Основы генетики

Депрессивноподобное состояние животных в эксперименте провоцируется длительными стрессорными воздействиями или селекцией. Проверка формирования депрессивноподобного статуса осуществляется в стандартных тестах «принудительного плавания» (Forced swimming test, он же Porsolt test, или «защемления хвоста» (Tail suspension test)

В обоих случаях оценивается время, когда животное от активных попыток освободиться из неприятного положения (погружение в воду или подвешивание за хвост), переходит к неподвижности, зависанию, которое исследователи ассоциируют с потерей животным надежды и поведением отчаяния. Клинически активные антидепрессанты увеличивают время наступления неподвижности.

Ангедония оценивается в тесте на потребление сахара (Sucrose consumption): животным в домашнюю клетку помещают две бутылки - с водой и 5-10 %-м раствором сахарозы. В состоянии депрессии объем выпитого раствора сахарозы в процентном отношении снижен.

Одна из моделей формирования у животных депрессивного состояния называется «обученная беспомощность» (Learned helplessness model). Она разработана около 30 лет назад. Животные сидят в трех одинаковых клетках с прикрепленными к лапам электродами. Контрольному животному ток не подается. В две другие клетки ток подается, однако в первой клетке животное может отключить ток, выполнив инструментальное действие (например, нажав на педаль), т. е. оно находится в состоянии избегаемого стресса. Во второй клетке данное действие не приводит к отключению тока (ток отключается только одновременно с 1-й клеткой), т. е. создается ситуация неизбегаемого стресса. Именно последний тип стресса оказывает наиболее разрушительное влияние на психику, приводя к депрессии.

Модель позволяет оценить профилактический эффект фармакологических препаратов (до стрессорных воздействий) и терапевтический эффект (после возникновения поведенческих нарушений). В первом случае эффективными оказываются препараты анксиолитического ряда, во втором - антидепрессивного.

Интересуют генетиков и стереотипные движения (облизывание, фырканье, мотание головой, вытягивание в одном местоположении, упорное грызение прутьев клетки). Существуют стереотипии, при которых более сложные паттерны поведения (еда, питье, уход за собой и социальное поведение) исчезают.

Стереотипии автоматически регистрируются приборами «Open ?eld system», «Home cage activity system». Большинство движений при стереотипии можно вызвать большими дозами психостимуляторов (кокаин, амфетамин). Эта модель используется для скрининга потенциальных антипсихотических веществ. Исследование стереотипии имеет длинную историю, ранее фокус внимания был сосредоточен на дофаминэргической системе стриатума. Современные исследования связаны с поиском внутриклеточных белков-посредников, участвующих в клеточном метаболизме.

Особенно сложными являются методы и оборудование для оценки когнитивных функций (памяти, обучения и т.п.) .

Для оценки когнитивных функций используется:

· радиальный лабиринт - Radial maze, в котором животное выбирает оптимальную стратегию исследования и нахождения пищи (награды) с минимумом усилий;

· Т-лабиринт - Т-maze, в котором животное ищет приманку;

· тест в водном лабиринте Морриса (Morris water maze), основанный на поиске оптимальной стратегии для избегания воды с минимумом усилий - на поиске кратчайшей дистанции до спрятанной под водой платформы на основании предыдущей памяти о ее местонахождении;

· лабиринт Барнеса (Barnes Maze), который позволяет исследовать процессы обучения и памяти, используя пространственную навигацию;

Кроме памяти и обучения к когнитивным процессам относят феномен внимания как селекцию сенсорной информации из среды для последующего стимулсвязанного процессинга. Внимание состоит из нескольких субкомпонентов, включая ориентирование, селективное внимание, длительное внимание (бдительность) и рассредоточенное внимание. Этот феномен также доступен для моделирования на животных.

Разработаны методы и оборудование для исследования социального поведения животных. По определению, социальное поведение - это поведение, требующее для своей реализации, по крайней мере, еще одного представителя своего вида. Сюда относят все варианты межсамцовых взаимодействий, репродуктивное (половое) и родительское поведение.

Социальные межсамцовые взаимодействия (парные или групповые) можно разделить на следующие категории:

· социальный интерес - следование, принюхивание к партнеру, генитальный груминг;

· защитное поведение - побежки (как активное избегание партнера), замирание (пассивная реакция затаивания, страха);

· агрессивное поведение - угрозы, биение хвостом, нападения, толчки-отпихивания, погоня, агрессивный груминг, ходьба «шариком» и пр.;

· сопровождающее взаимодействие несоциальное поведение - автогруминг, исследование клетки, рытье подстилки.

Как правило, встреча с новым партнером начинается с реакции социального интереса, далее перерастает в агрессивные взаимодействия, когда животные выясняют свой ранг, после чего интенсивность их социальных контактов снижается и носит во многом ритуализированный характер.

На инициацию, продолжительность и интенсивность социальных взаимодействий влияет уровень тревожности животных: чем он выше, тем меньше эти параметры. В целом тестовые ситуации можно варьировать, изменяя освещенность тестового поля (яркая - неяркая), территорию (знакомая - незнакомая), партнеров (знакомых - незнакомых).

Исследование полового поведения дифференцируют на изучение половой мотивации и непосредственного взаимодействия самца и самки. Анализ репродуктивного поведения применяется при тестировании трансгенных мышей, фармакологических исследованиях, изучении возрастной физиологии.

Уровень половой мотивации самцов оценивается по поведению «рвения» к рецептивной самке. На основе этого разработаны множество тестов: тесты с обучением и оперантным поведением, преодолением препятствий различной сложности, бeгом самца по движущейся в противоположном направлении беговой дорожке, тест «перегородка» и другие.

С точки зрения сексуального взаимодействия любая особь может быть оценена по критериям:

· аттрактивности (привлекательности), оцениваемой в тестах по времени, проводимому около нее или ее запаха особью противоположного пола;

· рецептивности (восприимчивости к сигналам сексуальной направленности), оцениваемой по соответствующему поведению в ответ на стимулы данного репертуара;

· процептивности (характерному поведению тестерного животного, стимулирующему половую активность особей противоположного пола)

Все эти критерии могут быть использованы для создания тестов.

Тесты для исследования социального поведения животных чувствительны к анксиолитическим (противотревожным) и анксиогенным (тревогогенным) веществам, причем разные классы анксиолитиков эффективны в разных тестовых ситуациях.

Основной инструментарий - оборудование, регистрирующее моторное поведение: «Open ?eld system», «Home cage system», «Ethostudio system» и др.

Наиболее распространенные тесты:

· тесты, изучающие социальные взаимодействия на нейтральной арене;

· тест «резидент-интрудер», где самцу, предварительно сидящему в изоляции и вследствие этого агрессивному, подсаживают партнера, после чего регистрируют весь спектр межсамцовых взаимодействий;

· тест «перегородка», где самцы находятся по разные стороны перфорированной прозрачной перегородки, а социальный интерес (мотивация) измеряется по времени, проведенному у преграды.

Перечисленные методы используют для изучения генетики и молекулярных механизмов агрессии и тревожности, доминантно-субординантных отношений, социального стресса и др.

Созданы тесты для исследования процессов социального узнавания, привыкания и предпочтения.

Понятие «социальное узнавание» было введено в употребление в 1980-е гг. Оно основано на безусловном поведенческом ответе (интересе) животного при подсадке незнакомого партнера. Ольфакторное исследование подсаженной особи истощается со временем, тогда как подсадка нового партнера сопровождается возобновлением интереса со стороны тестерной особи. В первой сессии животных ссаживают для знакомства, потом рассаживают и вновь ссаживают вместе или с другим партнером. Узнавание определяется как значительное снижение времени ольфакторного исследования при повторном ссаживании со знакомым партнером, а забывание - как одинаковое исследование обоих.

В других вариантах протокола исследуют процессы социального привыкания и социального предпочтения. Например, сживаются вместе знакомый и новый партнер. В целом на поведение в тесте могут оказывать влияние различные характеристики стимулируемых животных (их социальный ранг, сексуальная аттрактивность, ольфакторные особенности). Развитие предпочтения в подобных экспериментах может отражать следствия предыдущих опытов (например, сексуальных контактов или контактов на фоне фармакологических вмешательств). Исследования социальной памяти - активно развивающаяся область поведенческой физиологии.

Есть тесты для исследования родительского поведения. Родительское поведение, характерно для многих видов млекопитающих. Это омплексная стратегия активности по заботе, вскармливанию и, в ряде случаев, обучению молодняка. Родительское поведение делят на активное и пассивное.

У лабораторных грызунов активное родительское поведение включает гнездостроительство, перенос детенышей из одного места в другое (как вариант - возврат в гнездо), вылизывание молодняка.

Пассивное поведение подразумевает принятие лактирующей самкой позы, подходящей для кормления детенышей.

Для оценки родительского поведения разработаны многочисленные тесты. Самые простые включают видеонаблюдение и регистрацию конкретных параметров родительского поведения в течение определенного интервала времени или его наблюдение после периода депривации (например, удаление детеныша или детенышей на срок до 3-4 часов).

Более усложненные варианты оценки родительского поведения могут включать предварительное обучение матери (оперантное поведение), или использование лабиринтов (Y-и Т-типов), Hole-board system.

Помещая в один из рукавов лабиринта или отверстие арены запаховую метку детеныша, оценивают аттрактивность (привлекательность) детского запаха для матери. Другой способ оценки эмоциональной значимости ребенка для матери исследуют в установке «Place preference system».

Тест на «местопредпочтения» - Place Preference System - широко используется для оценки разных видов поведения, как правило, с выраженной эмоциональной составляющей. Установка состоит из двух или трех камер. Автоматически регистрируются моменты перехода между частями, общее время нахождения в каждом отсеке, двигательная активность и пройденный путь. Вариант протокола для исследования родительского поведения: предварительное содержание в четные дни матери с детенышем в левом отсеке, в нечетные дни - одной матери в правом отсеке прибора. Далее оценивается предпочтительное место нахождения самки в отсутствие детеныша.

Рис.1. 35. Оборудование для теста на «местопредпочтения»

У видов, способных издавать звуки, изучают генетически обусловленные различия в параметрах осциллограмм (визуализированные звуковые колебания) «песен». Наиболее популярными среди исследователей являются видоспецифические брачные звуки.

Рис. 1.36. Фото малой чайки (Larus minutus) и осциллограмма ее брачной песни.



Рис. 1.37. Фото желтоголового королька (Regulus regulus) и осциллограмма его брачной песни.

В последнее десятилетие была разработана батарея стандартных тестов для поведенческого фенотипирования мутантных и нокаутных линий мышей - так называемый SHIRPA-протокол. Он включает более 40 пунктов (блоки 1 и 2 из табл. 1) и позволяет проводить универсальный скрининг с выявлением морфологических дефектов и нарушений в нервно-мышечной, сенсорной и вегетативной системах организма.

Последний, третий, блок тестов в Табл. 1, оценивает более тонкие функциональные особенности нервной системы, связанные с индивидуальным и социальным поведением животных, их интеллектом и психикой.

Преследуя единую цель всесторонней проверки функционирования нервной системы, разные лаборатории используют вариативные наборы поведенческих тестов.

Таблица 1. Вариант батареи тестов для фенотипирования животных

№	Блоки поведенческого и физиологического скрининга
1.	Общее здоровье, внешний вид, индивидуальные характеристики: · вес, длина и форма тела, ушей, головы; наличие шерсти, усов и пр.; · ряд физиологических параметров организма, в том числе температура тела; анализ крови, мочи; сердечный и дыхательный ритмы; · мышечный и брюшной тонус, тонус конечностей, передача нервно-мышечного возбуждения; · раздражимость, агрессивность, вокализация, страх; · особенности уринации, дефекации, слюнотечения, слезотечения; · потребление пищи и воды.
2.	Оценка сенсорных и моторных функций животного: · слуховая, зрительная, ольфакторная и болевая чувствительность; · особенности позы, походки, поддержание равновесия, наличие причудливого поведения; · спонтанная локомоторная активность; · циркадные ритмы.
3.	Анализ высшей нервной деятельности животного: · социальное и эмоциональное поведение; · обучение и память.

Таким образом, генетики используют в своих исследованиях широкий арсенал методов, специфического оборудования и программного обеспечения для оценки поведенческого признака. Использование современных методологических и инструментальных возможностей поведенческого фенотипирования позволяет исследовать практически весь этологический репертуар животных.

1.5 Некоторые принципы генетического анализа поведения

Генетический анализ является основным методом генетики, с его помощью достигается вычленение наследственных факторов -- генов, контролирующих анализируемый признак. «Подобно тому, как основой наших химических знаний являются данные, добываемые химическим анализом, разлагающим вещества на составляющие их простые элементы, так и в основе наших генетических знаний лежит генетический анализ, разлагающий генотип организма на составляющие его наследственные элементы», -- писал известный генетик А. С. Серебровский.

Значение генетического анализа для генетики поведения трудно переоценить, поскольку это один из ее основных методов, благодаря которому эта наука сформировалась как самостоятельное научное направление.

Генетический анализ поведения с помощью исследования плейотропного эффекта морфологических мутаций.

Мировая генетическая коллекция Drosophila melanogaster включает многие сотни «видимых» мутаций, затрагивающих все части и органы тела. Например, изменяющих пигментацию глаз или хитиновых покровов, форму глаз или крыльев, приводящих к исчезновению отдельных жилок на крыле, щетинок на теле или целых органов: антенн, глаз пли крыльев.

При изучении плейотропного эффекта морфологических мутаций на поведенческие реакции очень важно в методическом отношении разделить возможное влияние генотипической среды от влияния, которое оказывает анализируемый мутантный ген.

Изучение плейотропного эффекта морфологических мутаций началось в 1915 году, когда Стертевант стал изучать влияние на половую активность и избирательность спаривания рецессивных мутаций, нарушающих пигментацию глаз (white, vermilion), тела (yellow) и изменяющих форму крыльев (curved). Все мутантные самцы в его опытах уступали в конкуренции за самок самцам дикого типа. В то же время самки с желтой окраской тела отличались повышенной половой рецептивностью.

В 40-х годах Скотт и Р. А. Мазинг продолжили изучение плейотропного влияния морфологических мутаций на поведение дрозофилы. Р. А. Мазинг подвергла тщательному исследованию интенсивность фотореакции и избирательность яйцекладки. Для изучения фототаксиса ею были выбраны мутации, уменьшающие число фасеток в глазах (Bar, eyeless), изменяющие пигментацию глаз (white, sepia), редуцирующие поверхность крыла (vestigial, dumpy), а также мухи дикого типа. Мух испытывали в Т-образных стеклянных трубках, к одному из концов которых подводили источник света, и сравнивали их продвижение к освещенному концу.

У мух всех мутантных линий фототаксис оказался ослабленным. Но надо было выяснить, связан ли этот эффект с действием самих мутаций или действием окружающей генотипической среды. Для ответа на этот вопрос было проведено несколько серий возвратных скрещиваний. Было выявлено, что процедура возвратных скрещиваний почти во всех случаях приводит к полному восстановлению до уровня нормы фотореакции у гибридного потомства, имеющего мутантный фенотип. Тем самым была доказана решающая роль генотипического окружения в контролировании фототаксиса.

Аналогичные подходы были использованы Р. А. Мазинг при изучении другого поведенческого признака -- избирательности откладки яиц на питательные среды: содержащую сахар и не содержащую сахара.

В последующие годы морфологические мутации широко привлекались для исследования половой и двигательной активности, избирательности спаривания и ряда других поведенческих реакций.

При изучении полового поведения самцов yellow и самцов дикого типа было обнаружено, что половая стимуляция самок в значительной степени достигается за счет вибрации крыльев самцов. Самцы yellow вибрируют крыльями во время ухаживания менее интенсивно и через большие интервалы, чем нормальные самцы, это ведет к резкому понижению конкурентоспособности мутантов.

С помощью изучения морфологических мутаций удалось продемонстрировать роль антенны и связанного с ней чувствительного выроста -- аристы в восприятии половых стимулов самцов. Самки, гомозиготные по мутации antennaless и лишенные тем самым ольфакторной чувствительности из-за отсутствия антенн, не способны к избирательному спариванию.

Для успешного осуществления половых реакций имеет значение и нормальная зрительная рецепция. Так, при половой конкуренции самцов, несущих различные мутации в гене white, белоглазые особи на свету уступали самцам с более интенсивной пигментацией, в то время как в полной темноте шансы конкурентов уравнивались.

Пигментные мутации дрозофилы представляют собой интерес для нейрогенетики потому, что некоторые предшественники образования пигментов служат одновременно источником синтеза нейроактивных веществ. Так, коричневые глазные пигменты оммохромы возникают на конце одной из ветвей кинуренинового пути обмена триптофана, который одновременно является предшественником серотонина и гормона мелатонина.

Пигмент меланин в кутикуле мухи образуется в результате обмена другой аминокислоты -- тирозина. А тирозин, окисляясь, служит предшественником катехоламинов -- дофамина и норадреналина. Таким образом, можно полагать, что пигментные мутации дрозофилы влияют одновременно и на поведенческие особенности.

Действительно, у мух мутантных линий yellow, ebony и tan с измененной окраской тела и со сниженной половой и двигательной активностью найдены значительные отличия от нормы в содержании дофамина. Показана низкая суточная двигательная активность мух мутантных линий vermilion и cardinal, лишенных коричневых пигментов и имеющих ярко-красные глаза. Упомянутая выше мутация tan интересна еще и тем, что она в отличие от всех прочих пигментных мутации нарушает фототаксис. Тонкими электрофизиологическими исследованиями при снятии электроретипограмм удавалось выявить нарушение у мутантных особей функции отдельных монополярных нейронов в ламинарном слое клеток сетчатки зрительного анализатора.

Описаны морфологические мутации, изменяющие положение крыльев: wing-up А и wing-up В. Обе эти мутации, неаллельные друг другу, локализованы в X -хромосоме в районе локуса forked. Обе они, будучи в гомозиготном пли гемизиготном состоянии, обусловливают поднятое кверху вертикальное положение крыльев и неспособность летать. Мутация wing-up В в гетерозиготном состоянии нарушает способность к полету, т. е. по данному признаку она является доминантной, тогда как ее видимое морфологическое проявление носит рецессивный характер. Оказалось, что у мутантных мух имеет место нарушение двигательной мускулатуры крыльев.

«Видимые» мутации дрозофилы служат богатым источником для изучения генетической детерминации физиологических особенностей. В некоторых случаях с их помощью удается раскрыть структурные и функциональные основы поведенческих признаков.

Генетический анализ поведения с помощью спонтанных и индуцированных мутаций.

Для изучения поведенческих признаков важно получить достаточно представительные выборки мутаций, влияющих на поведенческие признаки. При наличии таких выборок становится возможным выявить участие различных генов в контролировании данного признака, раскрыть характер их взаимодействия, подойти к механизмам генетического регулирования поведенческих особенностей.

Вопрос о необходимости получения в достаточных количествах нужных поведенческих мутаций у дрозофилы был поставлен С. Бензером в семидесятых годах. Бензер считал, что задача сводится к созданию аналогов селективных сред, где в качестве селектирующего фактора выступала бы сама поведенческая особенность мутантных мух. В ответ на соответствующий раздражитель они должны автоматически отделяться от остальной массы нормальных особей. Надежность выделения нужных мутантов повышают за счет многократного повторения процедуры сортировки особей по поведению.

Свои идеи Бензер реализовал при получении мутаций, индуцированных химическими мутагенами и затрагивающих фотореакцию. Был взят сильный алкилирующий агент этилметансульфонат, вызывающий в большом количестве точечные мутации типа замены пар оснований. Использовали методику «Muller-5», обычно применяемую для выделения рецессивных сцепленных с полом мутаций, а также некоторые другие методики и линии со сцепленными А-хромосомами у самок.

Рис. 1.38. Метод обнаружения рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций у дрозофилы (методика «Muller-5») В -- ген полосковидных глаз; w^a -- ген абрикосового цвета глаз.

Эффективный способ выделения термочувствительных неврологических мутантов разработал в 1971 году Сузуки. Он, так же как и Бензер, использовал для индукции мутаций химические мутагены.

Высокоэффективную селективную среду для отбора физиологических мутантов с нулевой активностью алкогольдегидрогеназы (АДГ) разработали в 1972 году Софер и Хэткоф.

Таким образом, задача создания селективных методик для выделения физиологических и поведенческих мутаций у дрозофилы была решена. Но получение мутаций по данному признаку является лишь первым этапом генетической работы.

Второй этап изучения генетики поведения с помощью индуцированных мутаций заключается в установлении числа генов, к которым относятся выделенные мутации. Вероятны три ситуации:

1) все выделенные по данному признаку мутации будут результатом мутирования одного гена;

2) каждая отдельная мутация затронет свой локус,

3) мутирует несколько локусов, причем некоторые из них повторно.

Для определения принадлежности двух рецессивных мутаций к одному и тому же или разным генам используют функциональный тест на аллелизм. Для этого их объединяют в гетерозиготном состоянии в потомстве от скрещивания гомозиготных родителей:

где % и a_t -- мутации по данному поведенческому признаку.

Если у гетерозиготных особей F₁ выявится аномальное поведение, то можно считать, что анализируемые мутации не комплементарны друг другу, т. е. являются аллелями одного гена, и их генотип следует записывать как (1). Если же у гетерозигот F₁ обнаружится нормальное поведение, значит в анализ вовлечены комплементарные, взаимодополняющие мутации, которые относятся к разным локусам (2).

В работах Хота, Бензера, Сузуки было испытано на аллелизм по нескольку десятков рецессивных сцепленных с полом мутаций. Мутации, изменяющие фототаксис, возникли, как оказалось, в результате мутирования семи различных генов в Х-хромосоме, а температурозависимые мутации, вызывающие паралич, распределились по четырем генам.

Третий этап генетического анализа состоит в картировании локусов, по которым выделенные мутации распределены. Картирование новых мутантных генов, в том числе и влияющих на поведение, достигается с помощью тестерных линий, несущих в соответствующей хромосоме цепочку рецессивных и доминантных маркеров, т. е. легко опознаваемых и точно локализованных мутаций. В гибридном потомстве учитывают частоту рекомбинантных классов особей, несущих анализируемый признак и маркерные признаки. Необходимый результат может быть также достигнут с помощью тестерных линий, несущих серию делеций вдоль по длине хромосомы.

Гены, контролирующие данный поведенческий признак, могут распределиться на генетической карте самым различным образом. Например, Каплан с сотрудниками исследовал мутации, нарушающие локомоцию и четко проявляющиеся на провокационном фоне, -- при эфирном наркозе. Тридцать полученных ими мутаций распределились по четырем локусам в Х-хромосоме на участке около 30% длины генетической карты, т. е. в 30 морганид. В другой работе 53 термочувствительные мутации, затронувшие 52 локуса, сосредоточились на одном участке, занимающем 13% длины генетической карты 3-й хромосомы.

Доведение генетического анализа до картирования отдельных генов, контролирующих физиологический или поведенческий признак, позволяет понять генетическую организацию этого признака.

Фенотипическую локализацию действия мутантного гена можно осуществить с помощью хромосомных мозаиков. В семидесятые годы Хотта и Бензером были получены мозаичные особи, несущие разные по величине нормальные и мутантные части тела.

В эксперименте использовались ранее полученные рецессивные мутации, распределенные по пяти локусам в Х-хромосоме и нарушающие фототаксис. Эти мутации путем кроссинговера порознь сочетались в одной хромосоме с рецессивными маркерами: у w sn f. Оппозиционная Х-хромосома несла нормальные аллели этих рецессивных мутаций, но включала структурную перестройку, придававшую ей форму кольца.

Такая необычная кольцевая хромосома уже на ранних эмбриональных стадиях развития имеет высокую вероятность претерпеть разрыв и в результате потеряться. Те ткани, в клетках которых сохранятся обе Х-хромосомы, будут по фенотипу нормальными. Те же ткани и органы, которые разовьются из клеток, утративших кольцевую Х-хромосому, окажутся мутантными, поскольку рецессивные мутации, будучи в гемизиготном состоянии, смогут теперь проявиться. Чем раньше в ходе онтогенеза произойдет элиминация кольцевой Х-хромосомы, тем больший участок тела будет иметь мутантный фенотип. При наличии маркеров, изменяющих окраску тела (у), глаз (w) и форму щетинок (sn и f ), мутантные ткани легко различить на поверхности любого участка тела.

Рис. 1.39. Гинандроморф дрозофилы.

Левая сторона тела (черная) состоит из клеток с двумя Х-хромосомами, а правая (белая) - из клеток с одной хромосомой.

Рис. 1.40. Другие варианты строения гинандроморфов дрозофилы. Типы мозаичности фенотипа у гинандроморфных особей D.melanogaster по мутации hyperkinetic.

Известно, что в сложном глазу дрозофилы имеется около 800 омматидиев. (Омматидий -- это структурная и функциональная единица фасеточного глаза насекомых. Омматидии сформировались в ходе эволюции из изолированных простых глазков при их интеграции в сложные, или фасеточные, глаза). Каждый омматидий включает 8 упорядоченно расположенных фоторецепторных клеток. Хотта и Бензер производили снятие электроретинограмм ЭРГ (это запись биоэлектрических потенциалов сетчатки глаза, возникающих при действии на нее света) у мозаичных особей, имеющих один глаз нормальный, а другой мутантный или же часть глаза нормальную, а другую мутантную. В отдельных случаях исследовали мозаиков с нарушением всего нескольких омматидиев. В результате была доказана высокая степень автономности фоторецепторных клеток глаза, функционирование которых определяется их собственными генотипическими особенностями.

Одновременно с работой Хотта и Бензера появилась работа Икеды и Каплана, которые применили метод получения мозаиков для нейрофизиологического исследования мутаций, вызывающих подергивание лапок у наркотизированных эфиром мух. Было изучено 77 гинандроморфов, несущих в Х-хромосоме соответствующую мутацию. С помощью микроэлектродной техники получили характеристики электрической активности отдельных нейронов торакального ганглия и доказали автономность отдельных мотонейронов в про-, мезо- и метаторакальных отделах торакального синганглия.

Без использования генетических подходов получение таких результатов вряд ли было бы возможным.

Исследование мозаичных особей позволило Хотта и Бензеру предложить способ вычленения так называемых фокусов -- структур, ответственных за проявление поведенческих признаков.

Логика рассуждений была при этом следующая. В раннем эмбриогенезе дрозофилы, уже на стадии бластодермы, отдельные ее участки детерминированы. Из них формируются имагинальные диски, которые в свою очередь дают начало вполне определенным частям тела имаго. Если мозаицизм захватывает данный участок тела, что выявляется с помощью маркеров, и это сопровождается определенной поведенческой аномалией, то тем самым доказывается поражение нервной системы, мускулатуры или иных структур именно в данном участке. Таким путем было подтверждено, что мутации, нарушающие зрительную рецепцию и изменяющие электроретинограмму, затрагивают глаза или область, непосредственно к ним примыкающие. Мутация Hk^1P нарушает функцию торакального ганглия. Сложный фокус мутации drop-dead (drd), вызывающей раннюю гибель мух, находится в церебральном ганглии. Билатеральные взаимосвязанные фокусы мутаций wings-up локализуются в районе торакса.

Получение мозаиков возможно лишь при утрате одной из Х-хромосом. Если же теряется одна из больших аутосом, то очень быстро наступает гибель особи. Холл и Кэнкель, сотрудники Бензера транслоцировали на Х-хромосому небольшие участки аутосом, нехватка по которым в гетерозиготном состоянии не приводит к летальному исходу. Эти исследователи в качестве маркеров использовали мутантные гены кислой фосфатазы и а-глицерофосфатдегидрогеназы, что дало возможность наблюдать мозаицизм тканей также и во внутренних органах.

При изучении генетики поведения используют и неврологические мутации. Например, Левин и Вимэн провели исследование морфологии летательных мышц и их иннервации, используя для этого мутацию stripe. Мутантные гомозиготные мухи не способны летать, их моторная активность редуцирована до кратковременных высокочастотных фибрилляций крыльев, однако видимых морфологических отклонений от нормы они не имеют. Основываясь на результатах микроэлектродной техники, авторы заключили, что ненормальное поведение мух stripe обусловлено дисбалансом в передаче импульсов, направляемых синергическим волокнам, и импульсов, направляемых мышцам-антагонистам.

Конопка и Бензер провели исследование циркадного ритма с помощью серии специально полученных мутаций. При применении химического мутагена этилметансульфоната (ЭМС) были получены три сцепленные с полом рецессивные мутации, изменяющие суточную цикличность вылупления имаго: per", per", per'. Все три мутации локализованы на коротком участке Х-хромосомы между генами zeste (1.0) и white (1.5).

Мутация null-period--arhythmic (per") обусловливает сравнительно равномерное распределение частот от рождения мух в течение суток. Мутация short-period (per') контролирует вполне четкий ритм, но не при 24-часовом, а при 19-часовом цикле. Мутация long-period (per¹) удлиняет цикл вылупления до 28 часов.

В лаборатории Бензера в 1976 году была получена сцепленная с полом мутация dunce («тупица»). Особенность этих мутантов заключается в неспособности к выработке условных рефлексов избегания на специфический запах при подкреплении электрическим током. В то же время их обонятельные реакции, так же как другие физиологические и поведенческие особенности, сохраняются нормальными.

Получены мутации, обусловливающие резистентность к таким нейротропным и психотропным веществам, как амфетамин, барбитал, бидрин, физостигмин, кофеин, теофиллин и пикротоксин. Эти мутации представляют для исследования метаболизма нейромедиаторов.

Получение мутаций, влияющих на физиологические и поведенческие признаки, открывает благоприятные возможности для их последующего углубленного исследования. Генетический анализ таких мутаций может быть осуществлен в полной мере, вплоть до картирования на генетической карте. С их помощью может быть раскрыта система генетического контроля физиологических признаков.

Вклад мутационного анализа поведенческих признаков в генетику поведения является весьма значительным.

Генетический анализ поведения с помощью исследования сравнительно-генетических и селекционных методов.

Селекционный и сравнительно-генетический методы являются традиционными для генетики поведения, поскольку именно на них основывались первые представления о наследственной обусловленности поведенческих признаков.

Сравнительно-генетический метод заключается в выявлении различий среди особей, выращенных в идентичных условиях, но принадлежащих разным генетическим совокупностям, репродуктивно изолированным, например видам, популяциям или линиям.

Селекционный метод заключается в отборе для размножения в ряду поколений особей с определенными чертами поведения. Двусторонний отбор на альтернативные варианты признака (например, отрицательный или положительный фототаксис) или на разную степень проявления признака (высокую или низкую активность) позволяет не только практически вычленить из общей фенотипической изменчивости признака долю наследственно обусловленной вариабельности, но и получить линии, четко различающиеся по интересующему признаку.

В результате селекционного и сравнительно-генетического методов подбирают пары линий, контрастные по поведению, для их дальнейшего изучения гибридологическими, физиологическими и биохимическими методами.

Инбредные и селектированные линии имеют значительно более сложные различия, чем мутантные, выделенные из материнской линии в результате индуцированного мутагенеза, поэтому гибридологический анализ инбредных и селектированных линий, как правило, не доводят до локализации генов, ответственных за линейные различия.

Однако ограничить исследования в генетике поведения использованием только мутационных моделей не представляется возможным. Для решения ряда важных проблем в этой области селекционные модели более адекватны, нежели мутационные, например, при выяснении степени генетической обусловленности индивидуальной изменчивости поведения и адаптивного значения отдельных поведенческих особенностей, изучения популяционного полиморфизма поведенческих признаков, выявления роли поведения в микроэволюционных процессах.

Из двух традиционных подходов -- сравнительно-генетического и селекционного -- последний, более перспективен для модельных экспериментов по генетике поведения дрозофилы, поскольку позволяет вести исследования по интересующим свойствам поведения и получать линии с желаемой степенью контрастности.

Особое место в сравнительно-генетических исследованиях занимают сравнительно-видовые сопоставления. Они не претендуют на роль модельных, так как ограничивают применение гибридологического анализа: у дрозофилы, как у других организмов, межвидовые скрещивания редко дают жизнеспособное и фертильное потомство. Такого рода опыты преследуют специальные цели: оценку генетического расстояния между видами, изучение механизмов их изоляции, выяснение видовых особенностей образа жизни, выявление специфических и перекрывающихся экологических потребностей совместно обитающих видов.

Из всех признаков поведения в сравнительно-видовых исследованиях наибольшее внимание было уделено половому поведению. Особенности полового поведения были изучены у 101 вида рода Drosophila, относящимся к различным систематическим группам, что внесло определенный вклад в эволюционную систематику данного рода. Для большинства видов дрозофилы установлена более активная роль самок в избирательности спаривания, однако, в недавнее время обнаружен вид, где ведущую роль в этом отношении играет самец

Виды дрозофилы различаются по степени зависимости полового поведения от освещения, а также по способности самцов ухаживать за безголовыми самками.

В некоторых случаях благодаря скрещиваемости близкородственных видов группы D. paulistorum, а также D. simulans и D. melanogaster, D. pseudoobscura и D. persimilis, D. auraria и D. triauraria удалось осуществить элементарный генетический анализ видовых особенностей поведения с получением гибридов первого поколения.

Методом селекции можно повысить эффективность межвидовых скрещиваний, снизить их физиологическую изоляцию. Однако, при использовании такого приема для повышения разрешающей способности генетического анализа видовых признаков надо удостовериться, что селекция не затронула анализируемые признаки.

В опытах по генетике поведения используют такие стандартные линии как «Орегон», «Кантон-С», а также «Флорида», «Эдинбург» и несколько других, более редких линий. Дополнительным источником уникальных инбредных генотипов для сравнительно-генетических исследований у дрозофилы могут служить обширные наборы мутантных линий.

Была успешной селекция мышей и крыс на степень выраженности ряда поведенческих признаков. Осуществлены селекционные программы, которые охватили практически весь диапазон признаков поведения, показавших генетическую изменчивость, -- от скорости проведения нервного возбуждения в нервно-мышечном синапсе до высокой и низкой способности к обучению. В то же время с помощью селекции формируются линии, которые состоят из животных, сходных по выраженности исследуемого признака и иногда ряда других признаков, но не обладающих генетической однородностью. Это затрудняет использование их в целях идентификации генов, влияющих на данный признак.

В ряде случаев удалось провести работу по выведению инбредных селектированных линий, т.е. полностью гомозиготных животных с контрастными в случае двух линий величинами интересующего исследователей признака. Инбридинг начинают после того, как получены неперекрывающиеся межлинейные различия по интересующему признаку. Таких линий немного. В качестве примера можно привести инбредные линии мышей Short- и Long sleep, у которых после гипногенной дозы этанола развивается либо короткий, либо длинный период сна. Основную же массу составляют инбредные линии мышей и крыс, выведенные ранее, до начала активных исследований в области генетики поведения. Такие линии были необходимы для исследований по иммунологии, гистосовместимости, онкологии.

Основными отличиями инбредных линий от генетически гетерогенных аутбредных, является изогенность, гомозиготность, фенотипическое подобие, долговременная стабильность, возможность идентификации.

Поскольку вероятность резких различий по поведению у случайно взятых линий невелика, обычно одновременно обследуют несколько линий. Если к поведенческим оценкам инбредных линий добавить оценки их гибридов, то появляется возможность разложить генетическую компоненту изменчивости признака на ее составляющие: изменчивость, зависящую от аддитивного действия генов, а также зависящую от аллельного и неаллельного взаимодействия генов, т. е. соответственно от доминирования и эпистаза.

Для оценки этих параметров разработан специальный метод диаллельного анализа. Метод основывается на представлениях о полигенном наследовании поведенческих признаков и на допущении наличия только двух аллелей для каждого локуса. Исходным материалом для математического анализа служат данные диаллельного скрещивания, т. е. всех возможных комбинаций между выбранными линиями. Диаллельный анализ, позволяет оценить нижний предел количества генов, влияющих на признак, определить их аддитивный эффект, степень и направление доминирования, охарактеризовать родительские линии по общей и специальной комбинативной способности и по относительному содержанию в них аллелей с рецессивным или доминантным действием, а также выявить различия в реципрокных скрещиваниях.

Диаллельный анализ является прекрасным методом для формально-генетического изучения изменчивости по признакам поведения в популяциях, для выяснения генетической организации признака на уровне популяции. Однако для анализа генетической детерминации признака на организменном уровне у дрозофилы существуют более тонкие и адекватные методы, а именно выделение и накопление мутантных генов, влияющих на признак, в селектируемых линиях с последующей их локализацией в хромосомах.

Глава 2. Пути реализации генетической информации на уровне поведения

2.1 Генетика морфологических особенностей нервной системы и их связь с изменчивостью признаков поведения

Генетиков всегда интересовала морфофизиологическая основа поведения. Знание этой основы -- необходимая предпосылка для успешного поиска механизмов влияния генов на поведение. Использование искусственно получаемых мутаций при хорошем знании генетики изучаемого объекта, его развития, нейроанатомии помогает вскрыть первичные морфологические, электрофизиологические или биохимические эффекты генов, ведущие к изменению поведения. Вариаций структурной организации нервной системы также влияют на поведение.

Одним из показателей нейронного статуса является вес мозга. На мышах отмечены линейные различия по весу мозга, но эти различия не коррелировали, например, с таким признаком, как скорость приобретения условных реакций избегания при действии электрического тока. Однако генетическая модификация веса мозга селекционным путем влияет на способность к обучению.

В процессе селекции изменяются темпы и продолжительность развития нервной ткани, причем селекция на высокий вес мозга увеличивает темпы эмбрионального и неонатального роста, но не меняет его продолжительность. Животные этих линий имеют более тяжелый мозг при рождении по сравнению с неселекционируемым контролем, и эта разница сохраняется в течение всего периода постнатального роста.

Селекция в обратном направлении не изменяет темпы эмбрионального развития нервной ткани. Вес мозга у новорожденных селекционируемых животных одинаков с весом мозга неселекционируемого контроля. Однако у первых наступает более ранняя остановка в постнатальном развитии мозга. Это может иметь существенное влияние на поведение, так как вместе с сокращением периода морфологического развития мозга меняется и продолжительность периода зависимого от средовой стимуляции функционального становления нервной системы.

Установлено, что средовые воздействия в ранний период онтогенеза существенно влияют на некоторые морфологические показатели нервной ткани. Оказалось, что увеличение числа микронейронов (звездчатых, ретикулярных и гранулярных нервных клеток), которым отводится особая роль в осуществлении творческой функции мозга, происходит и после рождения.

Средовые воздействия в ранний постнатальный критический период развития приводят к увеличению числа микронейронов и к усложнению их дендритных связей. Вследствие этого селекция на более низкий вес мозга, сокращая период его постнатального развития, может уменьшать как число нейронов, так и число межнейронных контактов.

Селекция на лучшую способность к обучению влечет за собой увеличение веса мозга и особенно одного из его отделов -- гиппокампа, который играет важную роль в процессе обучения. Гранулярные нейроны зубчатой фасции гиппокампа имеют прямое отношение к хранению следов прошлого опыта.

Описаны межлинейные различия в структурной организации проводящих путей головного мозга у мышей. Так, у линий, характеризующихся крайней агрессивностью, высокой двигательной активностью или хорошей обучаемостью, наблюдались разнообразные отклонения от нормальной организации проводящих путей, например, некоторая редукция мозолистого тела, изменение положения передней комиссуры, и некоторые другие отклонения в позиции проводящих путей, которые могли служить основой структурной пластичности мозга и причиной наследственной изменчивости в поведении. Генетический анализ показал, что выявленная изменчивость в структурной организации проводящих путей детерминирована полигенно.

При анализе клонов кузнечика К. Гудман сравнил однородность и вариабельность роста и развития различных нейронов. Для многих нейронов клонированных кузнечиков были показаны различия в образуемых нейральных связях.

Сходные результаты были получены на микроскопических ракообразных - дафниях. Самки дафний, как известно, способны производить потомство, не будучи оплодотворёнными самцами. Благодаря этой способности к партеногенезу у данного вида возможно получить линии генетически идентичного потомства одной самки - клоны.

Глаз дафнии содержит 176 сенсорных нейронов, которые образуют синаптические контакты ровно со 110 нейронами оптического ганглия. Но точное число синапсов, образующихся между определённым сенсорным нейроном и специфическим нейроном ганглия, может различаться более чем в три раза при сравнении отдельных клонов. Предполагают, что подобная вариабельность обусловлена действием внешних факторов.

Гораздо сложнее обнаружить идентичные нейроны для сравнения синаптических связей у позвоночных животных. Подобное исследование можно проводить на близнецах.

Некоторые костистые рыбы имеют идентифицируемые нейроны - маутнеровские клетки, а некоторые виды этих рыб способны к размножению без оплодотворения; т.е. мать и все её дочери генетически идентичны. Каждая особь имеет по одной гигантской маутнеровской клетке в каждой половине мозга. Отмечено, что паттерн ветвления дендритов маутнеровских нейронов у клонов сходен, но существуют индивидуальные различия в деталях ветвления и образуемых синапсах.



Рис.2.1. Вероятная схема работы тормозного электрического синапса на маутнеровском нейроне рыбы.

1 - нервное окончание, 2 - начальный сегмент аксона маутнеровской клетки, 3 - глиальная «чашечка». Стрелкой показано направление тока, порождаемого потенциалом действия нервного окончания.

Интересны результаты экспериментального увеличения массы мозга у рыб. Путем трансплантации соответствующего коре млекопитающих отдела мозга (tectum) на ранних стадиях эмбрионального развития был экспериментально увеличен этот отдел мозга у африканской рыбки (Tilapia macrocephala). Это привело к заметному улучшению ее интеллектуальных способностей.

Рис.2.2., Рис.2.2.а Африканская рыбка (Tilapia macrocephala) «поумневшая» в результате экспериментального увеличения одного из отделов мозга

Описаны межлинейные различия в структурной организации проводящих путей головного мозга у мышей. Так, у линий, характеризующихся крайней агрессивностью, высокой двигательной активностью или хорошей обучаемостью, наблюдались разнообразные отклонения от нормальной организации проводящих путей, например, некоторая редукция мозолистого тела, изменение положения передней комиссуры, и некоторые другие отклонения в позиции проводящих путей, которые могли служить основой структурной пластичности мозга и причиной наследственной изменчивости в поведении. Генетический анализ показал, что выявленная изменчивость в структурной организации проводящих путей детерминирована полигенно.

Отдельные неврологические мутации у мышей также вызывают те или иные структурные изменения в нервной системе: нарушение послойности коры головного мозга, клеточных взаимодействий в ткани мозжечка, степени миелинизации нервных волокон.

У мышей известны многие мутации, влияющие на нервную систему. У некоторых мутантов отсутствуют определённые участки мозга. У других - наблюдаются специфические анатомические нарушения, такие как дефекты миелинизации или дезорганизация характерных клеточных образований, нарушение послойности коры головного мозга.

Одна группа мутаций, особенно заинтересовавшая исследователей, включала различные моногенные нарушения, влияющие на постнатальное развитие мозжечка. Все они получили названия, четко характеризующие сопутствующие локомоторные нарушения: reeler (вертящийся), staggerer (шатающийся) и weaver (покачивающийся).

Рис. 2.3. Мутации, нарушающие развитие мозжечка у мышей.

а) Мозжечок нормальной мыши; б) Мозжечок мутанта weaver;

в) Мозжечок мутанта reeler.

Мозжечок мутантов reeler характеризуется аномальным расположением клеток. Наблюдается отсутствие характерных слоёв клеток в мозжечке, гипокампе или коре мозга.

Мозжечок мутантов weaver содержит намного меньше гранулоцитов, по сравнению с нормальным мозжечком, вследствие нарушения способности данного типа клеток нормально мигрировать. Гранулярные клетки мышей weaver не способны вырабатывать белок САМ (белок cell adhesion molecule). Это соединение, которое обеспечивает гранулярным клеткам способность присоединяться или мигрировать вдоль глиальных клеток. Уровень гранулярных клеток у мутантов не достигает нормы, а в мозжечке не формируется нормальная ламинарная (послойная) организация.

Р.Гринспан с сотрудниками описал мутантов плодовой мушки Drosophila, которые были нормальными во всех отношениях, за исключением того, что имели нарушения памяти. Эти мутанты, названные dunce («тупица»), amnesiac («с амнезией») и turnip («репа»), либо были не способны к обучению, либо могли обучаться, но быстро всё забывали. Дефекты памяти были обусловлены биохимическими изменениями, происходившими вследствие инактивации генов и отсутствия или нарушений синтеза соответствующих белков.