Клініко-патогенетичні особливості вітамін D-дефіцитного рахіту у дітей першого року життя при ожирінні

Дефіцит вітаміну D - клінічний синдром, який розвивається в результаті зниження 25(ОH)D в сироватці крові. Останні роки активно обговорюється питання про нормативні значення рівня гідроксивітаміну D у дітей і дорослих. При цьому до сих пір залишається суперечливим питання щодо рівня 25(ОH)D, за яким визначають наявність дефіциту вітаміну D. Погляди на встановлення дефіциту вітаміну D історично зазнавали різноманітних змін. Слід зазначити, що сучасні лабораторні технології дозволяють виключати з сумарної концентрації загального 25(ОН)D нещодавно відкриту неактивну форму 3-епі-25(ОН)D3, який за результатами сучасних досліджень визначається в крові дітей віком до 1 року. Отже, даний аспект являється важливим для отримання достовірних результатів рівня 25(ОН)D в сироватці крові у когорті дітей даної вікової групи [64, 151, 230]. Сироваткова концентрація загального 25-гідроксивітаміна D виражається в нанограммах на мілілітр (нг / мл) або в наномолях на літр (нмоль / л), причому 1 нг / мл становить 2,496 нмоль / л [77, 200].

Для оцінки статусу вітаміну D в організмі дитини на сьогоднішній день науковці та клініцисти використовують класифікацію, згідно з положеннями якої інтерпретація результатів дослідження концентрації сироваткового гідроксивітаміну D проводиться незалежно від віку дитини. На думку більшості міжнародних професійних організацій, дефіцит має місце тоді, коли 25(ОН)D нижче 20 нг / мл (тобто нижче 50 нмоль / л), рівень 25(ОН)D від 21 до 29 нг / мл (тобто 52 - 72 нмоль / л) може розглядатися, як індикатор відносної недостатності вітаміну D, а рівень 30 нг / мл і вище- як достатній (тобто, близький до нормального). Інтоксикація вітаміном D спостерігається, коли рівень 25(ОН)D вище, ніж 150 нг / мл (374 нмоль / л). Міжнародне ендокринологічне товариство (The Endоcrіne Sоcіety), Федеральна комісія з харчування Швейцарії (FCN), Іспанське суспільство дослідження кісток і мінерального обміну, підтримує точку поділу достатності рівну 30 нг / мл, ставлячи пріоритетом оптимальні умови мінералізації кісткової тканини, абсорбцію кальцію в кишечнику і пригнічення надлишкової секреції ПТГ з мобілізацією кальцію з кісток [83, 108, 173, 233, 239, 260]. Дані класифікації ґрунтуються на високій поширеності остеомаляції і рахіту у пацієнтів з рівнями 25 (ОН) D менше 20 нг / мл і виявлення підвищення частоти немінералізованого остеоїда у осіб, рівні сироваткового гідроксивітаміну D яких були в межах 20-30 нг / мл [84, 120].

Отже, цільова концентрація вітаміну D в сироватці крові як дітей, так і дорослих повинна відповідати рівню більше 30 нг / мл (75 нмоль / л) для забезпечення всіх позитивних впливів цього вітаміну на організм людини. Поточні дані біохімічних, спостережних і рандомізованих контрольованих випробувань показують, що рівень сироваткового 25(ОH)D, принаймні, 50 нмоль / л обов'язковий для нормалізації паратиреоїдного гормону (ПТГ), щоб звести до мінімуму ризик остеомаляції та оптимального функціонування кісткових клітин [107, 163]. Адекватні рівні вітаміну D життєво важливі для нормальної роботи ендокринної системи, не тільки в кістковій тканині, але також і у всьому організмі. Протягом тривалого часу не було консенсусу щодо оптимальних рівнів 25(ОН)D в популяції, і тільки на теперішній час до цієї проблеми зростає зацікавленість. Слід зазначити, що дебати з приводу порогових значень рівня сироваткового гідроксивітаміну D тривають з урахуванням безпечності, максимальної користі для організму та попередження захворювань, пов'язаних із його дефіцитним станом.

Найважливішим недоліком існуючого останні десятиліття підходу для корекції статусу вітаміну D є застосування в лікувальних цілях засобів на основі цього вітаміну без відповідного лабораторного підтвердження його дефіциту. Безумовно, не можна забувати про різні технічні можливості в минулому і сьогоденні, адже лабораторна оцінка концентрації вітаміну D в сироватці крові стала доступною практичному лікарю відносно недавно. Однак навіть у сучасних умовах фахівці продовжують ігнорувати цей факт. За даними літератури рекомендується визначення концентрації сироваткового 25(ОH)D для немовлят, дітей, підлітків та вагітних жінок, які мають, принаймні, один фактор ризику для низького статусу вітаміну D [237]. Останнім часом з'явилися повідомлення про необхідність індивідуального підходу при призначенні вітаміну D (після визначення вмісту в крові його активних метаболітів) для корекції дефіциту вітаміну D. За результатами сучасних досліджень відомо, що кожні 100 МО (2500 нг) при щоденному застосуванні вітаміну D підвищують рівень 25(ОH)D в сироватці крові на 1 нг/мл [108, 215].

У літературі широко обговорюється вплив як власне ожиріння, так недостатності вітаміну D на зміни вуглеводного і жирового обміну. Без перебільшення можна сказати, що кожне захворювання, особливо у дітей раннього віку, супроводжується більшою чи меншою мірою порушеннями показників ліпідного обміну. Компоненти ліпідного обміну відіграють суттєву роль у процесах метаболічної адаптації організму в нормі і при багатьох патологічних станах, що сприяє вторинним зсувам у ліпідному спектрі крові. Посилення перекисного окислення ліпідів, функціональні та структурні порушення фосфоліпідного спектру клітинних мембран розглядаються як головний патохімічний механізм багатьох патологічних процесів у дитячому віці [26, 54]. Аналіз літературних джерел виявив перехресні дослідження, де простежувався зв'язок сироваткового рівня вітаміну D та ліпідів у різних вікових групах [137]. За останніми даними встановлено асоціації між статусом вітаміну D у дітей віком від 9 місяців та ліпідами крові, ІМТ: обернено пропорційний зв'язок концентрації сироваткового вітаміну D з рівнями холестерину ліпопротеїдів високої щільності (ХС ЛПВЩ), холестерину, ІМТ [71]. На жаль, не виявлено дослідження щодо кореляції вищевказаних показників у дітей більш раннього віку.

Незважаючи на те, що проблема вітамін D-дефіцитного рахіту у дітей раннього віку достатньо висвітлена в літературі та розроблені загальнонаціональні програми по анте- та постнатальній профілактиці та лікуванню, однак, патогенетичні основи захворювання залишаються найбільш складними та дискутабельними. У зв'язку з неухильним зростанням частоти розвитку даної остеопатії у дітей особливе значення має оцінка стану здоров'я в критичні періоди росту, один з яких - перший рік життя. Вивчення остеогенезу у дітей цієї вікової групи - важливе завдання, оскільки своєчасна профілактика рахіту, розпочата в цьому віці, дозволяє попередити розвиток органічної патології кісткової системи в подальшому [36].

З курсу нормальної анатомії, фізіології відомо, що розвиток кісткового скелета являє собою тривалий процес, який починається ще у внутрішньоутробному періоді життя і закінчується до 20-23 років. Інтенсивний ріст протягом усього дитинства створює для кісткової тканини абсолютно особливе положення, при якому вона дуже чутлива до несприятливих впливів зовнішнього середовища, включаючи порушення харчування, рухової активності та ін. Будучи метаболічно активною, кісткова тканина являє собою динамічну систему, в якій постійно відбуваються процеси ремоделювання, пов'язані з руйнуванням старої кістки остеокластами і утворенням нової остеобластами. Кісткове ремоделювання є механізмом, спрямованим на збереження гомеостазу, ріст і оновлення кісткової тканини. Весь період існування кісткової тканини в фізіологічних умовах супроводжується узгодженням між процесами синтезу та резорбції. Баланс ремоделювання, тобто кінцева різниця між кількістю резорбованої і новосформованої кісткової тканини, залишається позитивним протягом усього дитячого віку. Всі ці процеси регулюються як на організмовому, так і на локальному рівнях за рахунок гормонів і цілого ряду речовин білкової природи, більша частина яких відносяться до неколагенових протеїнів кісткового матриксу. В зв'язку з вищевказаним, необхідно відмітити, що при рахіті утворення органічного субстрату кістки відбувається в сповільнених проти норми темпах [6, 30, 142]. Відомо, що при цій патології порушується рівновага між кісткоутворенням та руйнуванням. Слід відзначити, що в умовах гіповітамінозу D в структурі кісткового метаболізму характерним є переважання процесів резорбції над синтезом кісткової тканини, що призводить до відкладення остеоїда при відсутності адекватної мінералізації [13].

В останні роки відомості про патогенез рахіту значно доповнилися новими даними, для діагностики та оцінки кісткового метаболізму активно розробляються нові методи. Розвиток за останнє десятиліття імунохімічних, цитохімічних та генетичних методів дозволило визначити роль окремих компонентів в механізмі розвитку даного захворювання. Так, різноманітні біохімічні аналізи, які відображають активність остеобластів (клітин кісткоутворення) і остеокластів (клітин кісткової резорбції), були розроблені для клінічного застосування з метою розширити наше розуміння про цикл кісткового ремоделювання, патогенез скелетних розладів і реакцію цих порушень до терапії.

Поділ маркерів метаболізму на маркери формування і резорбції відображає активність взаємопов'язаних процесів кісткового ремоделювання. До маркерів кісткового формування відносять: загальну лужну фосфатазу та її кістковий ізофермент, карбокси- і амінотермінальний пропептид проколлагена І типу, остеокальцин. Маркери кісткової резорбції включають: піридинолінові поперечні зшивки колагену (піридинолін, дезоксипіридинолін), тартратрезистентную кислу фосфатазу, оксипролін (гідроксипролін), карбокси- і амінотермінальний телопептиди колагену І типу, галактозілоксілізин, кістковий сіалопротеїн [25].

В нашій країні на сьогоднішній день доступним є визначення в сироватці крові наступних біохімічних показників: загальної лужної фосфатази, остеокальцину, пропептиду проколлагену І типу та телопептиду колагену І типу. Для їх використання з метою діагностики кісткових порушень в педіатрії існує проблема, яка пов'язана з недоліками інформативності кожного з цих сучасних маркерів. Адже на складність розробки дитячих референтних значень, а, відповідно, - і інтерпретації отриманих результатів, впливає їх значна варіабельність, пов'язана із впливом на показники вікових, статевих, антропометричних та інших особливостей педіатричного контингенту.

Одним з найбільш інформативних і чутливих біохімічних маркерів формування кістки і швидкості її ремоделювання є остеокальцин. Це найважливіший неколагеновий білок матриксу кістки, що становить 3 %. У ході утворення нової кістки остеокальцин синтезується остеобластами, цей процес залежить від вітаміну К і стимулюється вітаміном D3. Остеокальцин прямо впливає на гормони, регулюючи обмін кальцію (кальцитонін, паратгормон і вітамін D). Після виходу з остеобластів, остеокальцин не тільки вбудовується в матрикс кістки, але також виділяється у кровотік. Він вважається специфічним маркером кісткоутворення, його концентрація в крові відображає метаболічну активність остеобластів кісткової тканини [4, 51].

Відомо, що вітамін D-дефіцитний рахіт у дітей раннього віку супроводжується зниженням вмісту остеокальцину в сироватці крові, причому ступінь зниження залежить від вираженості рахітичного процесу. Вміст остеокальцину в крові дітей, хворих на рахіт, знаходиться в зворотній залежності від концентрації паратгормону і в прямій - з рівнем загального та іонізованого кальцію і кальцитоніну [20, 27].

В класичному розумінні в сучасній клінічній практиці остеокальцин розглядається як маркер метаболізму кісткової тканини, маркер, за допомогою якого можна оцінити інтенсивність кісткового обміну при різних захворюваннях і станах [37]. Однак, все більшу увагу дослідників притягнуто до остеокальцину як до можливого нового посередника або активного учасника підтримки гомеостазу глюкози і регулятора жирової тканини. З'ясувалося, що скелет виступає як ендокринний регулятор енергетичного обміну завдяки остеокальцину, адже контролює всі детермінанти енергетичного метаболізму: гомеостаз глюкози і виробництво інсуліну, толерантність до глюкози і чутливість до інсуліну, жировий обмін, витрату енергії і апетит [67, 86, 111, 117, 123, 198, 250, 270].

Метаболічну активність остеокальцину доведено у дослідженнях, які проводилися на мишах, цей ефект полягає у опосередкованному регулюванні проліферації панкреатичних в-клітин, секреції інсуліну і синтезу адипонектину на жировій тканині [158]. Результати експериментальних досліджень вказують і на зворотній зв'язок, який зводиться до того, що інсулін і лептин, в свою чергу, діють на кісткову тканину за рахунок модулювання секреції остеокальцину [96, 164, 189]. Крім того, дослідження на мишах показали, що остеокальцин може являтись терапевтичним підходом до лікування ожиріння та резистентності до інсуліну [112].

Проте, клінічні дослідження за участю людей тільки показали кореляцію між рівнем остеокальцину та факторами, пов'язаними з енергетичним метаболізмом. Аналіз літературних джерел виявив безліч наукових праць, присвячених пошуку асоціації ожиріння з рівнем остеокальцину. Висновки сучасних досліджень, які проводились у дітей та підлітків, стверджують, що рівень даної речовини в сироватці крові має обернений пропорційний зв'язок з маркерами ожиріння (ІМТ, відсотком жиру в організмі, обводом талії) [68, 183]. На жаль, не виявлено наукових праць, де вивчалася вищевказана асоціація в когорті дітей першого року життя з рахітом на тлі ожиріння.

Прогрес в області генної інженерії також доповнив знання про роль основних учасників, які контролюють виробництво вітаміну D і ефекти, через які 1,25 - дигідроксивітамін D3 впливає на гомеостаз кальцію, фосфату і фізіологію кістки. Останні успіхи в галузі генетики людини пов'язані з виявленням мутацій в генах, що регулюють метаболізм вітаміну D і його фізіологічні дії [80, 135]. Незважаючи на успіхи в області генетики D-вітамін дефіцитного рахіту у дітей раннього віку, в даний час не розроблено будь-яких надійних методів визначення генетичної схильності до цього захворювання або прогнозування терапевтичної відповіді у пацієнтів.

За даними літератури, поліморфні генетичні варіанти можуть здійснювати як якісний, так і кількісний вплив. Результати сучасних досліджень показали, що рівень сироваткового 25(ОH)D може залежати і від генетичних факторів. Попередні дослідження виявили кілька загальних поліморфних варіантів генів VDR, GC, NАDSYN1 і CYР2R1, які були пов'язані з циркулюючими рівнями 25 - гідроксивітаміну D і дефіцитом вітаміну D у дітей та дорослих [65, 98, 143, 222]. Одні з наукових повідомлень стверджують, що більш низькі рівні 25(ОH)D3 в сироватці крові, а також значна частота дефіциту вітаміну D (< 20 нг / мл) були виявлені у носіїв генотипу bb Bsm І поліморфного маркера гена VDR [243]. Враховуючи представлені дані, виправданий інтерес до вивчення ролі окремих поліморфізмів у патогенезі вітамін D-дефіцитного рахіту.

На сучасному етапі активно вивчається роль гена, що кодує рецептор вітаміну D. Поява аналітичних даних про VDR сприяє новому направленню у більш поглибленому вивченні багатьох захворювань, в тому числі і вітамін D-дефіцитного рахіту. VDR є фактором транскрипції, що регулює експресію генів, які забезпечують його біологічну активність (ендокринну, аутокринну та паракринну). VDR є членом досить великого сімейства ядерних гормональних рецепторів, яке включає рецептори для глюкокортикоїдів, мінералокортикоїдів, статевих гормонів, гормонів щитоподібної залози, метаболітів вітаміну А або ретиноїдів [104, 263]. Відомо, що VDR кодується геном VDR, для якого характерний генетичний поліморфізм, тобто існування різних алельних варіантів цього гена в популяції. Найновіші дані демонструють, що активація VDR може регулювати безпосередньо та / або опосередковано дуже велику кількість генів (від 0,5 % до 5% від загального генома людини, тобто, 100-1250 генів) [127, 136, 272]. Ген VDR у людини представлено однією копією, яка міститься в довгому плечі 12-ї хромосоми (12q13.11). Більшість дослідників вважають, що ген рецепторів вітаміну D складається з 11 екзонів [271]. Доведено, що саме мутації гена VDR являються етіологічним фактором розвитку вітамін D-залежного рахіту 2-го типу [143].

Найбільш частою причиною відмінностей у структурі генів є точкові мутації - заміни одиничних нуклеотидів, або поліморфізм одиничних нуклеотидів (Sіngle nucleоtіde роlymоrрhіsm, SNР, сніп). Точкові відмінності в індивідуальних геномах у людини займають у середньому близько 1 % геному і складають 95 % поліморфних послідовностей. Іншими словами, сніпи - це позиції одиничних нуклеотидів, які у одних людей зайняті однією основою, а в інших - альтернативною. Дослідниками доведено, що саме SNР за рахунок формування специфічних алелей генів роблять важливий внесок у фенотипічні відмінності між людьми, у тому числі в індивідуальні особливості розвитку захисних реакцій, схильність до цілого ряду захворювань, а також чутливість до фармакологічних агентів. Для оцінки значущості виявлених індивідуальних одиничних нуклеотидних поліморфізмів (SNР) в аналізованих генах проводять дослідження порівняння їх частоти між здоровими особами та групами хворих. Передбачувальну інформативність виявлених SNР оцінюють за коефіцієнтом ризику (оdds rаtіо, ОR), що вказує, у скільки разів частіше даний маркер зустрічається у хворих, ніж у популяції в цілому. Встановлено понад 2400 SNР, статистично достовірно асоційованих із захворюваннями з високими ОR [38, 46, 93].

На сьогодні описано 1518 однонуклеотидних поліморфізмів (SNР) гена VDR у людини. Серед них Bsm І, локалізований у 8-му інтроні, недалеко від ділянки, яку позначають як 3'-UTR (untrаnslаted regіоn). Суть однонуклеотидного поліморфізму Bsm І полягає в тому, що у положенні 58980 гуанін заміщається на аденін. Самі по собі поліморфізми в інтронах не є функціонально значимими, оскільки не змінюють послідовності азотистих основ у змістовній частині гена, проте, будучи зчепленими з регуляторними ділянками гена, можуть бути маркерами функціональних зв'язків інших SNР із розвитком патологічних процесів і хвороб [31].

Поширеність поліморфізму гену VDR має расово-етнічні розбіжності. Розбіжності в результатах дослідження багато дослідників пояснюють існуванням відмінностей у будові самого геному, в особливостях харчування (передусім, у рівні споживання кальцію та вітаміну D), а також впливу чинників довкілля на організм людини у різних регіонах світу [219].

Недавні дослідження показали, що в особливостях метаболічних порушень важливу роль можуть відігравати і генетичні фактори, які обумовлюють схильність до вітамін D-дефіцитного рахіту [184].

Проте, лише в декількох наукових працях вивчався взаємозв'язок між рецепторами вітаміну D та вітамін D-дефіцитним рахітом [101]. Дослідження, присвячені зв'язку генетичних поліморфізмів гена VDR і даному захворюванню, одиничні і не дають прямих доказів впливу конкретних алелів на нього. Найбільшу увагу дослідників було сфокусовано на поліморфізмі VDR, виявленому за допомогою рестриктаз Bsm І (rs1544410), Ара І (rs7975232), Tаq І (rs731236) і Fоk І (rs2228570). Проте результати проведених раніше досліджень неоднозначні і значно варіюють залежно від популяції і етнічних особливостей досліджуваної когорти.

З огляду на літературні дані, присвячені вивченню вищезазначеній асоціації, було виявлено зв'язок між підвищенням частоти B алеля / BB генотипу одиничного нуклеотидного поліморфізму в сайті рестрикції Bsm І, F алеля / FF генотипу в сайті Fоk І і генотипу АА в сайті Ара І та ризиком для виникнення рахіту серед азіатів. Висновки проведеного мета-аналізу дозволяють припустити, що генотип bb одиничного нуклеотидного поліморфізму в сайті рестрикції Bsm І і ff генотип в сайті Fоk І можуть являтись захисними факторами для ризику розвитку даного захворювання в цій популяції [150]. На жаль, нами не виявлено наукових повідомлень, які б стосувались дослідження частоти SNР гена VDR у хворих на вітамін D-дефіцитний рахіт серед європейської когорти.

Особливу зацікавленість на сучасному етапі становлять дані щодо впливу Bsm І поліморфного маркера гена VDR на мінеральну щільність кісткової тканини і циркулюючий в крові рівень остеокальцину [69, 251, 252, 253].

Все більшу увагу дослідників привернуто до вивчення поліморфізму одиничних нуклеотидів гена рецептора вітаміну D при різних патологічних станах. І ожиріння у даному випадку не виключення. Генетичні дослідження також дають підставу стверджувати про зв'язок між однонуклеотидними поліморфізмами гену VDR та маркерами ожиріння. Ці спостереження припускають, що генетично детерміновані зміни функції VDR можуть грати роль у пацієнтів із ожирінням [100, 232].

Таким чином, дитячий вік пацієнтів, зв'язок вітаміну D зі зростанням і розвитком дитини, становленням майже всіх систем організму, а також важлива роль його в патогенезі цілого ряду захворювань сприяли проведенню даного дослідження. Беручи до уваги значну поширеність вітамін D-дефіцитного рахіту, що відображає очевидну недостатню ефективність діючих профілактичних заходів з урахуванням багатофакторності захворювання, непередбаченість, незворотність та вагомість наслідків, недостатність даних щодо кореляції клінічних проявів рахіту з сучасними лабораторними маркерами кісткового метаболізму, значимість статусу вітаміну D для підтримки здоров'я та попередження ряду захворювань залишаються актуальними питаннями та свідчать про необхідність подальшого вивчення особливостей рахіту у дітей першого року життя.

На сьогоднішній день існує багато різних доказів про порушення біохімічних процесів при вітамін D-дефіцитному рахіті, їх взаємозв'язок, вираженість та залежність від генетичних факторів, що обумовлює необхідність поглибленого вивчення метаболічних порушень у дітей першого року життя. Попри дані, які відомі про асоціацію надмірної маси тіла та ожиріння з дефіцитом вітаміну D та як наслідок розвитку рахіту в вищевказаної вікової групи, зміни в організмі дитини потребують подальшого ретельного вивчення, що і визначило мету даного дослідження. Крім того, поглиблений аналіз метаболічних порушень при вітамін D-дефіцитному рахіті у дітей першого року життя з надмірною масою тіла та ожирінням дозволить покращити якість діагностики та прогноз перебігу захворювання. Таким чином, планується встановити важливість розгляду надмірної маси тіла та ожиріння у дітей першого року життя як фактора ризику по розвитку вітамін D-дефіцитного рахіту для оптимізації в перспективі профілактичних та лікувальних заходів.

Незважаючи на те, що аспекти вітамін D-дефіцитного рахіту у дітей першого року життя перебувають у центрі уваги не лише вчених, а й практичних лікарів, недостатньо вивченими залишаються питання своєчасної, малоінвазивної, небагатовартісної та безпечної діагностики ступеня вираженості даної патології, з врахуванням багатофакторності захворювання - індивідуальності та своєчасності профілактичних та лікувальних заходів. Вивчення клініко-патогенетичних особливостей вітамін D-дефіцитного рахіту у дітей першого року життя на тлі надмірної маси тіла та ожиріння, як можливого фактора ризику даного захворювання, розширить наші знання про стан біохімічних порушень та механізми, що регулюють кістковий метаболізм. В доступній нам літературі не зустрічалися публікації, в яких би вивчалися асоціації гідроксивітаміну D, остеокальцину, дані фосфорно-кальцієвого обміну, загальної лужної фосфатази та клінічні прояви вітамін D-дефіцитного рахіту у дітей першого року життя, які мають надмірну масу тіла чи ожиріння, не досліджувався взаємозв'язок рівня 25(ОН)D з показниками ліпідного обміну та фізичного розвитку в даній віковій групі. В результаті аналізу літературних джерел не проводились дослідження асоціації однонуклеотидного поліморфізму Bsm І гена VDR, що кодує рецептори вітаміну D, з клініко-лабораторними даними вітамін D-дефіцитного рахіту у дітей першого року життя української популяції. Таким чином, уперше буде проведена клініко-патогенетична характеристика вітамін D-дефіцитного рахіту у дітей першого року життя, які мають надмірну масу тіла та ожиріння. Проведені дослідження суттєво розширять наше уявлення про механізми обмінних порушень при даній патології. Розуміння цих механізмів сприятиме появі в перспективі нових підходів до профілактики та лікування вітамін D-дефіцитного рахіту у дітей, які мають надмірну масу тіла та ожиріння.



РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Робота виконана на кафедрі педіатрії № 1 Вінницького національного медичного університету імені М. І. Пирогова впродовж 2013-2015 рр. Для реалізації програми дослідження здійснено співробітництво з інфекційно-боксованим відділенням для дітей раннього віку обласної дитячої клінічної лікарні м. Вінниці, клінічною та біохімічною лабораторією обласної дитячої клінічної лікарні м. Вінниці, біохімічною лабораторією та лабораторією епігенетики на базі ДУ "Інститут геронтології імені Д. Ф.Чеботарьова НАМН України".

У роботі дотримані етичні принципи щодо людей, які виступають суб'єктами дослідження з урахуванням основних положень GCР ІCH та Хельсинської декларації Всесвітньої медичної асоціації з біомедичних досліджень, де людина виступає їх об'єктом (Wоrld Medіcаl Аssоcіаtіоn Declаrаtіоn оf Helsіnkі 1964, 2000, 2008), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (2007 р.) і рекомендації Комітету з біоетики при Президії НАМН України (2002 р.). Наявні позитивний висновок комісії з біоетики Вінницького національного медичного університету імені М. І. Пирогова (протокол № 12 від 10.12.2015 р.) та локальних комісій з біомедичної етики при обласній дитячій клінічній лікарні м. Вінниці. Це передбачало дотримання концепції інформованої згоди з урахуванням етичних принципів стосовно дітей, які виступають об'єктом дослідження.

Дизайн роботи був розроблений виходячи з поставленої мети та завдань дослідження із використанням системного підходу та комплексу клінічних, біохімічних та генетичних обстежень.

Перший етап передбачав дослідження наукової медичної літератури, мета-аналізів, системних оглядів, електронних баз даних щодо вивчення сучасного уявлення про вітамін D-ендокринну систему, її значення в етіології та патогенезі рахіту. Пріоритет надавався розгляду епідеміологічних відомостей, актуальних факторів ризику та механізмів розвитку даного захворювання, дослідженню патогенетичного зв'язку між дефіцитом вітаміну D та ожирінням, ролі поліморфних маркерів гена VDR в особливостях метаболічних порушень, аналізу новітніх методів діагностики, лікування та профілактичних заходів щодо запобігання вищезазначеної патології.

У процесі виконання роботи проведено ретроспективний клініко-анамнестичний аналіз 284 карт стаціонарних хворих, які знаходилися на лікуванні у відділенні для дітей раннього віку Вінницької обласної дитячої клінічної лікарні в період 2011-2013 рр. з документованим супутнім діагнозом рахіт. Вік дітей становив від 3 до 12 місяців (середній вік - (5,98 ± 1,66) місяців). Дослідили скарги, анамнестичні дані, клінічні прояви рахіту та проаналізували графіки фізичного розвитку згідно діючого протоколу. У ході дослідження встановлено, що серед обстежених 121 дитина ((42,61 ± 2,93) %; 95% СІ: 36,82 - 48,6 %) мали показники фізичного розвитку, які перевищували вікову норму (співвідношення маси тіла до віку, маси тіла до зросту та ІМТ до віку). Серед них ожиріння було зафіксовано у 34 дітей ((28,1 ± 4,09) %, Se = 92 %), надмірна маса тіла - у 39 пацієнтів ((32,23 ± 4,25) %), ризик надмірної маси тіла - у 48 дітей ((39,67 ± 4,45) %). Таким чином, серед дітей першого року життя, яким встановлений діагноз рахіт, більше третини обстежених пацієнтів мали показники фізичного розвитку, що перевищували вікову норму.

Другий етап базувався на визначенні мети та завдань, об'єкту та предмету досліджень, обґрунтуванні методів та обсягу дослідження.

Третій етап роботи передбачав клініко-анамнестичну характеристику дітей, хворих на вітамін D-дефіцитний рахіт, оцінку фізичного розвитку та проведення загальноприйнятих та спеціальних біохімічних та генетичних досліджень.

Для досягнення мети та вирішення поставлених завдань дослідження проведено комплексне клінічне та лабораторне обстеження 150 дітей віком від 3 до 12 місяців (середній вік - (5,43 ± 1,4) місяців).

Основну групу досліджуваних (n=90) склали діти, які мали ознаки вітамін D-дефіцитного рахіту та згідно графіків діючого протоколу показники фізичного розвитку (маса тіла для даного віку, співвідношення маси тіла до зросту, ІМТ для даного віку), які перевищували вікову норму.

Для встановлення діагнозу вітамін D-дефіцитного рахіту використовували клініко-анамнестичні дані та результати лабораторного дослідження. Діагноз та визначення ступеня тяжкості захворювання у дітей формулювали відповідно до МКХ-10, клас ІV «Хвороби ендокринної системи, розлади харчування та порушення обміну речовин», шифр Е 55.0 та Наказу МОЗ України № 9 від 10.01.2005 року «Про затвердження Протоколів надання медичної допомоги дітям» (Протокол лікування та профілактики рахіту у дітей ).

Основну групу дітей було розподілено на 3 підгрупи: підгрупу І (n=30) становили діти з вітамін D-дефіцитним рахітом та ризиком надмірної маси тіла; підгрупу ІІ (n=30) склали діти з вітамін D-дефіцитним рахітом та надмірною масою тіла; підгрупу ІІІ (n=30) склали діти з вітамін D-дефіцитним рахітом та ожирінням.

Критерії включення дитини до основної групи: вік від 3 до 12 місяців, наявність клінічних ознак вітамін D-дефіцитного рахіту, показники фізичного розвитку, які перевищували вікову норму.

Критерії виключення дитини з дослідження: недоношеність; вроджені вади розвитку органів та систем; важкі перинатальні враження центральної нервової системи; синдром мальабсорбції; хвороби обміну речовин; захворювання, що супроводжуються D-резистентним рахітом; період року - з червня по вересень; небажання матері приймати участь у дослідженні.

Групу порівняння (n=30) становили діти з вітамін D-дефіцитним рахітом та показниками фізичного розвитку, які перебували в межах ліній стандартного відхилення, що відповідали віковій нормі.

До контрольної групи (n=30) ввійшли практично здорові діти.

У дослідження були включені діти від одноплідної вагітності, матері яких не мали хронічних захворювань, котрі з урахуванням патогенезу могли спричинити порушення фосфорно-кальцієвого метаболізму у дітей.

Для формування вибірки обрано метод рандомізації та описовий тип дослідження. Рандомізацію проводили блоком по 4 дитини для того, щоб досягти рівномірного розподілу хворих у підгрупах.

2.1 Клінічна характеристика обстежених дітей

Діти, які ввійшли до обстеження, були проаналізовані за віком. Кількісний склад дітей основної групи залежно від віку представлений у таблиці 2.1.

Таблиця 2.1 - Кількісний склад дітей основної групи залежно від віку

Вік (міс.)	Всього (n = 90)	І підгрупа (n = 30)	ІІ підгрупа (n = 30)	ІІІ підгрупа (n = 30)
	Абс.	Р ± m,%	Абс.	Р ± m,%	Абс.	Р ± m,%	Абс.	Р ± m,%
3-6	54	60,00 ± 4,97	18	60,00 ± 8,94	17	56,67 ± 9,05	19	63,33 ± 8,80
6-12	36	40,00 ± 4,97	12	40,00 ± 8,94	13	43,33 ± 9,05	11	36,67 ± 8,80

В основній групі за віком домінували діти від 3 до 6 місяців (54 особи (60,00 ± 4,97) %). Середній вік дітей основної групи становив (5,1 ± 1,2) місяці.

У групі порівняння переважали діти віком від 3 до 6 місяців (18 осіб (60,00 ± 8,94) %) порівняно з частотою дітей другого півріччя (12 осіб (40,00 ± 8,94) %). Середній вік дітей групи порівняння склав (4,8 ± 1,1) місяці.

Домінування даного віку серед хворих на вітамін D-дефіцитний рахіт можна пояснити тим, що маніфестація та період розпалу вказаного захворювання характерні здебільшого для дітей першого півріччя [10].

Порівняльна характеристика кількісного складу обстежених дітей засвідчила про відповідність між відносними величинами та їх похибками в групах дослідження. Ці дані вказують на однорідність хворих в основній групі та групі порівняння стосовно вищезазначеного критерію.

Серед дітей основної групи було 54 хлопчика (60,00 ± 4,97) % та 36 дівчаток (40,00 ± 4,97) % (табл. 2.2).

Таблиця 2.2 - Кількісний склад дітей основної групи залежно від статі

Стать	Всього (n = 90)	І підгрупа (n = 30)	ІІ підгрупа (n = 30)	ІІІ підгрупа (n = 30)
	Абс.	Р ± m, %	Абс.	Р ± m, %	Абс.	Р ± m, %	Абс.	Р ± m, %
Хлопчики	54	60,00 ± 4,97	16	53,33 ± 9,11	19	63,33 ± 8,8	19	63,33 ± 8,8
Дівчатка	36	40,00 ± 4,97	14	46,67 ± 9,11	11	36,67 ± 8,8	11	36,67 ± 8,8

У групі порівняння також переважали хлопчики - 16 осіб (53,33 ± 9,11) % порівняно з питомою вагою дівчаток - 14 осіб (46,67 ± 9,11) %. Таким чином, групи були рeпрeзeнтативними за гендерними особливостями дітей.

Проведений аналіз дітей основної групи в залежності від їх місця проживання показав, що більшість - 68 дітей (75,55 ± 4,53) % проживали в сільській місцевості, тоді як інші 22 дитини (24,45 ± 4,53) % були мешканцями міста (табл. 2.3).

Таблиця 2.3 - Кількісний склад обстежених дітей основної групи залежно від місця проживання

Місце проживання	Всього (n = 90)	І підгрупа (n = 30)	ІІ підгрупа (n = 30)	ІІІ підгрупа (n = 30)
	Абс.	Р ± m, %	Абс.	Р ± m, %	Абс.	Р ± m, %	Абс.	Р ± m, %
Село	68	75,55± 4,53	24	80,00± 7,30	21	70,00± 8,37	23	76,67± 7,72
Місто	22	24,45 ± 4,53	6	20,00± 7,30	9	30,00 ± 8,37	7	23,33 ± 7,72

Як свідчать отримані дані, в групі порівняння більшу частку також становили діти (20 осіб (66,67 ± 8,61) %), які проживали в сільській місцевості, тоді як лише третина (10 пацієнтів (33,33 ± 8,61) %) були мешканцями міста. З даних випливає, що групи обстеження були репрезентативними за місцем проживання.

Характеристика захворювань, з якими діти перебували на стаціонарному лікуванні, наведена у таблиці 2.4.

Таблиця 2.4 - Характеристика захворювань, з якими діти основної групи перебували на стаціонарному лікуванні

Патологія	Всього (n = 90)
	Абс.	Р ± m, %
Пневмонія гостра	26	28,88 ± 4,78
Гострий обструктивний бронхіт	31	34,44 ± 5,01
Гострий бронхіоліт	5	5,55 ± 2,41
Гострий стенозуючий ларинготрахеїт	2	2,22 ± 1,55
Вірусна інфекція неуточненої етіології	23	25,55 ± 4,60
Середній гнійний отит	1	1,11 ± 1,11
Спазмофілія	2	2,22 ± 1,55

Проведений аналіз захворювань, з якими діти перебували на стаціонарному лікуванні, показав, що у дітей обох груп переважала гостра патологія органів дихання - 117 випадків (97,50 ± 1,43) %. Так, в основній групі дана патологія була зареєстрована у 87 дітей (96,67 ± 1,89) %, тоді як в групі порівняння частота гострих захворювань дихальної системи склала 100 %.

В групі порівняння 11 дітей (36,40 ± 8,80) % мали пневмонію, у третини - 10 дітей (33,33 ± 8,61) % - вірусна інфекція неуточненої етіології, у 7 дітей (23,33 ± 7,72) % діагностовано гострий обструктивний бронхіт, у 2 (6,66 ± 4,55) % - гострий бронхіоліт і у 1 дитини (3,33 ± 3,28) % - гострий стенозуючий ларинготрахеїт.

У структурі супутньої патології переважали функціональні гастроінтестинальні розлади, які були виявлені у 14 дітей (15,55 ± 3,82) % основної групи та у 5 дітей (16,67 ± 6,80) % групи порівняння (табл. 2.5).



Таблиця 2.5 - Характеристика супутньої патології у обстежених дітей

Патологія	Основна група (n = 90)
	Абс.	Р ± m,%
Функціональні гастроінтестинальні розлади	14	15,55 ± 3,82
Атопічний дерматит	9	10,00 ± 3,16
Малі серцеві аномалії	7	7,78 ± 2,82
Дисплазія кульшових суглобів	2	2,22 ± 1,55

Прояви атопічного дерматиту спостерігались у 9 дітей (10,00 ± 3,16) % основної групи та у 2 дітей (6,67 ± 4,55) % групи порівняння. Дещо меншою була кількість дітей з малими серцевими аномаліями (відкритий овальний отвір, аномалія прикріплення хорди) - відповідно у 7 дітей (7,78 ± 2,82) % основної групи та у 3 дітей (10,00 ± 5,48) % групи порівняння. Дисплазія кульшових суглобів спостерігалася у 2 дітей (2,22 ± 1,55) % основної групи та у 1 дитини (3,33 ± 3,28) % групи порівняння.

Серед фонових захворювань залізодефіцитна анемія (І та ІІ ступеня) реєструвалася у 18 дітей (20,00 ± 4,22) % основної групи та у 4 дітей (13,33 ± 6,21) % групи порівняння. Таким чином, групи дітей, хворих на вітамін D-дефіцитний рахіт, були репрезентативними за соматичним статусом.

У подальшому нами вивчено особливості акушерського анамнезу.

Характеристика дітей основної групи за гестаційним віком, масою та довжиною тіла при народженні відображена в таблиці 2.6.

Таблиця 2.6 - Характеристика дітей основної групи за гестаційним віком, масою та довжиною тіла при народженні М ± m

Параметри	Всього (n = 90)	І підгрупа (n = 30)	ІІ підгрупа (n = 30)	ІІІ підгрупа (n = 30)
Гестаційний вік, тижні	39,27 ± 0,07	39,18 ± 0,20	39,34 ± 0,17	39,11 ± 0,16
Маса тіла, г	3682,20 ± 36,55	3446,12 ± 40,10	3618,53± 33,31	3699,21± 37,90
Довжина тіла, см	52,20 ± 0,32	51,60 ± 0,53	51,44 ± 0,41	52,38 ± 0,50

Гестаційний вік дітей в групах обстеження відповідав ознакам доношеності і становив від 37 тижнів до 42 тижнів, маса тіла при народженні знаходилася в діапазоні від 2830 г до 4500 г, довжина тіла дорівнювала значенням від 47 см до 55 см. Так, за даними нашого дослідження, середній гестаційний вік дітей основної групи становив (39,27 ± 0,07) тижнів, у пацієнтів групи порівняння - (39,32 ± 0,19) тижнів.

Аналіз антропометричних показників дітей основної групи при народженні показав, що маса тіла в середньому коливалась у межах (3682,20 ± 36,55) г, в групі порівняння даний показник становив (3465,11 ± 31,60) г.

Середні показники довжини тіла при народженні у дітей основної групи дорівнювали (52,2 ± 0,32) см, тоді як в групі порівняння вони відповідали значенням (50,6 ± 0,24) см.

Контингент матерів в групах обстежених дітей вивчено за віковими характеристиками, акушерським анамнезом, перебігом періоду вагітності та пологів, соціальним статусом.

Аналіз віку матерів обстежених дітей показав, що він коливався від 18 до 40 років. Середній вік матерів дітей основної групи становив (27,1 ± 3,3) років, групи порівняння - (28,8 ± 5,1) років.

Кількість дітей, народжених від перших пологів, склала 5 (57,77 ± 5,21) % в основній групі та 18 дітей (60,00 ± 8,94)% - в групі порівняння. Повторні пологи спостерігались відповідно: в 38 жінок (42,23 ± 5,21) % та 12 жінок (40,00 ± 8,94) %. Оперативне пологове вирішення шляхом кесарського розтину проводилося у 19жінок (21,11 ± 4,3) % основної групи та у 5 жінок (16,67 ± 6,8)% групи порівняння. Гестоз І половини вагітності відмічався у 41 жінки (45,55 ± 5,25) % основної групи та у 13 жінок (43,33 ± 9,05) % групи порівняння. Гестоз легкого ступеня тяжкості ІІ половини вагітності спостерігався відповідно до груп дослідження у 23 (25,55 ± 4,6) % та у 7 (23,33 ± 7,72) % жінок. Загроза переривання вагітності у досліджуваних групах зустрічалась у 18 матерів (20,00 ± 4,22) % та у 8 матерів (26,67 ± 8,07) %, відповідно. Таким чином, по акушерському анамнезу досліджувані групи виявилися репрезентативними.

В основній групі вищу освіту мали 27 жінок (30,00 ± 4,83) %, середню професійну освіту - 44 жінок (48,89 ± 5,27) % і середню освіту - 19 жінок (21,11 ± 4,31) %. У групі порівняння вищу освіту мали 10 матерів (33,33 ± 8,61) %, середню професійну освіту - 13 матерів (43,33 ± 9,05) %, середню освіту - 7 матерів (23,33 ± 7,72) %.

Узагальнюючи представлений матеріал, важливо відмітити, що групи дослідження, які включали дітей та їх матерів, були репрезентативними за основними віковими, гендерними, соціальними характеристиками, акушерським анамнезом, соматичними статусом та супутньою патологією.

При формуванні контрольної групи з метою однорідності вибірки відносно інших груп дослідження були враховані вікові характеристики, гендерні особливості, місце їх проживання (табл. 2.7).

Таблиця 2.7 - Кількісний склад дітей контрольної групи залежно від віку, статі та місця проживання

Показник	Абс.	Р ± m,%
Вік, місяці	3 - 6	20	66,67 ± 8,61
	6 - 12	10	33,33 ± 8,61
Стать	хлопчики	19	63,33 ± 8,80
	дівчатка	11	36,67 ± 8,80
Місце проживання	село	17	56,66 ± 9,05
	місто	13	43,37 ± 9,05

В контрольній групі кількість дітей першого півріччя склала 20 обстежених (66,67 ± 8,61) %, а дітей другого півріччя - 10 (33,33 ± 8,61) %. Середній вік дітей становив (6,4 ± 1,7) місяців.

Оцінка статевої приналежності показала, що серед дітей контрольної групи було 19 хлопчиків (63,33 ± 8,80) % та 11 дівчаток (36,67 ± 8,80) %.

Проведений аналіз дітей контрольної групи залежно від їх місця проживання показав, що більшість дітей (17 осіб (56,66 ± 9,05) %) проживали в сільській місцевості, тоді як інші (13 дітей (43,37 ± 9,05) %) були мешканцями міста.

Характеристика дітей контрольної групи за гестаційним віком, масою та довжиною тіла при народженні відображена в таблиці 2.8.

Таблиця 2.8 - Характеристика дітей контрольної групи за гестаційним віком, масою та довжиною тіла при народженні

Параметри	М ± m	Міn-mаx
Гестаційний вік, тижні	39,32 ± 0,11	38 - 41
Маса тіла при народженні, г	3348,11 ± 33,55	2950 - 4100
Довжина тіла при народженні, см	51,25 ± 0,22	47 - 55

Середній гестаційний вік дітей контрольної групи становив (39,32 ± 0,11) тижнів. Проведений аналіз антропометричних показників дітей контрольної групи при народженні показав, що маса тіла коливалась у межах (3348,11 ± 33,55) г. Середні показники довжини тіла при народженні становили (51,25 ± 0,22) см.

Аналіз віку матерів обстежених дітей контрольної групи показав, що середні його показники становили (24,2 ± 3,5) років.

Кількість дітей, народжених від перших пологів, склала 20 осіб ((66,67 ± 8,61) %), тоді як повторні пологи спостерігались у 10 матерів ((33,33 ± 8,61) %).

Оперативне пологове вирішення шляхом кесарського розтину проводилося у 6 жінок ((20,0 ± 7,3) %) контрольної групи. Гестоз І половини вагітності відмічався у 12 жінок ((40,00 ± 8,94) %) групи контролю. Гестоз ІІ половини вагітності спостерігався у 5 жінок ((16,67 ± 6,80) %). Загроза переривання вагітності зустрічалась у 6 матерів ((20,00 ± 7,31) %).

В групі контролю вищу освіту мали 11 жінок (36,66 ± 8,8) %, середню професійну освіту - 14 жінок ((46,67 ± 9,11) %) і середню освіту - 5 осіб ((16,67 ± 6,8) %).

Таким чином, вибірка дітей контрольної групи була репрезентативною за віковими характеристиками, гендерними особливостями, місцем проживання, акушерським анамнезом та соціальним статусом відносно основної групи.

2.2 Методи дослідження

Методологія дослідження запланована згідно з вимогами доказової медицини, виходячи з сучасних принципів наукового пізнання та організована відповідно до поставленої мети.

Для виконання поставлених завдань застосовано наступні методи дослідження:

1. Клініко-анамнестичне обстеження.

2. Лабораторні: загальноклінічні (загальний аналіз крові, загальний аналіз сечі), біохімічні показники (25(ОН)D, остеокальцин, загальний кальцій, іонізований кальцій, неорганічний фосфор, загальна лужна фосфатаза, показники ліпідного обміну - загальний холестерин (ЗХС), тригліцериди (ТГ), холестерин ліпопротеїдів високої щільності (ХС ЛПВЩ), холестерин ліпопротеїдів низької щільності (ХС ЛПНЩ), холестерин ліпопротеїдів дуже низької щільності (ХС ЛПДНЩ) та коефіцієнт атерогенності (КА).

3. Генетичне обстеження - вивчення однонуклеотидного поліморфізму Bsm І гену VDR, що кодує рецептори вітаміну D.

4. Методи варіаційної статистики з визначенням вірогідності безпомилкового прогнозу.

Збір анамнезу було здійснено шляхом опитування батьків та аналізу амбулаторних карт дітей з фіксуванням отриманих даних в карти обстеження пацієнтів.

Оцінку стану здоров'я дітей проводили за допомогою методів клінічного обстеження, яке включало оцінку фізичного розвитку, загально-соматичного статусу, нервово-психічного розвитку з метою виявлення у пацієнтів симптомів вітамін D-дефіцитного рахіту та ризику надмірної маси тіла, надмірної маси тіла чи ожиріння.

Верифікацію клінічного діагнозу вітамін D-дефіцитного рахіту проводили відповідно до протоколу зі спеціальності «Педіатрія» (Наказ МОЗ України № 9 від 10.01.2005 р.).

Визначення вмісту гідроксивітаміну D у сироватці крові

Принцип методу. Для визначення концентрації 25(ОH)D в сироватці крові використано кількісний електрохемілюменісцентний метод за допомогою апарату Elecsys (Rоche Dіаgnоstіcs, Німеччина) тест-системами Cоbаs у відповідності до інструкції фірми-виробника. Вибір тест-системи зумовлений тим, що вона не виявляє неактивну форму, а саме 3-емпір 25(ОН)D, який за результатами сучасних досліджень визначається в крові дітей віком до 1 року. Отже, даний аспект являється важливим для отримання достовірних результатів рівня 25(ОН)D у сироватці крові у когорті дітей даної вікової групи.

Кров для дослідження забирали у стерильні пробірки. Сироватку крові отримували центрифугуванням упродовж 15 хвилин при 2000 g, аліквоти сироватки відбирали в мікропробірки Eррendоrf і зберігали при t (- 20 ^оС) до проведення дослідження.

Методика електрохемілюменісцентного імуноаналізу (ЕХЛА).

У результаті першої інкубації зразка (15 мкл) реагентом для попередньої обробки зв'язаний 25-гідроксивітамін D виділено із вітамін D-зв'язуючого білка. У результаті другої інкубації попередньо обробленого зразка поміченим рутенієм вітаміном D-зв'язуючим білком, утворено комплекс між 25-гідроксивітаміном D і рутенілірованим вітамін D-зв'язуючим білком. Третя інкубація: після додавання мікрочастинок, покритих стрептавідином, і 25-гідроксивітаміна D, міченого біотином, було утворено комплекс із вітамін D-зв'язуючого білка, міченого рутенієм, і біотинілірованого 25-гідроксивітаміна D. Реактивну суміш аспірували у вимірювальну чашку, де мікрочастинки магнітно захопилися на поверхню електрода. Після цього незв'язані речовини видалено за допомогою РrоCell. Застосування напруги на електрод викликало хемолюмінесцентну емісію, яку виміряли за допомогою фотоелектронного помножувача. Результати визначали через калібрувальну криву, яку специфічно для інструменту будували шляхом 2 - етапного калібрування і головною кривою, наданою через штрих-код реагенту.

Оцінку статусу вітаміну D в організмі дитини здійснювали згідно з класифікацією, затвердженою експертами Міжнародного ендокринологічного товариства. Відповідно до аспектів зазначеної класифікації, інтерпретація результатів дослідження концентрації сироваткового гідроксивітаміна D проводилася незалежно від віку дитини. Дефіцит вітаміну D діагностувався при концентрації сироваткового 25(ОН)D нижче 20 нг / мл, рівень 25(ОН)D від 21 нг / мл до 29 нг / мл розглядався як індикатор відносної недостатності вітаміну D, а концентрація 30 нг / мл і вище - як достатня (тобто, близька до нормального).

Визначення вмісту остеокальцину в сироватці крові

Принцип методу. Для визначення концентрації остеокальцину в сироватці крові використано кількісний електрохемілюменісцентний метод за допомогою апарату Elecsys (Rоche Dіаgnоstіcs, Німеччина) тест-системами Cоbаs у відповідності до інструкції фірми-виробника.

Кров для дослідження забирали у стерильні пробірки. Сироватку крові отримували центрифугуванням упродовж 15 хвилин при 2000 g, аліквоти сироватки відбирали в мікропробірки Eррendоrf і зберігали при t (- 20 ^оС) до проведення дослідження.

Методика ЕХЛА. В основі визначення даного кісткового маркеру є принцип електрохемілюмінесценціі з використанням специфічних моноклональних антитіл з системою стрептавідин-біотин. Ці антитіла розпізнають специфічні ділянки N-MІD і N-кінцевого фрагмента остеокальцину В якості мітки у всіх тест-системах застосовується рутенієвий комплекс: трис (2,2 біпіріділ-рутеній (ІІ). Концентрацію останніх вимірювали за хемілюмінесценцією рутенію, яким мічені антитіла.

Визначення показників ліпідного профілю в сироватці крові

Визначення вмісту ЗХС та ТГ у сироватці крові проводили колориметричним ферментним аналізом із контрольною сироваткою фірми Rосhe на автоматичному біохімічному аналізаторі Cоbаs Іntegrа 400 Рlus.

Для визначення ХС ЛПВЩ використовували пероксидазний колориметричний ферментний метод з набором Chоlesterоl (Rосhe Dіаgnоstіcs, Швейцарія; Humаn, Німеччина).

ХС ЛПНЩ в ммоль/л вираховували за формуло (2.2.1):

ХС ЛПНЩ = ЗХС - ХС ЛПВЩ - ТГ/2,18 (2.2.1)

де ЗХС - загальний холестерин, ммоль/л;

ХС ЛПВЩ - холестерин ліпопротеїдів високої щільності, ммоль/л;

ТГ-тригліцериди,ммоль/л.

ХС ЛПДНЩ в ммоль/лпідраховували за формулою (2.2.2):

ХС ЛПДНЩ = ТГ/2,18 (2.2.2)

де ТГ-тригліцериди,ммоль/л.

КА в О розраховували за формулою (2.2.3) А.М. Климова (1977 р.):

КА = (ЗХС - ХСЛПВЩ) / ХС ЛПВЩ (2.2.3)

де ЗХС- загальний холестерин, ммоль/л;

ХС ЛПВЩ - холестерин ліпопротеїдів високої щільності, ммоль/л.

Для генотипування венозну кров набирали в стерильних умовах в пробірки-вакутейнери з калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTА) (11,7 мМ) як антикоагулянта, виробництва «Sаrstedt» (Німеччина).

Забір крові для досліджень проводився кваліфікованими спеціалістами в клінічних умовах із дотриманням усіх правил медичної асептики та антисептики.

Матеріал для дослідження заморожували і зберігали при температурі (- 20°С). Для проведення генетичного аналізу із венозної крові обстежуваних осіб за допомогою стандартного фенолхлороформного методу було виділено ДНК. Поліморфні варіанти гена VDR - rs1544410 (Bsm І, А/G trаnsіtіоn), який знаходиться в інтроні 8,визначали методом ПЛР-RLFР (Restrіcted Length Frаgment Роlymоrрhіsm), який забезпечує виявлення точкових мутацій за допомогою специфічних ендонуклеаз.

Ампліфікацію ділянки гена, що містить сайт Bsm І поліморфізму, проводили за допомогою пари специфічних праймерів: прямого (sence) - 5`-АGGGАGАCGTАGCАА ААGGАG-3` і зворотного (аntіsense) - 5`-TGTCCCCААGGTCАCААT ААC-3`.

Праймери було синтезовано фірмою “Metаbіоn” (Німеччина). РCR проводили в термоциклері GeneАmр РCR System 2700 ("Аррlіed Bіоsystems", США).

Після проведення ПЛР до зразків додавали специфічні ендонуклеази Bsm І, суміш інкубували при температурі (37 °С) протягом 2 год. Якщо в 58980 позиції гена VDR містився гуанін, ампліфікат, який складався з 425 пар основ, розщеплювався рестриктазою Bsm І на два фрагменти - 232 і 193 пари основ.

У разі заміни гуаніну на аденін сайт рестрикції для Bsm І втрачався і утворювався один фрагмент розміром 425 пар основ.

Ампліфікати вивченого фрагмента гена VDR після рестрикції розділяли в 2,5 % агарозному гелі, що містив бромистий етидій. Горизонтальний електрофорез (0,1А; 140V) проводили протягом 40 хв. Візуалізацію ДНК після електрофорезу здійснювали за допомогою трансілюмінатора ("Біоком", Росія).

Про наявність або відсутність точкової мутації судили за наявністю або відсутністю розрізання продукту ампліфікації. Після аналізу зразки класифікували як ВВ, Bb або bb (великі літери представляють відсутність, маленькі - наявність місць рестрикції для ендонуклеази Bsm І).