Основи мікробіології

57. Основні методи культивування вірусів

1) біологічний - зараження лабораторних тварин. При зараженні вірусом тварина захворює. Якщо хвороба не розвивається, топатологічні зміни можна виявити при розтині. У тварин спостерігаються імунологічні зрушення. Однак далеко не всі віруси можна культивувати в організмі тварин;

2) культивування вірусів в курячих ембріонах. Курячі ембріони вирощують в інкубаторі 7-10 днів, а потім використовують для культивування. У цій моделі всі типи зачатків тканин схильні до зараження. Але не всі віруси можуть розмножуватися і розвиватися в курячих ембріонах.

У результаті зараження можуть відбуватися і з'являтися:

1) загибель ембріона;

2) дефекти розвитку: на поверхні оболонок з'являються освіти - бляшки, що представляють собою скупчення загиблих клітин, що містять віріони;

3) накопичення вірусів в аллантоісной рідини (виявляють шляхом титрування);

4) розмноження в культурі тканини (це основний метод культивування вірусів).

Розрізняють такі типи культур тканин:

1) перещеплюваних - культури пухлинних клітин; володіють великою мітотичної активністю;

2) первинно трипсінізірована - зазнали первинній обробці трипсином; ця обробка порушує міжклітинні зв'язку, в результаті чого виділяються окремі клітини. Джерелом є будь-які органи і тканини, найчастіше - ембріональні (мають високу мітотичної активністю).

Для підтримки клітин культури тканини використовують спеціальні середовища. Це рідкі поживні середовища складного складу, що містять амінокислоти, вуглеводи, фактори росту, джерела білка, антибіотики та індикатори для оцінки розвитку клітин культури тканини.

Про репродукції вірусів у культурі тканини судять по їх цитопатичної дії, яке носить різний характер залежно від виду вірусу.

Основні прояви цитопатичної дії вірусів:

1) розмноження вірусу може супроводжуватися загибеллю клітин або морфологічними змінами в них;

2) деякі віруси викликають злиття клітин і утворення многоядерного синцития;

3) клітини можуть рости, але ділитися, в результаті чого утворюються гігантські клітини;

4) у клітинах з'являються включення (ядерні, цитоплазматичні, змішані). Включення можуть забарвлюватися в рожевий колір (еозинофільні включення) або в блакитний (базофільні включення);

5) якщо в культурі тканини розмножуються віруси, що мають гемаглютиніни, то в процесі розмноження клітина набуває здатність адсорбувати еритроцити (гемадсорбції).

58. Культивування вірусів на лабораторних тваринах

Лабораторні тварини Чутливі лабораторні тварини використовувалися на перших етапах розвитку вірусології. У теперішній час вони також використовуються поряд з іншими методами культивуваня, причому перевага надається новонародженим тваринам, які більш чутливі до вірусної інфекції. Культивування вірусів в організмі тваринНайчастіше як піддослідні тварини служать кролики, морські свинки, білі щури, білі миші, рідше - голуби, кішки, собаки і ще рідше - мавпи. Лабораторних тварин заражають різними способами залежно від тропізму вірусу до певних тканин. Так, наприклад, для культивування нейротропних вірусів зараження виробляють переважно в мозок (віруси сказу, кліщовий енцефаліт та ін.), культивування респіраторних вірусів здійснюється при інтраназальному інфікуванні тваринних (віруси грипу), дерматотропних (вірус віспи) - шляхом нашкірного і внутрішньошкірного зараження. Найчастіше використовуються нашкірне, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне і внутрішньомозкове зараження. При первинному зараженні тварини можуть не захворіти, тому через 5-7 днів зовні здорових тварин вбивають, а з їх органів готують суспензії, якими заражають наступні партії тварин. Ці послідовні зараження називаються 'пасажами'.Індикацію, тобто виявлення факту розмноження вірусу, встановлюють на підставі розвитку типових ознак захворювання, патоморфологічних змін органів і тканин тварин або позитивної реакції гемагглютинації (РГА). РГА заснована на здатності деяких вірусів викликати аглютинацію (склеювання) еритроцитів різних видів тварин, птахів і людини за рахунок поверхневого вірусного білку - гемаглютинину. Нині використання тваринних для культивування вірусів обмежене.

59. Одним з найбільш доступних і зручних методів для виділення і культивування вірусів є використання курячих ембріонів

У курячих ембріонах здатні розмножуватися віруси з різним тропізмом, оскільки вони містять чотири субстрати для вірусу - амніон, алантоїс, хоріоналантоїсну мембрану і жовтковий мішок.

Існує два способи зараження курячих ембріонів - відкритий і закритий. Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у яких візуально немає пошкодження шкаралупи. Їх просвічують за допомогою овоскопа і відмічають межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком обробляють спиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шкаралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зараження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою і герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним мішком також обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим інструментом отвір у шкаралупі і вводять за допомогою шприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусмісткого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають стерильним розплавленим парафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих ембріонах їх можна заражати на хоріоналантоїсну оболонку, в алантоїсну порожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок тощо. При зараженні на хоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над повітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкаралупної оболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

В алантоїсну порожнину матеріал вводять закритим способом через невеликий отвір у шкаралупі на глибину 10-15 мм у безсудинній ділянці хоріоналантоїсної оболонки.

При зараженні в амніотичну порожнину використовують ембріони старшого віку. Зараження можна проводити відкритим і закритим способами. При першому після знаходження хоріоналантоїсної оболонки в ній роблять отвір, захоплюють стерильним пінцетом амніотичну оболонку і вводять матеріал з вірусами. При закритому способі вірусмісткий матеріал вводять на глибину до 20-25 мм за допомогою голки, яку спрямовують до тіла ембріона.

Для зараження в жовтковий мішок використовують 3-8-денні ембріони, тому що в них жовтковий мішок займає значну частину порожнини яйця. Зараження проводять закритим способом.

Заражені ембріони інкубують у термостаті протягом 2-4 діб. Потім їх охолоджують до температури 4°С протягом однієї доби для максимального звуження судин. Розтинають ембріони в стерильних умовах, попередньо обробивши шкаралупу йодом і спиртом. Матеріал із порожнин ембріона відсмоктують стерильним шприцом. У разі потреби досліджують оболонки і сам ембріон, які після виймання поміщають у стерильні чашки Петрі.

Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопатичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналантоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колір.

Таким чином, визначити наявність вірусів у матеріалі з курячих ембріонів можна за їх цитопатичною дією. Однак більшість вірусів репродукується в ньому без зовнішніх проявів ураження. Тоді для індикації вірусів застосовують реакцію гемаглютинації. Принцип її полягає в тому, що віруси здатні, адсорбуючись на мембрані еритроцитів, викликати їх аглютинацію. Кількість віріонів в ембріоні визначають за титром гемаглютинації - найбільшим розведенням матеріалу, при якому ще виявляють склеювання еритроцитів. Титрувати віруси можна також при культивуванні їх на шматочках хоріоналантоїсної оболонки. Для цього в стерильні лунки плексигласових пластин вносять шматочки шкаралупи, на якій знаходиться неушкоджена хоріоналантоїсна оболонка. Потім у цих лунках роблять розведення матеріалу, що містить віруси. Їх закривають спеціальними стерильними пластинами з фольги, і культивують віруси протягом двох-трьох діб при температурі 35-37°С. Пізніше в кожну лунку вносять 0,5% завись еритроцитів курки і через деякий час за умови наявності вірусів спостерігають випадання осаду еритроцитів у вигляді перевернутої парасольки.

60. Культура клітину вірусології.типи культур клітин.умови культивування та середовища для культури клітин

Клітинні культури - це генетично однорідні популяції клітин, що ростуть у постійних умовах оточуючого середовища. Це можуть бути штаминормальних клітин

Типи культур клітин [

1. Первинно-трипсинізовані - отримують із подрібнених тканин людини та тварин шляхом їх обробки трипсином чи іншими ферментами. Витримують лише 5-10 поділів (пасажів).

2. Перещеплювані - клітини, які набули здатності до безмежного розмноження, оскільки є похідними пухлин людини та тварин.

3. Напівперещеплювані (диплоїдні) - можуть витримувати до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом.

Умови культивування

Флакони із культуральним середовищем для вирощування тваринних клітин

Клітини звичайно поміщають у скляні посудини, звідси і дослідження отримали назву вивчення in vitro (від лат. in - в, vitro - скло), хоча тепер частіше культури вирощують у пластмасових посудинах. Виділені з тканин клітини інкубують при температурі +38°C +39°C (для клітин тваринного і людського організмів) та при +22°C +28°C (для рослинних клітин) у живильному середовищі відповідного складу. Клітини тоді ростуть у вигляді суспензії або моношару. Суспензійна культура - це вирощування окремих клітин або невеликих їх груп у завислому стані у рідкому живильному середовищі з використанням апаратури, що забезпечує їх аерацію і перемішування. Характерною особливістю суспензійних культур є їх морфологічната біохімічна гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняються за розміром і формою.

61. Виявляти віруси в культурі тканин можна за феноменом бляшкоутворення

Останнім часом досліджують утворення бляшок під бентонітовим живильним покриттям. Попередньо готують десятикратні розведення досліджуваного матеріалу, яким заражають відповідні культури клітин. Після 30-хвилинної інкубації їх відмивають стерильним фіpозчином і заливають бентонітовим покриттям, яке містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну бичачу сироватку, гідрокарбонат натрію, дистильовану воду і розчини антибіотиків для пригнічення сторонньої мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні клітин, бентоніт надає моношару клітин молочного кольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вогнищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок. Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопатичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналантоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колірРепродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграціїферментативною обробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25% розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв'язків між клітинами) можна проводити при температурі 37°С або 4°С.Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в камері Горяєва.

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні середовища - сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5% гемогідролізат, 0,5% гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає створити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недоліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові розчини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмивання клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторіях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденовірусів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору, паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліовірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різноманітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденовірусів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, грибами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матеріалу або повітря спричиняє їх загибель. Тоді неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобігання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчини антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміцину (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибкових препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є неможливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тканин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чутливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріплених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найчастіше використовують лінії культур клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (рабдоміосаркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом'яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфологію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отримання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідними вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, через що їхрідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одержують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітиндо складу середовища додають 10-20% сироватки крові та гліцерин. Отриману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожують до -20°С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі -196°С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко розморожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38°С.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграціїферментативною обробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25% розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв'язків між клітинами) можна проводити при температурі 37°С або 4°С.Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в камері Горяєва.

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні середовища - сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5% гемогідролізат, 0,5% гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає створити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недоліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові розчини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмивання клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторіях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденовірусів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору, паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліовірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різноманітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденовірусів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, грибами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матеріалу або повітря спричиняє їх загибель. Тоді неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобігання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчини антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміцину (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибкових препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є неможливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тканин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чутливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріплених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найчастіше використовують лінії культур клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (рабдоміосаркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом'яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфологію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отримання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідними вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, через що їхрідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одержують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітиндо складу середовища додають 10-20% сироватки крові та гліцерин. Отриману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожують до -20°С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі -196°С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко розморожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38°С.

62. Основні етапи патогенезу вірусних інфекцій

Проникнення вірусу в організм. Основні вхідні ворота для збудників вірусних інфекції людини - дихальні шляхи і шлунково-кишкового тракту, рідше - шкірні покриви. В деяких випадках розвиваються локальні поразки, але частіше в місці проникнення не виникає будь-яких проявів або вони носять стертий характер, а збудник мігрує в чутливі тканини. Поширення збудника в організмі може носити локальний чи системний характер. Локальні ураження вірусами типові для збудників респіраторних та кишкових інфекцій, а також для деяких шкірних захворювань. Тривалість інкубаційного періоду більшості подібних інфекцій становить 2-3 доби. Первинну реплікацію часто супроводжує вірусемія. Вона зазвичай протікає безсимптомно або по типу продромальних явищ, але може виникати і на тлі вираженої клінічної картини, не викликаючи розвитку додаткової симптоматики. Для подібних захворювань характерно повторне зараження, так як циркулюють AT не виявляють протективний ефект, а секреторний імуноглобулін А (IgA) надає лише короткочасне нейтралізує дію на слизовій оболонці. Системні ураження. З місця проникнення збудники потрапляють в кровотік, викликаючи вірусемія, і поступово фіксуються в чутливих тканинах. Первинне розповсюдження зазвичай викликає продромальний явища. Оскільки вірусемія передує поразці чутливих тканин, то тривалість інкубаційного і продромального періодів подібних інфекцій можуть збільшуватися до 2-3 тижнів. Вірусемія при системних інфекціях зазвичай носить двоетапний характер. Перший етап закінчується поглинанням циркулюючих вірусів клітинами ретикулоендотеліальної системи. Надалі можливо кілька варіантів:

* повна елімінація збудника (абортивна інфекція);

* розмноження вірусів в фагоцитах з подальшим виходом і розвитком вираженої вторинної вірусемії, що супроводжується появою характерних клінічних ознак захворювання (наприклад, енцефалітів);

* деякі віруси (Наприклад, вірус гепатиту В, пікорна-і тогавирусов) слабо поглинаються фагоцитами і можуть циркулювати в крові у вільному стані, а збудники колорадській кліщовий лихоманки і лихоманки долини Ріфт впроваджуються в еритроцити.

Основні органи-мішені найбільш поширених вірусних інфекцій представлені на рис. 5-9. Багато із зазначених на малюнку збудників можуть вражати, крім названих, та інші тканини (так, поліовіруси здатні викликати ураження шлунково-кишкового тракту, а вірус епідемічного паротиту має тропність до епітелію звивистих канальців яєчок)

63. Імунітет

це сукупність процесів, спрямованих на захист організму від генетично чужорідних субстанції і збереження постійності внутрішнього середовища (гомеостазу).

У поняття противірусного імунітету входять три категорії захисних механізмів:

1) природна видова резистентність;

2) неспецифічні клітинні і загально фізіологічні реакції (участь інтерферону, неспецифічних інгібіторів, фізіологічна температура тіла, піноцитоз вірусних часток, фагоцитоз заражених вірусом кліток);

3) специфічний набутий імунітет після перенесеного захворювання чи імунізації (утворення його зв'язане за участю В-лімфоцитів у продукції антитіл класу G, М, А і Е, а також за участю Т - лімфоцитів).

Фактори і механізми противірусного імунітету мають свої особливості, що відрізняють їх від імунних реакцій у відношенні бактерій та інших патогенних агентів тваринного і рослинного походження. Ці особливості визначається природою вірусів. Їх абсолютним внутрішньоклітинним паразитизмом на генетичному рівні. Вірусна інфекція - це перш за все інфекція чутливих клітин. Взаємодія вірусу та сприйнятливих клітин лежить в основі патогенезу вірусного захворювання. Поза клітинами віруси можуть зберігати життєздатність, але не розмножується, бо не мають власних білок синтезуючих систем.

Захист клітини від вірусної генетичної інформації та пригнічення репродукції вірусу є кардинальною особливістю противірусного імунітету. Відмічаючи його специфіку, не треба забувати, що захисні реакції організму, спрямовані проти вірусів, підкоряється загальним імунологічним закономірностям. Антигени, імунокомпетентні клітини та антитіла лежать в основі специфічної імунної відповіді по відношенню до будь-яких генетично чужорідних агентів, в тому числі і вірусів.

Інтерферон - особливий противірусний білок, який продукується зараженими клітинами чи цілим організмом. Відкрили його англійські вірусологи Айзекс і Лінденман (1957).

Властивості інтерферону. Існує не один інтерферон, а інтерферони, тобто не єдиний білок, а клас білків, що розрізняються різною молекулярною масою (ММ) й іншими параметрами. По антигенній специфічності інтерферони поділяються на альфа, бета і гама, що відповідає колишнім позначенням лейкоцитарного, фібробластного й імунного (тип II) інтерферону.

Індукція інтерферону. У клітинах людини мається 27 генетичних локусів для інтерферонів, з яких 14 є функціонуючими. Інтерферони закодовані в генетичному апараті клітини.

Система інтерферону не має центрального органа, тому що здатністю виробляти інтерферон володіють усі клітини організму хребетних, хоча найбільше активно виробляють його клітини білої крові. Інтерферон спонтанно не продукується інтактними клітинами, а для утворення його потрібні індуктори, якими можуть бути віруси, бактеріальні токсини, рикетсії, екстракти з бактерій і грибів, фітогемаглютиніни, синтетичні речовини - полікарбоксили, полісульфати, декстрани, але найбільш ефективними індукторами інтерферону є двоспіральні РНК, убиті і живі віруси.

Механізм утворення інтерферону в клітині. Генетично інформація для продукції інтерферону міститься в ДНК клітини, і для його утворення в клітині необхідний попередній синтез інформаційної РНК на матриці клітинної ДНК у перші години після зараження. Реплікацію іРНК для інтерферонів каталізує клітинна РНК-полімераза.

Весь інтерферон у клітках синтезується після індукції de novo. Практично всі клітини тією чи іншою мірою здатні утворювати інтерферон, крім кліток лінії Vero. Проміжок часу між початковою взаємодією індуктора і клітини (адсорбція індуктора) і появою інтерферону, розглядається як lag-період, залежить від характеру системи індуктор - клітина. При використанні як індуктор вірусу lag-період здебільшого триває 4 - 8 годин.

При деяких вірусних інфекціях інтерферон продукується в значних кількостях у тканинах, уражених тим чи іншим вірусом. По характеру інтерферони поділяють на два типи: I тип - «класичний», чи кислотостійкий; II тип - імунний, чи нестійкий до кислоти.

Яка ж роль імунокомпетентних клітин у продукції інтерферону I і II типів? Інтерферони II типу продукуються лімфоцитами у відповідь на вплив мітогенів чи попередньо сенсибілізованими лімфоцитами у відповідь на відповідний антиген. Інтерферон I типу синтезують популяції лімфоцитів з периферичної крові, молозива і молока у відповідь на вірусну інфекцію. При цьому рівень утворення його прямо пропорційний кількості узятих у досвіді як лімфоцитів, так і макрофагів.

Вплив інтерферону на кілерну активність клітин. Інтерферон сприяє або збільшенню кілерної активності сенсибілізованих Т-лімфоцитів, або індукує функцію в клітин, що до впливу інтерферону нею не володіли.

Фактори, що впливають на утворення ендогенного інтерферону. Організм реагує на вторгнення вірусу посиленим утворенням інтерферону в клітинах ураженої тканини і тим самим перешкоджає розмноженню вірусу, нейтралізує його дію. Одним з факторів, що визначають резистентність організму, і є здатність його тканин виробляти інтерферон. У різних тварин вона неоднакова і визначається уродженими особливостями організму і віком.

На вироблення інтерферону тканинами організму впливають і зовнішні умови, наприклад погода, температура повітря; узимку і восени організм виробляє менше інтерферону, чим у теплий час року. Мабуть тому влітку люди значно рідше хворіють на грип.

Вікові особливості в становленні системи утворення інтерферону. Існують обумовлені віком закономірності утворення інтерферону у людини. Було доведено, що в процесі росту організму кількість інгібіторів інтерфероноутворення в плазмі крові зменшується, а кількість факторів, що активізують цей процес, зростає.

Чутливість репродукції вірусів до інтерферону. Одна з основних властивостей інтерферону - придушувати розмноження багатьох гетерологічних вірусів. До інтерферону чуттєві усі відомі в даний час віруси, однак їх чутливість неоднакова. Найбільш чуттєві віруси, що мають зовнішню оболонку й утримуючі ліпіди (міксовіруси, група вірусів віспи, арбовіруси), тоді як пікорна- і аденовіруси, позбавлені зовнішньої оболонки, більш стійкі до дії інтерферону. Мається і певні виключення: віруси герпесу з добре розвинутою оболонкою стійкі до дії інтерферону. Найбільш чуттєві в тканевих культурах арбовіруси. Тому вони використовуються як модель для перевірки активності інтерферону.

64. Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА)

Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0% суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, прогріваючи при температурі 56°С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО - гемаглютинуюча одиниця - максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді «ґудзика» на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації останнього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшкоутворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі системи - курячі ембріони та лабораторні тварини

При вивченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компонентами реакції є вірусмісткий матеріал (культуральна рідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних властивостей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів.

З матеріалу, що містить віруси, попередньо готують послідовні десятикратні розведення від 10^-1 до 10^-8. По 0,1 мл кожного розведення вносять у пробірки, в яких знаходиться культура клітин. Перед проведенням досліду в пробірках замінюють живильне середовище. Як правило, заражують по три пробірки з культурою клітин для кожного розведення вірусмісткого матеріалу. Контролем є культури клітин, які не інфікують вірусом. Клітинні культури інкубують при 37°С протягом 5-7 днів. Результати оцінюють за наявністю або відсутністю цитопатичної дії. Визначають 50% тканинну цитопатичну дію вірусів (ТЦД₅₀), тобто найбільше розведення вірусів, яке викликає цитопатичний ефект у 50% заражених клітин.

В основному досліді використовують пробірки із розведеннями імунної сироватки, куди вносять стандартну дозу вірусу (найчастіше 100 ТЦД₅₀), а після інкубації при кімнатній температурі протягом 30-60 хв додають одношарові культури клітин. Систему інкубують при 37°С протягом одного тижня і враховують наявність цитопатичного ефекту. Відсутність його свідчить про нейтралізацію вірусу, який вивчається, специфічною імунною сироваткою. За ідентичною схемою реакцію можна ставити в спеціальних полістиролових планшетах.

65. В імуноферментних методах

Антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв'язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з'єднання антигена і антитіла з кон'югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людських тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулюючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н₂О₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс антиген - антитіло. Після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв'язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші антитіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти гаптена, кон'юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості системи авідин-біотин. Авідин - глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінанти, які зв'язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин).

Замість авідину, кон'югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали застосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх використання може бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пероксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для цього методу вже розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні антитіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точнішої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпопуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасно можна виявити два або більше різних антигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з'єднання авідин-біотин-пероксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне антитіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюється продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв'язане з комплексом авідин-біотин-пероксидаза, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох випадках в якості іншого антитіла використовують кінські протимишачі антитіла.

Твердофазні імуноферментні методи. Принцип цих методів полягає в наступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджувану сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають субстрат для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчастіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є модифікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердому носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сироватки зв'язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні антитіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв'язались з антигеном, мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних антитіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв'язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостерігається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій - ³H і йод - ¹²⁵J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників g-проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв'язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв'язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв'язуватись з антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод «сендвіча» також використовується для дослідження антигенів. У даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке зв'язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від кількості зв'язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення антигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений антиген. Кількість зв'язаного міченого антигена є пропорційною кількості досліджуваних антитіл.

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST (radioallergosorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST (paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на твердій фазі (фільтрувальний папір Ватман №50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані антитіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З допомогою цієї реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. Відповідна модифікація цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних методів, вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Проте для їх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують проведення роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.

66. Вірусологічні методи дослідження

Методи вивчення біології вірусів та їх ідентифікації. У вірусології широко використовуються методи молекулярної біології, з допомогою яких вдалося встановити молекулярну структуру вірусних частинок, способи проникнення їх в клітку і особливості репродукції вірусів, первинної структури вірусних нуклеїнових кислот і білків. Розвиваються методи визначення послідовності складових елементів вірусних нуклеїнових кислот і амінокислот білка. З'являється можливість зв'язати функції нуклеїнових кислот і кодованих ними білків з послідовністю нуклеотидів і встановити причини внутрішньоклітинних процесів, що грають важливу роль в патогенезі вірусної інфекції.

Вірусологічні методи дослідження засновані також на імунологічних процесах (взаємодія антигену з антитілами), біологічні властивості вірусу (здатність до гемаглютинації, гемолізу, ферментативна активність), особливості взаємодії вірусу з клітиною-господарем (характер цитопатичної ефекту, освіта внутрішньоклітинних включень і т.д.).

В діагностиці вірусних інфекцій, при культивуванні, виділення та ідентифікації вірусів, а також при отриманні вакцинних препаратів широко застосовують метод культури тканин і клітин. Використовують первинні, вторинні, стабільні перевиваемие і диплоїдні клітинні культури. Первинні культури отримують при диспергирование тканини протеолітичними ферментами (трипсином, коллагеназой). Джерелом клітин можуть бути тканини і органи (частіше нирки) ембріонів людини і тварин. Суспензію клітин в живильному середовищі поміщають в так звані матраци, бутлі або чашки Петрі, де після прикріплення до поверхні судини клітини починають розмножуватися. Для зараження вірусами використовують зазвичай клітинний моношар. Живильну рідину зливають, вносять вірусну суспензію в певних розведеннях і після контакту з клітинами додають свіжу живильне середовище, зазвичай без сироватки

67. Всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою:

1) для виявлення антитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних антигенів-діагностикумів - для серологічної діагностики інфекційної хвороби; 2) для визначення невідомих антигенів (бактерій, грибів, вірусів) за відомими стандартними сироватками-антитілами - для серологічної ідентифікації збудників. Якщо в реакції антитіла з антигеном беруть участь низькодисперс-ні антигени (бактерії, клітини), спостерігається феномен, або реакція, аглютинації (РА); при взаємодії антитіл з високодисперсними антигенами (полісахариди, білки та їх комплекси) утворюються преципітати (флокуляти). У реакції преципітації (РП) завдяки полівалентній природі антигену й антитіла утворюються ґратчасті структури, будова яких залежить від кількісного співвідношення антигену й антитіла

Коли до комплексу антиген - антитіло приєднується комплемент, відбувається реакція зв'язування комплементу (РЗК).

Взаємодія антитіла з антигеном може зумовлювати нейтралізацію токсину антитоксином (РН), активацію системи комплементу, реакцію негайної гіперчутливості.

Антитіла, що належать до класів IgA і IgE, не мають властивості спричинювати РП, РА, РЗК-

У ряді випадків з'єднання антитіла з антигеном може бути неміцним; оборотність комплексу антиген-антитіло відбувається в результаті конформаційних змін молекули антитіла, при надлишку антигену або зменшенні спорідненості між антигеном і антитілом, а також під впливом зовнішніх факторів (температура, кислотність середовища та ін.).

Усі імунологічні реакції поділяють на моно- й полісистемні.РЕАКЦІЯ АГЛЮТИНАЦІЇ Аглютиніни - антитіла, що мають властивість спричиняти склеювання відповідних бактерій, еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, клітин тканин, корпускулярних хімічних часточок з адсорбованими на них антигенами або антитілами з утворенням конгломератів (аглю-тинатів), видимих неозброєним оком.

Додавання відповідних імунних сироваток до зависі бактерій спричиняє їх аглютинацію і випадання в осад у виглядіпластівців або зерен. В реакції аглютинації (моносистемній, прямій, двокомпонентній) беруть участь антитіло (аглютинін) і корпускулярний антиген (аглютиноген); вони взаємодіють у певних кількісних співвідношеннях і при наявності електроліту (0,85% розчин натрію хлориду).

РА бактерій з відповідними аглютинуючими сироватками характеризується специфічністю. Проте може траплятися групова аглютинація, тобто склеювання близьких, споріднених мікроорганізмів, хоч і в слабших розведеннях сироватки. Схематично це можна зобразити так: бактерія А містить аглютиногени а, Ь, с, бактерія В - b, c, d, бактерія С - с, d, є, а в сироватках крові імунізованих тварин утворюються відповідні їм аглютиніни.

Для виявлення специфічних аглютинінів у сироватках крові тварин, імунізованих складним комплексом антигенів бактеріальної клітини, застосовують метод адсорбції аглютинінів (реакція виснаження Кастеллані).

За допомогою методу адсорбції аглютинінів вивчають також антигенну структуру бактерій; крім того, його використовують для приготування специфічних аглютинуючих і лікувальних сироваток, вакцин і діагностикумів. Аглютинуючі сироватки, добуті методом адсорбції аглютинінів, називають монорецепторними. Вони дають змогу точніше визначати видову залежність низки збудників інфекційних захворювань.

При імунізації тварин рухливими бактеріями, що містять джгутикові (Н) і соматичні (О) антигени, у них виробляються відповідно Н- і О-аглютиніни. Джгутикові аглютиніни спричиняють швидше склеювання бактерій у вигляді пухких пластівців, соматичні аглютиніни порівняно повільно утворюють конгломерати бактерій у вигляді дрібних зерен. На цій підставі Н-аглютинація називається крупнопластівцевою, а О-аглютинація - дрібнозернистою.

Бактерії, що містять Vi-антиген, слабко або зовсім не аглютинуються О-сироватками, але добре аглютинуються Vi-сироватками. Це доводить, що О- і Vi-антигени, так само як О- і Vi-антитіла, мають різну структуру.

При здійсненні РА треба враховувати феномен затримки аглютинації. Це бувє як при занадто великих, так і при малих концентраціях імунної сироватки, взятої для РА. Цей феномен властивий усім реакціям імунітету і має враховуватись при лабораторній діагностиці інфекційних захворювань.

РА широко застосовують для серологічної діагностики черевного тифу, паратифів А і В (реакція Відаля), бруцельозу (реакція Райта), висипного тифу (реакція з рикетсіями Провачека), туляремії, лептоспірозу та інших захворювань, коли за допомогою відомих бактерій (діагностикумів) визначають у сироватці крові хворих відповідні аглютиніни.