Основы генетики

Эксперименты с одноклеточными организмами показали, что они избирательны по отношению к электромагнитному полю или токам в водных растворах. Так, например, парамеции и амёбы предпочитают отрицательный полюс, а другие инфузории -- положительный. Некоторые одноклеточные организмы не проявляют гальванотаксиса, но ориентируются вдоль или поперёк электромагнитного поля.

У простейших существуют сложные специализированные рецепторы -- органеллы. Такими рецепторами являются ложноножки корненожек Allogromia sp. или осязательные волоски трубача Stentor sp.

В качестве особой фоторецепторной системы формируются глазки, или стигмы. Эти образования пигментированы, позволяют простейшим ориентироваться в градиенте света и дифференцировать различные длины волн светового диапазона. Описаны эксперименты, в которых удавалось выработать рефлекторное поведение парамеций на красный и синий свет. Стигмы особенно хорошо развиты у динофлагеллат, эвглен и фитофлагеллат.

Надо отметить, что среди простейших существуют группы (Amoeba), прекрасно реагирующие на свет, но не имеющие специализированных мембранных органелл для его восприятия.

Хорошо развиты у простейших органоиды движения. Небольшой размер организма позволяет эффективно пользоваться приспособлениями ультраструктурного размера для перемещения, питания или агрессивного поведения.

Корненожки и амёбы образуют мембранные образования, называемые ложноножками, или псевдоподиями. Они позволяют многим простейшим двигаться и захватывать пищу.

Рис.4.1.а. Ложноножки позволяют многим простейшим двигаться и захватывать пищу.

Другие простейшие используют для движения простейшие довольно крупные жгутики или многочисленные мелкие реснички, которые позволяют перемещаться с невероятной скоростью.

У простейших существуют аналоги мышечных волокон -- мионемы, которые позволяют изменять форму тела или совершать сложные движения.

Но если есть активное движение, значит, можно наблюдать и быстрые поведенческие реакции, т.е. поведение.

Сложность поведения простейших поразила уже первых исследователей. Свободноживущие амёбы проявляют весьма разнообразные стратегии захвата пищи, реагируют на свет и колебания воды. Каждая неудача в захвате пищи вызывает применение нового приёма, разнообразие которых весьма велико. Этот пример говорит о том, что амёбы корректируют своё поведение в зависимости от результата. В реакции амебы на внешнее раздражение проявляется известная изменчивость: амеба привыкает к сигналам, и повторение однородных сигналов может при известных условиях перестать вызывать соответствующие реакции. И наоборот, как показали опыты, изменение сигнала вновь вызывают оживление угасшей реакции.

Прикреплённые инфузории тоже могут демонстрировать элементарные поведенческие реакции. Широко известны результаты опытов с трубачом (Stentor roeseli) (Рис. 4.1.), которого посыпали растёртым кармином. Первоначальная реакция на частицы кармина отсутствует, а затем трубач смещает воронку в сторону от падающих частиц. Если это не помогает, то он начинает активно работать околоротовыми ресничками, пытаясь выбросить уже попавшие в воронку частицы и предупредить попадание новых. При продолжении воздействия трубачи интенсивно сокращают свой стебелёк, и, в конце концов, отрываются от поверхности и уплывают в другое место.

Если трубач не уплыл, а воздействие прекращено, то животное ненадолго запоминает ситуацию. При возобновлении посыпания кармином трубач уже не демонстрирует все стадии рецептивной адаптации. Он сразу начинает с прерванной стадии и обычно уплывает. Это говорит том, что инфузории обладают формой донервной памяти, которая сохраняется несколько десятков минут.



Рис.4.1. Stentor roeseli может демонстрировать элементарные поведенческие реакции

О том, что одноклеточные могут использовать предыдущий «опыт», говорят и другие эксперименты. Например, помещенные в круглый сосуд одноклеточные, вначале двигаются хаотично, но после того, как животные многократно ударяются о стенки сосуда, направление их движений меняется и приобретает характер вписанного в круг многоугольника, при котором они начинают испытывать минимальное количество ударов. Их движение приобретает организованный структурный характер.

Аналогичные данные получены в опыте, при котором одноклеточные помещались в квадратный сосуд. Формы движения, которые приобретали животные в этом случае, принимали другой характер, и животные начинали двигаться по траектории ромба, вписанного в квадрат, при минимальном количестве ударов о стенки сосуда.

Но такое «научение» простейших имеет ряд особенностей, резко отличающих их от условно-рефлекторных форм деятельности высших животных. Прежде всего, изменения поведения, полученные в процессе такого «научения», оказываются очень непрочными и быстро угасают, как только внешние условия перестают поддерживать вызванные к жизни формы поведения. С другой стороны, эти формы поведения, раз угаснув, не восстанавливаются самостоятельно, и животное, потерявшее эти формы поведения, должно «обучаться» снова. Наконец, раздражители, действующие на простейших, имеют кратковременное сигнальное значение. У животного не вырабатываются те стойкие формы сигнального поведения, которые характерны для условно - рефлекторной деятельности высших животных.

Набор донервных способов контроля поведения простейших позволяет:

· осуществлять рецепцию всех основных типов внешних воздействий;

· отвечать на полученные сигналы пищевым поведением, размножением или движением по градиенту сигнала;

· демонстрировать привыкание к определённым типам воздействий или избегание раздражителя.

Инерционная биохимическая память одноклеточных рассматривается исследователями как своеобразный предшественник нейронной памяти многоклеточных животных. Основным принципом донервного взаимодействия с внешней средой является общая клеточная чувствительность, которая имеет избирательный характер.

Отсутствие оперативной индивидуальной памяти компенсируется у одноклеточных животных генетически детерминированными реакциями или направленным морфогенезом.

4.2 Генетика поведения инфузорий

Ресничные одноклеточные Paramecium и Tetrahymena представляют собой прекрасные модели для изучения генетики поведение простейших. При изучении этих объектов можно использовать и поведенческий, и электрофизиологический, и биохимический и генетический подход. Анализ поведения простейших, как правило, включает изучение физиологического состояния клетки, поиск поведенческих мутантов и их отбор, а также исследование влияния различных химических веществ (лекарственных препаратов и пр.).

Поскольку парамеции являются довольно крупными (до 250 мкм в диаметре), они легко могут быть использованы для наблюдения поведения, поисков поведенческих мутантов и электрофизиологического анализа. Tetrahymena обладает сравнительно высокой скоростью гомологической рекомбинации и используется для создания трансгенных линий и стабильных нокаутных мутантов по отдельным генам.

Поведение простейших особенно подробно изучено на примере Paramecium aurelia. Локомоторные реакции парамеции находятся под контролем поверхностной мембраны. Направление и частота биения ресничек коррелируют со сдвигом электрического потенциала мембраны, обусловленным изменениями потенциалзависимой проводимости кальция. Изменения направления движения ресничек вызывают изменение направления перемещения парамеции.

Рис. 4.2. Paramecium aurelia.

Репертуар поведения свободноживущих инфузорий заключается в том, что при действии химического или физического стимула они демонстрируют смену направления биения ресничек. Показано, что подобные локомоторные реакции находятся под контролем поверхностной мембраны. Направление и частота биения ресничек коррелируют со сдвигом электрического потенциала мембраны, который обусловлен изменениями потенциалзависимой проводимости кальция. Изменения направления движения ресничек вызывают изменение направления перемещения парамеции.

Роль специфических ионных каналов в каскадной передаче сигналов и в последующих изменениях подвижности инфузорий была выявлена при сравнении клеток дикого типа с некоторыми поведенческими мутантами.

Ученые получили сотни мутантных линий Paramecium aurelia. При помощи поведенческого, электрофизиологического и генетического анализов в этих работах показаны физико-химические механизмы адаптивного поведения простейших.

Установлено, что большинство мутаций, которые затрагивают поведение, локализованы в несцепленных локусах и наследуются согласно менделеевским законам. Электрофизиологический анализ показал, что следствием подобных мутаций зачастую является нарушение или исчезновение одного или более ионных токов, деполяризующих или реполяризующих мембрану при реакции избегания.

Известны мутанты Pawn (что значит пешка, передвижение которой по шахматной доске имеет определенные ограничения). Они в отличие от особей дикого типа не могут плыть назад и могут быть температурочувствительными. Всего выделяют несколько несцепленных локусов, мутанты по которым характеризуются фенотипом Pawn: pwA, pwB, pwC.

Ещё одна мутация Paramecium tetraurelia (d4-662), сначала характеризовавшаяся как четвёртый локус Pawn - мутация pwD - фактически оказалась аллелью pwB (pwB662). Показано также, что аллели pwB взаимодействуют между собой.

Мутация Pawn проявляется в специфическом моногенном дефекте, связанном с отсутствием возбудимости мембраны, несущей реснички. Реснички при этом не затрагиваются мутацией. При морфологических исследованиях у парамеций были обнаружены нити, связывающие основания ресничек (базальные тельца). Предполагалось, что система этих нитей координирует движение ресничек, однако доказательств этому не получено.

Прочтение генома инфузории Tetrahymena thermophila показало, что генетический код, используемый инфузорией, оказался несколько иным, чем у всех других организмов: стоп-кодоны у тетрахимены могут использоваться для кодирования аминокислот. Кроме того, выяснилось, что эта инфузория умеет эффективно удалять из рабочих копий своего генома весь «мусор» -- повторяющиеся и чужеродные фрагменты. Потомство, однако, всегда получает в наследство «неочищенный» вариант генома.

Рис. 4.3. Tetrahymena thermophila

У тетрахимены, как у всех инфузорий, есть два клеточных ядра -- маленький микронуклеус, содержащий две копии генома (пять пар хромосом), и большой макронуклеус с многократно дуплицированным геномом (несколько сотен хромосом).

Микронуклеус хранит наследственный материал для передачи следующим поколениям, но его гены практически не работают. Гены макронуклеуса, наоборот, активно работают - транскрибируются -- считываются и используются для синтеза белков, но они не могут быть переданы потомкам.

Инфузории, как и другие простейшие, размножаются делением, причем делятся оба ядра. Однако такое бесполое размножение не может длиться бесконечно долго: рано или поздно инфузории должны сливаться попарно и обмениваться наследственным материалом. В ходе этого полового процесса (конъюгации) макронуклеус разрушается вместе со всеми своими генами.

В обмене наследственным материалом участвуют только микронуклеусы. Поэтому следующее поколение инфузорий (образовавшееся после полового процесса) получает лишь те гены, которые хранились в микронуклеусах родителей. Микронуклеус снова делится пополам, и одно из дочерних ядер начинает расти и превращается в новый макронуклеус.

Ученые установили, что в ходе образования макронуклеуса геном не только многократно дублируется, но и модифицируется: длинные хромосомы разрезаются на несколько более мелких, некоторые фрагменты генома удаляются, другие меняются местами.

Исследователям удалось прочесть геном макронуклеуса. Он оказался неожиданно велик, причем не столько по своей длине (105 миллионов пар оснований -- это в 30 раз меньше, чем у человека, и примерно во столько же раз больше, чем у среднестатистической бактерии), сколько по числу генов. Геном одноклеточной тетрахимены содержит свыше 27 тысяч генов, которые кодирую различные белки. Это примерно столько же, сколько геном человека и значительно больше, чем другие прочтенные геномы одноклеточных.

Еще одна необычная особенность генома инфузории состоит в чрезвычайно низком содержании повторяющихся нуклеотидных последовательностей и мобильных генетических элементов (транспозонов): они занимают всего 2% генома (для сравнения - у человека -- около 50%).

Функциональная роль повторяющихся последовательностей остается неясной. Возможно, некоторые из этих последовательностей важны для регуляции экспрессии генов. Кроме того, известно, что многочисленные повторы и мобильные элементы придают геному пластичность и повышают вероятность различных геномных перестроек (например, транслокаций -- перемещений фрагментов ДНК на другую хромосому или на новое место в той же хромосоме).

Исследователи пришли к выводу, что низкое содержание повторов и мобильных элементов в геноме макронуклеуса тетрахимены объясняется тем, что почти весь «мусор», имеющийся в геноме микронуклеуса, удаляется при формировании большого ядра.

Повторы, очевидно, не нужны для нормальной работы генов и для жизнеобеспечения организма, они удаляются из «рабочей копии» генома. Но они передаются потомкам, возможно для того, чтобы геном сохранял пластичность. Вероятно, это адаптация, направленная на оптимизацию эволюционного процесса.

В геноме инфузории используется только один стоп-кодон, а не три, как у большинства других живых организмов. У тетрахимены роль стоп-кодона выполняет только одна последовательность нуклеотидов -- УГА. Два другие классические стоп-кодона (УАА и УАГ) у тетрахимены кодируют аминокислоту глутамин.

Впрочем, и триплет УГА у тетрахимены не всегда обозначает конец гена. В некоторых случаях (это зависит от нуклеотидного «контекста») эти три нуклеотида кодируют редкую аминокислоту селеноцистеин.

Тетрахимена оказалась единственным из изученных на сегодняшний день организмов, у которого могут транслироваться все 64 триплета.

Ученые получили поведенческие мутанты Tetrahymena, неспособные плыть назад вследствие специфического нокаута гена, кодирующего динеин.

У Tetrahymena thermophila дикого типа при помощи видео дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии обнаружена интересная поведенческая реакция, способствующая завершению цитокинеза. Этот процесс, названный ротокинезом облегчает физическое разделение дочерних клеток.

Ротокинез включает постоянное однонаправленное вращение одной из образующихся дочерних клеток вокруг оси, проходящей вдоль цитоплазматического мостика, соединяющего дочерние клетки. Предполагают, что вращающий момент, генерируемый ротокинезом, может ослаблять цитоплазматический мостик между предполагаемыми дочерними клетками, тем самым увеличивая вероятность успешного цитокинеза. Механизм, который обеспечивает именно такое финальное разделение клеток в конце цитокинеза изучен не полностью.

Нокаутные по генам, кодирующим kinesin-II гомологичные молекулярные моторы Kin1p и Kin2p, линии Tetrahymena thermophila парализованы вследствие полной утраты ресничек и подвержены частым нарушениям цитокинеза. Наблюдения за живыми делящимися клетками показали, что формирование борозды деления у двойных kinesin-II нокаутов идёт нормально вплоть до последней стадии разделения клеток.

У тетрахимены описана также мутация dcc (defective in ciliogenesis and cytokinesis - дефект биогенеза ресничек и цитокинеза), вследствие которой у особей наблюдаются нарушения биогенеза ресничек. Они неспособны восстанавливать подвижность после децилиации и неспособны к полноценному цитокинезу.

Преимущества Paramecium и Tetrahymena формируют основу для генетического анализа функциональных компонентов сенсорной трансдукции и адаптационных реакций этих животных.

4.3 Генетика поведения Dictyostelium discoideum

Dictyostelium discoideum (диктиостелиум) -- это клеточный слизевик, относящийся к типу Mycetozoa. Описанный в 1935 году диктиостелиум вскоре стал одним из интереснейших модельных организмов в клеточной биологии, генетике и биологии развития.

Рис.4.4. Dictyostelium discoideum - модельный организм в клеточной биологии, генетике и биологии развития.

Большую часть жизни диктиостелиум проводит в виде одиночных почвенных амеб, однако при определенных условиях эти амебы образуют подвижные агрегаты, а затем многоклеточные плодовые тела сложного строения. Происходящие при этом процессы межклеточной сигнализации, клеточной дифференцировки и морфогенеза позволяют использовать его в качестве модельного объекта.

В природе Dictyostelium discoideum обитает в почве и подстилке (влажном листовом опаде). Одиночные амёбы Dictyostelium discoideum питаются в основном бактериями - их привлекает выделяемая бактериями фолиевая кислота.

Жизненный цикл диктиостелиума начинается с того, что его споры высвобождаются из зрелых плодовых тел и разносятся ветром. При достаточно высокой влажности и температуре из спор выходят миксамёбы -- одноклеточная стадия развития диктиостелиума. При достаточной влажности и наличии пищи они питаются и делятся с помощью митоза.

При исчерпании пищи начинается агрегация миксамёб. На этой стадии в клетках миксамёб синтезируются специфические гликопротеиды и аденилатциклаза. Гликопротеиды обеспечивают межклеточную адгезию, а аденилатциклаза синтезирует цАМФ.

Рис.4.5. Образование цАМФ

цАМФ, секретируемый в среду, служит, как и у бактерий, сигналом «клеточного голода». У диктиостелиума цАМФ также является хемоаттрактантом для голодных миксамёб. Несколько случайно оказавшихся радом и «склеившихся» первыми миксамёб служат центром, к которому привлекаются и ползут со всех сторон голодные миксамёбы. Соединяясь с помощью молекул клеточной адгезии, они образуют агрегат из нескольких десятков тысяч клеток.

Изначально плоский агрегат совершает сложные движения, приподнимается над субстратом, а затем ложится на бок и превращается в мигрирующего «слизня» -- подвижный псевдоплазмодий длиной 2-4 мм.

Псевдоплазмодий мигрирует всё время одним концом вперед, и в его составе начинается дифференцировка клеток. Часть клеток на переднем конце образуют полисахаридную оболочку. Псевдоплазмодий мигрирует сквозь неё, и какая-т ее часть остается на субстрате в виде слизистого следа.

Псевдоплазмодий движется по направлению к свету, более высокой температуре и большей сухости воздуха.

цАМФ и вещество, известное как фактор индукции дифференцировки (DIF), стимулируют дальнейшую дифференцировку и формирование нескольких типов клеток.

На переднем конце псевдоплазмодия оказываются клетки -- предшественники стебелька плодового тела, а на заднем -- клетки-предшественники спор. После окончания миграции в подходящих условиях клетки псевдоплазмодия совершают сложные перемещения и формируют соответствующие части плодового тела.

«Сходные с передними» (аnterior-like) клетки, открытые сравнительно недавно, распределены по задней половине тела псевдоплазмодия. Эти клетки формируют подставку (самую нижнюю часть плодового тела).

После остановки псевдоплазмодия за счет перемещения клеток формируются «стадия сомбреро», а затем начинается кульминационная фаза формирования плодового тела.

В ходе этой фазы передние и задние клетки псевдоплазмодия меняются местами. Передние клетки «сомбреро» формируют целлюлозные клеточные стенки и собираются в полый трубчатый стебелек, по наружной поверхности которого клетки -- предшественницы спор мигрируют вверх, а остальные клетки -- предшественницы стебелька -- вниз.

Полностью сформированное плодовое тело высотой 1-2 мм образуется через 8-10 часов после начала этой фазы. После созревания спор на его вершине споры рассеиваются, и цикл начинается снова.

Рис.4.6. Плодовое тело Dictyostelium discoideum

Рис.4.7. Жизненный цикл Dictyostelium discoideum

Рис.4.8. Микрофотографии жизненного цикла Dictyostelium discoideum

Кроме описанной выше бесполой части цикла, в жизненном цикле диктиостелиума может происходить и половое размножение. Переход к половому размножению может запускаться подсыханием подстилки, где живут миксамёбы. Сливаясь, две миксамёбы разных типов спаривания образуют зиготу -- «гигантскую клетку». Зигота начинает заглатывать окружающих миксамёб. Проглотив несколько сотен миксамёб, зигота выделяет толстую целлюлозную оболочку, формируя так называемую макроцисту.

Макроциста делится сначала с помощью мейоза, а затем с помощью митоза, формируя множество гаплоидных миксамёб. Выходя из-под оболочки макроцисты, они начинают питаться и размножаться бесполым путём. Таким образом, в жизненном цикле Dictyostelium discoideum единственная диплоидная стадия -- это зигота.

Преимущества диктиостелиума как модельного объекта -- относительно простое строение, небольшое число типов клеток, а также короткий жизненный цикл и простота выращивания в лабораторных условиях.

Хемотаксис у Dictyostelium discoideum изучается на примере движения миксамёб по направлению к источнику секреции цАМФ. В секреции цАМФ и скорости передвижения миксамёб наблюдается цикличность с определенным периодом. Интересно, что использование цАМФ в качестве хемоаттрактанта не описано ни у одного другого организма. В прокариотических и животных клетках цАМФ служит внутриклеточным сигналом, а Dictyostelium discoideum - единственный организм, у которого цАМФ действует еще и как внеклеточная сигнальная молекула

При формировании плазмодия отдельные клетки слизевика агрегируют в результате хемотаксиса. Одна из реакций на голодание у миксамеб состоит в том, что они начинают вырабатывать и выделять цАМФ, который служит хемотаксическим сигналом, привлекающим других миксамеб. Агрегация инициируется случайным образом: любые клетки, начинающие первыми секретировать цАМФ, привлекают другие клетки и таким образом становятся центрами агрегации. цАМФ, вырабатываемый такими «клетками-инициаторами», секретируется отдельными «импульсами» и связывается специфическими рецепторами на поверхности соседних голодающих амеб, направляя тем самым их движение в сторону источника цАМФ.

Такой хемотаксический ответ можно продемонстрировать, нанеся из микропипетки ничтожное количество цАМФ на любой участок поверхности клетки голодающей миксамебы. Ответом будет немедленное образование псевдоподии, растущей в сторону пипетки. Псевдоподия прикрепляется к поверхности, на которой находится клетка, и тянет клетку в том же направлении. Как только образуется центр агрегации, зона его влияния быстро расширяется, так как агрегирующие клетки не только отвечают на сигнал цАМФ, но и передают его от клетки к клетке.

Каждый импульс цАМФ побуждает соседние клетки не только к движению к источнику импульса, но и к испусканию собственного импульса в виде цАМФ. Этот новый, высвобождающийся с небольшой задержкой импульс в свою очередь ориентирует находящиеся рядом клетки, вызывая у них тоже выброс цАМФ, и т.д.

Таким образом возникают регулярные чередующиеся волны цАМФ, распространяющиеся из каждого центра агрегации, заставляя более удаленных миксамеб двигаться внутрь концентрическими или спиральными волнами. Преимущество такой системы передачи состоит в том, что по мере распространения из центра сигнал постоянно возобновляется, не ослабляясь на большом расстоянии.

Помимо активации сигнальной системы цАМФ голодание миксамеб Dictyostelium вызывает экспрессию сотен новых генов, и некоторые из них кодируют молекулы межклеточной адгезии, участвующие в агрегации клеток.

Амёбы Dictyostelium в последние годы стали излюбленным объектом биологов, изучающих эволюцию кооперации и социального поведения. Ученых интересуют скопления одноклеточных индивидуумов, которые создают идеальные условия для развития социального паразитизма и нахлебничества. Для того чтобы выжить, социальным организмам вроде диктиостелиума необходимо каким-то образом защищаться от нахлебников.

Исследования на диктиостелиуме, показали, что вероятность развития устойчивости в результате случайных мутаций у этого организма довольно высока. Ученые работали с двумя штаммами диктиостелиума -- «честными» амёбами дикого типа (условное обозначение штамма -- AX4) и одним из нескольких известных штаммов амёб-«обманщиков» (chtC). Если смешать амёб из этих штаммов в равной пропорции и начать морить их голодом, они образуют химерные (смешанные) плодовые тела. При этом «обманщики» занимают лучшие места в плодовом теле и превращаются в споры, предоставляя «честным» амёбам в одиночку строить ножку плодового тела. В результате среди образовавшихся спор резко преобладают споры обманщиков.

Ученые искусственно повысили темп мутирования у «честных» амёб AX4 при помощи генетических конструкций (плазмид), встраивающихся в различные участки генома диктиостелиума. В состав плазмиды входил ген устойчивости к антибиотику бластицидину S. Встраиваясь в разные места генома, эта плазмида влияла на работу близлежащих генов. Затем из множества получившихся амёб-мутантов взяли тысячу особей с разными мутациями и каждой из них дали возможность размножиться.

После этого стали вести отбор на устойчивость к нахлебникам, причем в качестве отбирающего агента использовались сами нахлебники. Амёб из тысячи мутантных штаммов смешивали в равной пропорции и объединяли с амёбами-обманщиками, причем последних было в четыре раза больше, чем честных амёб-мутантов. Смешанную популяцию морили голодом, заставляя образовывать плодовые тела. Затем собирали образовавшиеся споры и выводили из них амёб. Естественно, среди них преобладали обманщики chtC, но экспериментаторы убивали их всех бластицидином S (ведь все амёбы-мутанты имели ген, защищающий их от этого антибиотика). В результате получалась смесь амёб-мутантов, но из тысячи исходных штаммов в ней теперь преобладали те, кто смог лучше других противостоять обманщикам. Этих амёб снова смешивали с обманщиками в пропорции 1 : 4 и снова заставляли образовывать плодовые тела.

После шести таких циклов в популяции амёб-мутантов остались представители только одного из тысячи исходных штаммов. Авторы исследовали геном этих амёб и выяснили, что плазмида у них встроилась в ген DDB_G0271758, кодирующий белок с неизвестной функцией.

Выживший мутантный штамм назвали rccA (resister of cheater chtC A).

Рис.4.9. Социальный паразитизм у Dictyostelium а -- при избытке пищи амёбы живут поодиночке, растут и размножаются бесполым путем (делением); b-c -- при недостатке пищи амёбы собираются в большие скопления. d -- в результате образуются многоклеточные агрегаты длиной в несколько миллиметров. e-g --многоклеточный агрегат превращается в «плодовое тело» на ножке; при этом около 20% клеток жертвуют собой, образуя ножку (желтые клетки - «честные»), а 80% превращаются в споры и получают шанс продолжить свой род (синие клетки - «обманщики»).

Авторы убедились, что амёбы rccA действительно защищены от нахлебничества со стороны обманщиков-chtC. Если смешать тех и других в равной пропорции, то споры в химерных плодовых телах образуются тоже в равной пропорции -- следовательно, жульнические приемы амёб chtC, в чём бы они ни заключались, бессильны против амёб rccA. Однако другой штамм амёб-обманщиков, LAS1, успешно паразитировал на амёбах rccA. Следовательно, мутация в гене DDB_G0271758 защитила амёб не от любых обманщиков, а только от вполне определенных.

Исследователи также проверили, не стал ли устойчивый штамм rccA сам «обманщиком» по отношению к исходному штамму AX4. Теоретически, один из способов одолеть обманщика в эволюционной «гонке вооружений» -- это самому стать еще более искусным обманщиком. Подобное соревнование между обманщиками в итоге может привести всю систему, основанную на кооперации, к полному краху. Однако в данном случае этого не произошло: штамм rccA остался вполне «честным» по отношению к AX4.

Эксперименты со смешанными культурами, состоящими из равного количества амёб AX4 («диких»), chtC («обманщиков») и rccA («защищенных»), показали, что амёбы rccA защищают от обмана не только себя, но и диких амёб AX4 (хотя и в несколько меньшей степени). Присутствие амёб rccA каким-то образом мешает обманщикам chtC вытеснять амёб AX4 из выгодных позиций в плодовых телах. Ясно, что взаимопомощь честных штаммов открывает дополнительные возможности для борьбы с обманщиками.

Исследование показало, что вероятность появления мутаций, обеспечивающих защиту от нахлебников, у диктиостелиума весьма высока. Присутствие нахлебников способствует распространению защитных мутаций. Это должно приводить к эволюционной «гонке вооружений» между обманщиками и честными амёбами: первые совершенствуют средства обмана, вторые -- средства защиты. Для того чтобы защититься от обманщиков, амёбы не обязаны сами становиться обманщиками. Это способствует сохранению кооперации.

Генетические механизмы обмана и защиты от него пока остаются неизвестными, но скорее всего они связаны с системами межклеточной коммуникации и взаимного узнавания.

Глава 5. Генетика поведения беспозвоночных животных

5.1 Генетика поведения круглых червей

Основные закономерности биологии прокариот установлены в работах на E.coli, биологии эукариот - на дрожжах Saccharomyces cerevisiae, а среди многоклеточных животных самым изученным, пожалуй, является Caenorhabditis elegans (произносится как «ценорабдитис элеганс»). Это животное, которое легко культивировать, оно быстро развивается. Это маленькая (около 0,5 мм в длину) свободно живущая нематода.

Нематода (круглый червь) Caenorhabditis elegans -- замечательный модельный объект для самых разнообразных исследований. В 2002 году Сиднею Бреннеру, который первым начал использовать этого червя в качестве модельного объекта в генетических и эмбриологических исследованиях, была присуждена Нобелевская премия.

Рис. 5.1. Сидней Бреннер

Одной из первых задач, которые поставил перед собой Сидней Бреннер и его сотрудники, было построение полной диаграммы строения нервной системы червя. Тело каждой нормальной особи Caenorhabditis elegans содержит ровно 302 нейрона и 56 глиеподобных клеток. Все эти клетки, их морфология, расположение в пространстве, а также способы их соединений между собой и с мускульными клетками были полностью описаны много лет спустя после начала проекта. В 1986 году вышел объемный труд, обобщающий многолетние исследования, с подзаголовком, который дал ему Бреннер: «Сознание червя» («The Mind of a Worm»). Ученые выяснили, что процесс развития Caenorhabditis elegans является очень строго упорядоченным. Это значит, что судьба каждой клетки эмбриона определена с самого начала, и можно с очень высокой степенью точности прогнозировать, какие клетки разовьются из данной клетки личинки. Каждая эмбриональная клетка-родоначальница дает начало своей линии клеток взрослого организма, формирующих определенную ткань. Бреннер и его группа описали все существующие у Caenorhabditis elegans клеточные линии и проследили их судьбу под микроскопом. Решающую роль в этих исследованиях сыграл Джон Салстон.

Рис.5.2. Джон Салстон.

Теперь, если возникает необходимость определить значение какого-нибудь воздействия (или мутации) на развитие червя, это можно сделать очень корректно, так как благодаря работе группы Бреннера все развитие Caenorhabditis elegans на клеточном уровне описано до мельчайших деталей.

Рис.5.3. Caenorhabditis elegans

Сам Бреннер сфокусировал исследования на наборе генов червя, изменения в которых, как он продемонстрировал, влияли на работу мускулатуры и передвижение Caenorhabditis elegans. Он назвал их unc - генами, из-за того, что мутации в них приводили к некоординированным (uncoordinated) движениям. Впоследствии стало ясно, что unc-гены влияют не только на координацию движений, но также вовлечены в формирование и развитие нервной системы.

Бреннер, наряду с Салстоном, стал вдохновителем проекта по описанию генома Caenorhabditis elegans, полное картирование которого было завершено к концу 1998 года.

Генетический аппарат Caenorhabditis elegans достаточно простой: в 6 парах гомологичных хромосом содержится, около 3000 генов. Гаплоидный геном содержит 80 млн. пар нуклеотидов (в 17 раз больше, чем у E.coli и в 38 раз меньше, чем у человека).

С помощью мутационного анализа идентифицировано около 800 генов. Среди них гены, влияющие на форму и поведение червей, гены, кодирующие миозин и гены, контролирующие характер и направление развития, гены гибели и долголетия. Получена библиотека генома в виде большого набора перекрывающихся фрагментов ДНК.

Тело нематоды прозрачно, поэтому можно прижизненно наблюдать деление, миграцию и дифференцировку клеток, а также описывать генеалогические отношения и поведение всех клеток, начиная со стадии одноклеточного яйца и кончая взрослым животным.

Бреннер индуцировал у Caenorhabditis elegans множество поведенческих мутаций и попытался выявить корреляцию поведенческих реакций со структурными и молекулярными особенностями этих мутантов.

Caenorhabditis elegans -- гермафродит, для которого характерно самооплодотворение, причем сначала продуцируется и запасается сперма, а затем развиваются и откладываются яйца, около 300 у каждой особи. Продолжительность жизненного цикла при температуре 20° С составляет от 3 до 4 суток.

Самооплодотворение способствует возникновению гомозиготности, но у одной и той же особи могут возникать различные индуцированные мутации, поэтому в результате нерасхождения хромосом в мейозе постоянно появляется некоторое число самцов (0.1%), которые при скрещивании с гермафродитами переносят ту или иную мутацию, которую и используют в качестве генетической метки.

Caenorhabditis elegans весьма удобен для изучения генетики поведения, поскольку его легко разводить в лабораторных условиях, он имеет гаплоидный набор из шести хромосом, соответствующих шести группам сцепления.

У Caenorhabditis elegans довольно высок процент клеток, подверженных апоптозу в ходе нормального развития: одна из каждых шести клеток генетически запрограммирована к гибели. Эта гибель полоспецифична, так что гибель одной клетки у эмбрионов одного пола не означает, что погибнут гомологичные клетки у эмбрионов другого пола.

Симметрия у Caenorhabditis elegans также формируется своеобразно, порой не в результате симметричного деления клеток, а благодаря их активным перемещениям.

Как и у других организмов, важную роль в развитии нематод играют гомеозисные гены. У Caenorhabditis elegans, например, у мутантов по локусу Пп-12 нарушено развитие вульвы, эти мутанты стерильны. Вероятно, как и у дрозофилы, функционирование гомеозисных генов регулирует процесс регионализации нервной системы нематод.

Caenorhabditis elegans имеет цилиндрическое, волосовидное, несегментированное тело, оставляющее на агаре в чашке Петри легко различимый след, который можно регистрировать и анализировать. Эти видимые бороздки в агаре могут проходить вдоль градиента аттрактантов, вроде химических соединений (циклические нуклеотиды), катионы, щелочные значения рН.

Характер расположения бороздок отражает особенности поведения:

· ориентацию -- движение вдоль градиента концентрации, включая «боковое» движение головы червя;

· скопление -- постоянное скопление большого числа нематод в какой-либо особой точке градиента;

· привыкание -- наблюдаемое после того, как контейнер и его содержимое делаются привычными для особи.

Анализ различных мутантов, характеризующихся дефектами кутикулы, позволил прийти к выводу, что ориентирование в химическом градиенте обусловливается сенсорными органами, расположенными на голове животного. Мутантные черви со вздутиями в дистальной части хвоста ориентируются нормально, в то время как наличие таких вздутий на голове делает ориентацию невозможной.

Еще в начале работы с Caenorhabditis elegans была описана мутация age-1, при которой продолжительность жизни увеличивается до 34 дней.

Другая группа мутаций, влияющих на продолжительность жизни, связана с особенностями жизненного цикла этой нематоды. По окончании эмбриогенеза из яйца выходит личинка первой стадии (L1), которая затем проходит фазы L2, L3 и L4, после чего особь становится половозрелой.

Однако в жизненный цикл Caenorhabditis elegans может включаться еще одна, специфическая стадия - стадия покоящейся личинки, называемой «дауером» (dauer) -- стадия d. В таком состоянии животное успешно переживает неблагоприятные условия среды, например перенаселение или недостаток пищи.

Стадия d может наступить в период после стадии L2 вместо L3. При восстановлении пригодных для жизни внешних условий и стадии d червь переходит в стадию L4.

Ученые предполагают, что в стадии d у животного происходит своеобразное выключение процессов старения, поскольку подобные покоящиеся личинки могут оставаться жизнеспособными на срок до 1 года.

Рис.5.4. Жизненный цикл Caenorhabditis elegans

Выявлено семейство генов daf, участвующих в формировании стадии покоящейся личинки. Манипулируя условиями выращивания личинок с мутацией гена daf-2, можно получить особей, которые почти столь же жизнеспособны, как и особи дикого типа, но длительность их жизни значительно увеличена -- до 43 дней.

Личиночное развитие Caenorhabditis elegans контролируется активностью четырех классов хемосенсорных нейронов. При этом выбор между нормальным развитием и развитием в упомянутую личиночнуюформу - «dauer larva» -регулируется конкурирующими средовыми стимулами: пища и «dauer pheromon» (специфический феромон).

Гибель нейронов классов ADF, ASG, ASI и ASJ приводит к тому, что животные развиваются как «dauer»-личинки независимо от средовых условий. Анализ мутантов, дефектных по «dauer formation» показывает, что хемосенсорные нейроны активны в отсутствие сенсорных входов и что «dauer» феромон тормозит способность этих нейронов генерировать сигналы, необходимые для нормального развития.

Было показано, что у нематод имеется два различных состояния -- активное и относительно неподвижное. С помощью видеокамеры исследователи фиксировали положение червя каждые 10 секунд и затем, сравнивая картинки, оценивали активность движения червя на бактериальной питательной среде. В результате такого видеонаблюдения выяснилось, что перед каждой линькой (а линяет он 4 раза) червь двигается значительно реже и меньше и сохраняет неподвижность сравнительно дольше.

Между линьками проходило примерно 10-11 часов, из которых период малой активности занимал около 2 часов. Этот период относительного покоя был назван летаргическим.

Летаргический период сам по себе не однороден: несколько раз за это время червь совершает быстрые движения, то есть на фоне покоя фиксируются 10-15-секундные всплески активности.

Конечно, обнаруженное у нематод летаргическое состояние настоящим сном никто не считает, хотя некоторые черты этого состояния повторяют свойства сна у высших животных: во-первых, это замедленная реакция на раздражители по сравнению с активным состоянием; во-вторых, если некоторое время не давать червю «спать», то затем реакция на раздражители еще сильнее ослабляется, то есть летаргия становится более глубокой.

Реакцию на раздражители исследователи проверяли по скорости и разнообразию двигательных ответов на химический стимул и на механический толчок -- в обоих случаях было отмечено явное замедление реакции и снижение разнообразия реакций у животных в летаргическом состоянии. Депривация (лишение сна) достигалась путем механического раздражения червя. В результате нематода вынуждена была постоянно двигаться. Когда депривацию прекращали, червь немедленно переходил к летаргическому состоянию, и можно было проверять реакцию на стимулы.

И действительно, после 20-30-минутной депривации реакции на стимулы замедлялись, то есть «сон» становился более глубоким.

Таким образом, Caenorhabditis elegans переживает состояния покоя, во время которых чувствительность нейронов остается на прежнем уровне, так как специфические реакции на раздражители всё же фиксируются. Но зато в это время снижена скорость и эффективность обработки сигналов, идущих от чувствительных нейронов к мускулатуре. В результате замедляются и становятся менее разнообразными движения червя.

Одной из самых распространенных поведенческих моделей, используемых для анализа генетики поведения Caenorhabditis elegans, является пищевое поведение.

Глотка этой нематоды является «пищевым насосом», состоящим из трех частей:

· тела (corpus), которое поглощает бактерий;

· перемычки (isthmus), которая проводит бактерий к терминальной луковице

· терминальной луковицы (terminal bulb) в которой бактерии размалываются и проводятся в кишку.

Глотка окружена базальной мембраной и содержит 80 клеток, 20 из которых -- нейроны фарингеальной нервной системы (гомолог интрамуральной нервной системы пищеварительной трубки позвоночных). Эта система связана с остальной нервной системой парой нервов.

Наличие автономной иннервации позволяет глотке нормально функционировать в случае её изоляции in vitro. Только один из 20 нейронов (М4) существен для жизни. Он иннервирует задний отдел перемычки, и в случае его отсутствия она остается закрытой, бактерии не транспортируются для размалывания и переваривания, так что животное голодает.

Черви с интактным М4 нейроном и отсутствующими 19 другими жизнеспособны, хотя эти нейроны необходимы для нормального паттерна.

Леон Эйвери изолировал и охарактеризовал гены, которые контролируют присутствие или отсутствие, паттерн иннервации и функции 20 нейронов, ответственных за пищевое поведение. Было обнаружено 35 генов, локализованных во всех 6 хромосомах, и предполагается, что имеется еще столько же, отвечающих за данную форму поведения. Выявленные этим ученым 52 мутации по своему фенотипическому эффекту можно разделить на три группы:

· Мутанты eat действуют на подвижность фарингеальных мышц и, кроме того, на функционирование мышц стенки тела. Многие мутанты этого типа вызывают нарушение функций некоторых нейронов.

· Мутанты pha вызывают дефекты фаринкса, которые предотвращают нормальное пищевое поведение и часто вызывают дефекты в морфогенезе и клеточной спецификации.

· Мутанты phm обусловливают слабые или нерегулярные сокращения фарингеальных мышц. Они могут также нарушать нейральный контроль мышечной функции.

У Caenorhabditis обнаружены также система генов, контролирующих развитие хеморецепторов, которые реагируют на водорастворимые аттрактанты (биотин, лизин, сАМР, ионы натрия и хлора), летучие репелленты (октанол), летучие аттрактанты (диацетил, пиразин, иниазол, бензальдегид, изоамиловый спирт, тиазол), а также система генов, контролирующих развитие температурных рецепторов.

Было идентифицировано более 40 генов, кодирующих трансмембранные рецепторы. Эти «рецептороподобные» гены можно подразделить на 6 семейств (sra. srb, srg, srd, sre, srd), основываясь на сходстве последовательностей их ДНК.

Гены одного и того же семейства часто собраны в один кластер. Некоторые из этих кластеров могут коэкспрессироваться наподобие оперонной системы, однако, в некоторых случаях гены из одного кластера экспрессируются в разных нейронах. Предполагается, что в целом геноме Caenorhabditis elegans содержится более 100 генов, экспрессирующихся в хеморецепторах.

В последнее время идентифицированы гены, контролирующие нейрогенез у Caenorhabditis elegans: mec-3, определяющий наподобие гена cut у Drosophila специфичность типа нервной клетки и гены ипс-5, ипс-6, ипс-40, наподобие гена fas-l у Drosophila, контролирующие характер роста нервных отростков.

У Caenorhabditis elegans были получены разные поведенческие мутанты. Примерно у половины мутантов с нарушенным поведением были найдены отклонения в строении нервной системы. Их можно раз делить на 4 группы.

1. Изменения в клетках-предшественницах нейронов. Поскольку ход нормального развития нейронов из нейробластов изучен у этого вида достаточно хорошо, мутации в этих элементах легко обнаружить. Они могут проявляться в виде особенностей поведения на разных стадиях развития организма.

2. Изменения в специфичности синаптических связей. Поскольку соединения нейронов взрослой особи дикого типа уже известны возникающие вследствие мутаций структурные изменения синаптических соединений можно с достаточной надежностью сопоставить аномалиями поведения у таких животных.

3. Изменения в расположении отростков нейронов. Создана полная топографическая карта нервной системы Caenorhabditis elegans позволяющая выделить таких мутантов, у которых отростки нейронов идут к аномальным мишеням. Такие мутации изменяют направление прорастания и характер контактов у нейронов сразу нескольких классов. Очевидно, что изменения поведения при этом достаточно разнообразны.

4. Изменения в функции нейромедиаторов. Эту категорию эффектов оказалось возможным проанализировать с развитием методов иммуноцитохимии и биохимии. Данные о медиаторной специфичности конкретных нейронов, как правило, оказываются неточными.

Примером мутаций, нарушающих движения, может служить мутация roller, при которой червь перемещается, переворачиваясь через головной и хвостовой концы, и bent head: при этой мутации изменена анатомия головного конца, и вместо обычных «рыскающих» движений перемещение идет по спирали. Движения червя обеспечиваются элементами брюшной нервной цепочки. Ее нейроны и их соединения хорошо описаны, известны также и эмбриональные клетки-предшественницы этих нейронов. Выделяют пять классов нейронов, которые подразделяются на два главных типа: возбудительные нейроны, инициирующие движение животного вперед или назад, и тормозные нейроны, координирующие сокращения мышц двух сторон тела.

Одними из первых, описанными у Caenorhabditis elegans, были мутации группы Unc (uncoordinated).

Фенотипически группа мутаций Unc подразделяется на 3 категории:

· животные либо сохраняют неподвижность в покое, либо при стимуляции, которая в норме побуждает их двигаться вперед или назад, сокращаются все мышцы одновременно;

· животные не способны двигаться в одном из направлений (вперед или назад), а при соответствующей стимуляции закручиваются либо дорсальной, либо вентральной стороной кверху;

· животные неспособны двигаться по прямой, не извиваясь

Несмотря на относительную простоту, поведение Caenorhabditis elegans может видоизменяться в результате накопления индивидуального опыта. Экспериментально показано, что у этих животных могут происходить процессы: неассоциативного обучения -- привыкание к регулярно действующему стимулу (механическое сотрясение), растормаживание привыкания и сенситизация.

Микроскопическая нематода как объект генетики поведения дает возможность исследовать нейроморфологические основы примитивных поведенческих реакций.

5.2 Генетика поведения моллюсков

Слизни, улитки, устрицы, осьминоги - все это представители типа Моллюсков, который включает в себя почти 100000 видов. Эти мягкотелые животные демонстрируют очень разнообразное поведение. Некоторые моллюски, например осьминоги, обладают сложным поведением и ярко выраженными способностями к решению различного рода экспериментальных задач, а другие - демонстрируют только весьма простые и примитивные поведенческие реакции.

Наиболее изучаемыми поведенческими реакциями у моллюсков являются пищевое поведение, гальванотаксис, половое поведение, а также защитные реакции и реакции нападения.

Объект, на котором проведены классические эксперименты по физиологии поведения моллюсков - это Aplysia californica или морской заяц. Аплизия -- один из крупнейших представителей заднежаберных моллюсков. Жабры у аплизии расположены на правой стороне тела под складкой мантии (в мантийной полости). С боков тело аплизии прикрыто парой массивных лопастей, которые расправляются и, волнообразно сокращаясь, позволяют ей плыть довольно долгое время.

Нервная система Aplysia californica состоит всего из 20 000 нервных клеток. Они настолько крупные (в диаметре могут достигать до 1 мм), что их видно невооруженным глазом. Нервные клетки аплизии хорошо различаются: они окрашены в разные цвета.

На Aplysia californica проведены классические эксперименты по физиологии поведения моллюсков. В них показана роль индивидуальных нервных клеток (так называемых индентифицируемых нейронов) в формировании поведенческих реакций организма.



Рис.5.5. Aplysia californica - объект, на котором проведены классические эксперименты по физиологии поведения моллюсков

Используя в качестве модели нервную систему Aplysia californica, Эрик Кандел открыл молекулярные механизмы работы синапсов. Он доказал, что изменения в деятельности синапса являются основными в механизме памяти. Ученому удалось также доказать, что такой же тип формирования памяти, который был обнаружен во время изучения Aplysia californica, существует и у млекопитающих. Эрику Канделу в 2000 году присудили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за открытия, касающиеся преобразования сигналов в нервной системе, за объяснение того, как в простейшей системе из трех нейронов формируется кратковременная и долговременная память

Рис.5.6. Эрик Кандел

Нервная система аплизии состоит из четырёх парных ганглиев в головном конце животного. Один из головных ганглиев иннервирует глаза и щупальца; второй - мышцы рта. Другие два парных ганглия иннервируют ногу. Брюшной ганглий контролирует такие основные висцеральные функции как циркуляция, дыхание и размножение.



Рис.5.7. Брюшной ганглий Aplysia californica

В своих исследованиях Эрику Канделу и его сотрудникам удалось обнаружить и составить детальные карты идентифицируемых нейронов в ганглиях аплизии, особенно - в брюшном ганглии. Своё название - «идентифицируемые» - эти клетки получили потому, что они довольно крупные и похожи у разных особей.

Рис.5.8. Схема брюшного ганглия Aplysia californica

В нервной системе аплизии оказалось много идентифицируемых клеток. Это дало возможность трассировать нервные сети, опосредующие различные поведенческие реакции этого животного.

Эрик Кандел и его коллеги сумели показать на аплизии, что для формирования памяти -- как кратковременной, так и долговременной -- достаточно всего трех нейронов, определенным образом соединенных между собой. Память изучали на примере формирования условного рефлекса: моллюску осторожно трогали сифон, и тотчас вслед за этим сильно били по хвосту. После такой процедуры моллюск некоторое время реагирует на легкое прикосновение к сифону бурной защитной реакцией, но вскоре всё забывает. Если «обучение» повторить несколько раз, формируется стойкий условный рефлекс.