоном вводили по 100 мкг актиномицина D.

Таблица 12 - Влияние кортизола и глюкагона на активность серин-дегидратазы и тирозин-аминотрансферазы в печени крыс

Хотя механизмы индукции ферментов глюкагоном и кортизолом различны, можно думать, что в обоих случаях вовлекается какое-то регуляторное звено, общее для действия обоих гормонов. С целью выяснения этой возможности McNamara и Webb исследовали индукцию тирозин-аминотрансферазы в печени адреналэктомированных крыс. Оказалось, что предварительное введение глюкагона примерно вдвое снижало ответ тирозин-аминотрансферазы па кортизол. Наряду с этим менялась чувствительность к 5-азацитидину, который без глюкагона не тормозил кортизоловой индукции фермента. Авторы полагают, что в индукции тирозин-аминотрансферазы обоими гормонами есть какое-то общее место действия; возможно, это фонд уже предсуществующей информационной РНК для данного фермента. Наряду с этим и кортизоловая, и глюкагоновая индукция фермента имеют свои характерные особенности, наиболее заметные по фазе денндукции.

Примером взаимодействия гормонов в регуляции активности ферментов является влияние тироксина на кортикостероидиую индукцию тирозин-аминотрансферазы. Введение тироксина крысам не только снижает базальную активность этого фермента, но резко подавляет увеличение ферментативной активности в ответ на кортикостероиды. При гипотиреозе активность тирозин-аминотрансферазы превышает норму и полностью сохранена или даже повышена кортикоидная индукция. Антагонистическое действие гормонов щитовидной железы по отношению к кортикостероидам показано и для ферментной системы, окисляющей пролин в печени крыс.

Имеются данные об активирующем влиянии гормонов щитовидной железы и об их синергическом действии по отношению к кортикостероидам. Так, например, активность ферментной системы, катализирующей синтез аланина из пировиноградной кислоты и аммиака в печени крыс, значительно повышается после введения животным тироксина или после добавления гормона к гомогенатам печени in vitro. Активность фосфорилазы в сердечной мышце крыс повышалась после введения животным кортикостерона или тироксина; адреиалэктомия значительно снижала изменение активности фермента при введении тироксина. Тиреоидэктомия в свою очередь значительно снижала повышение активности фосфорилазы после введения кортикостерона. На основании этих данных авторы пришли к выводу, что оба гормона регулируют активность данного фермента и что для проявления действия каждого гормона необходимо присутствие другого. Синергизм тиреоидных гормонов и кортикостероидов показан нами в отношении распада треонина. Ответ треонин-дегидратазы на тироксин был выше у интактных, а на кортизол - у адреналэктомированных животных. Совместное 'введение обоих гормонов давало одинаковое увеличение активности фермента у интактных и адреналэктомированных крыс - вероятно, в этом случае повышение активности достигало максимально возможного.

Большой интерес представляет взаимодействие глюко-кортикоидов и катехоламинов в регуляции ферментативной активности. Стимуляция адреналином синтеза глюкозы из лактата в перфузируемой печени была значительно снижена, если перфузировали печень от адренал-эктомированных крыс; добавление глюкокортикоидов в среду перфузии восстанавливало активацию глюконеогенеза и гликогенолиза в печени, а также липолиза в жировой печени в ответ на адреналин. Необходимо наличие глюкокортикоидов и для адреналиновой индукции тирозин-аминотрансферазы: увеличения активности этого фермента в печени после введения адреналина не было, если у крыс удаляли надпочечники. Возможно, важными аспектами пермиссивного действия глюкокортикоидов является влияние этих гормонов на связывание катехоламинов с белками, так называемую протеидизацию гормонов, а также воздействие кортикостероидов на поддержание нормальной чувствительности ряда ферментных систем к цАМФ. Адреналин, вводимый вместе с глюкагоном, значительно задерживал увеличение активности серин-дегидратазы в печени крыс при введении глюкагона. Авторы считают, что эффект адреналина в данном случае опосредован через задержку образования цАМФ в печени. Возможно, этот же эффект лежит в основе блокирующего действия адреналина и других катехоламинов на глюкозиую индукцию глюкокиназы в печени крыс. Значительный интерес представляет взаимодействие инсулина и глюкагона. Добавление инсулина в среду перфузии изолированной печени крыс значительно подавляло стимулирующее действие глюкагона на гликогенолиз и на увеличение содержания цАМФ в клетках печени. Совместное введение крысам инсулина и тироксина повышало активность триптофан-оксигеназы в печени на 110%.

Значительное число, работ посвящено исследованию роли половых гормонов в регуляции некоторых ферментов, в частности гистидазы. Гистидаза катализирует следующую реакцию

Этот фермент находится под сложным гормональным контролем. Эстрогены, повышающие активность гистидазы в печени крыс в пре- и постпубертальном периоде, неэффективны у гипофизэктомированных крыс, когда активность фермента уже повышена. Глюкокортикоиды, тестостерон, AKTT и СТГ, подавляющие активность гистидазы у интактных крыс, были неэффективны после гипофизэктомии. Андрогены не влияли на активность гистидазы в печени крыс-самцов в возрасте 23--60 дней, но значительно снижали ферментативную активность у взрослых животных. Установлены половые различия в ферментативной активности гистидазы: у самок активность фермента в печени значительно выше, чем у самцов. Однако эти различия проявляются лишь при содержании животных на рационах с физиологическим количеством белка и заметно сглаживаются при питании рационами с 0 или 91% белка. В постнатальной регуляции активности гистидазы печени у крыс участвуют также глюкагон и кортикостероиды, причем глюкагоновая индукция отсутствует в неонатальный период и появляется позже 1-го месяца жизни, а корти-костероидная хорошо выражена от рождения до 60 дней жизни и затем несколько снижается.

Взаимодействие половых и других гормонов исследовали и по влиянию их на другие ферменты.Введение тестостерона крысам не вызывало резкого изменения активности аланин- и аспартат-аминотрансфераз в печени крыс; однако у кастрированных животных индукция этих ферментов кортизолом была выражена сильнее, чем у интактных. Такой же эффект кастрации обнаружен и в отношении аспартат-аминотрансферазы почек. Интересно, что инсулин, тормозящий кортикостероидную индукцию многих ферментов в печени, усиливал кортизоловую индукцию аспартат-аминотрансферазы в почках неполовозрелых и взрослых крыс-самок. Андрогены, по данным Л.И.Поликарповой, необходимы для индукции трансами-назкортикостероидами и инсулином в печени крыс.

Braidman и Rose исследовали влияние половых гормонов на глюкокортикоидную индукцию триптофан-оксигеназы, тирозин-аминотрансферазы и аланин-амино-трансферазы в печени крыс.

Таблица 13 - Влияние половых гормонов, кастрации и адреналэктомии на активность ферментов в печени самок и самцов крыс

Эстрадиол значительно повышал активность всех трех ферментов у самок. Адреналэктомия снижала активность триптофаноксигеназы и аланин-амшютранеферазы, а введение адрепалэктоми-рованным самкам эстрадиола повышало активность обеих аминотрансфераз. У интактных самцов исходная активность триптофаноксигеназы была ниже, чем у самок, и не менялась после кастрации. Введение эстрадиола повышало активность фермента, особенно у кастрированных самцов. Полученные данные свидетельствуют о том, что для полного выявления действия эстрадиола на активность триптофаноксигеназы и тирозин-аминотрансферазы у самок необходимо присутствие надпочечников. Роль надпочечников в эстрогеновой индукции ферментов у самок неясна, так как количество кортикостерона в крови самок не повышается после введения эстрадиола. Возможно, эстрогены индуцируют ферменты через посредство других гормонов, например тиреоидных, играя при этом пермиссивную роль. Тестостерон значительно снижает активность триптофаноксигеиазы у интактных самок; может быть, это результат снижения содержания кортикостена в крови этих животных. Значительно большее увеличение активности триптофаноксигеиазы в печени кастрированных самцов в ответ на введение эстрогена указывает на значение эндогенных андрогенов для подавления ответа фермента на эстрогены.

Мы пытались выяснить взаимодействие андрогенов с кортикостероидами в индукции треонин-дегидратазы. Интактным крысам-самцам в течение 3 дней вводили по 5 мг тестостерона, по 5 мг кортизола или оба гормона вместе. Тестостерон тормозил исходную активность фермента и значительно снижал величину индукции кортизолом.

Интересные данные получены относительно влияния простагландинов. Введение простагландииа Ei крысам мало влияло па активность тирозин-аминотрансферазы в печени, подавляло индукцию этого фермента глюкагоном и инсулином, не изменяя индукции кортизолом.

При рассмотрении вопроса о взаимодействии гормонов в отношении их влияния на активность ферментов необходимо учитывать особенности биологического действия отдельных гормонов.

Тироксин. Тироксин является гормоном с широким спектром биологического действия. С физиологической точки зрения наиболее известно влияние гормонов щитовидной железы на рост и развитие органов и тканей и на регуляцию процессов тканевого дыхания. Наиболее общим проявлением стимуляции основного обмена является калоригенное действие тиреоидных гормонов. Окисление различных субстратов в клетке сопровождается процессами накопления энергии в форме АТФ. Основная часть фосфорных макроэргических соединений накапливается в ходе реакций, в которых участвуют пиридиннуклеотидные и флавиновые ферменты, а также цитохромы. Сопряжение дыхательных процессов с фосфорилированием происходит в митохондриях. Величина отношения Р/О позволяет судить о соотношении между числом молекул фосфора, включившихся в АТФ, и числом потребленных молекул кислорода. Величина Р/О может быть равной 3,2 или 1 в зависимости от звена, на котором субстрат включается в цепь транспорта электронов. Снижение коэффициента Р/О ниже 1 указывает на разобщение процессов окисления и фосфорили-рования. В 1951 г. Martius и Hess впервые показали, что в митохондриях печени животных, получавших массивные дозы тироксина, значительно снижается коэффициент Р/О и возрастает количество потребляемого кислорода. Разобщение процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях печени крыс обнаружили в опытах in vitro при добавлении тироксина в концентрациях от 5Х10^-5 до IXlO^-4 М. Введение тиреоидных гормонов в дозах, вызывающих гипертиреоз, но не тиреотоксикоз, не всегда приводило к разобщению дыхания и фосфорилирования, но повышало интенсивность процессов фосфорилирования. Таким образом, действие тироксина и трийодтиронина зависит от дозы: малые дозы повышают дыхание и фосфорилирование, большие повышают дыхание и снижают фосфорилирование, вызывая разобщение этих процессов в митохондриях.

При морфологическом исследовании обычно обнаруживают характерное набухание митохондрий, причем наиболее резко изменения структуры митохондрий выражены в ткани сердечной мышцы. Размеры митохондрий печени от 0,5 мкм в норме увеличивались при гипертиреозе до 0,8 мкм. Набухание митохондрий наблюдали и в опытах in vitro при инкубации их с тироксином в концентрации 1-5х10^-5 M. Добавление АТФ in vitro препятствовало эффекту тироксина, а ионы магния значительно снижали степень набухания.

При попытке выяснения особенностей действия гормонов щитовидной железы, интересные данные получены на тиреоидэктомированных крысах. Животных брали в опыт при максимальной недостаточности гормонов, о чем судили по характерным изменениям веса и основного обмена. Из печени выделяли митохондрии, затем фракционировали их и в отдельных структурах митохондрий определяли активность ряда ферментов

Тиреоидэктомия приводила к повышению активности ферментов, локализованных во внешних мембранах; активность ряда ферментов во внутренних мембранах, а также глутаматдегидрогеназы матрикса снижалась.

Хотя дыхание митохондрий, выделенных из печени тиреоидэктомированных крыс, было снижено, содержание в них компонентов дыхательной цепи было таким же, как в контроле. Добавление тироксина in vitro к митохондриям печени тиреоидэктомированных крыс оказывало нормализующее воздействие на активность ферментов митохондрий. Авторы считают, что эффект тироксина локализован главным образом на уровне цитохромов, прямо участвующих в реакциях биосинтеза АТФ, а также цитохрома Ci и негематиновых железосодержащих белков.

Альдостерон. Как уже указывалось, специфической функцией альдостерон а является регуляция транспорта электролитов через мембраны почек, слюнных и потовых желез и слизистой оболочки кишечника. Однако при недостаточном или избыточном содержании в организме гормонов с широким спектром биологического действия действие альдостерона может быть несколько иным и результирующий эффект может отличаться от обычного при сбалансированном гормональном статусе.

Инсулин. Инсулин, как и глюкокортикоиды, обладает широким спектром биологического действия. На этот гормон отвечают все ткани организма, за исключением, возможно, мозга и эритроцитов. Характерным эффектом инсулина является усиление утилизации и транспорта глюкозы, аминокислот и ионов в тканях, а также стимуляция разнообразных анаболических' процессов. В соответствии с этим показана индукция инсулином ферментов утилизации глюкозы, из которых наиболее резко и быстро увеличивается активность гликогенсинтетазы. Активность этого фермента в печени собак возрастает в 29 раз уже в первые 7-13 мин от начала инфузии инсулина. Такое быстрое увеличение ферментативной активности скорее является результатом активации фермента, чем индукцией, хотя для инсулина показана возможность

Влияния и на биосинтез ферментных белков. При перфузии изолированной печени крыс добавление инсулина в среду перфузии приводило к значительному повышению активности тирозин-аминотрансферазы с максимумом через 2-5 ч от начала перфузии. В отличие от действия кортизола, продолжающегося до тех пор, пока стероид присутствует в среде перфузии, изменение активности тирозин-аминотрансферазы при введении инсулина имеет характер пика с последующим снижением, несмотря на продолжающееся поступление инсулина к клеткам печени. Очевидно, in vivo имеется два механизма повышения активности тирозин-аминотрансферазы - стероидный и панкреатический.

В отношении основных механизмов действия инсулина очень важен вопрос о том, проникает ли инсулин в клетки или же действие его является результатом взаимодействия гормона с клеточными мембранами. В настоящее время на этот вопрос нельзя ответить категорически. Возможно, что многие стороны физиологического действия инсулина являются вторичными по отношению к его действию на мембраны клеток, по всей вероятности, содержащие рецепторы для инсулина. В качестве «передаточной системы» можно думать об аденилциклазе, хотя, по мнению большинства авторов, цАМФ скорее всего не участвует прямо в действии инсулина. Возможно, посредником действия инсулина является какое-то производное цАМФ, действие которого, по крайней мере в случае тирозин-аминотрансферазы, сходно с эффектом цАМФ.

Инсулин может вызывать изменение активности фермента следующими путями.

1. Путем конформационных изменений в определенных неферментных клеточных структурах с последующим изменением проницаемости и активацией «передаточной системы». Последняя в конце концов активирует ферментные системы, связанные с комплексом рецептор-трансдуктор.

2. Путем индукции изменения конформации самих ферментов с последующим изменением активности этих ферментов. Для такого эффекта необходимо проникновение инсулина в клетки.

3. Путем прямого или косвенного влияния па функционирование генома с последующим изменением скорости транскрипции или трансляции. Возможность действия инсулина на скорость биосинтеза ферментов действительно существует.

В целом можно полагать, что многие стороны действия инсулина на промежуточный обмен являются вторичными по отношению к действию инсулина на клеточные мембраны. Однако не исключена возможность того, что инсулин, являющийся иизкомолекулярным белком и существующий в организме в нескольких формах, все же может проходить в клетки некоторых тканей.

СТГ, как и инсулин, является гормоном с разнообразным биологическим действием и, кроме характерного ускорения роста, оказывает влияние на обмен белков, углеводов, липидов и солей. Гипофизэктомия приводит к повышению индуктивного ответа тирозин-аминотрансферазы и триптофаноксигеиазы в печени крыс на кортизол; введение СТГ, наоборот, тормозит кортизоловую индукцию обоих ферментов. Животным через 2 дня после операции вводили на 100 г массы кортизол по 2,5 мг, глюкагон по 150 мкг, инсулин по 1 единице по отдельности или вместе с 200 мкг СТГ и через 3 ч определяли активность фермента в печени.

Kenney полагает, что «базальный» уровень активности тирозин-аминотрансферазы на самом деле является частично индуцированным, поддерживаемым при посредстве цАМФ и механизмов, контролирующих синтез этого нуклеотида. Поэтому можно представить, что снижение количества тирозин-аминотрансферазы после введения СТГ является отражением сниженного поступления гормонов, необходимых для поддержания концентрации цАМФ, достаточной для создания «базальной» скорости синтеза трансаминазы.

Участвует СТГ, по всей вероятности, и в индукции гистидазы печени при введении эстрогенов.

В отношении СТГ существует мнение, что действие этого гормона на скелетные мышцы осуществляется через посредник, который называют «фактором сульфирования». Этот фактор, стимулирующий включение сульфатов в хондроинтинсульфат, а также тимидина и уридина в ДНК, пролина в оксипролин коллагена, по всей вероятности, является пептидом с относительной молекулярной массой около 8000. Хотя механизм действия и физиологическая роль фактора еще неясны, значение его для роста и анаболического ответа на введение СТГ несомненно. Daughaday предложил называть этот фактор «соматомедином».

Паратгормон и тиреокальцитонин. Эти гормоны, секре-тируемые паращитовидными и щитовидной железами, в физиологическом отношении являются антагонистами. Паратгормон повышает, а тирокальцитонии снижает содержание кальция в костной и других тканях. Для паратгормона установлено прямое действие на активность адепилциклазы в почечной ткани. Оба гормона повышают активность ферментов цикла трикарбоновых кислот и систем транспорта электронов в митохондриях почек и других органах.

Чтобы правильно судить о влиянии того или иного гормона на активность определенных ферментных систем, необходимо учитывать взаимодействие и взаимовлияние различных гормонов в целостном организме. Различные гормоны могут активировать одни и те же ферменты, как это имеет место, например, для индукции гликогенсинтетазы глюкокортикоидами и инсулином; на биосинтез белков в клетках печени влияют почти все гормоны. В связи с этим очень важно знать характер взаимодействия различных гормонов и особенности действия отдельных гормонов как в целостном организме, так и в более простых системах, используемых для исследования механизма действия гормонов.

При исследовании па культуре клеток и в опытах с перфузией изолированной печени показано, что кортикостероиды и инсулин индуцируют тирозип-аминотрансферазу; такое же действие оказывали оба гормона и при введении животным. Однако совместное введение обоих гормонов in vivo приводило к заметному подавлению кортизоловой индукции тирозин-аминотрансферазы в печени. Антагонизм кортикостероидов и инсулина in vivo обнаружили также и в отношении ряда других ферментов: аланин- и аспартат-аминотрансфераз, серии- и трео-нин-дегидратаз. Отсутствие антагонизма кортикостероидов и инсулина в опытах на культурах клеток еще раз подчеркивает необходимость сопоставления результатов, полученных в модельных исследованиях, с данными, полученными на целостном организме.

Глюкокортикоиды оказывают отчетливый пермиссивный эффект, позволяющий полностью проявиться действию другого гормона. Это, в частности, хорошо показано в отношении псрмиссивного действия кортизола на индукцию серип-дегидратазы в печени.

Примером антагонистического влияния гормонов является подавление тироксином кортикостероидной индукции тирозин-аминотрансферазы; однако в отношении других ферментов тироксин может быть, наоборот, сииср-гистом кортикостероидов. Сложные взаимоотношения в индукции ферментов существуют между глюкагоном и инсулином, эстрогенами и СТГ, адреналином и глюкагоном, андрогенами и кортикостероидами и т. д., необходимо также учитывать особенности действия отдельных гормонов, широту или специфичность их биологического эффекта.

Очень трудно судить о прямом действии гормонов, так как нет данных о взаимодействии гормонов с субклеточными структурами. Как известно, инсулин оказывает действие при непосредственном добавлении его к изолированным тканям, но он неэффективен при добавлении к гомогенатам. Возможно, что для каждого гормона есть свой основной механизм действия. К сожалению, мы еще не знаем всех тех многочисленных стадий, которые протекают от первичного взаимодействия гормона с рецептором до первого проявления действия гормона на различные ткани, например, действия кортикостероидов на синтез ферментов в печени и в других тканях. При рассмотрении влияния отдельных гормонов на печень следует учитывать, что в печени в 3 раза больше ДНК и в 6 раз больше РНК, чем в скелетной мышце. Эти особенности обмена веществ в отдельных тканях в совокупности со специфичностью действия того или иного гормона могут в значительной степени определять результирующий эффект действия нескольких гормонов.

Очень важен вопрос о физиологическом смысле действия отдельных гормонов. Кортикостероиды имеют очень большое число точек приложения действия, и многие ткани являются для них тканями-мишенями. Андрогены и эстрогены воздействуют также почти на все типы клеток. Альдостерон, специфической функцией которого является регуляция активного транспорта натрия и калия через, эпителиальные структуры, в высоких концентрациях оказывает глюкокортикоидподобное действие, а некоторые глюкокортикоидные гормоны обладают минералокортикоидным влиянием. Такое «перекрывание» действия различных гормонов играет, по-видимому, особенно важную роль при резком изменении гормонального статуса, когда количество одних гормонов в организме возрастает, а других - снижается.

Для наиболее полного выяснения механизмов действия гормонов целесообразно сочетание двух путей исследования: «физиологического», позволяющего установить закономерности гормональной регуляции в целостном организме, и «молекулярного», дающего возможность выявления отдельных конкретных сторон действия и взаимодействия гормонов в модельных опытах. Интеграция этих двух подходов позволит получить картину, наиболее близкую к действительной.

4 Участие циклического аденозинмонофосфата в гормональной регуляции активности ферментов

В последние годы большое внимание привлекают работы, показавшие, что во многих случаях действие гормонов связано с образованием циклического аденозин-монофосфата и последующим влиянием этого соединения на активность ферментов.

Открыли цАМФ и подробно исследовали его Sutherland и Rail. В основе химической структуры цАМФ лежит аденин, связанный с рибозой и фосфорной кислотой. Фосфорная кислота образует циклическую структуру благодаря этерификации в положениях 3' и 5', что и определяет особенность структуры нуклеотидов такого типа. В последнее время появились работы о физиологическом значении другого циклического нуклеотида - гуанозин-монофосфата, у которого вместо адепина другое пуриновое основание - гуанин.

Обнаружен цАМФ практически во всех тканях многоклеточных организмов, у некоторых одноклеточных и во многих биологических жидкостях млекопитающих.

В тканях животных концентрация цАМФ составляет от 10^-7 до 10^-6 М, что значительно ниже концентрации других нуклеотидов, например АТФ - около IX 10^-3, АДФ - около 10-⁴ или 5'-АМФ около 10-⁴M. В условиях «покоя», т. е. без экзогенного введения гормонов или стимуляции их секреции, концентрация цАМФ в тканях и жидкостях организма относительно постоянна.

Циклический цАМФ образуется из АТФ при участии аденилциклазы, для проявления активности которой необходимы ионы магния. Кроме того, отмечено значительное активирующее действие ионов фтора, биологическое значение которых еще неясно. Другой фермент - фосфо-диэстераза катализирует расщепление цАМФ до 5'-АМФ. Таким образом, количество цАМФ в организме определяется активностью двух ферментов -- аденилциклазы и фосфодиэстеразы:

Аденилциклаза является очень лабильным ферментом, локализованным в клеточных мембранах, обнаружена почти во всех тканях; фосфодиэстераза также выявляется во всех тканях, причем наибольшая активность обнаружена в мозжечке.

Циклический ГМФ образуется из ГТФ под действием гуанилциклазы, для активности которой необходимы ионы марганца. Фермент характеризуется большей растворимостью, чем аденилциклаза, а также относительной инертностью к гормонам и ионам фтора.

Предположение об участии цАМФ в реализации действия гормонов на те или иные процессы возникло в первую очередь на основании того, что количество этого нуклеотида увеличивалось или уменьшалось в тканях после введения гормонов, сопровождавшегося характерным биологическим ответом на гормон.

Увеличение или уменьшение количества цАМФ в ткани после введения того или иного гормона совпадает с действием гормона. Это позволяет предположить, что цАМФ является посредником в действии гормонов. Корреляцию между изменением содержания цАМФ в тканях и физиологическим ответом на тот или иной гормон удалось показать не только после введения гормонов животным, но и в более простых системах. Если срезы бычьего гипофиза инкубировать с простагландинами E₂, А или Bi in vitro, то отмечается значительное увеличение выхода СТГ в среду инкубации с максимумом через 45 мин, а содержание цАМФ в ткани резко возрастает уже через 10 мин контакта ткани гипофиза с гормонами. Еще быстрее наступал максимум увеличения количества цАМФ в костной ткани черепа эмбрионов крыс при инкубации ткани с паратгормоном in vitro. Увеличение содержания цАМФ в ткани почки отмечали после инкубации in vitro с адреналином, норадреналином, паратгормоном или простагландином E_j, а также после добавления глюкагона к среде, которой перфузировали изолированную печень крыс.

Рис.11. Влияние глюкагона in vitro на содержание цАМФ в ткани печени и в среде инкубации.

Siddle и др. изучали влияние глюкагона на содержание цАМФ в ткани печени крыс 4-5-недельного возраста после добавления гормона в среду инкубации кусочков печени in vitro. Количество цАМФ повышалось очень быстро -- уже через 10 мин после введения глюкагона в среду.

В опытах in vivo повышение содержания цАМФ также происходило очень быстро, причем это повышение наблюдали как у интактных, так и у адреналэктомированных крыс.

Рис.12. Влияние введения глюкагона интактным и адреналэкто-мироваиным крысам на содержание в печени цАМФ.

Интересно, что у адреналэктомированных животных увеличение количества нуклеотида было выражено сильнее, чем у интактных животных. Авторы объясняют это снижением активности систем, инактивирующих цАМФ, в результате адреналэктомии.

В последнее время появляются данные, свидетельствующие о возможности действия и стероидных гормонов через изменение количества цАМФ. Введение 5 мкг эстрадиола крысам повышало через 4 ч содержание цАМФ в матке, что сопровождалось резким увеличением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеиазы и 6-фосфоглюкопатдегидрогеназы. В пользу такой возможности говорит также влияние половых гормонов на активность цАМФ-зависимых протеинкиназ в простате и матке крыс.

Поскольку, как уже упоминалось, количество цАМФ в ткани определяется активностью ферментов, катализирующих синтез и распад этого нуклеотида, то влияние гормонов может осуществляться посредством влияния на активность обоих ферментов. Наиболее изучено действие гормонов на аденилциклазу.

Аденилциклаза является липопротеидным ферментом, тесно связанным с мембранами клеток и клеточных частиц. По современным представлениям, она состоит из 2 субъединиц: каталитической и регуляторной. Каталитическая субъединица расположена на внутренней, а регуляторная - на наружной поверхности мембраны. Ввиду тесной связи аденилциклазы с мембранами и ее лабильности пока не удалось получить высокоочищеиных препаратов фермента из клеток животных. Активность аденилциклазы значительно меняется в ответ на введение гормонов.

Таблица 14 - Влияние гормонов и NaF на активность аденилциклазы в культуре эмбриональной печени крыс

Глюкагон и изопротеренол и особенно NaF повышают, а инсулин снижает активность аденилциклазы. Показано увеличение активности фермента в гомогенатах сердца морских свинок после добавления простагландинов, в семенных пузырьках крыс после добавления тестостерона in vitro или введения гормона in vivo, в ткани молочной железы кроликов, крыс и мышей после инкубации с адреналином или кортизолом, в гомогенатах почек крыс в ответ на добавление пара-гормона или тирокаль-цитонина.

Действие гормона обнаруживалось уже через 1 мин после его добавления -- такой быстрый эффект является скорее всего результатом прямого взаимодействия гормона с адеиилциклазой в качестве алло-стерического эффектора.

Недавно выявили увеличение активности гуанилциклазы в гомогенате печени крыс после добавления секретина. Интересно, что глюкагон, структурно очень близкий к секретину, не активировал гуанилциклазу и, наоборот, секретин, не активировал аденилциклазу. Возможно, что действие секретина, в отличие от действия глюкагона, опосредовано не через цАМФ, а через цГМФ.

Влияние гормонов на увеличение содержания цАМФ в тканях может осуществляться посредством торможения фосфодиэстеразы, катализирующей разрушение цАМФ. Такая возможность признается рядом авторов в отношении эффекта инсулина, вызывающего снижение количества цАМФ в печени и мышцах вследствие повышения активности фосфодиэстеразы. Однако при диабете, когда содержание цАМФ в сердце крыс повышалось вдвое, не отмечали изменений активности фосфодиэстеразы.

При одновременном определении активности обоих ферментов в гомогенатах яичника кроликов нашли, что активность фосфодиэстеразы не изменялась, а активность аденилциклазы значительно возрастала уже через 2 мин инкубации в присутствии ЛГ.

Таким образом, действие различных гормонов на изменение количества цАМФ может быть опосредовано как через влияние на системы синтеза, так и распада этого нуклеотида. Наибольший интерес представляет вопрос о роли цАМФ в гормональной индукции ферментов. Участие цАМФ в индукции ферментов впервые предположили Peraino и Pitot. Они показали, что влияние глюкагона на активность серин-дегидратазы в печени крыс может быть усилено вдвое адреналином, вторым индуктором аденилциклазы в печени.

Введение глюкагона, адреналина и цАМФ плодам крыс в 2 последних дня беременности вызывало появление в печени активности тирозин-амино-трансферазы, которую у интактных животных можно обнаружить лишь после рождения. Очень подробно индукцию цАМФ тиро-зин-аминотрансферазы и других ферментов исследовали Wicks и др.. Адреналэк-томированным крысам вводили внутрибрюшинно по 5 мг дибутирил-цАМФ либо однократно, либо повторно и определяли активность тирозин-амино-трансферазы в печени. Дибутирил-цАМФ является производным цАМФ, имеющим более высокую активность, чем свободный нуклеотид. Причина

этого еще неясна: возможно, что дибутирил-цАМФ более легко проникает в клетки и более устойчив к фосфодиэстеразе.

Однократное, а тем более повторное введение цАМФ оказывает значительное индуцирующее влияние на тирозин-аминотрансферазу, эффект цАМФ по величине превосходит эффект кортизола. Сравнивали влияние цАМФ на активность нескольких ферментов. Интактным взрослым крысам, получавшим в течение 5 дней безбелковый рацион, вводили внутрибрюшинно на 100 г массы животного кортизол по 2,5 мг, дибутирил-цАМФ -- по 6 мг, 5'-АМФ -- по 6 мг, глюкагон -- по 150 мкг или теофиллин -- по 2 мг. Животных забивали через 4 ч и в печени определяли активность 4 ферментов.

Таблица 15 - Индукция 4 ферментов в печени крыс после введения дибутирил-цАМФ и гормонов

Индукция тирозинами-нотрансферазы глюкагоном опосредована, но всей вероятности, через цАМФ. Об этом свидетельствует примерно равная величина индукции цАМФ и глюкагоном вместе с теофиллином, предотвращающим распад образовавшегося в результате действия глюкагона цАМФ. Кортизол скорее всего индуцирует тирозин-аминотрансферазу другим путем, так как сочетание его либо с глюкагоном, либо с цАМФ дает четкий аддитивный эффект. Интересно также, что аналогичные отношения существуют и для пируваткиназы. Серин-дегидратаза также индуцируется цАМФ, в то время как триптофаноксигеназа отвечает на цАМФ гораздо слабее, чем остальные ферменты. В клетках гепатомы крыс in vitro также обнаружили возможность индукции тирозии-аминотрансферазы при помощи цАМФ независимо от кортикостероидов.

Введение цАМФ кастрированным крысам-самцам заметно повышало активность гексокиназы и фосфофруктокиназы в семенных пузырьках и простате уже через 4 ч, но максимум активности наступал через 16--24 ч. Дибутирил-цАМФ индуцировал in vivo активность и других ферментов в печени крыс: фенилалапин-амииотрансферазы и серин-аминотрансферазы. Индуцирующее действие цАМФ было показано в культуре ткани эмбриональной печени крыс в отношении тирозин-аминотрансферазы, причем кортизол и цАМФ в очень низких концентрациях заметно потенцировали эффект друг друга. Аналогичные данные получены при исследовании индукции этого же фермента в культуре клеток гепатомы. В связи с этим приобретают новый интерес результаты исследований Gray и Chytil и др. об увеличении активности триптофаноксигеназы при добавлении цАМФ к препаратам фермента или к супернатанту гомогената печени. Однако в этом случае, по мнению Chytil, цАМФ не является прямым активатором триптофаноксигеназы, а претерпевает следующие изменения:

Насколько этот механизм активации имеет место in vivo, еще неясно, но возможность такого контроля представляет несомненный интерес.

Действие гормонов может вызывать не только увеличение, но и снижение содержания цАМФ в тканях. Наиболее ярким представителем таких гормонов является инсулин, который снижает количество цАМФ в жировой ткани, инкубированной с адреналином. Действие инсулина проявляется уже через 5 мин и при очень низкой концентрации инсулина--10 микроединиц на 1 мл. Взаимоотношения инсулина с другими гормонами, их влияние на образование цАМФ особенно наглядно выявляются при исследовании регуляции липолиза. Известно, что ряд пептидных гормонов и катехоламииы активируют липолиз а инсулин и простагландины тормозят его. Этот антагонизм проявляется и в противоположном действии на содержание цАМФ в жировой ткани.

Активация и торможение липолиза могут быть представлены следующей схемой.

Рис.13

Вероятно, биологические механизмы, действующие через посредство снижения количества цАМФ в тканях, могут иметь столь же важное физиологическое значение, как и механизмы, действующие путем увеличения содержания цАМФ в тканях.

Приведенные данные свидетельствуют об участии цАМФ в гормональной индукции ферментов, но не дают ответа на вопрос о том, как это участие осуществляется. Большое значение для выяснения этого имели работы по исследованию механизма действия фосфорилазы гликогена; в ходе этих работ был впервые открыт цАМФ.

Фосфорилаза гликогена существует в двух формах: активной и неактивной. Фосфорилаза а является тетрамером с относительной молекулярной массой 495000; фосфорилаза b имеет относительную молекулярную массу 242000. Превращение форм b--a происходит при помощи особого фермента - киназы фосфорилазы, катализирующей фосфори-лирование двух остатков серина. В свою очередь кипаза фосфорилазы активируется специальным ферментом - протеинкиназой. Протеинкиназа переносит фосфатную группу от ATЦ к остаткам серии а и треонина киназы фосфорилазы и других белков. Протеинкиназа состоит из двух субъединиц: рецепторной и каталитической. Рецепторная часть является ингибитором протеинкиназы, а связывание рецептора с цАМФ приводит к диссоциации протеинкиназы с освобождением каталитически активного фермента. Комплекс рецепторио-каталитической протеинкиназы имеет молекулярную относительную массу 152000, каталитическая субъединица -- 60500 и рецепторная -- 92000. Таким образом, активация протеинкиназы при посредстве цАМФ является примером аллостерической регуляции активности фермента, приводящей к очень быстрому изменению ферментативной активности. Начальное звено -- образование цАМФ -- контролируется гормонами, которые таким многоступенчатым путем воздействуют на разнообразные звенья обмена веществ.