Основы генетики

Исследования на дрозофиле выявили большое количество специфических мутаций, каждая из которых приводит к определённому дефекту в какой-либо части нервной системы насекомого. Например, летальная мутация Notch вызывает у дрозофилы увеличение (разрастание) нервной системы вследствие избыточной выработки клеток-предшественников.



Рис. 2.4. Мутация Notch дрозофилы. У эмбриона дикого типа обнаруживается около четырёх клеток предшественников нервных клеток на один гемисегмент (а), а у мутантных - более десяти (б), что является следствием низкой активности гена Notch

Исследования генетики морфологических особенностей нервной системы и связи этих особенностей с изменчивостью поведения активно развиваются. Экспериментальных данных в этой области относительно конкретных связей специфических форм поведения со специфическими структурными особенностями нервной системы пока немного, однако ученые полагают, что морфологическая организация мозга -- один из главных путей реализации генетической информации на уровне поведения.

2.2 Связь поведения с некоторыми биохимическими показателями

В основе всех поведенческих изменений лежат нейрохимические и сопутствующие им нейрофизиологические сдвиги определенных функциональных единиц центральной нервной системы. В исследованиях по функциональной нейрохимии показано, что при любом физиологически активном состоянии нервных клеток, в том числе и в процессе обучения усиливается метаболизм РНК. Тесно связан с интенсивностью обмена РНК белковый обмен нервных клеток.

Интенсификация синтеза РНК и специфических белков в процессе функционирования нейронов дает основание полагать, что генетически детерминированные различия в поведении могут быть обусловлены особенностями метаболизма РНК и белков в определенных функциональных отделах мозга. Например, были отмечены межлинейные различия по содержанию РНК и некоторых участвующих в ее метаболизме ферментов у линий крыс, различающихся по скорости образования рефлексов. Выявлены также межлинейные особенности обмена РНК у крыс, предрасположенных к аудиогенным эпилептическим припадкам (линия Крушинского -- Молодкиной), и не предрасположенных. У первых количество РНК на нейрон ядра Дейтерса достоверно выше, чем у вторых. Причем эти различия сказываются еще до появления в ходе онтогенеза патологической реакции на звук, т. е. они не являются следствием этой реакции, а, вероятно, генетически обусловлены.

Генетические различия в скорости условнорефлекторного обучения могут быть до некоторой степени скоррелированы с интенсивностью синтеза специфичных для всей нервной ткани белков.

То, что поведенческая изменчивость обусловлена некоторыми метаболическими эффектами генов внутри нервной клетки, подтверждают также данные по связи между ферментами и поведением. Так, обнаружены линейные различия у мышей по активности фенилаланингидроксилазы, которая в норме превращает фенилаланин в тирозин, и скоррелированные различия в поведении. Активность этого фермента у гомозигот по гену дайльют (dilutedd), характеризующихся ослабленной пигментацией и крайней нервозностью, уменьшена почти наполовину. Летальные же гомозиготы по гену дайльют (d¹d¹) проявляют только 14% нормальной активности фенилаланингидроксилазы. Названные мутации подавляют активность фенилаланингидроксилазы через продукцию ингибитора фермента, который у нормальных мышей уменьшается на третьей постнатальной неделе.

Биохимия алкоголизма также демонстрирует корреляцию между активностью ферментной системы, и поведением. Оказывается, что различные линии мышей в условиях предоставления им выбора воды и алкогольных растворов различной концентрации, характеризуются стабильными линейными средними употребленного алкоголя. Выявлена корреляция между этими средними и активностью печеночной алкогольной дегидрогиназы (АДН). Линия с сильным алкогольным предпочтением характеризовалась высоким уровнем активности АДН. И наоборот, линия с сильным избеганием алкогольных растворов имела низкую активность фермента.

В условиях различных алкогольных режимов у животных всех линий наблюдалось адаптивное изменение активности фермента, но характер этого изменения был специфичным для каждой линии.

В экспериментах показано, что моноаминэргическая система мозга принимает участие в регуляции многих форм поведения у человека и животных в норме и патологии. Исследователи предполагают, что уровень экспрессии генов тирозингидроксилазы (TH), дофаминового транспортера (DAT), моноаминоксидазы А (MAO-A) и серотонинового транспортера (SERT) может играть определенную роль в таких поведенческих процессах, как агонистическое (конкурентное) и субмиссивное (подчиненное) поведение.

Методом полуколичественной мультиплексной полимеразной цепной реакции ученые исследовали изменение экспрессии генов SERT и МАОА в ядрах шва среднего мозга, генов TH и DAT в VTA мозга мышей линии СВА/Lac c агрессивным и подчиненным типами поведения. По результатам двух независимых экспериментов у подчиненных животных обнаружено значительное увеличение уровня мРНК генов МАОА и СЕРТ по сравнению с контрольной группой и агрессивными особями. Вероятно, увеличение экспрессии генов МАОА и СЕРТ отражает ускоренную инактивацию серотонина в ответ на усиление функционирования серотонергической системы под влиянием социального стресса.

В тоже время у мышей линии СВА/Lac c агрессивным типом поведения было обнаружено достоверное увеличение уровня мРНК генов TH и DAT в мезолимбических дофаминэргических нейронах мозга.

Эксперименты показали, что хроническое проявление агрессии сопровождается долговременной активацией дофаминэргической системы, в частности активацией генов TH и DAT, вовлеченных в синтез и инактивацию дофамина, соответственно.

Ген, кодирующий фермент моноаминоксидаза А (MAOA), который разрушает нейротрансмиттеры, оставшиеся в синаптической щели, привлек внимание ученых, когда была обнаружен семья с мутацией в этом гене.

История такова. На прием к врачу пришла женщина, которая хотела иметь ребенка, но боялась, что ребенок будет болен, поскольку у нее в семье мужчины (не все, но многие) отличались высокой агрессивностью (немотивированная агрессия и легкая степень умственной отсталости). Когда они были обследованы, оказалось, что это не просто дурной характер, а генетически детерминированное заболевание. Родословная этой семьи представлена на рисунке (кружочки с ромбиком в центре обозначают женщин-носительниц мутации).

Рис. 2.5. Однонуклеотидная замена Т--Г в гене МАОА в семье с частым агрессивным поведением мужчин

По характеру наследования поняли, что это заболевание, сцепленное с полом, потому что здоровые женщины рожали больных сыновей (дочери рождались нормальными, то есть, не были агрессивными).

В Х-хромосоме обнаружили мутантный ген, и выяснили, что он кодирует МАОА. Мутация - единичная нуклеотидная замена, которая приводила к обрыву синтеза белка и МАОА при этом не функционировала.

Таким образом, замена одного нуклеотида (цитозина на тимин в данном случае) приводила к ярко выраженному аизменению поведения.

Этот ген стали более активно исследовать. Такая мутация, как в этой семье, полностью инактивирующая фермент, больше нигде не была найдена, но были обнаружены мутации, снижающие активность МАОА.

Ученые исследовали группу людей с низкой и нормальной активностью МАОА и сравнили количество случаев асоциального поведения (нападение, нападение с целью нанесения повреждений, убийство, изнасилование, жестокость по отношению к животным). Когда просто так исследовали выборку, разницы не обнаружили. Но когда эту выборку разделили по условиям воспитания в детстве (Рис. 2.6), то оказалось, что разница в поведении людей, которые воспитывались в благоприятных условиях, практически отсутствует, а вот если условия были плохие, то разница становится существенной.

Рис. 2.6. Связь асоциального поведения, условий воспитания и генотипа по гену МАОА.

Для изучения связи моноаминоксидазы А с особенностями дповедения провели серию экспериментов на мышах. У мышей «нокаутировали» ген МАОА. Такие мыши были очень агрессивны, они набрасывались на своих сородичей без всякого повода, то есть вели себя также, как и люди с аналогичным генетическим дефектом.

Подобные исследования помогают понять, что именно в поведении детерминировано генетически и в какой мере, а что подвержено влиянию среды.

Все биохимические различия у животных, характеризующихся разным поведением, могут обусловливаться не только истинными генетическими корреляциями, но и целым рядом сложных взаимодействий, как в цепях метаболизма, так и со средой.

Но большинство наблюдаемых наследственных различий в специфическом поведении не ассоциируется со специфическими белковыми молекулами или ферментами. Поведенческая изменчивость детерминируется в основном количественной регуляцией функционального состояния тех или иных отделов центральной нервной системы.

Множество факторов могут регулировать функциональное состояние конкретных нейронных структур, множество биохимических звеньев лежит в основе их функционирования, но, вероятно, все они выходят на уровень мембранных процессов, генерирующих нервный импульс. Генетическая изменчивость этих процессов, протекающих в специфических нейронных цепях, может детерминировать изменчивость многих форм поведения.

2.3 Гормональная регуляция изменчивости признаков поведения и эндокринологическая генетика

Эндокринные железы могут оказывать сильное прямое воздействие на поддержание гомеостаза, регулирование эмоциональных поведенческих реакций, особенно связанных со стрессом, и на половое поведение. Из всех эндокринных желез только паращитовидная железа практически не оказывает прямого влияния на поведение, поскольку эта железа секретирует гормон, участвующий в регулировании концентрации кальция в крови.

Широко известны фенотипические поведенческие эффекты различных гормонов. Поведение ухаживания самцов, половая восприимчивость самок, материнская забота - стимулируются определенными эндокринными условиями. Доказано, что гормоны влияют на поведение, действуя непосредственно на определенные нейроны в центральной нервной системе. Кроме того, изменения, вызываемые гормонами в периферическом органе-мишени, также косвенно влияют на поведение, так как они вновь опосредуются через определенные районы центральной нервной системы. Накоплено достаточно данных о том, что половые стероиды могут регулировать или модулировать многие аспекты поведенческого репертуара животных.

Например, спонтанная агрессия грызунов проявляется только у самцов по отношению друг к другу. Кастрированные самцы не проявляют спонтанной агрессии, но если их подвергнуть андрогенной терапии, то у них наблюдается самая типичная форма агрессивного поведения. В норме самцы не проявляют агрессивных реакций по отношению к самкам, но если самкам вводить некоторое время тестостерон, то такие самки вызывают у самцов типичные спонтанные атаки. Вероятно, в половой системе самок продуцируются феромоны, которые тормозят атаки самцов. Введение андрогенов подавляет продукцию веществ, ингибирующих самцовую агрессию, и она начинает проявляться в своей типичной форме по отношению к таким самкам. Таким образом, в регуляции агрессивного поведения самцов играют роль гормональные механизмы обоих полов.

Характер социальных взаимодействий животных может также в существенной степени модулироваться эндокринной системой гипофиз -- кора надпочечников.

Гормоны влияют на весь ход онтогенеза. Они оказывают важное организующее влияние на развитие поведения в эмбриональный и ранний постнатальный периоды.

Характер становления поведенческих реакций, в проявлении которых наблюдается половой диморфизм, определяется половыми гормонами и в неонатальный период. Последующая маскулинизация поведения грызунов, наблюдаемая во взрослой жизни, является результатом действия андрогенов в критический период раннего онтогенеза. Такая форма материнского поведения у кроликов, как гнездостроение, может быть подавлена у самок неонатальным введением андрогенов, а у самцов стимулирована эстрогеновым воздействием в тот же период. В отсутствие циркулирующих андрогенов (неонатальная кастрация самцов) в этот период определенные участки мозга остаются в недифференцированном состоянии.

Имеется целый ряд экспериментальных доказательств высокой функциональной активности эндокринных желез зародышей и новорожденных, которая многократно превосходит гормональную активность взрослых организмов, что указывает на существование дополнительных гормональных мишеней на различных этапах онтогенеза.

Гормоны влияют на поведение через регуляцию генетической активности в нервной ткани. Половые стероиды, например, участвуют в регуляции уровня ферментов, связанных с метаболизмом нервных медиаторов: уровень моноаминоксидазы, инактивирующей катехоламины и серотонин, меняется на различных стадиях астрального цикла в соответствии с изменениями яичниковых и гипофизарных гормонов.

В экспериментах на крысах воздействие гипофизарного гормона роста, вводимого в эмбриональный период развития приводило к увеличению веса мозга. Вероятно, такое воздействие оказывает не сам гормон роста, который не проходит через плацентарный барьер, а один из его метаболитов -- соматомедин, который проходит через плаценту.

Интересны результаты исследований эффектов физиологических колебаний материнского гормона роста на структуру мозга и способности к адаптивному обучению у потомков. Многие метаболические события, являющиеся следствием стрессирования беременных матерей, режима их кормления, применения некоторых лекарственных препаратов, вовлекают в процессы материнский гормон роста и, следовательно, могут оказывать эффект на морфологию нервной системы и интеллектуальное развитие потомков.

С одной стороны гормоны регулируют работу генетического аппарата нейронов, но с другой -- функциональная активность эндокринных желез сама находится под генетическим контролем.

Одно из первых исследований эндокринологической генетики, проведенное в 1966 году, было посвящено анализу изменчивости в биосинтезе кортикостероидов in vitro и характера ее наследования. Оценивая биосинтетическую активность коры надпочечников у мышей двух линий (СВА и А) и выражая, ее в количестве кортикостероидов на единицу веса тела, исследователи показали, что распределение признака у названных линий носило непрерывный характер. Если же признак выражался в количестве гормонов коры надпочечников на единицу веса надпочечников, трансгрессия между линиями становилась меньше. При распределении в линиях количества кортикостероидов на единицу веса зон, синтезирующих надпочечниковые стероиды (клубочковой и пучковой), трансгрессия еще более уменьшалась. И наконец, если биосинтетическую активность надпочечников выразить в единицах одного глюкокортикоида --кортикостерона на единицу веса указанных зон коры, то признак из количественного превращается в качественный (рис. 2.7).

Рис 2.7. Распределение показателей функционального состояния коры надпочечников у мышей линий СВА и А(цит. по Spickett, 1966).

а -- количество кортикостероидов (в ммкг) на 1 г веса тела;

б -- количество кортикостероидов на 1 мг веса коры надпочечников;

в -- количество кортикостероидов на 1 мг веса клубочковой и пучковой зон; г -- количество кортикостерона на 1 мг веса клубочковой и пучковой зон.

Проведенный гибридологический анализ показал, что различия в продукции кортикостерона корой надпочечников между линиями СВА и А детерминируются одним геном.

Таким образом, идя по пути более специфического описания фенотипического выражения количественного признака, можно из полигенной системы вычленить эффекты отдельных генов.

Продемонстрированы также генетические эффекты на такие свойства систем, осуществляющих транспорт гормонов, как их способность связывать гормон с молекулами-переносчиками, обратимо или необратимо инактивировать его.

Нервные регулирующие влияния на эндокринную систему в значительной степени определяются реактивностью организма на средовые стимулы. Например, выявлены генетически детерминированные различия в реактивности животных на фотопериод, на стрессирующую ситуацию.

Гормональные механизмы, обеспечивающие адаптацию в стрессовой ситуации, выявляют генетическую изменчивость по многим признакам, в том числе и по поведенческим реакциям, и тем самым могут влиять на ход эволюционных процессов.

Интересно в связи с этим отметить, что иногда в стрессовых ситуациях наблюдается поведение в филогенетическом отношении более древнее. Такие факты были описаны у шмелей и у кошек. Они указывают на то, что эволюция поведения во многих случаях идет не путем полного уничтожения старых реакций и замены их новыми, а путем снижения пенетрантности старых реакций до нуля, путем перевода их в скрытое состояние. Однако иногда в крайних условиях неизвестные гормональные механизмы вызывают вновь к жизни старые в филогенетическом отношении поведенческие реакции.

Таким образом, с одной стороны, генетический аппарат детерминирует функционирование эндокринной системы, а с другой -- эндокринная система регулирует деятельность генетического аппарата нейронов. Все это сказывается, в том числе, и на поведенческих реакциях.

Раздел 2. Специальная генетика поведения представителей некоторых таксономических групп

Глава 3 . Генетика поведения бактерий

3.1 Генетические основы социального поведения бактерий

Обычно под поведением обычно понимают реакции, проявляющиеся в движениях. Поведение бактерий, конечно, не может быть сложным и разнообразным. Но многие бактерии способны к направленному передвижению в соответствии с сигналами, поступающими из окружающей среды.

Имеется несколько принципиально различных типов движения бактерий. Наиболее распространено движение при помощи жгутиков: одиночных бактерий и бактериальных ассоциаций (роение). Частным случаем этого также является движение спирохет, которые извиваются благодаря аксиальным нитям, близким по строению к жгутикам, но расположенным в периплазме.

Другим типом движения является скольжение бактерий, не имеющих жгутиков, по поверхности твёрдых сред. Его механизм пока недостаточно изучен, предполагается участие в нём выделения слизи (проталкивание клетки) и находящихся в клеточной стенке фибриллярных нитей, вызывающих «бегущую волну» по поверхности клетки. Наконец, бактерии могут всплывать и погружаться в жидкости, меняя свою плотность, наполняя газами или опустошая аэросомы.

У бактерий можно изучать некоторых простейшие элементы поведенческих реакций, например, движение, обусловленное мерцанием жгутиков или ресничек. Бактерии отвечают на химическое раздражение движением по направлению к источнику раздражения (положительный хемотаксис) или, наоборот, от этого раздражителя (отрицательный хемотаксис). Эта их реакция обусловлена функционированием своеобразного молекулярного мотора, от которого зависят вращения жгутика, действующего наподобие пропеллера и направляющего движение бактерии.

Бактерии взаимодействуют друг с другом, как внутри одного вида, так и с представителями других видов. При этом они обмениваются сигнальными молекулами.

Хотя генетика микроорганизмов изучается достаточно активно (полностью расшифрованы геномы многих сотен микробов), генетические основы их поведения изучены гораздо хуже. Но, тем не менее, есть интересные результаты. Так, ученые из Института биологии развития им. Макса Планка (Тюбинген, Германия) на примере почвенной бактерии Myxococcus xanthus показали, что радикальные изменения коллективного поведения и межорганизменных взаимосвязей у бактерий могут происходить в результате весьма незначительных модификаций генома.

Myxococcus -- типичный представитель миксобактерий, которым свойственно весьма сложное коллективное поведение. Например, они иногда собираются в большие скопления и устраивают коллективную «охоту» на других микробов. «Охотники» выделяют токсины, убивающие «добычу», а затем используют органические вещества, высвободившиеся при распаде погибших клеток.

Как и другие миксобактерии, Myxococcus при недостатке пищи образует плодовые тела, в которых часть бактерий превращается в споры. В виде спор микробы могут пережить неблагоприятные условия. Плодовое тело собирается из огромного множества индивидуальных бактериальных клеток. Создание такой крупной и сложной многоклеточной структуры требует совместных скоординированных действий миллионов отдельных бактерий, из которых лишь малая часть получает прямую выгоду, а все остальные, по сути дела, жертвуют собой ради общего блага. Но лишь очень немногие из участников коллективного действия смогут превратиться в споры и передать свои гены следующим поколениям. Все остальные выступают в роли «стройматериала», который погибнет, не оставив потомства.

Рис.3.1. Myxococcus -- типичный представитель миксобактерий

Рис.3.2.Плодовые тела, образованные бактериями Myxococcus xanthus

Среди миксококков есть генетические линии (или штаммы), не способные к образованию собственных плодовых тел, но умеющие пристраиваться к «чужим» плодовым телам и образовывать там свои споры.

Один из таких штаммов (исследователи назвали его OC, от obligate cheater -- «облигатный обманщик») не способен образовывать споры в монокультуре, однако, он успешно внедряется в чужие плодовые тела и спорулирует там даже с большей эффективностью, чем штамм-хозяин, построивший плодовое тело.

Ученые экспериментировали с этой системой «паразит--хозяин», выращивая смешанную культуру альтруистов и обманщиков попеременно то в «голодной», то в богатой питательными веществами среде и следя за колебаниями численности двух штаммов. Во время голодовок выжить могли только те бактерии, которым удалось превратиться в споры. В одном из опытов в штамме OC произошла мутация, в результате которой бактерии не только восстановили утраченную способность к самостоятельному (без «помощи» другого штамма) образованию плодовых тел и спор, но и получили дополнительное преимущество. По не вполне ясным причинам мутантные бактерии оказались защищены от «нахлебников» -- представителей штамма ОС, своих прямых предков.

Возникший в результате мутации новый штамм получил условное название PX (от phoenix -- «феникс»). Этот штамм появился и быстро размножился как раз тот момент, когда почти все бактерии в экспериментальной культуре (исходный «дикий» штамм и паразиты ОС) погибли. Штамм PX, как выяснилось, побеждает в конкурентном соревновании и «диких» миксококков, и паразитов ОС. Он не нуждается для образования плодовых тел в других штаммах и защищен от паразитизма.

Генетический анализ исследованных штаммов показал, что PX отличается от своего прямого предка OC единственной мутацией -- заменой нуклеотида в некодирующей (вероятно, регуляторной) области гена фермента ацетилтрансферазы.

Всего в геноме миксококка более 30 генов различных ацетилтрансфераз (так называются ферменты, прикрепляющие к каким-либо молекулам ацетильную группу -CO-CH3), и конкретная функция той из них, ген которой изменился у штамма PX, неизвестна, но некоторые косвенные данные, однако, указывают на возможную регуляторную роль этого фермента. Не исключено, что он влияет на активность каких-то транскрипционных факторов -- белков, регулирующих активность генов. Действительно, активность целого ряда генов у PX сильно изменилась по сравнению с OC.

Итак, ученым удалось зарегистрировать мутацию, в результате которой бактерии Myxococcus xanthus приобрели сразу два полезных свойства: способность к сложному коллективному поведению (образованию плодовых тел) и защищенность от паразитов. Мутация состояла в замене одного нуклеотида в регуляторной области гена, предположительно участвующего в регуляции активности других генов.

Группа ученых из Гарвардского университета в результате многолетних исследований выяснила генетическую основу сложного социального поведения Bacillus subtilis. Эти повсеместно распространенные почвенные бактерии относятся к числу наиболее хорошо изученных микроорганизмов, их геном полностью расшифрован в 1997 году. Размер генома -- 4 214 630 пар оснований, общее число генов -- 4225, и функции большинства генов в общих чертах известны.

Этого, однако, недостаточно, чтобы понять механизмы, управляющие сложным поведением этой бактерии. B. Subtilis умеет, например, при необходимости отращивать жгутики и приобретать подвижность, собираться в «стаи» (swarming behavior) и принимать решения на основе химических сигналов, получаемых от сородичей. При этом используется особое «чувство кворума» (quorum sensing) -- нечто вроде химического голосования, когда определенное критическое число поданных сородичами химических «голосов» меняет поведение бактерий. B. subtilis способна собираться в многоклеточные агрегаты, по сложности своей структуры приближающиеся к многоклеточному организму.

Рис.3.3. «Плодовое тело» Bacillus subtilis -- сложный многоклеточный агрегат, часто образуемый дикими бактериями в природе, и почти никогда -- в лаборатории.

В критической ситуации (например, при длительном голодании) бактерии превращаются в споры, устойчивые к неблагоприятным воздействиям. Но превращение в спору для B. subtilis -- процесс дорогостоящий, требующий активизации около 500 генов, и эта мера приберегается на самый крайний случай.

В качестве предпоследней меры в голодные времена B. subtilis прибегает к убийству своих сородичей и каннибализму. При голодании у B. subtilis срабатывает особый генный переключатель, который может находиться лишь в одном из двух дискретных состояний (включено/выключено). «Переключатель» состоит из ключевого гена-регулятора Spo0A и нескольких других генов, которые взаимно активируют друг друга по принципу положительной обратной связи.

Активизация Spo0A приводит к целому каскаду реакций, в том числе к производству клеткой токсина SdpC, убивающего тех бактерий, у которых «переключатель» выключен. Но голодание приводит к активизации Spo0A только у половины микробов. Погибшие клетки распадаются, высвободившиеся из них органические вещества используются убийцами. Если никаких перемен к лучшему так и не произойдет, они образуют споры.

Поначалу было неясно, почему токсин убивает только тех бактерий, которые его не выделяют (то есть тех, у кого Spo0A не активирован). Оказалось, что на мембране бактерий есть защитный белок SdpI, выполняющий сразу две функции. Во-первых, он защищает клетку от токсина SdpC (просто хватает молекулы токсина и держит, не дает им ничего делать). Во-вторых, молекула белка SdpI, схватившая молекулу токсина, изменяется таким образом, что другой ее конец (торчащий из внутренней стороны мембраны) хватает и удерживает молекулы белка SdpR, функция которого состоит в том, чтобы блокировать производство защитного белка SdpI.

Таким образом, схватывание защитным белком молекулы токсина приводит к инактивации белка, тормозящего производство защитного белка. То есть чем больше будет токсина, тем больше клетка будет производить защитного белка. А как только токсин в окружающей среде закончится, молекулы SdpR перестанут инактивироваться, и производство защитного белка остановится.

По молекулярно-биологическим меркам это -- крайне простой регуляторный каскад. Так бактерии защищаются от собственного токсина. А бактерии с выключенным Spo0A оказываются незащищенными, потому что синтез спасительного SdpI у них блокируется еще одним белком -- AbrB. Отключить AbrB можно только путем включения Spo0A, поэтому клетки с выключенным Spo0A обречены на гибель.

3.2 Генетика хемотаксиса у бактерий

Бактерии способны реагировать не на любые химические соединения, но только на определенные химические соединения и различные для разных бактерий. Такие вещества называют хемоэффекторами.

Среди эффекторов есть вещества, привлекающие бактерий, - аттрактанты, и вещества, их отпугивающие, - репелленты.

В поверхностных структурах бактериальной клетки есть специальные белковые молекулы - рецепторы, специфически соединяющиеся с определенным эффектором. При этом взаимодействии молекула эффектора не изменяется, а в молекуле рецептора происходят конформационные и другие изменения.

У большинства бактерий есть рецепторы, воспринимающие молекулярный кислород, протоны, у многих есть рецепторы, воспринимающие аминокислоты, сахара. Так, например, кишечная палочка - Escherichia coli - имеет около 20 различных типов рецепторов. Клетка кишечной палочки содержит около 25 тыс. рецепторных молекул.

Благодаря этим рецепторам бактерии обладают хемотаксисом.

Хемотаксис - это свойство организмов перемещаться к определенным химическим веществам (аттрактанты) и удаляться от других (репелленты).

Подвижных бактерий привлекает множество химических веществ. Хеморецепторы чувствительны к специфическим химическим веществам, которые не вырабатываются организмом бактерии.

Получены десятки мутантных клонов Escherichia coli (Рис.3.4) , у которых отсутствует положительный хемотаксис ко многим веществам (например, сахарам, аминокислотам и кислороду), привлекающим Е. coli дикого типа, даже, несмотря на то, что мутантные бактерии полностью сохраняли подвижность и обладали полным набором нормальных жгутиков. Мутанты реагируют на все обычные раздражители, кроме особых аттрактантов, способность отвечать на которые у них утрачена.

Рис.3.4. Микрофотография Escherichia coli

Для сильных аттрактантов -- сахаров (N-ацетилгдюкозамина, фруктозы, галактозы, глюкозы, мальтозы, маннитола, рибозы, сорбитола и трегалозы) описано девять хеморецепторов. Два предназначены для обнаружения аминокислот (аспартата и серина).

На генетической карте Е. coli были локализованы гены подвижности и хемотаксиса, включающие такие локусы:

· curly (он связан с повреждением белка жгутиков и с изменением их движений, так что возможны только вращательные движения);

· motile (жгутики нормальны на вид, но не могут двигаться);

· flagella (отсутствие жгутиков, неподвижность);

· chemotaxix (хемотаксис отсутствует при сохранении подвижности; локус включает три гена).

У E. сoli хемотаксис можно пронаблюдать, если вставить капиллярную трубу, заполненную аттрактантом, или репеллентом, в пробирку, содержащую бактериальные клетки в жидкой агаризованной среде (Рис. 3.4).

Если капилляр содержит нейтральный химикат, который ни привлекает, ни отвращает, бактериальные клетки безразличны к нему и остаются однородно рассеянными повсюду в среде (A).

Если капилляр содержит аттрактант, движение клеток направленно к устью (входному отверстию) капилляра, и, в конечном счете, клетки в него проникают (Б).

Если капилляр содержит репеллент, клетки отплывают от него (В).

Рис.3.4. Хемотаксис у E. сoli в жидкой агаризованной среде в присутствии химических соединений нейтрального действия (А), аттрактивного действия (Б) и репеллентного действия (В).

Большинство аттрактантов - питательные вещества, такие как сахар и аминокислоты, тогда как большинство репеллентов - вредные вещества или продукты выделения, например, кислоты или спирты. Следовательно, ответ хемотаксиса важен для бактериальных клеток, поскольку обеспечивает их перемещение в среду с благоприятными условиями или удаление от вредных условий.

В отсутствии аттрактантов или репеллентов, клетки движутся хаотично. В присутствии аттрактанта периоды продвижения по направлению к нему становятся более продолжительными, а периоды перемещения в другом направлении - более редкими и короткими, т.е. в целом траектория движения клеток направлена к источнику аттрактанта. Действие репеллентов противоположно, и, следовательно, клетки постепенно рассеиваются от их источника.

Выявление мутаций, затрагивающих хемотаксис у бактерий, позволило установить генетические компоненты данного типа ответа.

Фенотипы мутаций хемотаксиса подразделяют на пять категорий:

1. «Специфическое отсутствие хемотаксиса» означает, что клетки мутанта не проявляют ответ на специфический аттрактант или репеллент. Например, галактоза - аттрактант. Фенотип мутанта, который не в состоянии отвечать положительным хемотаксисом на галактозу, что и отличает его от бактерий дикого типа, демонстрирует «отсутствие хемотаксиса, специфичное для галактозы». Следствием мутации в другом гене является фенотип специфического отсутствия положительного хемотаксиса к глюкозе.

2. «Множественное отсутствие хемотаксиса» относится к фенотипам не способным проявлять ответ хемотаксиса на группу химически несвязанных веществ. Например, мутации в гене tsr приводят к неспособности мутантов отвечать на присутствие аттрактанта - аминокислоты серин или репеллентов - индола, лейцина и ацетата. Мутанты c множественным отсутствием хемотаксиса образуют четыре группы комплементации, соответственно которым определяют четыре гена - tsr, tar, trg, и tap.

3. Общее отсутствие хемотаксиса - это неспособность отвечать на какой бы то ни было аттрактант или реппеллент. Не смотря на то, что у таких мутантов есть нормальные жгутики, так же как аппарат, необходимый для того, чтобы переключить направление их вращение, они не способны управлять вращением жгутиков в ответ на аттрактанты или репелленты. Мутации общего отсутствия хемотаксиса могут быть объединены в шесть групп комплементации в зависимости от гена, который является существенным для любого вида хемотаксиса: cheA, cheB, cheR, cheW, cheY, и cheZ.

4. Мутации в моторных компонентах жгутиков вызывают отсутствие хемотаксиса из-за дефектов в аппарате, который управляет переключением между направлениями вращения жгутиков. Эти мутанты либо непрерывно движутся (плывут), либо непрерывно «падают», в зависимости от специфического типа мутации. С помощью генетического анализа мутаций в моторных компонентах были установлены три гена, необходимые для того, чтобы бактериальная клетка была способна переключаться между «плаванием» и «падением»: fliG, fliM, и fliN.

5. Неподвижные мутанты - это мутанты, которые неспособны ни «плавать», ни «падать», т.е. они неподвижны. Мутации неподвижности включают большое количество различных генов, которые необходимы для синтеза или работы жгутиков.

Анализ мутаций был важен для понимания процесса хемотаксиса у бактерий. Например, корреляция между направлением вращения жгутиков и состоянием «плаванья» или «падения» клеток была установлена при наблюдении за двумя типами мутаций в моторных компонентах жгутиков.

Все гены, задействованные в хемотаксисе, были клонированы и секвенированы, и их генные продукты были идентифицированы. Хемотаксис бактерий дикого типа требует наличия ряда белков, так называемых хемосенсоров, каждый из которых связывается с определённым аттрактантом или репеллентом. В качестве примеров хемосенсоров можно привести галактоза-связывающий белок и переносчик глюкозы. Известно более чем 20 различных хемосенсорных белков; около половины из них связываются с аттрактантами, а другая половина - с репеллентами. Мутации в генах, кодирующих хемосенсорные белки, приводят к отсутствию хемотаксиса. Приспособительное значение хемотаксиса доказано экспериментально. Например, формы холерного вибриона с нарушенным хемотаксисом оказываются менее болезнетворными (вирулентными), чем исходные. За счет хемотаксиса к корешкам растений приближаются симбиотические или паразитические бактерии, корневые выделения иногда воспринимаются ими с расстояния до 10 см (огромное для бактерии расстояние). Кроме хемотаксиса бактерии могут проявлять и другие поведенческие реакции:

· фототаксис, характерный для бактерий, использующих свет в качестве источника энергии;

· вискозитаксис, при котором бактерии стремятся в среду с большей вязкостью (характерен для некоторых патогенных бактерий);

· термотаксис - движение в сторону повышения или понижения температуры;

· магнетотаксис - способность некоторых бактерий плыть вдоль линий магнитного поля (в клетках таких бактерий, называемых магнетобактериями, находятся кристаллики железосодержащих минералов (например, магнетита), ориентирующиеся вдоль линий магнитного поля как стрелка компаса)

Новое необычное «электрическое» поведение бактерий Shewanella oneidensis обнаружили американские биологи. Оказалось, что S. oneidensis очень любят металлические частицы, подплывают к ним, садятся на них, снова «сбегают», активно передвигаются вблизи объекта, опять садятся. При замедленной съемке обнаружилось, что каждый раз при приближении к металлическим частицам микроорганизмы начинали активно двигаться. Бактерии демонстрировали подобное поведение и вблизи электрода батареи. При этом, как только электрод переставал работать, активное плавание прекращалось.

Рис.3.4.а. Бактерий Shewanella oneidensis

Такое поведение бактерий получило название электрокинеза (electrokinesis). Вероятно, бактерии во время контакта с металлом собирали посредством химической реакции энергию, затем несколько минут активно передвигались и снова садились для «подзарядки». К сожалению, генетические основы многих поведенческих реакций бактерий изучены пока недостаточно.

3.3 Самоидентификация и взаимное узнавание бактерий

В ходе эволюции у разных организмов развились разнообразные, в том числе весьма сложные и эффективные, механизмы различения «свой»-«чужой». Способность отличать своих от чужих -- одно из фундаментальных свойств живого. На этой способности основаны важнейшие биологические процессы и явления, в том числе половое размножение (выбор партнера), видообразование (формирование репродуктивной изоляции), защита от патогенных микробов и вирусов, отторжение чужеродных тканей, колониальность, многоклеточность, социальность, включая разные формы кооперации и даже альтруизма (который, как правило, направлен на «своих», прежде всего на родственников). В ходе эволюции у разных организмов развились разнообразные, в том числе весьма сложные и эффективные, механизмы различения своего и чужого. У высших организмов (эукариот) эти механизмы изучены значительно лучше, чем у прокариот (бактерий и архей).

Поскольку генетические и биохимические основы различения «своих» и «чужих» у бактерий изучены пока недостаточно, то каждое новое открытие в этой области привлекает к себе пристальное внимание.

Американскими микробиологами был раскрыт механизм взаимной идентификации у бактерии протея (Proteus mirabilis) (Рис.3.5). Этот микроб живет в пищеварительном тракте человека и обычно безвреден, но при неблагоприятном стечении обстоятельств может вызывать инфекционные заболевания.

Рис.3.5. Бактерии Proteus mirabilis

Для протея характерен довольно сложный аналог социального поведения, что выражается, в частности, в согласованных передвижениях больших групп бактериальных клеток.

В геноме этой бактерии выявлен участок, отвечающий за самоидентификацию и взаимное узнавание микробов. Мутации в этом участке могут приводить к мгновенному разделению популяции микробов на группы, относящиеся друг к другу как к «чужакам». Представители таких групп «отказываются» образовывать смешанные скопления.

Когда две колонии или «стаи» (swarms) Proteus mirabilis встречаются на поверхности питательной среды, происходит одно из двух: либо колонии сливаются, либо они сохраняют самостоятельность. В последнем случае между ними образуется хорошо видимая граница. Выбор одного из двух вариантов зависит от степени родства. Если обе стаи принадлежат к одному и тому же штамму (клону, генетической линии), они, скорее всего, сольются; если к разным -- между ними, скорее всего, возникнет граница. Данная особенность используется в медицинской практике для идентификации штаммов микроба.

Рис.3.6. Колонии Proteus mirabilis

Было установлено, что многие штаммы Proteus mirabilis выделяют токсичные белки -- протицины, предназначенные для борьбы с конкурирующими штаммами. Каждый штамм выделяет свой протицин, к которому он устойчив, и к тому же обладает устойчивостью к некоторым (но не всем) чужим протицинам. Однако образование границ между неродственными «стаями» определяется не протицинами, а чем-то другим. Дело в том, что некоторые штаммы не выделяют протицинов, но при этом всё равно образуют границы, в том числе и с другими штаммами, лишенными протицинов.

Чтобы выяснить причины этого явления, исследователи «заставили» бактерий быстро мутировать, активизировав перемещение мобильных генетических элементов (транспозонов). Из одного «предкового» штамма (BB2000) было получено 3600 мутантных штаммов-потомков. Среди них обнаружился один, который «отказался» смешиваться с другими мутантами и с предковым штаммом BB2000. Его назвали Ids (от слов «identification of self» -- «самоидентификация»). Очевидно, в штамме Ids произошла мутация, вследствие которой этот штамм изменил свою самоидентификацию и начать воспринимать родительский штамм BB2000 как «чужой».

Оказалось, что у штамма Ids транспозон встроился в участок генома, содержащий шесть генов, функции которых до сих пор не были известны. Ученые обозначили этот участок idsABCDEF. По-видимому, транспозон нарушил нормальную работу этих генов, что и привело к «отчуждению» бактерий-мутантов от предков и родственников.

Чтобы проверить это предположение, у бактерий из предкового штамма BB2000 удалили все шесть генов. Получились мутанты, которые считали штамм Ids «своим», а предков -- «чужими». Стало ясно, что данные шесть генов действительно играют ключевую роль в самоидентификации данных бактерий и в различении своих и чужих. После этого началась кропотливая генно-инженерная работа с целью выяснения функций каждого из шести генов в отдельности.

Выяснилось, что удаление гена idsA само по себе не ведет к изменению самоидентификации бактерий. Этот ген, по-видимому, играет какую-то вспомогательную роль. Однако удаление или поломка хотя бы одного из генов idsB, idsC, idsD, idsE, idsF приводит к тому, что бактерии начинают считать предковый штамм «чужим». При этом бактерии, у которых удален ген B, C, D или E, считают «своими» бактерий, у которых удалены все шесть генов. Однако бактерии с удаленным геном F считают «чужими» всех, кроме самих себя.

Исследователи обнаружили, что похожие генетические системы идентификации есть и у других штаммов Proteus mirabilis, а также у других видов бактерий. Была проведена дополнительная серия экспериментов, в которой участок idsABCDEF пересаживался (целиком или по частям) другому, неродственному штамму Proteus mirabilis (штамм HI4320) вдобавок к его собственной генетической идентификационной системе. Бактерии из штамма HI4320, которым участок idsABCDEF от штамма BB2000 пересадили целиком, начинают считать свой родной штамм HI4320 «чужим». Однако если в пересаженном участке поврежден ген D или E, отчуждения не происходит: бактерии продолжают считать штамм HI4320 «своим».

Эти и другие, более сложные, эксперименты позволили ученым установить, что самую важную роль в различении «своих» и «чужих» играют гены D и E. Именно они определяют «индивидуальность» бактерии. В этих генах обнаружились вариабельные области, то есть участки, сильно различающиеся у разных штаммов. Гены D и E образуют уникальную генетическую «идентификационную карточку», по которой штаммы бактерий различают друг друга.

Гены B, C и F, по-видимому, нужны для того, чтобы эта «идентификационная карточка» могла быть должным образом представлена и опознана. У разных штаммов эти гены различаются слабо, и если взять любой из этих генов у одного штамма и пересадить другому, самоидентификация бактерий не изменится.

Судя по ряду косвенных признаков, система идентификации у Proteus mirabilis не ограничена участком idsABCDEF. Скорее всего, существуют и другие, пока еще не выявленные, гены, участвующие в различении «своих» и «чужих». Вся система в целом может оказаться весьма сложной.

Существуют и другие ситуации, в которых бактерии могут решать дилемму «свой»-«чужой». Например, ситуация симбиоза.

Симбиоз с различными бактериями чрезвычайно широко распространен как у животных, так и у растений. Очень часто многоклеточный организм не получает симбионтов автоматически от своих родителей, а должен сам каким-то образом найти их в окружающей среде и «получить» их в начале своей жизни. Учитывая огромное разнообразие микроорганизмов во всех природных местообитаниях, понятно, что в такой ситуации первостепенное значение приобретает точность «взаимного узнавания» симбионта и хозяина.

Но механизмы этого узнавания, безусловно, существуют.

Есть паразитические бактерии, у которых очень близкие формы паразитируют на совершенно разных хозяевах. Например, одна из разновидностей бактерии Salmonella enterica заражает только людей, а другая имеет широкий круг хозяев -- от приматов до грызунов. При этом геномы обеих разновидностей чрезвычайно похожи друг на друга. Пока не удалось обнаружить в их геномах то ключевое различие, от которого зависит выбор хозяина.

В случае симбиоза оба участника заинтересованы в точном узнавании партнера. Ученым удалось расшифровать механизм взаимного узнавания в симбиотической ассоциации растений с азотфиксирующими бактериями. В этом случае ключевую роль играют выделяемые бактериями сигнальные вещества, которые определенным образом влияют на работу генов в клетках корня растения-хозяина.

Частично расшифрован и механизм выбора партнера у другой пары симбионтов -- тихоокеанского кальмара Euprymna scolopes и светящейся бактерии Vibrio fischeri.



Рис.3.7. Кальмар Euprymna scolopes светится благодаря симбиотическим бактериям Vibrio fischeri, живущим в особом «светящемся органе».

Рис.3.8. Светящиеся бактерии Vibrio fischeri

Известно, что одни разновидности светящейся бактерии Vibrio fischeri живут в симбиозе с рыбами, другие -- с кальмарами. Ученые выяснили, что способность заселять светящиеся органы кальмаров определяется одним-единственным бактериальным геном. Пересадка этого гена от «кальмарной» разновидности микроба его «рыбной» разновидности приводит к тому, что последняя приобретает способность жить в симбиозе с кальмарами.

Геномы «кальмарной» и «рыбной» разновидности Vibrio fischeri были полностью изучены и оказались весьма сходными (90% сходства по набору генов и 98,8% -- по аминокислотным последовательностям белков).

Исследователи обнаружили, что один из тех генов, которые активно работают у Vibrio fischeri в период заселения светящихся органов молодых кальмаров, в геноме «рыбного» штамма отсутствует. Дальнейшие исследования показали, что этот ген (его условное обозначение -- rscS) действительно играет ключевую роль в содружестве бактерий с кальмарами.

Ген rscS кодирует белок-рецептор, который располагается на клеточной мембране, реагирует на какие-то внешние сигналы и передает их внутрь клетки, активизируя другой регуляторный белок -- транскрипционный фактор SypG. В свою очередь, SypG стимулирует активность группы генов, которые кодируют белки, необходимые для синтеза особых полисахаридов, которые выводятся из бактериальной клетки и располагаются на ее наружной поверхности. От этих полисахаридов зависит способность бактерий размножаться в слизи, выделяемой светящимся органом кальмара.

Ген rscS встречается в двух аллельных вариантах (rscS_A и rscS_B), причем только аллель rscS_A позволяет бактерии вступить в симбиоз с кальмаром. Именно этот вариант гена присутствует у всех «кальмарных» штаммов и у того «рыбного» штамма, который сумел наладить отношения с кальмаром. У всех остальных «рыбных» штаммов либо присутствует второй вариант гена (rscS_B), либо ген вовсе отсутствует (как у той «рыбной» линии, чей геном был полностью прочтен авторами).

Чтобы убедиться в том, что наличие аллеля rscS_A у V. fischeri является необходимым и достаточным условием симбиоза с кальмарами, ученые провели ряд генно-инженерных экспериментов. Они выводили из строя этот ген у «кальмарных» штаммов -- и бактерии теряли способность жить в содружестве с кальмарами. Они внедряли ген в «рыбные» штаммы -- и они приобретали эту способность. Таким образом, предположение полностью подтвердилось.

На основе сравнения нуклеотидных последовательностей трех других генов исследователи построили эволюционное древо изученных штаммов микроба. Судя по этому древу, изначально V. fischeri не имел гена rscS и жил в симбиозе только с рыбами. Затем один из штаммов микроба приобрел этот ген. Все штаммы, имеющие ген rscS, образуют на древе монофилетическую (происходящую от одного предка) группу. Это означает, что ген был приобретен только один раз. Сначала он существовал только в одном варианте -- rscS_A. Некоторые из потомков того микроба, который впервые обзавелся новым геном, покинули своих прежних хозяев -- рыб -- и перешли к симбиозу с кальмарами. Впоследствии кое-кто из них вернулся к симбиозу с рыбами, причем это возвращение сопровождалось изменениями в гене rscS. Так появился второй вариант этого гена -- rscS_B, который, возможно, каким-то образом улучшает «взаимопонимание» между микробами и рыбами.

Это первый известный случай, когда главным «действующим лицом» во взаимном узнавании симбионтов оказался регуляторный ген.

Ученые считают, что необходимо дальнейшее изучение генетики процессов самоидентификации и взаимного узнавания бактерий для их дальнейшего практического использования.

Глава 4. Генетика поведения одноклеточных животных

4.1 Особенности поведения одноклеточных животных

Одноклеточные животные демонстрируют довольно широкий спектр поведенческих реакций. Относительно небольшие размеры простейших дают им возможность непосредственно использовать рецепторный аппарат мембраны для быстрого изменения поведения. Простейшие прекрасно двигаются по градиенту пищевых растворов и избегают растворов щелочей, кислот и солей. Одноклеточные животные обладают хемотаксисом, термотаксисом, фототаксисом, гальванотаксисом. Есть данные о том, что они способны к элементарному «обучению».

Ученые установили такое свойство одноклеточных организмов, как привыкание. Эксперименты проводили на парамециях, которых предварительно приучали к определённой температуре, а затем помещали в ванночку с температурным градиентом. Оказалось, что оптимальной для парамеций является температура 24-28°C. Однако при выдерживании инфузорий при низких температурах они предпочитали уменьшение обычного оптимума. Экспериментаторы рассматривали такие результаты как явное свидетельство «обучаемости» парамеций.