Основы генетики

Л.З.Кайданов создал новое направление в науке, связанное с раскрытием генетических последствий отбора по адаптивно важным признакам. Многие десятки лет Л.З. Кайдановым и его учениками выполняется уникальный по масштабам селекционно-генетический эксперимент, не имеющий аналогов в мире. Начиная с 1966 года на протяжении более 750 поколений проводится селекция родственных линий Drosophila melanogaster по репродуктивной функции. Отбор идет по поведенческому признаку - половой активности самцов и сопровождается тесным инбридингом.

Полученная в результате такой селекции линия с низкой половой активностью самцов (НА) характеризуется целым комплексом генетически контролируемых изменений, важнейшие из которых затронули нейроэндокринную систему.

Л.З. Кайдановым впервые было показано, что отбор линий по репродуктивной функции приводит к их дивергенции по составу мутаций, затрагивающих жизнеспособность. Селекция на снижение адаптивных качеств линии сопровождается резким увеличением генетического груза - мутаций, снижающих жизнеспособность. Отбор же в противоположном направлении приводит к увеличению доли квазинормальных и супервитальных хромосом.

Специальные исследования, в ходе которых изучаемые хромосомы были подвергнуты рекомбинационному анализу, показали, что практически каждая хромосома несет несколько мутаций, затрагивающих жизнеспособность. В составе многих хромосом, демонстрирующих квазинормальный эффект по влиянию на жизнеспособность своих гомозиготных носителей, были обнаружены супервитальные мутации. Эти мутации являются полудоминантными супрессорами, и их можно рассматривать как элементы компенсационного комплекса генов, обеспечивающего в соответствии с концепцией В.А. Струнникова выживание линий, насыщенных вредными мутациями.

Линия НА и другие инадаптивные линии характеризуются высокой частотой мутирования. В основе высокой мутабильности низкоактивных линий лежит, по-видимому, hobo-система мобильных генетических элементов (МГЭ). НА-линии отличаются от высокоактивных линий составом и локализацией hobo. Они различаются также по составу дефектных (делетированных) копий. Эти генетические особенности обусловливают значительный индукционный потенциал низкоактивных, но не высокоактивных линий в системе Н-Е гибридного дисгенеза.

Был найден способ усиления индукционного потенциала низкоактивных линий - изогенизация их хромосомного набора в условиях дисгенных скрещиваний. При этом установлено явление массовых неслучайных перемещений по геному копий хобо элемента. Таким образом, была раскрыта связь между направлением отбора и уровнем генетической нестабильности селектируемых линий.

Л.З. Кайданов вместе с профессором Института молекулярной генетики РАН В.А.Гвоздевым открыл явление адаптивных транспозиций мобильных генетических элементов (ретротранспозонов).

В геноме линии НА содержится несколько copia-подобных МГЭ. Их распределение по хромосомам стабильно в течение сотен поколений поддержания линий. Однако изменение приспособленности линии, произошедшее в результате перемены направления отбора, приводит к внезапным и координированным неслучайным транспозициям МГЭ по геному. По-видимому, изученные мобильные генетические элементы являются составной частью системы генотипа селектируемых линий, обеспечивающей стратегию преодоления вредных последствий инбридинга и отбора в минус-направлении.

Линии, полученные Л.З. Кайдановым, представляют собой уникальный материал для изучения генетики поведения дрозофилы.

Рис.1.19. Леонид Зиновьевич Кайданов

О развитии генетики поведения в конце ХХ начале ХХ1 века можно судить по ряду монографий.

В 1975 году вышла монография Л. Эрмана и П. Парсонса «Генетика поведения и эволюция», в которой авторы в качестве поведения рассматривают любые формы активности, проявляемой организмом как единым целым по отношению к окружающей среде, к условиям его существования. Однако основное внимание они уделяют тем сторонам мышечных, гормональных и нервных реакций организма на внешние условия, о которых с той или иной степенью достоверности известно, что они обладают наследственной природой.

В монографии Л.Н.Трут «Очерки по генетике поведения» опубликованной в 1978 году, рассматриваются вопросы факториальной генетики поведенческих реакций животных разных филогенетических уровней, некоторые аспекты эпигенетического контроля поведения, каналы онтогенетической реализации генотипа на уровне поведения.

В 2000 году вышла монография Л.И. Корочкина и А.Т.Михайлова «Введение в нейрогенетику». Книга посвящена актуальным проблемам современной нейрогенетики. Авторы рассматривают нейронную теорию как основу нейробиологии и нейрогенетики и на базе этой теории дают подробный анализ различных аспектов этих наук. Подробно описаны генетические системы, которые определяют выбор клеткой пути развития и характер дифференцировки нейронов. В монографии рассмотрены различные экспериментальные модели, используемые в нейрогенетике и генетике поведения, и теории, которые появились в ходе анализа результатов, полученных при исследовании этих моделей.

Данные современной науки об эволюции, онтогенезе и генетике поведения содержатся в учебнике З.А.Зориной, И.И. Полетаевой, Ж.И. Резниковой «Основы этологии и генетики поведения», вышедшей в 2002 году.

Вся история исследований в области генетики поведения убедительно доказывает, что поведенческие признаки так же генетически детерминированы, как и все остальные. Генетическая детерминация реализуется в процессе индивидуального развития, когда в результате функционирования соответствующих генетических систем формируются нейральные сети, выполняющие соответствующие поведенческие реакции, а различия в способностях к обучению и запоминанию связаны с различиями в эффективности функционирования этих сетей.

1.3 Понятие признака в генетике поведения

Генетическая изменчивость особей в популяции может проявляться по огромному числу признаков, в том числе и поведенческих. Для успешного проведения опытов по генетике поведения необходимо подобрать соответствующие поведенческие признаки. Это непростая задача.

Ученые исследовали самые разные поведенческие признаки у разных видов животных: предрасположенность к судорогам, общую возбудимость, локомоторную активность, ориентировочно-исследовательские реакции, разные аспекты репродуктивного поведения, классические и инструментальные условные реакции, реактивность к фармакологическим веществам.

Для удобства организации научных исследований поведенческие признаки разделили на группы согласно физиологическим функциям, лежащим в их основе (Рис. 1.20.)

Рис.1.20. Классификация поведенческих признаков в соответствии с физиологическим функциям, лежащим в их основе.

Разделение поведения на моторные и сенсорные, эмоциональные, социальные и «интеллектуальные» компоненты является во многом условным, но необходимым для дифференцировки их друг от друга. Реально эти поведенческие паттерны представляют пересекающиеся множества, где в каждом присутствуют компоненты всех остальных.

В эксперименте предварительное тестирование моторных и сенсорных функций позволяет избежать недостоверных положительных и отрицательных результатов при предъявлении более сложных поведенческих задач, например, с экспериментов по обучению, в которых используются сенсорные стимулы, а в ходе их выполнения участвует моторика.

Для успешного проведения экспериментов по генетике поведения необходимо подобрать соответствующий признак - «единицу поведения». В качестве таких «единиц» генетика поведения заимствовала из этологии комплексы фиксированных действий (КФД), которые представляют собой сложные стереотипные движения, образующие высокоорганизованную последовательность.

Термин КФД появился благодаря Конраду Лоренцу, который считал, что основу поведения, т.е. его базовые единицы, составляют специфичные для каждого вида животных движения, форма которых является постоянной, закреплённой генетически. Эти движения он назвал «инстинктивными действиями», а так же «наследственными координациями» (Erbkoordinationen -- нем.,), и именно последний термин, переведённый Нико Тинбергеном на английский язык как «fixed action pattern» (по-русски буквально -- фиксированная форма действия), с 50-х гг., закрепился в этологии для их обозначения. В русскоязычной литературе также переводились как: комплексы фиксированных действий (КФД) или фиксированные комплексы действий (ФКД).

Комплексы фиксированных действий оказались удобными для изучения благодаря своей чёткой выраженности и устойчивости. Генетическая изменчивость затрагивает не «рисунок», или паттерн (pattern), КФД, а преимущественно частоту его выполнения и пороги активации в тех или иных условиях, т.е. их пространственно-временные характеристики, что вполне поддается точному, количественному измерению.

Наследование видоспецифических особенностей в выполнении КФД можно анализировать, изучая поведение гибридов первого поколения от скрещивания особей родственных видов, у которых это поведение чётко различается, а также у особей с локальными мутациями, затрагивающими этот признак.

Среди примеров КФД, генетика которых хоть в какой-то степени изучена, можно отметить, например, гнездостроительное поведение у разных видов попугаев-неразлучников, материнское поведение (подтаскивание детёнышей к гнезду) у мышей отселектированных линий и другие поведенческие признаки.

Рис.1.21.а. Примеры «единиц поведения» - комплексов фиксированных действий. Пчела, строящая соты

Рис.1.21.б. Примеры «единиц поведения» - комплексов фиксированных действий. Выпрашивание пищи кукушонком

Как правило, для исследования роли генотипа в формировании поведения ученые выбирают либо те признаки, которые легко поддаются количественному учету, либо те признаки, которые легко измерить по степени выраженности.

Как же эти признаки связаны с генотипом?

Когда в 30-е годы сформировалась феногенетика -- направление, анализирующее пути и правила становления признака в процессе развития, то в рамках этого направления были установлены следующие принципы:

§ каждый ген влияет на все признаки в организме, хотя его влияние на некоторые из них может быть очень мало,

§ любой признак организма зависит от всего генотипа в целом.

Было показано, что влияние генов на фенотипические признаки может быть и непосредственным и опосредованным. Некоторые признаки, например первичная структура белка, определяются последовательностью нуклеотидов в данном гене. Другие признаки, более отдаленные от первичного эффекта гена, как правило, находятся под влиянием многочисленных генов. Поведенческие признаки, как правило, связаны с функцией конкретных генов не прямо, а опосредованно.

Если признак отдален от первичного эффекта гена несколькими «ярусами» биохимических процессов, то обнаруживается влияние некоего гена не только на исследуемый признак, но и на многие другие стороны строения, функций и поведенческих реакций организма. Это явление называется плейотропией. Плейотропия (от греч. рlйiфn -- более многочисленный, больший и trуpos -- поворот, направление) - множественное действие гена, способность одного гена воздействовать одновременно на несколько разных признаков организма.

Было показано, что проявление гена может быть многообразным и практически всем хорошо изученным генам присуща плейотропия. Например, гены, определяющие окраску шерсти у домовой мыши, влияют также на размеры тела; ген, влияющий на пигментацию глаз у мельничной огнёвки, имеет ещё десять морфологических и физиологических проявлений. У лабораторных мышей, имеющих мутацию brindled, отмечаются «вьющиеся» вибриссы, «ослабленная» окраска шерсти, тремор, а также ряд других аномалий. Эти проявления мутантного гена являются следствием нарушений в усвоении меди -- микроэлемента, необходимого для многих биохимических реакций.

Плейотропия часто распространяется на признаки, имеющие эволюционное значение, -- плодовитость, продолжительность жизни, жизнеспособность. Плейотропия свидетельствует о взаимосвязанности процессов клеточного метаболизма и биохимических механизмов онтогенеза, о наличии между первичным действием гена и его фенотипическим проявлением многих промежуточных звеньев, на которые могут влиять другие гены и факторы внешней среды.

Классическим примером плейотропии, связанным с поведенческими признаками дрозофилы было впервые обнаруженное А. Стёртевантом в 1915 году и подробно описанное в 1956 году М. Бэсток влияние мутации yellow на уровень половой активности мух. Широко известны также многочисленные плейотропные эффекты мутации альбинизма (нарушение остроты зрения, специфические особенности морфологии зрительных путей), обнаруживающиеся не только у лабораторных мышей и крыс, но и у многих других видов животных и даже человека. К плейотропным эффектам относятся множественные отклонения от нормы в развитии мозга мышей при неврологических мутациях.

Для количественного описания неоднозначного соответствия фенотипа генотипу выдающийся генетик Н.В. Тимофеев-Ресовский ввел понятия экспрессивности и пенетрантности генов.

Экспрессивностью называется степень выраженности рассматриваемого признака у организмов с одинаковым генотипом. Другими словами экспрессивность - это степень фенотипического проявления эффектов аллеля определенного гена у разных генетически сходных между собой особей. Экспрессивностью характеризуется конкретная особь. Например, у дрозофил с генотипом eyeless (безглазые) уменьшено число глазных фасеток, но абсолютное число фасеток варьирует от 0 до 50% от нормы, которая составляет 779 фасеток. Тогда экспрессивность этого аллеля при полном отсутствии фасеток у особи равна 100%, а у особи с числом фасеток, уменьшенным в два раза, - 50%.



Рис. 1.22. Мутация eyeless у Drosophila melanogaster.

а, а' -- нормальные глаза; b, b' -- совершенно безглазая форма, с с' - промежуточное выражение признака

В основе различий экспрессивности могут лежать многие причины, в частности влияние факторов среды или генетического фона. Если экспрессивность очень изменчива (вплоть до отсутствия проявления признака у отдельных особей), то вводится дополнительная характеристика проявления действия гена -- пенетрантность (частота проявления аллеля определенного гена у разных особей группы родственных организмов).

Пенетрантностью проявления гена называется отношение числа особей, у которых проявляется данный признак, к общему числу с данным генотипом. Пенетрантностью характеризуется признак в однородной группе особей. При полной пенетрантности (100%) мутантный ген проявляет свое действие у всех особей, имеющих его, а при неполной - лишь у некоторых. Например, у дрозофилы доминантная мутация Lobe (L) вызывает уменьшение размера глаз, однако этот признак проявляется только у 75% особей; у остальных 25% мух - носителей гена L - глаза нормальные. Тогда пенетрантность аллеля L равна 75%.

Экспрессивность и пенетрантность часто зависят от условия среды, в которой развивается организм: освещения, температуры или влажности.

Примером изменчивости признаков поведения, которые связаны с экспрессивностью и пенетрантностью, могут быть количественные вариации в проявлении фиксированного комплекса действий (ФКД) исследовательской активности, пищевого поведения, в интенсивности репродуктивного поведения, которые можно наблюдать у животных идентичных генотипов, например у мышей и крыс инбредных линий.

Внутрилинейная изменчивость признаков поведения определяется очень многими факторами. Например, влияние соседства сородичей в жилой клетке. Поскольку лабораторные мыши и крысы относятся к видам, живущим в сообществах, то изоляция животного вызывает мощные изменения нейрохимических процессов в организме, а также изменение поведения. Содержание же животных в группе выявляет различия, определяющиеся положением особи во внутригрупповой иерархии. Есть и другие примеры проявления изменчивости поведения особей с идентичными генотипами.

Для успешного проведения опытов по генетике поведения подбирали соответствующий признак, опираясь на знания о физиологии, нейрофизиологии и поведении животных. Внимание исследователей привлекали разные признаки, например, предрасположенность к судорогам, общая возбудимость, локомоторная активность, ориентировочно-исследовательские реакции, разные аспекты репродуктивного поведения, классические и инструментальные условные реакции, реактивность к фармакологическим веществам. Чаще всего выбирали такие признаки, которые легко поддаются количественному учету (например, четкие видоспецифические движения), либо такие, которые легко измерить по степени выраженности (например, уровень локомоторной активности, измеряемый по длине пройденного животным пути за фиксированное время опыта).

К дополнительным трудностям при изучении генетики поведения приводит и тот факт, многие поведенческие признаки зависят от ряда внешних по отношению к нервной системе факторов, например от сезона года, или от гормонального фона, который сформировался в данное время в организме.

Первый этап генетического исследования признаков поведения связан с оценкой их генетической изменчивости. Признаки организма могут варьировать, обнаруживая фенотипическую изменчивость в пределах нормы реакции, размах которой определен генотипом.

При изучении поведенческих признаков, генетики сталкиваются также с изменчивостью, которая связана с воздействием индивидуального опыта.

Основным материалом для работ в области генетики поведения являются отселектированные и инбредные линии. Селекция ведется по широкому диапазону признаков поведения, показавших генетическую изменчивость, -- от скорости проведения нервного возбуждения в нервно-мышечном синапсе до высокой и низкой способности к обучению. Но с помощью селекции формируются линии, которые состоят из животных, сходных по выраженности исследуемого поведенческого признака и иногда ряда других признаков, но не обладающих генетической однородностью. Это затрудняет использование их в целях идентификации генов, влияющих на данный признак.

В ряде случаев удается получить полностью гомозиготных животных с контрастными в случае двух линий величинами интересующего исследователей поведенческого признака. Но таких линий немного. В качестве примера можно привести инбредные линии мышей Short и Long sleep, у которых после гипногенной дозы этанола развивается либо короткий, либо длинный период сна.

Существуют линии мышей, имеющих общее происхождение и выращенных в одинаковых условиях, но демонстрирующих различные поведенческие реакции при помещении в ярко-освещённое открытое пространство. Эти линии были получены следующим образом.

В первой серии экспериментов исследователи брали группу обычных полевых мышей и помещали каждую особь по очереди в ярко-освещённую коробку. В ответ на ситуацию мыши демонстрировали самые разнообразные поведенческие реакции. Некоторые особи оказались довольно трусливыми: они неподвижно сидели возле стенок. Другие оказались более смелыми - бродили по коробке, хотя и не отходили далеко от её стенок. Некоторые мыши ориентировались свободно, даже выходили на середину освещённого поля. При помощи различных методов исследователи измеряли движения каждой особи и отобрали наиболее неподвижных и наиболее активных.

В дальнейшем активные мыши скрещивались с активными, а неактивные с неактивными, т.е. проводилась селекция в двух противоположных направлениях. Полученное в обоих случаях потомство аналогичным образом тестировалось, отбиралось и скрещивалось. Т.е. от наиболее трусливых родителей в дальнейшие скрещивания брали только самых неактивных потомков, а среди потомков самых храбрых родителей отбирали наиболее активное потомство. Всего было проведено более 30 поколений инбредных скрещиваний. С каждым последующим поколением мыши из трусливой группы становились всё более трусливыми, и мыши из смелой группы все более смелыми.

Таким образом, исследователи получили две линии мышей, имеющих общее происхождение и выращенных в одинаковых условиях, но демонстрирующих различные поведенческие реакции при помещении в ярко-освещённое открытое пространство.

Чтобы убедиться в отсутствии влияния на поведение мышей неконтролируемых факторов, был проведен дополнительный эксперимент, который заключался в следующем.

Новорожденных мышей из неактивной линии помещали на воспитание к самкам из активной линии и наоборот, а также мышей из обеих отселектированных линий одновременно помещали на воспитание к одной взрослой самке. При последующем тестировании мыши демонстрировали поведенческие реакции, свойственные своей исходной линии.

Эти результаты говорят о том, что поведенческие признаки зависят от наследственности. Трусливость, как и храбрость, и ряд других поведенческих признаков называются количественными наследственными признаками, поскольку фенотипы (наблюдаемые поведенческие реакции), ассоциированные с соответствующими генотипами, варьируют измеряемыми количествами или степенями.

Исходное поколение мышей включало в себя особей «не очень трусливых», «умеренно трусливых», «довольно трусливых» и других, с «разной степенью трусливости». Если ввести некую размерность для этого признака (проранжировать его) и построить график, получится колоколовидная кривая. Подобные признаки называют ещё признаками с непрерывной изменчивостью, так как отдельные их значения в популяции/линии изменяются непрерывно от одного экстремального значения к другому.

Среди поведенческих признаков известны и признаки другого типа - признаки с прерывистой изменчивостью или качественные. Они либо присутствуют у исследуемого объекта, либо отсутствуют. Примером такого признака у человека может служить способность или неспособность сворачивать язык в трубочку.

Рис.1.23. Семь из десяти людей, обладающие определенным доминантным геном, способны сворачивать язык трубочкой.

Однако большинство поведенческих признаков всё же являются количественными.

Наряду с факторами внешней среды и генотипом у млекопитающих в формировании признака участвует еще один важный параметр - пренатальные и постнатальные влияния материнского организма. Это так называемый материнский эффект. Наиболее простые примеры влияния материнского организма на физиологические реакции и поведение потомства -- это эффекты различных пренатальных воздействий на самку (стресс, влияние фармакологических агентов), степень выраженности которых может зависеть от ее генотипа.

Экспериментально показано, что при соблюдении стандартных условий выращивания, как матерей, так и их потомства, физиологические реакции и поведение потомства зависят от типа влияний «материнской среды». Эти влияния могут существенно сказываться не только на внутрилинейной, но и на межлинейной изменчивости. Иными словами, влияние «материнской среды» инбредной линии С на формирование признака может быть иным, чем влияние на этот признак «материнской среды», свойственной генотипу линии В.

Влияние материнской среды складывается из трех компонентов: цитоплазматического, внутриутробного и постнатального.

Цитоплазматический компонент обнаруживается не только у млекопитающих, но и у тех животных, развитие которых проходит вне материнского организма. Он заключается в том, что яйцеклетка и сперматозоид при слиянии привносят разные количества цитоплазмы, причем белки, синтезируемые на основе материнских иРНК, обнаруживаются в зародыше и после начала дробления. Кроме того, цитоплазма яйцеклетки передает зародышу значительно большее количество митохондриальной ДНК, чем цитоплазма спермия. Это означает, что цитоплазматические влияния могут иметь и генетическую природу.

Внутриутробный компонент материнского эффекта определяется генотипом матери, а также специфическими воздействиями, которые испытывает ее организм, Самки разного генотипа, даже выращенные и содержащиеся в одинаковых условиях, создают потомству разную «материнскую среду», что может повлечь за собой различия в фенотипе потомства, в том числе и поведенческом фенотипе.

Постнатальный компонент связан с тем, что детеныши млекопитающих длительное время зависят от материнской заботы, которая может по-разному проявляться.

В генетике поведения разработаны экспериментальные приемы, с помощью которых можно оценить относительный вклад каждого из этих компонентов (цитоплазматического, внутриутробного и постнатального) в фенотипическую изменчивость признака поведения.

Под поведенческим признаком в генетике поведения понимают любую ответную реакцию живой материи на какое-либо изменение в окружающей среде, для которой характерна, либо прерывистая, либо непрерывная изменчивость, зависящая от одного (двух) или многих генов. Конечно, легче других изучать поведенческие признаки, определяемые единичными генами.

1.4 Методы оценки признаков поведения (поведенческое фенотипирование)

Прежде чем приступить к селекции по поведенческому признаку, исследователь решает вопрос о выборе подходящего признака поведения, способа его оценки и метода отбора. Надо учитывать, что чаще всего признаки поведения относят к категории количественных и они подвержены влиянию множества средовых и генетических факторов, а методика измерения признака должна быть надежной и нетрудоемкой.

В этом разделе представлены наиболее известные методы оценки признаков поведения у модельных генетических объектов. Ряд методик, использующихся в генетике поведения, будут описаны в главах, посвященных генетике поведения отдельных таксономических групп.

При наблюдениях за животными в естественных условиях или при содержании их в клетках для оценки поведения наиболее часто используется регистрация этограмм - запись (зарисовка, фотографирование, видеозапись и т.п.) всей последовательности поведенческих актов и поз животного. На основе этограмм при анализе социального поведения можно составить социограммы - диаграммы, графически демонстрирующие частоты проявления тех или иных актов поведения при общении особей в группах.

Рис. 1.24. Этограмма сигнального поведения каменки-плешанки (Oenanthe pleschanka) а--г -- различные формы территориального и угрожающего поведения самца, д -- то же самки; е--и -- брачное поведение самца, к -- то же самки. Стрелки обозначают одно- или многократные движения головы и крыльев.

Рис. 1.25. Пример социограммы для социальных отношений семейных групп монгольских песчанок. Толщина стрелок пропорциональна числу взаимодействий между особями; направление показывает, кому адресовано действие.

Для объективной количественной регистрации поведения животных используют многочисленные автоматические и полуавтоматические приборы, снабженные специальным программным обеспечением для обработки данных. Разработаны компьютерные программы, оптимизированные для записи и анализа уникальных поведенческих фенотипов. Каждая такая система обладает высокой пропускной способностью, способна осуществлять видеоанализ активности как одного животного, так и целой группы животных в реальном времени. После видеоанализа программы переводят данные в удобный для статистического анализа формат крупноформатной таблицы.

Программы для анализа поведения групп животных используются, например, при оценке ритмов движений животных, включая хаотичность, склонность оставаться близко к стенам или продвигаться ближе к центру клетки, и т.д. Можно также получить детализированную статистику о поведении группы животных, таком как полная средняя скорость, активная средняя скорость, и т.д., а также определить специфические события, происходящие в группе.

Но, несмотря на активное развитие автоматизированных систем регистрации и учёта признаков, не утратили своей научной ценности приборы и тест-системы, разработанные на более ранних этапах становления генетики поведения. Так, например, в поведении дрозофилы наибольшее внимание уделялось половому поведению, фото- и геотаксисам, а также двигательной активности.

Наиболее изящные методы измерения признака разработаны для таксисов. Прибор для оценки геотаксиса предложен в пятидесятые годы Хиршем. Он состоит из отдельных Т-образных блоков, имеющих один центральный тоннель и два боковых переулка. Блоки расположены рядами, причем в каждом последующем ряду число блоков увеличивается на единицу. Таким образом, вход в лабиринт один, а выходов в десятирядном лабиринте -- одиннадцать.



Рис.1.25. Лабиринт для изучения геотаксиса

Используют и более удлиненный вариант лабиринта с 15 рядами и 16 выходами. Лабиринт ориентирован вертикально. Насекомому при прохождении каждого блока предоставляется возможность выбрать направление движения, т. е. подняться вверх по одному из переулков или опуститься вниз по второму. К движению в направлении выхода мухи стимулируются светом люминесцентной лампы, равномерно освещающей конечные коллекционные трубки, и запахом пищи, находящейся в них же.

При прохождении лабиринта с 11 (или 16) выходами каждая особь минует 10 (или 15) перекрестков, по одному в каждом ряду. Путь в соседние отсеки (равно, как и назад) прегражден воронками, ориентированными соответствующим образом. Одновременно можно испытывать по 200 или 300 особей одного пола. Каждая муха получает индивидуальную оценку в соответствии с номером коллекционной трубки, в которую она попала. В самую нижнюю трубку, обозначенную «0», собираются особи, ни разу не обнаружившие отрицательного геотаксиса, в самую верхнюю трубку, под номером «10», попадают особи, все 10 раз проявившие отрицательный геотаксис.

Существует и иной вариант оценок: особям, собиравшимся в центральную трубку и тем самым совершившим равное число поворотов вверх и вниз, дается оценка 0, все особи, попавшие в трубки, расположенные выше центральной, считаются геоотрицательными, а скопившиеся в нижних трубках -- геоположительными. Особи ив крайних трубок получают максимальный балл +5 и --5 или +7,5 и --7,5 (в зависимости от числа финальных трубок).

Лабиринт для оценки фототаксиса построен на аналогичном принципе. Особенностью его является горизонтальная ориентация, а также то, что состоит он не из Т-образных, а из Y-образных блоков, в которых один из боковых переулков освещен, а другой затемнен.

Прибор для «сортировки» мух методом обратного потока состоит из двух групп пробирок, укрепленных в двух штативах, которые можно сдвигать относительно друг друга (Рис. 1.26). Мух помещают в пробирку 0, после этого аппарат ставят вертикально и легким постукиванием сбрасывают их на дно пробирки. Затем всю систему кладут плашмя, так чтобы верхние концы пробирок были обращены к свету (а). Мухи, обладающие фототаксисом, движутся к свету, а другие остаются в темном конце (б). Через 15 с обращенный к свету (на рисунке -- верхний) ряд пробирок сдвигают вправо (в) и снова стряхивают мух вниз (г). При этом мухи, реагировавшие на свет, попадают в пробирку 1. Верхний ряд пробирок сдвигают влево (д) и после перемещения системы в горизонтальное положение дают возможность мухам, проявившим фототаксис, снова бежать к свету. Процедуру повторяют 5 раз. В результате наиболее активные мухи оказываются в пробирке 5, несколько менее реактивные -- в пробирке 4 и т.д.

Рис. 1.26. Прибор для «сортировки» мух методом обратного потока

Для измерения особенностей полового поведения и уровня локомоторной активности обычно прибегают к прямым визуальным наблюдениям. Мух для испытаний рассаживают парами или целыми группами. Половую активность измеряют либо латентным временем до начала копуляции, либо частотой спариваний в определенный срок. Для самцов установлена высокая корреляция между этими двумя способами оценки, равно как и с их общей плодовитостью. Продолжительность копуляции, по всей видимости, является самостоятельным признаком и с уровнем половой активности постоянной связи не имеет. Скорость спариваний учитывают при объединении виргинных (т.е.неоплодотворенных) самок и самцов индивидуальными парами или более многочисленными группами. В последнем случае создают ситуацию либо мужского выбора -- один самец среди нескольких самок, либо женского, либо обоюдного -- по несколько пар вместе.

Поведенческие признаки, в отличие от морфологических, подвержены влиянию самой обстановки проведения эксперимента. Например, показано, что половая активность зависит от численного состава испытуемой группы. По-видимому, для проявления максимальной половой активности существует оптимальная плотность, так как активность снижается при повышении численности группы и при ее уменьшении. Половая активность самцов зависит от числа доступных самок. В гетероморфной группе половая активность самцов зависит от частоты встречаемости их генотипа, причем преимуществом обладают редкие формы. На половую активность мух влияют условия их личиночного развития, характер освещения до начала эксперимента.

Двигательную активность изучают с помощью приборов разного типа: открытое пространство, или арена, расчерченная на квадраты; кольцевая «беговая» дорожка, размеченная на участки, система камер, соединенных узкими переходами (Рис. 1.27., Рис.1.28).



Рис.1.27. Круговая дорожка для наблюдения за двигательной активностью дрозофил (по Connolly, 1966).

Рис. 1.28. Прибор для массовых испытаний двигательной активности дрозофил. Система камер, расположенных в ряд (1--6). Стартовая камера (1) отделена от остальных задвижкой. Шесть рядов камер смонтированы вместе для параллельного наблюдения за 6 особями или 6 группами.

При этом камеры могут располагаться в один ряд, линейно или тройками вокруг центрального сосуда. Система камер, расположенных в ряд (Рис.1.28. 1--6). Стартовая камера (1) отделена от остальных задвижкой. Шесть рядов камер смонтированы вместе для параллельного наблюдения за 6 особями или 6 группами.

Двигательную активность оценивают числом квадратов, линий или камер, которые особь пересечет за определенное время, а при массовых тестах -- долей особей, переселившихся из стартовой камеры в соседние. Длительность испытаний, как правило, варьирует в пределах 1--25 мин. При продолжительных 6--24 часовых массовых испытаниях изучаемую активность называют дисперсионной, или миграционной. При этом испытание проводят как на свету, так и в полной темноте.

Простой метод оценки общей локомоторной активности предложен Е. М. Лучниковой. Заключается он в подсчете числа активных в данный момент (или неактивных) особей из десяти, находящихся в пробирке. Объективность такого метода доказана эффективностью отбора.

Абиотические условия эксперимента могут играть в опытах по генетике поведения существенную роль. Так, генетическая изменчивость по миграционной активности лучше выявляется на свету, но не в темноте. Продолжительность испытательного срока (1 час или 7 дней) влияла на генетическую архитектонику рецептивности самок дрозофилы к самцам yellow: с увеличением длительности испытания увеличивалось влияние на рецептивность аддитивной компоненты взаимодействия генов.

При использовании метода «лабиринта» подопытному животному ставится задача нахождения пути к определенной, непосредственно не воспринимаемой им «цели», которой является чаще всего пищевая приманка, но может быть и убежище («дом») или другие благоприятные условия. При отклонении от правильного пути в отдельных случаях может применяться наказание животного.

В простейшем виде лабиринт имеет вид Т-образного коридора или трубки. В этом случае при повороте в одну сторону животное получает награду, при повороте в другую его оставляют без награды или даже наказывают. Более сложные лабиринты слагаются из разных комбинаций Т-образных (или им подобных) элементов и тупиков, заход в которые расценивается как ошибки животного (рис. 1.29).

Рис.1.29. Варианты лабиринтов: а - план первого лабиринта, применявшегося в зоопсихологии (лабиринт Смолла); б - лабиринт из «мостиков»

Результаты прохождения животным лабиринта определяются, как правило, по скорости достижения «цели» и по количеству допущенных ошибок. Метод «лабиринта» позволяет изучать как вопросы, связанные непосредственно со способностью животных к научению (к выработке двигательных навыков), так и вопросы пространственной ориентации, в частности роль кожно-мышечной и других форм чувствительности, памяти, способности к переносу двигательных навыков в новые условия, к формированию чувственных обобщений и др.

Информативным может быть и метод «обходного пути». В этом случае животному приходится для достижения «цели» обойти одну или несколько преград. В отличие от метода «лабиринта» животное в данном случае непосредственно воспринимает объект (приманку), на который направлены его действия уже в начале опыта. Учитываются и оцениваются скорость и траектория передвижения при поиске обходного пути вокруг преграды. В несколько измененном виде Л. В. Крушинский использовал метод «обходного пути» для изучения способности разных животных к экстраполяции.

Метод дифференцировочной дрессировки направлен на выявление способности подопытного животного к различению одновременно или последовательно предъявляемых объектов и их признаков. Выбор животным одного из двух или более предъявляемых объектов вознаграждается (положительная дрессировка), в других случаях одновременно с подкреплением правильного выбора наказывается неправильный (положительно-отрицательная дрессировка).

Последовательно уменьшая различия между признаками объектов (например, их размеры), можно выявить пределы различения (дифференцировки). Таким образом, можно получить сведения, характеризующие, например, особенности зрения у изучаемого вида животных (его остроту, цветоощущение, восприятие величин и форм и т.п.). Этим же методом можно изучать процессы формирования навыков, память животных, способность к обобщению.

Вариантом дифференцировочной дрессировки, применимым лишь к высшим животным, является метод «выбора по образцу». Животному предлагается произвести выбор среди ряда объектов, руководствуясь образцом, который показывается ему непосредственно экспериментатором или в специальном аппарате.

При использовании метода «проблемной клетки» (ящика) перед животным ставится задача или открыть для себя выход из клетки, приводя в действие различные приспособления (рычаги, педали, затворы и т.п.), или же, наоборот, проникнуть в клетку, где находится подкорм, отмыкая запирающие устройства. Иногда применяются и небольшие ящики или шкатулки с затворами, отмыкание которых дает подопытному животному доступ к корму. При более сложной постановке эксперимента все механизмы и устройства действуют лишь в строго определенной последовательности, которая должна усваиваться и запоминаться животным.

Этим методом можно изучать сложные формы научения и моторные элементы интеллектуального поведения животных. Его особенно удобно применять для изучения животных с развитыми хватательными конечностями - крыс, енотов, обезьян и др. Такие эксперименты служат преимущественно для выявления высших психических способностей животных.

Наряду с более или менее сложными экспериментами в зоопсихологических исследованиях важную роль играет анализ обычного, неподкрепляемого манипулирования различными предметами. Такие исследования позволяют судить об эффекторных способностях животных, их ориентировочно-исследовательской деятельности, игровом поведении, способностях к анализу и синтезу.

В 1930-х гг. Американский исследователь Холл разработал тест «Open ?eld» («Открытое поле») для оценки общей (локомоторной) и исследовательской активности. Нарушения двигательной активности лабораторных животных представляют определенный исследовательский интерес; они имеют место у линий мышей, моделирующих болезни Паркинсона (непроизвольное подрагивание конечностей), Хантингтона (нейродегенеративное заболевание), латерального склероза, атаксии, дистонии и пр.

В тесте «Открытое поле» использовалась специальная установка (Рис.1.30) . Она представляла собой арену, поделенную на равные квадраты. В центр помещали животное, регистрировали число пересеченных им в процессе движения квадратов и узнавали пройденное за определенное время (4-10 мин) расстояние. Этот тест активно используется и в настоящее время, в том числе для изучения тревожности, памяти, начального скрининга фармакологических препаратов.

Современная установка для теста «Открытое поле» снабжена фотоэлементами, что позволяет автоматически регистрировать:

· исследовательскую и базовую активность животного;

· груминг (поведение, направленное на прихорашивание - облизывание, почесывание и т. п.);

· вертикальную активность, снижение активности в процессе освоения территории, редкие или стереотипные движения (индикатор нарушений ЦНС);

· подсчитывать пропорцию нахождения животного на периферии или в центре арены (как показатель тревожности), демонстрировать траекторию движения и пр.

Рис.1.30. а, 1.30.б. Установки для теста «Открытое поле»

Систему Home cage activity генетики используют для исследования поведения животных в домашней клетке. Она дополняет данные наблюдений в тестах, фокусирующихся на конкретных поведенческих ответах. Современное оборудование снабжено фотоэлементами или видеокамерой, позволяющими снимать и автоматически регистрировать активность животного, трекинг (траекторию движения), среднюю скорость передвижений, время нахождения в пластиковом укрытии, процент времени неподвижности животного, время приема пищи и воды и пр. Система способна снимать данные одновременно с 24-48 клеток.

Создан прибор подсчитывающий число вращений животного за определенный интервал времени (Ротометр) и прибор, оценивающий чувство равновесия, способность животного балансировать на вращающемся барабане (Ротарод). Разработан - прибор, подсчитывающий число вращений животного за определенный интервал времени.

Тест Raised-beam walking - «прогулка по приподнятой перекладине» - используется для оценки равновесия, в тестах на обучение или оценки возрастных изменений. Животное учится путешествовать по перекладине (разной конфигурации и толщины), достигая закрытой (безопасной) платформы. Регистрируются время ходьбы, соскальзывание лап, падения.

Рис.1.30.в. Тест «Прогулка по приподнятой перекладине»

Анализ походки по следам (отпечаткам лап) - Gait analysis system - тест, используемый, в частности, в исследованиях на животных с хирургическими вмешательствами на спинном мозге, при скрининге фармакологических препаратов. Установка представляет собой коридор, по которому животное предварительно обучают проходить. Сравнивают результаты теста до и после оперативного вмешательства, на фоне медикаментозной терапии.

Установка для оценки тремора животных - Tremor monitor - используется при фенотипировании трансгенных животных, анализе нарушений ЦНС, возрастных изменений, в фармакологических исследованиях. Эта установка отличает тремор от стереотипных движений, она снабжена программным обеспечением, представляет результаты в графическом и цифровом форматах.

Разработаны методы и создано оборудование для оценки сенсорных функций у лабораторных грызунов.

Прибор «горячая площадка» - Hot plate - оценивает пороговую чувствительность острой боли. В тесте «отдергивания хвоста» - Tail flick - прибор фокусирует обжигающий луч света на хвосте животного и замеряет латентный период отдергивания хвоста. Установка «стартл-рефлекс» создает любые комбинации звуков, шумов, белого шума, струи воздуха, света и электрических ударов разной интенсивности. Используется для изучения многих свойств ЦНС.

Разработан ряд поведенческих тестов для оценки зрения. Visual cliff apparatus используется для оценки остроты зрения. Двухуровневая установка имеет высокий уступ, на который помещается животное (Рис.1.31). Обрыв закрыт прозрачным оргстеклом. Особи с нормальным зрением затормаживают перед краем и исследуют его перед тем, как двинуться вперед. Слепые и слабовидящие животные пересекают уступ без задержки.

Рис.1.31. Тест для оценки зрения.

Метод Virtual optomotor system основан на оптомоторном рефлексе животного, который заключается в слежении (т. е. поворачивании головы и шеи) за движущимся предметом. В тесте это бегущие серо-белые волны на мониторе компьютера, контрастность которых в процессе тестирования снижается, что позволяет дифференцировать остроту зрения животных (Рис. 1.32).

Рис.1.32. а., Рис. 1.32.б Установки для метода Virtual optomotor system

Оценка функционального состояния ольфакторного анализатора важна при тестировании фармакологических препаратов, при изучении мотиваций и эмоциональной регуляции поведения, поведенческом фенотипировании мутантных линий мышей. Но исследование ольфакторной перцепции не требует специального оборудования. Тесты основаны на поиске или обнюхивании пищевой или другой аттрактивной (например, феромоны) приманки, помещаемой в домашнюю клетку. Регистрируется латентный период обнаружения приманки, время исследования запаха.

Эмоциональное поведение животных исследуется в разнообразных тестах, наиболее старинным из которых является тест «открытого поля», где этот параметр оценивается по числу фекальных болюсов, оставленных животным на арене.

Исследуют и такой поведенческий признак как тревожность. Под тревожностью этологи понимают защитный ответ организма на потенциальное присутствие угрозы (в отличие от страха, вызванного реальным угрожающим стимулом). Физиологические основы страха и тревожности во многом отличаются. Страх является адаптивной реакцией, в то время как повышенная тревожность дезадаптирует организм, вредит ему.

Тревожность подразделяют на конститутивную, во многом генетически закрепленную, и ситуативную, провоцированную условиями теста. Инбредные линии мышей могут отличаться по своему тревожному поведению, которое оценивается по уровню неофобии (боязнь новизны) в ситуации свободного исследования.

Исследования ситуативной тревожности можно разделить на две большие группы:

· без обучения (необусловленные)

· с обучением (обусловленные модели)

Модели без обусловливания, или этологические, основаны на исследовательской активности животных при наличии природных стимулов, вызывающих чувство страха или тревоги. Например, конфликт между желанием животного остаться в безопасном месте или исследовать новое, но потенциально опасное пространство (ярко освещенное или открытое). Исследовательский ответ животного состоит в осмотре, обнюхивании, подъемах на задние лапы, прыжках, рытье, заглядывании вниз, перемещении доступных объектов. Тревожный ответ - в замирании, поиске убежища, обильной дефекации и уринации.

Тревожность можно изучать в приподнятом крестообразном лабиринте - Elevated Plus Maze, который состоит из двух закрытых (аналог норы) и двух открытых (потенциально опасных) рукавов. Вся конструкция приподнята над полом на 60-70 см и ярко освещена сверху. В тесте измеряют число входов и время, проведенное в открытых и закрытых рукавах; акты заглядывания вниз, вытягивания-принюхивания, задний ход. Более тревожные мыши предпочитают закрытые рукава.



Рис.1.33. Мышь в приподнятом крестообразном лабиринте

В тесте «темно-светлая камера» - Light-dark exploration box, используется установка, поделенная на две части - темную, занимающую 1/3 пространства, и светлую. Животное помещают в светлый отсек и измеряют латентный период первого захода в темный отсек, число перемещений туда-обратно, время, проведенное в светлом и темном отсеках, выглядывание из темного в светлый и число вставаний на задние лапы. Анксиолитики (вещества, снижающие уровень тревоги) увеличивают число переходов между темным и светлым отсеками камеры и другие параметры.

Рис.1.34. а., Рис. 1.34.б. Тест «Темно-светлая камера».

Методы оценки тревожности с предварительным тренингом (обусловливанием) изучают классические условные рефлексы, с отрицательным подкреплением, где вначале нейтральный стимул при повторении становится условным для реализации определенного поведенческого ответа. Например, создают временное сочетание условного стимула (свет, звук) с безусловным (электрический ток). В результате животное при безобидном со стороны стимуле демонстрирует поведение, как будто его ударили током.

Выполнение таких тестов зависит от памяти. Они используются для скрининга анксиолитической или анксиогенной активности фармакологических препаратов, для изучения нейробиологии тревожности, или, например, для оценки опыта раннего детства.

Создано оборудование для формирования обусловленного контекстом страха поведения - Fear conditioning equipment. Оно состоит из звукоизолирующей камеры с полом из металлических прутьев, соединенных с генератором электрического тока, звукогенератора для условных сигналов (ими могут быть и другие стимулы, например один из часто используемых ольфакторных стимулов - запах апельсинового сока).

После обучения в камере у животного имеют место долговременные поведенческие изменения, которые можно изучать генетическими и фармакологическими методами.

Поведенческая модель для исследования активного и пассивного избегания - Active or passive avoidance system - напоминает обусловленный контекстом страх. Животное помещают в клетку (shuttle-box), где после условного сигнала по полу подается электрический ток. В ситуации пассивного избегания (закрытая дверь в безопасный отсек) регистрируют время замирания, в ситуации активного избегания (при открытой дверце в безопасный осек) - латентный период побежки. Коммерческий вариант установки может тестировать одновременно 8 животных.

Ученые исследуют и такой поведенческий признак как депрессия. Депрессия - это психическое состояние с пониженным настроением, сниженной жизнеспособностью, отсутствием стремления к удовольствию (ангедония). Некоторые виды депрессии провоцируются стрессорными жизненными обстоятельствами. Имеет место генетическая предрасположенность к заболеванию депрессией. В 1970-1980-х гг. причину депрессии видели в истощении моноаминовых депо нейронов, в настоящее время исследования молекулярных механизмов депрессии сконцентрированы на выяснении роли ряда транскрипционных факторов.