Основы генетики

Стадия преследования - если самка движется, самец передвигается вслед за ней. Периодически самец отставляет в сторону то одно крыло то другое, готовясь к выполнению следующей стадии.

Стадия вибрации - отставив в сторону одно крыло и вибрируя им, самец исполняет «песню любви», которая представляет собой звуковые колебания с определённым видоспецифическим ритмом. Выделяют следующие основные характеристики «песни» самца дрозофилы:

§ цепь пульсов (вся последовательность событий от момента начала вибрации до её завершения);

§ пульс (единичный акт вибрации);

§ количество циклов в пульсе;

§ количество пульсов в цепи в зависимости от вида;

§ пауза (время от момента завершения предыдущего пульса до начала следующего);

§ межпульсовый интервал (время от момента начала анализируемого пульса до начала последующего).

На рисунке приведен пример осциллограммы «песни» самца Drosophila montana с обозначениями ее основных характеристик.

Рис. 6.1. Осциллограмма «песни» самца Drosophila Montana

(I - цепь пульсов; 2 - пульс; 3 - количество пульсов в цепи; 4 - пауза; 5 - межпульсовый интервал)

Период «песни» самцов дикого типа D. melanogaster составляет около 55 -60 мс, при этом самец генерирует 25-30 пульсов в секунду, продолжительность одного пульса составляет 20 - 30 мс, а межпульсового интервала - 30 - 40 мс. Известно также, что пульс «песни» самца данного вида состоит из единственного цикла. Показано, что именно стадия вибрации является ключевой в репертуаре ухаживания дрозофилы. Есть лишь один вид (D. obscura), самцы которого не исполняют «песню».

Стадия лизания - самец лижет гениталии самки. При этом самец передаёт самке тактильную информацию и получает химические сигналы, свидетельствующие о степени половой зрелости партнёрши, т.е. о готовности или не готовности её к вступлению в спаривание.

Стадия копуляции - на этой стадии происходит половой контакт самца и самки. Самец делает попытку вступить в копуляцию сразу же после стадии лизания. Если эта попытка оказывается неудачной, он может на некоторое время приостановить ухаживание. Когда самец возобновляет ухаживание, то чаще всего он возвращается к стадии ориентации, преследования или вибрации (но никогда к стадии прикосновения или лизания) и выполняет всю последовательность действий вновь. Такая серия действий репертуара ухаживания оказывается успешной приблизительно в 90 % случаев лабораторных наблюдения за мухами дикого типа. Успешно выполненное ухаживание всегда заканчивается копуляцией. Продолжительность копуляции является видоспецифическим признаком (для D. melanogaster продолжительность копуляции составляет приблизительно 20 мин).

На рисунке показана последовательность стадий репертуара ухаживания D. Melanogaster.



Стадия ориентации Стадия прикосновения Стадия преследования

Стадия вибрации Стадия лизания Стадия копуляции

Рис.6.2. Стадии репертуара ухаживания D. Melanogaster.

Активная роль в процессе ухаживания принадлежит самцу. Действия самки на первый взгляд не видны наблюдателю. Фактически, самке дрозофилы нет необходимости предпринимать что-либо для привлечения самца к осуществлению ухаживания. Экспериментально показано, что самцы D. melanogaster ухаживают даже за наркотизированными самками. Однако самки не являются полностью пассивными. Даже принципиально рецептивные самки иногда демонстрируют элементы поведения отказа (хотя и выраженные не так ярко как у оплодотворённых самок), что, как считают, является проявлением «застенчивости» («female coyness»).

О готовности самки к спариванию свидетельствует снижение её локомоторной активности, что делает её более доступным объектом для попыток ухаживания и осуществления копуляции со стороны самца. Кроме того, для успешного акта копуляции необходимо, чтобы самка приняла определенную позу и четко скоординировала действия своих внешних гениталий. В случае если самка D. melanogaster не восприимчива к ухаживанию самца, например, вследствие недавнего вступления в копуляцию, демонстрация поведения отказа становится более выраженной: оплодотворённая самка выталкивает яйцеклад в сторону ухаживающего за ней самца. Такие действия блокируют большинство попыток копуляции.

Есть еще один способ, при помощи которого оплодотворённая (или по иным причинам нерецептивная самка) может блокировать попытки ухаживания со стороны самца. В ответ на «песню» самца нерецептивная самка генерирует свою «песню», которая представляет собой характерное жужжание с частотой около 300 циклов в секунду. В отличие от видоспецифической «песни» самца, звук, издаваемый самками, одинаков для особей всех видов рода Drosophila.

Одним из последствий спаривания является изменение химического профиля самки. Известно, что виргинные самки D. melanogaster в качестве феромонов экскретируют диеновые углеводороды, несколько нанограмм смеси которых стимулируют предкопуляционное поведение самцов данного вида. После того как происходит оплодотворение, экскреция феромонов у самки прекращается и начинается выработка антиафродизиаков - веществ с противоположным эффектом.

Самцы D. melanogaster также продуцируют феромоны, которые представляют собой моноеновые углеводороды. Эти вещества предотвращают попытки ухаживания со стороны других самцов и могут, кроме того, оказывать стимулирующее действие на самок.

Таким образом, половое поведение D. melanogaster состоит из репертуара ухаживания, который в свою очередь подразделён на ряд стадий, и копуляции. Практически для всех видов рода Drosophila оба эти процесса детально описаны и хорошо изучены с этологической точки зрения, что делает признаки полового поведения удобными для проведения генетического анализа.

Изучение наследственных различий признаков поведения обычно ограничивается проверкой модели аутосомной аддитивности и доминантности, т.е. анализом признаков у нескольких родительских линий, гибридов первого и второго поколений от реципрокных скрещиваний между ними и потомков всевозможных возвратных скрещиваний, не смотря на то, что поведенческий признак может иметь весьма сложную генетическую основу. Могут иметь место неаутосомные эффекты как следствие влияния половых хромосом или эпистатического либо какого-нибудь другого взаимодействия функционально связанных локусов. Кроме того, существуют нехромосомные и цитоплазматические факторы, которые передаются от материнского организма потомству.

Выделяют два типа цитоплазматических компонентов, наследование которых происходит по материнской линии: константные (первичные) цитоплазматические факторы (все внехромосомные компоненты яйца, существующие на протяжении всей жизни и передающиеся из поколения в поколение), например, митохондриальная ДНК, и транзитные материнские факторы (внехромосомные компоненты яйца, передающиеся только потомкам первого поколения) - продукты активности материнских генов и питательные вещества. Примеры всех типов наследования были описаны для поведенческих признаков Drosophila, в том числе и для компонентов полового поведения.

Модель наследования видоспецифических различий некоторых характеристик «песни» была исследована у гибридов D. virilis и D. littoralis. При помощи сегрегационного анализа установили, что различия таких характеристик как продолжительность паузы и пульса опредеяются X-хромосомными генами, локализованными у проксимального её конца.

Тем не менее, существуют и определённые аутосомные факторы, участвующие в контроле указанных признаков. Самок D. virilis скрещивали с самцами некоторых видов группы virilis с целью изучить взаимодействие X-сцепленных и аутосомных генов, влияющих на видовые различия «песни». Было выявлено, что Х-хромосомные (материнские) факторы D. virilis препятствуют изменениям длительности звукового пульса, не смотря на гетероспецифичность аутосомных генов «песни»].

С другой стороны, гены, ответственные за видоспецифичность различий количества пульсов в одном акте вибрации у D. virilis и D. lummei распределены по всем аутосомам, но отсутствуют в Х-хромосоме.

При исследовании примерно 40 лабораторных линий D. virilis в разных странах выявили значительную межлинейную и географическую вариабельность характеристик «песни» самцов. Так, наиболее высокие коэффициенты вариации характерны для таких признаков как количество пульсов и продолжительность одной цепи пульсов (15,5% и 16,1% соответственно). Путём сравнения потомков от различных скрещиваний было также выявлено существенное влияние Y-хромосомы и взаимодействия Y-хромосомы с другими факторами на разнообразие фенотипического проявления упомянутых признаков. Интересно, что направление действия Y-сцепленных генов абсолютно противоположно направлению влияния аутосомных факторов. Помимо упомянутого исследования, известно лишь несколько работ, в которых была выявлена статистически достоверная связь между генами Y-хромосомы и поведением. Так, показано, что нормальные XY самцы D. melanogaster имеют более высокую половую активность по сравнению с самцами, у которых изменено количество Y-хромосом (ХО и XYY). Не смотря на то, что Y-хромосома несёт ряд генов, определяющих фертильнось самцов D. melanogaster, не известно, содержит ли она гены, прямо влияющие на половое поведение нормальных (с точки зрения хромосомного набора) самцов. В исследованиях, проведенных на комарах Anopheles, установлено, что именно Y-хромосома полностью контролирует связанные с полётом компоненты полового поведения самцов. Для D. Melanogaster известно лишь незначительное, зависимое от генетического и цитоплазматического фона, влияние Y-хромосомы на геотаксис.

В контексте упомянутых исследований необходимо отметить обзорную работу Reinhold К., в которой на основании большого количества литературных данных, подвергнутых определённому математическому анализу, делается вывод о преимущественном контроле Х-хромосомными генами признаков, подверженных половому отбору. Тем не менее, этот вывод противоречит результатам, полученным в экспериментах по отбору на низкую и высокую половую активность самцов D. melanogaster, которые свидетельствуют о преимущественном контроле этого признака генами хромосомы-2. По данным же QTL-анализа было выявлено пять локусов количественных признаков, участвующих в контроле таких признаков полового поведения как «частота инициации ухаживания», «задержка ухаживания», «вступление в копуляцию» и «задержка копуляции», причём в данном случае три из них локализованы в хромосоме-3. Кроме того, для выявления генов, которые, так или иначе, контролируют признаки полового поведения Drosophila, широко используются линии с единичными генными мутациями.

В базе данных проекта «Геном дрозофилы» есть информация о примерно 100 генах, мутации в которых прямо или косвенно (плейотропно) приводят к изменениям признаков полового поведения.

Выделяют три основные группы генетических изменений, которые обусловливают аномалии процесса ухаживания и полового поведения в целом:

· Мутации, изолированные согласно вызываемым ими дефектам полового поведения, как, например, мутация fruitless. Однако таких мутаций известно не много, и вероятной причиной этого считают малое количество исследований, посвящённых данному вопросу.

· Нейрологические мутации и мутации, приводящие к изменениям поведения вообще (включая сенсорные мутации и мутации, нарушающие способность к обучению) и сопровождающиеся, в том числе, проявлениями аномальной программы полового поведения.

· Мутации пол-определяющих генов.

В определённой степени такая классификация является условной. Ведь чаще всего, мутации, вследствие которых появляются особи с дефектным половым поведением, плейотропны.

Плейотропный эффект проявляется двояко. С одной стороны, ослабленные в целом генетические варианты будут характеризоваться изменённым репродуктивным поведением, поскольку моторные реакции, необходимые для реализации программы полового поведения чувствительны к общим метаболическим нарушениям. С другой стороны, есть мутации, которые обычно изолируются по критериям, не имеющим отношения к половому поведению, а особи-носители таких мутаций, тем не менее, демонстрируют аномальное репродуктивное поведение. С этой точки зрения практически каждая мутация с явно выраженной фенотипической аномалией при условии должного изучения может быть отнесена к группе влияющих на половое поведение.

Так, например, самцы мутантные по цвету тела (yellow и ebony) не способны правильно выполнять ритуал ухаживания. Дефекты пигментации сопровождаются нейрологическими нарушениями, которые и приводят к изменениям поведения. Аномалии полового поведения были также выявлены у так называемых «локомоторных» мутантов. Многие из этих мутантов были определены как «медленные» (hypoactive), следовательно, не удивительно, что интенсивность ухаживания у них была ниже нормы. Это справедливо также и для inactive (iav) мутантов.

Предположительной причиной аномалий поведения особей с мутацией iav являются нейротрансмиттерные нарушения.

В основном аномальное поведение является характерной чертой насекомых с нарушениями нервной системы. Так, например, мутантные самцы couch-potato (cpo), при выведении этого локуса в гомозиготу, демонстрируют впадение в ступор вместо вступления в спаривание. Известно, что этот ген может переноситься транспозоном, он кодирует продукт, обладающий РНК-связывающей активностью, который локализуется в ядре и принимает участие в развитии периферической нервной системы. Известно, что для нормальной экспрессии гена cpo в периферической нервной системе необходимым условием является функционирование генов achaete, scute и daughterless.

Независимой группой исследователей была выявлена другая транспозон-ассоциированная мутация, приводящая к изменениям репродуктивного поведения исключительно самок - spinster. Самки Drosophila с такой мутацией характеризуются сниженной половой рецептивностью и проявляют ярко выраженное «поведение отказа».

Существует две стратегии исследований, которые чаще всего применяют в генетике поведения: обратная генетика и квази-обратная генетика.

Суть первой заключается в поиске нормального аллеля или варианта его экспрессии при известной мутации. Стратегия квази-обратной генетики заключается в первоочередном исследовании нейрохимии и нейроанатомии животного, выявлении нормальных генов, контролирующих эти биологические признаки, и лишь следующим шагом является поиск мутаций в этих локусах и тестирование их на наличие влияния на компоненты поведения.

Одно из направлений квази-обратной генетики - тестирование мутантов с нарушениями мозга. Как было обнаружено, самцы с такими мутациями как minibrain и no-bridge также демонстрируют пониженную интенсивность спаривания. У некоторых из них был выявлен аномальный набор феромонов.

Среди мутаций, влияющих на половое поведение D. melanogaster, выявлены и такие, которые вызывают конкретные морфологические дефекты. Такие фенотипические аномалии соответствуют определённым критериям:

· они не являются глобальными, т.е. более специфичны;

· по своим характеристикам они чаще всего би- или три-модальны;

· как правило, они касаются генетических локусов, не способных мутировать в летальные формы.

Изучение генетических аспектов процесса ухаживания Drosophila началось с экспериментов с сенсорными мутантами. Белоглазые мухи (white), ухаживают неактивно преимущественно вследствие сниженной остроты зрения: оптомоторная реакция самцов w на движущуюся самку снижена, кроме того, стадия преследования репертуара ухаживания выражена аномально.

То, что оптомоторные реакции являются важной составляющей ритуала ухаживания, было доказано путём тестирования самцов optomotor-blind (omb), которые фактически оказались дефектными именно в процессе ухаживания, как и полностью слепые самцы с мутацией no-receptor-potential-A (norpA).

У исследователей возник вопрос: действительно ли наблюдаемые аномалии ухаживания вызваны именно нарушением зрения? Ведь локус omb является гомеозисным - его различные аллельные формы вызывают широкий спектр нейральных и других тканевых дефектов, а продукт гена norpA функционирует на определённом расстоянии от глаза. Если же этиология нарушений ухаживания у этих мутантных самцов исключительно зрительная, то при тестировании в темноте у мутантных самцов и самцов дикого типа должны наблюдаться одинаковые показатели, что и было показано для w и omb мутантов.

Экспериментально была доказана и значимость функции обоняния в процессе распознавания самец-самка. Обнаружено влияние соединений-экстрактов из самок (виргинных и вступавших в спаривание) или самцов разного возраста и установлено, что самцы способны распознавать самок по запаху, но только на таком коротком расстоянии, что разница между ольфакторным восприятием и контактной хеморецепцией (вкусовым восприятием) практически отсутствует. Однако самцы, экспрессирующие мутации smellblind или olfactory-D, демонстрируют отсутствие реакции на любой источник запаха.

Эти две мутации, вызывающие снижение чувствительности к различным одорантам, оказались аллельными. Более того, при каждой из них мутирует также локус paralytic (para), кодирующий Na+-канал.

В экспериментах на parasbl и paraolfD мутантах установили, что нарушения в ухаживании и инициации копуляции у мутантных самцов не являются критическими, ведь мутанты smellblind, при удалении крыльев, в темноте не демонстрируют полной этологически обусловленной стерильности, а задержка ухаживания таких самцов меньше, по сравнению со зрительными мутантами. Самка, гомозиготная по любому из двух para аллелей, также проявляет аномалии в ритуале ухаживания: она продолжает двигаться по тестерной камере, вследствие чего самцу сложнее довести ритуал до конца.

Среди других причин нарушения полового поведения может быть выделено изменение биологических ритмов. Известно, что мутации, нарушающие циркадный ритм D. melanogaster, как, например, period (per), влияют и на периодичность ритма «песни» самцов. Этот ген контролирует всё развитие насекомого от оплодотворения яйца до выхода имаго, ведь продукт гена per - ключевой фактор в функционировании пейсмейкерного сигнала циркадного ритма.

Влияние мутации per на период «песни», который в норме составляет 55 - 60 с., проявляется в его сокращении (perS) или удлинении (perL). Выяснено, что самцов, «песня» которых характеризуется длинным периодом (приблизительно 80 с.), лучше воспринимают самки с такой же мутацией (perL), чем самки с мутацией perS. Для особей с мутацией perS (период «песни» самцов составляет приблизительно 40 с.) справедливо аналогичное. В то же время, как perL, так и perS самки лучше всего воспринимают самцов дикого типа.

Выявлены и мутации, непосредственно влияющие на характеристики «песни» самцов D. melanogaster. Среди них cacophony, dissonance и croaker. Так, характерной чертой «песни» мутантных самцов cacophony (cac) является полицикличность пульсов, тогда как интервалы между такими полицикличными пульсами оказались значительно длиннее, по сравнению с мухами дикого типа. Каждый из модифицированных циклов содержит два и более нормальных циклов. Из 2500 протестированных линий время задержки спаривания у мутантов cac оказалось самым продолжительным.

Аналогично экспериментам в темноте со зрительными мутантами, у мутантов cac удаляли крылья и проводили сравнительные тесты с мухами дикого типа. Как оказалось, процесс инициации спаривания у мутантов cac дольше по сравнению с бескрылыми особями дикого типа. Такой результат свидетельствует о плейотропности действия упомянутой мутации.

В экспериментах на гинандроморфах показано, что мутации задержки инициации спаривания и дефекта «песни» генетически разделены. Мутации в локусе cac связаны также с аномалиями функционирования зрительной системы, ведь данная мутация аллельна мутациям night-blind-A (nbA) и l(1)L13; последняя - летальна.

Эти генетические варианты представляют собой сложную модель комплементарного взаимодействия.

Еще одна мутация - dissonance (diss) - была индуцирована путём химического мутагенеза. Она локализуется в Х-хромосоме. «Песня» diss мутантных самцов характеризуется наличием длинных пульсов высокого тона. Самцы или самки, экспрессирующие diss не обнаруживают аномалий других поведенческих реакций. Но самцы diss дефектны не только в «песне», они также характеризуются более продолжительным, по сравнению с нормальными по этому гену самцами, латентный период ухаживания, что, как предполагают, является следствием аномалий зрительной системы.

Допускают, что существует определённая нейрогенетическая связь между факторами, контролирующими стадию «песни» ухаживания и функции зрительной системы

Мутация croaker (cro) была изолирована путём исследования записей «песни». Как и два предыдущие гена, cro имеет плейотропный эффект: дефекты «песни» и снижение успешности ухаживания сопровождаются плохой способностью к полёту. Возможно, мутация нарушает всю систему полёта, а не только ту её часть, которая участвует в генерации «песни» ухаживания. Тем не менее, электрические свойства, как личиночной, так и имагинальной нервно-мышечной системы не отличаются от таковых мух дикого типа. Более того, у мутантных по этому гену особей зрительная система функционирует нормально.

Ещё одна группа мутаций, которые влияют на половое поведение Drosophila - это мутации, нарушающие способность к обучению и память.

Мутации такого типа могут быть разделены на два класса: сопровождающиеся структурными дефектами мозга и без упомянутых аномалий - условные мутации.

Из исследований так называемых структурных мозговых мутаций известны два нейроанатомических участка, которые важны для нормальной реализации условных рефлексов: грибовидные тела и центральный комплекс. Биохимические и молекулярно-генетические исследования условных мутантов показали много типов молекул, которые обеспечивают процесс обучения, среди которых наиболее важным считают цАМФ - опосредованный сигнальный путь.

Было доказано, что пять генов этого пути важны для нормального процесса обучения: amnesiac (продукт подобен пептидам-активаторам аденилат циклазы), dunce (цАМФ фосфодиэстераза), rutabaga (аденилин циклаза), DCO (протеинкиназа А) и dCREB2 (cAMP-response element binding protein).

У особей, мутантных по этим генам, наблюдаются аномальные пластические свойства синаптической передачи, поэтому не удивительно, что плейотропный эффект таких мутаций сказывается на элементах полового поведения. Ведь, именно процесс обучения обеспечивает способность самцов распознавать самок, которые уже вступали в копуляцию, т.е. различать спектры феромонов. Кроме того, самец должен «помнить», что ему не следует ухаживать за такой самкой, т.к. она блокирует большую часть попыток копуляции, снижая таким образом вероятность репродуктивного успеха конкретного самца-ухажёра.

Не менее интересна с точки зрения полового поведения мутация fruitless. Она была изолирована как мутация, влияющая на ритуал ухаживания самцов. Однако спустя некоторое время оказалось, что плейотротное действие этой мутации распространяется на целый ряд биологических процессов: развитие центральной нервной системы, детерминацию пола, развитие мышц.

Известно, что ген fru кодирует продукт с активностью фактора транскрипции РНК полимеразы II, который является ядерным компонентом, а его аминокислотная последовательность содержит BTB/POZ домен и «цинковый палец» С2Н2 типа. Цитологически этот ген был картирован в районе 91А8 - В3 правого плеча третьей хромосомы.

Наибольший интерес эта мутация вызывает именно благодаря своему влиянию на половое поведение. Для «песни» мутантных самцов характерны аномальные интервалы между пульсами. Мутация также блокирует способность самцов изгибать брюшко при попытке осуществить копуляцию, т.к. нарушает развитие специфической для мужского пола мышцы - мышцы Лоренса, которая пересекает пятый сегмент брюшка.

Самцы fru ухаживают за другими самцами, особенно за гомозиготами по такой же мутации, и стимулируют других самцов, дикого типа и fru, ухаживать за собой. Мутантные самцы вырабатывают летучие вещества отличные от таковых нормальных самцов, о чем свидетельствуют данные газовой хроматографии и анализа влияния этих соединений на поведение. Считают, что мутация не влияет на самок.

Большинство исследованных мутаций влияют на репродуктивное поведение самцов. Описаны лишь несколько генов, которые непосредственно влияют на половую рецептивность самок:

· dissatisfaction (dsf) - локализован в хромосоме 1, мутантные самки не способны воспринимать ухаживание самцов, и не вступают в копуляцию, а также не способны откладывать жизнеспособные яйца;

· disconnected (disco) - локализован в хромосоме 3, мутанты имеют дефект оптической доли мозга, у мутантных самок наблюдаются нарушения циркадных ритмов половой активности;

· icebox (ibx) - локализован в хромосоме 1, у мутантных самок снижена половая рецептивность, и некоторые другие.

Мутации пол-детерминирующих генов тоже влияют на половое поведение Drosophila. Так, например, дисфункция генов Sex-lethal (Sxl), transformer (tra) или transformer-2 (tra-2) приводит к тому, что особи с хромосомным набором характерным для женского пола по фенотипу являются самцами, и, соответственно, демонстрируют половое поведение, свойственное самцам.

Причиной изменений в поведении могут быть не только мутации, но и генетические изменения, произошедшие вследствие продолжительной селекции и доместикации Drosophila. Было выявлено, что сниженный репродуктивный успех разных мутантных линий D. melanogaster является результатом не столько активности маркерных генов, сколько следствием аккумуляции большого количества «скрытых» мутаций, которые накапливались в течение многих поколений доместикации.

Некоторые другие физиологические мутации дрозофилы

К. Гилл описал индуцированную Х-лучами в третьей хромосоме рецессивную мутацию fruity (ftу). Эта ограниченная мужским полом мутация детерминирует гомосексуальное поведение. Можно наблюдать цепочки из трех и более преследующих друг друга самцов fty даже в присутствии самок.

В. Джадд с сотрудниками получил три мутантных аллеля независимого происхождения в локусе tkо (Х-хромосома). Мутанты совпадают шоковое состояние при легком потряхивании стаканчиков уже при нормальной температуре и несколько секунд остаются неподвижными.

С. Бензер тщательно исследовал рецессивную мутацию drop-dead, которая вызывает гибель взрослых особей через 2--4 дня после выхода имаго из куколки. При этом в первый день или два все элементы поведения сохраняются нормальными. Затем внезапно активность особей падает, нарушается координация движений и вскоре наступает смерть. Вся картина синдрома развивается в течение нескольких часов. Гистологическое изучение мутантных мух с начавшимися признаками синдрома показала грубые анатомические нарушения церебрального ганглия. Дегенерация захватывает также и зрительные доли. Другие отделы центральной нервной системы остаются незатронутыми.

В лаборатории С. Бензера получена сцепленная с полом мутация dunce («тупица»). Особенность этих мутантов заключается в неспособности к выработке условных рефлексов избегания на специфический запах при подкреплении электрическим током.

Серию мутаций, обусловливающих устойчивость к таким нейротропным и психотропном веществам, как амфетамин, барбитал, бидрин, физостигмин, теофилин и пикротоксин, получил Д. Мерриам с сотрудниками. Эти мутации индуцированы с помощью ЭМС (этилметансульфонат) в линии дикого типа Canton-S. По мнению исследователей, такие мутации представляют интерес для исследования метаболизма нейромедиаторов.

6.7 Использование мозаиков для выявления структур, затронутых поведенческими мутациями

Известно, что мозаичные особи, имеющие генотипически различные части тела, представляют огромную ценность для исследования клеточной автономии, специфичности выражения генов в различных тканях, взаимодействия тканей разного генотипа и др.

В плане генетики поведения систематическое изучение мозаиков D. melanogaster началось по инициативе С. Бензера. В 1970 г. ХХ века он вместе с И. Хота опубликовал статью под названием «Генетическое рассечение нервной системы дрозофилы посредством мозаиков». В ней описано несколько способов получения мозаиков, из них наиболее эффективен метод утраты в онтогенезе дрозофилы кольцевой Х-хромосомы.

В качестве исходного материала брали гетерозиготных особей на стадии зиготы, у которых одна Х-хромосома кольцевая -- In(l)w^vC, а другая, анализируемая, несет выбранную поведенческую мутацию и цепочку рецессивных маркеров у w sn f. Можно взять и другие маркеры, затрагивающие покровы, окраску тела и глаз, форму щетинок.

Вероятность разрыва и утраты кольцевой Х-хромосомы In(l)w^vC в процессе клеточных делений очень велика и составляет от 10% до 50%. В результате этого и образуются мозаичные особи, которые содержат исходные клетки дипло-Х и возникшие в результате потери кольцевой Х-хромосомы клетки гапло-Х с единственной Х-хромосомой (анализируемой).

Чем раньше в онтогенезе произойдет разрыв и утрата Х-хромосомы In(l)w^rC, тем большее количество клеток тела мухи будет гапло-Х. Если это событие произойдет уже при первом дроблении зиготы, то образуется гинандроморф, у которого одна половина тела будет женской, с клетками дипло-Х, а другая -- мужской, с клетками гапло-Х. Участки тела с клетками гапло-Х легко узнаются по рецессивным маркерам, проявляющимся в гемизиготном состоянии.

Дробление у дрозофилы происходит по синцитиальному типу, и примерно после 12 делений ядра мигрируют к поверхности яйца, образуя бластодерму. На стадии бластодермы отдельные ее участки уже детерминированы. Из них формируются имагинальные диски в теле личинки, которые, в свою очередь, дают начало вполне определенным частям тела имаго. Отдельные участки поверхности тела (экзоскелета) и прилежащие к ним ткани с высокой вероятностью состоят из клеток одного и того же клона. Например, если левая часть переднего грудного отдела мухи имеет кутикулу желтого цвета, т. е. состоит из клеток гапло-Х, то имеются все основания полагать, что соответствующий отдел центральной нервной системы -- левая часть грудного синганглия -- также будет с высокой вероятностью образована клетками гапло-Х. Это позволяет находить так называемые фокусы -- структуры, затрагиваемые анализируемыми мутациями.

В работе, посвященной мутациям дефектов зрения, Хотта и Бензер пришли к важному выводу об автономности зрительной системы каждого глаза. При снятии ЭРГ у билатеральных гинандроморфов рецепторный потенциал нормального глаза оставался нормальным, а рецепторный потенциал мутантного глаза был аномальным. Удалось отобрать таких мозаиков, все тело которых было нормальным и только один глаз являлся мутантным, т. е. состоял из клеток гапло-Х с анализируемой мутацией в Х-хромосоме. ЭРГ, снимаемая с такого глаза, неизменно оказывалась дефектной, характерной для данной мутации.

К. Икеда и В. Каплан, пользуясь аналогичной методикой, исследовали проявление шейкер-мутации Hk^lP у 77 мозаичных особей. При этом с помощью микроэлектродной техники характеризовали электрическую активность отдельных мотонейронов. Ими убедительно доказана автономность отдельных нейронов торакального синганглия. Без получения мозаичных особей подобного принципиального результата вряд ли удалось бы достичь.

Хотта и Бензер в разных экспериментах анализировали начальные этапы ухаживания (преследование самок и вибрацию крыльев) и конечные этапы -- попытку спаривания и само спаривание. Всего ими изучено в первой части работы 477 и во второй 208 мозаичных особей с самым различным сочетанием клеток дипло-Х и гапло-Х.

В первой части работы наблюдения вели с помощью бинокулярной лупы над отдельными парами особей гинандроморфов и самкой дикого типа C-S, которых помещали под часовое стекло. Результаты исследований показали, что контроль за ориентацией мозаиков по отношению к самкам и вибрацией крыльев в качестве элемента ухаживания осуществляется церебральным ганглием. Мозаичные особи, у которых все тело, за исключением головы, было женским, тем не менее, вели себя как самцы -- преследовали самок и вибрировали крыльями.

Во второй части работ наблюдения за спариваниями проводили в приборе, включающем сразу 10 камер. Ученые обнаружили, что попытки к спариванию совершают гинандроморфы, у которых и голова, и торакс -- самцовые. Для спаривания требуется к тому же нормальное мужское строение гениталий.

В дополнительной серии экспериментов к мозаичным особям подсаживали самцов дикого типа. Наличие у мозаиков женских брюшка и гениталий провоцировало ухаживание самцов. Однако чтобы мозаичная особь вела себя как самка, ее центральная нервная система должна была оставаться женской.

Характеристики мозаиков.

Мозаики -- это сложные особи, у которых некоторые участки различных тканей могут быть мутантными, в то время как остальные имеют нормальный генотип. Это дает возможность идентифицировать ту часть, которая служит «точкой приложения» мутантного гена при формировании мутантного поведенческого фенотипа особи.

Половые мозаики (или гинандроморфы), у которых одни части тела имеют генотип самца, а другие -- самки, могут дать интересную информацию относительно организации полового поведения.

Первые работы в этом направлении относятся еще к 1932 году, когда Уайтинг изучал половое поведение паразитических ос (Habrobracon). У них различие в половом поведений не сводится, как у дрозофилы, к отсутствию у самок реакций, характерных для самцов. Наблюдая гинандроморфов, которые имеют голову одного пола, а остальную часть тела -- другого, Уайтинг обнаружил, что поведение определяется генотипом клеток головного ганглия. Билатеральные (лево-правые) мозаики проявляли тенденцию как к поведению, характерному для самцов, так и к поведению, характерному для самок. Имеется несколько генетических ситуаций, ведущих к образованию гинандроморфов, а, следовательно, и несколько методов получения мозаиков. Один из них основан на использовании линии дрозофилы с кольцевой X-хромосомой и зависит от потери неустойчивой кольцевой X-хромосомы во время первого деления ядра зиготы эмбриона самки. В этом случае возникает два клона клеток: ХО и XX (рис. 6.3.)

Рис.6.3. Соматическая диаграмма образования генетических мозаиков.

Соотношение частей организма, имеющих генотипы XX и ХО, зависит от того, когда утрачивается кольцевая X хромосома. Если, например, она утрачивается при первом делении ядра зиготы, то клеточные клоны занимают по половине бластодермы, если позднее, то клон ХО занимает меньшую часть бластодермы. В редких случаях кольцевая X-хромосома утрачивается при первом делении и еще раз при более поздних делениях, в этих случаях у эмбрионов клон ХО занимает большую часть бластодермы.

Характер же мозаицизма будет определяться не только осью первого деления, но и характером миграции ядер к поверхности при образовании бластулы. Относительное положение ядер имеет тенденцию сохраняться, но все-таки при миграции ядра с генотипом ХО могут мигрировать вместе с ядрами с генотипом XX. Мигрирующие ядра равнонаследственны, и при образовании бластодермы место, занимаемое клеткой, в основном определяет ее судьбу, т. е. те структуры, происхождение которым она даст. Этот механизм обеспечивает появление самых различных мозаиков.

Нервная система и мезодерма, дающая образование мышечной ткани, также образуются из специфических районов бластодермы. Границы у мозаиков между «мужскими» и «женскими» частями в основном совпадают с межсегментальными границами и продольной средней линией экзоскелета (рис. 6.2.), так как экзоскелет есть совокупность многих частей, образующихся независимо в ходе метаморфоза из имагинальных дисков личинки. Имагинальные диски, в свою очередь, образуются из специфических районов бластодермы. Однако отдельные клеточные группы внутри одного диска могут быть также разного генотипа.

Рис. 6.4. Схематическое изображение внешних частей тела дрозофилы, образующихся независимо из отдельных имагинальных дисков.

а --голова; б --грудь; а -- брюшко.

Для маркирования «мужских» и «женских» частей тела используются генетически-рецессивные анатомические маркеры (желтый цвет тела, белые глаза, вильчатые щетинки и т. д.). Маркеры не проявляются в тех частях тела, которые имеют генотип XX. В этом случае они прикрыты нормальными аллелями. Однако они видны в «мужских» частях тела, утративших кольцевую X-хромосому и имеющих одну X-хромосому. Благодаря этому, отбирая различных мозаиков, можно найти, какие части тела должны быть мутантными, чтобы сформировался мутантный поведенческий фенотип. Иными словами, можно установить, какая именно анатомическая структура или клеточная ассоциация должна быть затронута мутацией, чтобы проявился эффект мутации на уровне целостного организма.

Разрешающая способность этого метода зависит от числа исследуемых особей: чем больше это число, тем больше вероятность, что среди них будут мозаики по самым ближним точкам.

Используя мозаиков, С. Бензер исследовал самые разнообразные мутации, например серию нефототаксисных мутаций, которые принадлежали пяти различным цистронам X-хромосомы. В норме мухи характеризуются положительным фототаксисом и двигаются по направлению к свету прямо, при этом свет равной интенсивности падает на оба глаза. Мутантные мухи с отрицательным фототаксисом предпочитают двигаться не к свету, а от него. Нефототаксисные же мутанты не проявляют ни положительного, ни отрицательного фототаксиса.

Интересно поведение билатеральных мозаиков у которых один глаз дефектный, т. е. мутантный, а другой -- нормальный. Они реагируют на свет, но в отличие от нормальных мух летят по направлению к источнику света не прямо, а по спирали, постоянно поворачивая свой мутантный глаз к свету, чтобы интенсивность света, падающего на оба глаза, была одинаковой (рис. 6.5.).



Рис. 6.5. Движение к источнику света билатеральных мозаиков по фототаксисным мутациям. А -- нормальная муха; Б -- билатеральный мозаик с одним мутантным глазом.

Исследование электроретинограммы мутантных по поведению мух подтвердило, что первичный фокус действия большинства нефототаксисных мутаций находится в самом глазу. Все мутации вызывали различные отклонения в электроретинограмме, так как мутантный эффект у разных мутаций осуществлялся разными путями. Причина одних отклонений -- пониженная светочувствительность фоторецепторных клеток, другие мутации вызывали дегенерацию зрительных палочек, у третьих -- отклонения в электроретинограмме обусловливались дефектом в передаче нервного сигнала от рецепторных клеток следующим нейронам.

6.8 Метод локализации фокуса действия мутации на карте презумптивных органов дрозофилы

Очень часто мутация, проявляющаяся на уровне поведения дрозофилы, затрагивает соответствующие рецепторные или эффекторные системы. Однако такая ситуация наблюдается не всегда. Ученые изучили гиперкинетические мутанты у дрозофилы. Поведение этих мутантов характеризуется тикообразными подергиваниями лап во время анестезии. Это эффект обнаруживается у гомозиготных по этой мутации самок и у самцов.

При изучении различных мозаиков по этой мутации обнаружили, что, для проявления описанного поведенческого дефекта, грудной сегмент должен быть мутантным. Генотип головы, ноги, брюшка не влияет на гиперкинетическое поведение. Иными словами, мутантная по генотипу нога очень часто не проявляет описанного синдрома. У билатеральных мозаиков поведение левых ног не зависит от поведения правых.

Данные, полученные при изучении различных мозаиков, продемонстрировали высокую корреляцию между внешним фенотипом кутикулы груди и проявлением тика. Однако эта корреляция не была абсолютной, у некоторых особей с мутантной грудью не наблюдалось подергивания лап и, наоборот, особи с нормальным генотипом груди иногда проявляли патологическое поведение. Эти данные можно истолковать следующим образом: не всегда генотип кутикулы груди отражает генотип структуры, ответственной за данный синдром. В некоторых, хотя и редких, случаях генотип морфологических маркеров не соответствует генотипу регулируемой изучаемое поведение структуры. Поэтому, естественно, встает вопрос, как локализовать те внутренние структуры, которые ответственны за формирование мутантного фенотипа, и как идентифицировать их генотип у мозаиков.

Для этого был предложен метод эмбрионального картирования или метод локализации мозаичных границ на бластуле. В основу метода был положен разработанный Стёртевантом принцип картирования генов на хромосоме путем определения частоты рекомбинаций, которая является функцией расстояний между ними.

В 1929 г. Стёртевант предложил тот же принцип для составления мозаичной карты бластодермы. Частота появления особей с разным генотипом тех или иных частей тела должна зависеть от расстояния между участками бластодермы, из которых возникают эти части. Стёртевант изучил около 400 мозаиков, но не обработал полученные данные. Через 40 лет по его данным была составлена карта бластулы («fate map»).

С. Бензер также с целью составления карты бластулы изучил 700 мозаичных мух. Он оценил расстояния между эмбриональным положением различных структур и построил карту расположения эмбриональных зачатков внешних частей тела на поверхности бластулы (рис. 6.6.).

Рис.6.6. Карта эмбриональных зачатков на поверхности бластулы.

а-- голова; б -- грудь; в -- крыло; г -- головной мозг;

д -- вентральная нервная система.

Бензер ввел единицу расстояния между эмбриональным положением различных структур, названную в память Стёртеванта Стёртом. Один Стёрт -- это расстояние, эквивалентное возможности, что в 1% случаев среди всех изученных мозаичных мух две структуры будут иметь различный генотип.

6.9 Селекционно-генетический метод в анализе поведения дрозофилы

Работы по созданию линий дрозофилы, различающихся по поведению, методами селекции наиболее интенсивно проводились в 50--60-е годы. В их основе лежали идеи и подходы генетики количественных признаков. Вопрос об идентификации отдельных генов, контролирующих тот или иной поведенческий признак, не ставился. Это было основным недостатком данного комплекса работ и определяло необходимость разработки мутационного анализа поведения, поскольку именно мутации дают в руки точный инструмент для анализа нервной системы.

Тем не менее, селекционно-генетические работы составляют значительную долю исследований и вносят свой вклад в изучение генетики поведения дрозофилы.

Одно из первых систематических селекционно-генетических исследований -- многолетняя работа Дж. Хирша с сотрудниками на созданных им линиях D. melanogaster, различающихся по геотаксису. Мух оценивали в специальном приборе -- классифакицонном лабиринте, имеющем один вход и до 15 выходов. Прибор ориентируется вертикально, и учитывается скорость продвижения по лабиринту отдельных особей. К 1969 году линии прошли свыше 150 поколений отбора. В каждой линии более 90% особей проявляли в конечном счете селектируемый признак -- положительный или отрицательный геотаксис.

Возвратный отбор приводил к быстрой ликвидации достигнутых предшествующей селекцией результатов. Гибриды Fi от скрещивания контрастных линий проявляли неполное доминирование положительной реакции над отрицательной.

Для вычленения роли отдельных пар хромосом в контролировании межлинейных различий Дж. Хирши с сотрудниками использовали принцип, заключающийся в получении серии комбинированных изогенных линий. Такие линии сочетают в себе в заданных комбинациях хромосомы исходных анализируемых линий. Получают их с помощью линий-тестеров, которые несут в больших хромосомах инверсии и доминантные и рецессивные маркеры.

В результате анализа удалось выяснить, что гены, контролирующие различия по геотаксису, распределены во всех больших хромосомах селектируемых линий, однако в хромосоме 3 имеется больше генов с положительным эффектом, а в Х-хромосоме -- с отрицательным.

Обширные исследования гео- и фототаксиса на ящичных популяциях D. Pseudoobscurа были проведены в лаборатории Ф. Г. Добжанского. Исходные популяции были заложены из линий, содержащих инверсии СН и AR в третьей хромосоме. Особей оценивали по поведению с помощью лабиринта Хирша в некоторой модификации. Отбор во всех случаях оказался эффективным и привел к четким различиям уже за первые 20--30 поколений. Селекция по поведению привела к межпопуляционным различиям по метрическим показателям: длине крыльев и лапок, размеру глаз, добавочному жилкованию. Оценка вклада отдельных пар хромосом в межпопуляционные различия по фототаксису после 100 поколений отбора показала ведущую роль третьей хромосомы, меньшую роль второй хромосомы и сравнительно небольшой вклад Х-хромосомы и четвертой хромосомы.

Успех селекции на фототаксис был достигнут также в работах на D. Melanogaster и D. Virilis.

Быстрые результаты при отборе линий D. melanogaster на различия по двигательной активности получила Е. М. Лучникова (1964). С помощью усовершенствованного ею метода создания комбинированных изогенных линий была показана ведущая роль генов хромосомы 3 в контролировании межлинейных различий по двигательной активности.

На ряде видов дрозофилы -- D. Melanogaster, D. Simulans, D. pseudoobsfura получены линии, различающиеся по половой активности самцов. Гибридологический анализ во всех случаях показал доминирование высокого уровня активности над низким и полигенный характер межлинейных различий.

Л. 3. Кайданов с сотрудниками установили, что различия между низкоактивной линией «НА» и полученной из нее возвратным отбором высокоактивной линией «ВА» D. melanogaster контролируются преимущественно генами второй пары хромосом, а также половыми хромосомами. Далее оказалось, что в хромосомах 2 линии «НА», в отличие от линии «ВА», в очень высокой концентрации содержатся мутации, понижающие жизнеспособность. И это несмотря на длительный отбор данных линий -- свыше ста поколений, сопровождаемый тесным инбридингом. Обнаружена высокая частота спонтанного возникновения мутаций, понижающих жизнеспособность, в ограниченном числе локусов в прицентромерном районе хромосомы 2 линии «НА». Но эти мутации лишь создают лишь фон, на котором проявляется специфическое действие других мутаций, контролирующих половую активность самцов и локализованных в Х-хромосоме и Y-хромосоме.

Гео- и фототаксис, двигательная и половая активность являются поведенческими признаками дрозофилы, которые наиболее интенсивно исследовались с помощью селекционно-генетического метода. Другие примеры анализа поведения дрозофилы с помощью этого метода содержатся в обзорх Л. Эрман и П. Парсонса, Л. 3. Кайданова, Е. М. Лучниковой.

Глава 7. Генетика поведения птиц

7.1 Птицы как объект генетического анализа поведения

Поведение птиц характеризуется высоким развитием инстинктивных форм поведения, в организацию которых огромный вклад вносит пренатальная и ранняя постнатальная среда.

Эволюция больших полушарий конечного мозга птиц шла в направлении развития центральных подкорковых узлов, образующих так называемое полосатое тело, или стриатум. Однако, несмотря на это, птицы легко вырабатывают условнорефлекторные реакции и аналитико-синтетические способности птиц достигают определенного уровня развития.

В ходе исследования способности различных видов животных экстраполировать направление движения раздражителя (платформы с кормом), оказалось, что вороновые (вороны, сороки, грачи) обладают практически такой же способностью к экстраполяции, как собаки и лисицы.

Вероятно, полосатое тело несет те же функции, что и кора у млекопитающих, его относительные размеры положительно коррелируют со способностью к экстраполяции. Наибольшей величины полосатое тело достигает у представителей вороновых, характеризующихся наилучшей способностью к экстраполяции, а наименьшей - у плохо экстраполирующих голубей и кур.

Благодаря способности птиц к образованию различных ассоциаций, их наследственно детерминированное поведение может быть существенно модифицировано окружающими условиями. В связи с этим анализ генетических основ поведения птиц предполагает изучение онтогенетической пластичности поведения, его эволюции в ходе онтогенеза.

7.2 Средовая модификация некоторых форм врожденного поведения у птиц

Любое новорожденное животное выживает и успешно развивается только в том случае, если физиологические и поведенческие реакции, приспосабливающие его к неонатальной среде, специфичной для данного вида, сформируются к моменту рождения. Учитывая эту исходную предпосылку и изучая эмбриогенезы различных видов животных, П. К. Анохин создал концепцию системогенеза. Согласно ей главным принципом эмбрионального развития нервной системы является принцип гетерохромного, избирательного развития, приводящего к ускоренному развитию клеточных элементов и проводящих путей, обеспечивающих новорожденному выживание. В качестве иллюстрации избирательного созревания тех систем, которые адаптируют новорожденного к неонатальной среде, П. К. Анохин рассматривает эмбриональное развитие птиц.

Например, только что вылупившиеся птенцы грача сразу же реагируют раскрытием клюва на звук «кар-р-р» и на движение воздуха, т. е. на раздражители, которые в естественных условиях сигнализируют о предстоящем приеме корма от прилетевших родителей.

Анализ способностей слухового аппарата грачонка показал, что к моменту вылупления в этом аппарате совершенно созрели лишь те рецепторные элементы, которые способны воспринимать составляющие звука «кар-р-р». Остальные же части рецепторного образования слухового аппарата оказываются к моменту рождения несозревшими.

При сопоставлении поведения новорожденных птенцов грача с поведением птиц, живущих, в дупле, можно видеть, что у последних созревают раньше другие функциональные системы, приспосабливающие птенцов к другим специфическим факторам среды. В дупле активным стимулом, сигнализирующим о корме, является затемнение дупла, наступающее, когда мать, прилетевшая с кормом, закрывает собой отверстие, через которое проникал свет. У этих птенцов созревают те функциональные системы, которые обеспечивают восприятие перемены освещения и направляют возбуждение на эффекторные пути, формирующие раскрытие клюва.