Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Целью работы явилось изучение антигипоксических и нейропротекторных свойств N-ADA при моделировании острой гипоксии в культуре клеток гиппокампа и острой гипобарической гипоксии in vivo.

N-арахидоноилдофамин

Все агонисты CBR принято подразделять на растительные (фитоканнабиноиды), эндогенные и синтетические. Среди фитоканнабиноидов (рис. 1), в состав которых входит более 60 соединений, полученных из растения C. sativa, впервые выделенным и наиболее хорошо изученным является Д9-тетрагидроканнабинол (ТГК), который отвечает за психоактивные эффекты экстрактов конопли и является агонистом обоих типов CBR. Другой фитоканнабиноид, каннабидиол, не является лигандом CBR, однако он оказывает значительное каннабимиметическое действие, проявляя антиоксидантные свойства, ингибируя деградацию анандамида и, возможно, взаимодействуя с другими, пока не изученными, CBR.

Наиболее известными эндогенными лигандами CBR (рис. 2) в настоящее время являются анандамид (АNА) и 2-арахидоноилглицерин (2- AG). Среди других ЭК выделяют ноладиновый эфир (2- арахидоноилглицерил эфир), виродамин и N-арахидоноилдофамин (N-ADA), однако их биологическая роль и биохимические характеристики в значительной степени остаются неизученными (Pertwee, 2006).

Рисунок 1 Химическая структура фитоканнабиноидов (Szabo, 2008)

Наиболее известными эндогенными лигандами CBR (рис. 2) в настоящее время являются анандамид (АNА) и 2-арахидоноилглицерин (2- AG). Среди других ЭК выделяют ноладиновый эфир (2- арахидоноилглицерил эфир,), виродамин и N-арахидоноилдофамин (N-ADA), однако их биологическая роль и биохимические характеристики в значительной степени остаются неизученными (Pertwee, 2006). Различные канабиноиды проявляют различную аффинность к разным типам CBR: некоторые являются агонистами преимущественно CBR-1 (N-ADA, АNА, ноладиновый эфир), другие представляют собой неселективные агонисты обоих типов CBR (2-AG, виродамин и др.) (Bisogno et al., 2000; Howlett et al., 2004; Massi et al, 2008; Szabo, 2008).

Синтетические лиганды CBR характеризуются большим разнообразием химического состава. Обычно их подразделяют на следующие категории: классические каннабиноиды, сохраняющие трициклическую дитерпеновую структуру ТГК (HU-210, HU-234, каннабидиол и т.д.), неклассические каннабиноиды (CP55940, CP47497, CP55244), аминоалкилиндолы (WIN 55.212- 2 и селективные агонисты CBR-1) и эйкозаноиды, которые метаболически более устойчивы и обладают большей селективностью, чемклассические каннабиноиды (O-1861, O-585, и O-689) (Szabo, 2008; Palazuelos et al., 2006).

Рисунок 2 Химическая структура эндогенных лигандов каннабиноидных рецепторов (Szabo, 2008)

N-ADA относится к группе N-ацилдофаминов (амидов длинноцепочечных жирных кислот) и представляет собой амид арахидоновой кислоты с дофамином (Bobrov et al., 2008). Изначально N-ADA был синтезирован для изучения эндованилоидной системы из-за его сходства с капсаицином (агонистом TRPV1), в котором молекула дофамина также сопряжена с арахидоновой кислотой. Затем его определили, как эндогенное соединение, которое синтезируется в основном в стриатуме, черной субстанции, гиппокампе, мозжечке и является агонистом СВR (Huang et al., 2002). Было показано, что он в 40 раз селективнее связывается с CBR-1, чем с CBR-2, и практически не связывается с дофаминовыми рецепторами (Bisogno et al., 2000). Поскольку N-ADA также активирует и TRPV1 (Caterina, Julius, 2001; van der Stelt, Di Marco, 2004; Bradshow, Walker, 2005), его характеризуют как CBR-1/TRPV1 гибридный лиганд. Было показано, что связывание N-ADA с TRPV1 и CBR-1 приводит к деполяризации мембраны и повышению концентрации внутриклеточного кальция ([Ca2+]i) в дорсальных ганглиях (Huang et al., 2002; Sagar et al., 2004). Однако рядом других исследователей кальциевый ответ на действие N-ADA или капсаицина в культурах нейронов гиппокампа не обнаружен (Crawford et al., 2009). Показано, что в гиппокампе N-ADA усиливает тормозные процессы за счет стимуляции ГАМК-ергической передачи (Huang et al., 2002).

N-ADA при связывании с CBR-1 в присутствии антагониста TRPV1, IRTX, в концентрации 10 мкМ тормозит выброс глутамата из пресинаптических терминалей дофаминергических нейронов черной субстанции, и, напротив, усиливает выброс глутамата при связывании с TRPV1 в присутствии антагониста CBR-1 АМ 281 (Marinelli et al., 2007). Авторами было показано, что для эффективного связывания с TRPV1 необходимо участие мембранного транспортера эндоканнабиноидов (EMT), что объясняется расположением связывающего сайта. Следует отметить, что в отсутствие антагонистов CBR-1 или TRPV1, высвобождение глутамата нейронами черной субстанции существенно не изменялось, что, очевидно, связано с одновременной стимуляцией рецепторов обоих типов.

Кроме регуляции синаптической передачи, N-ADA индуцирует термальную гипералгезию, стимулирует спонтанную и термически вызванную активность в спинальных ноцицептивных нейронах и оказывает действие на сократительную активность гладких мышц за счет активации TRPV1, а также проявляет сосудорасширяющее действие, активируя как CBR-1, так и TRPV1 мелких сосудов брыжейки (Price et al, 2004; O'Sullivan et al, 2004; Huang and Walker, 2006).

При парентеральном введении животным N-ADA в концентрациях 1-10 мг/кг вызывает классическую каннабиноидную тетраду (гипотермия, анальгезия, снижение локомоторной активности и каталепсия), действуя, так же, как и классический агонист CBR-1. Этот эффект блокируется антагонистом CBR-1, но не блокируется антагонистами дофаминовых рецепторов (Bisogno et al., 2000).

Таким образом, N-ADA может действовать как про-, так и эндоканнабиноид, в зависимости от того, взаимодействует ли он с TRPV1 или CBR-1, соответственно.

1.1.2 Биосинтез и деградация эндоканнабиноидов

Каннабиноиды синтезируются и реализуются локально on demand (по требованию). Таким образом, уровень их генерации не является постоянным, а кинетика их деградации является основным фактором их активности. В естественных условиях, как полагают, синтез анандамида происходит путем ферментативного гидролиза фосфолипазой D мембранного предшественника - N-арахидоноил фосфотидилэтаноламина (Schmid et al., 1983; Deutsch, Chin, 1993). N-арахидоноил фосфотидилэтаноламин формируется путем ферментативного переноса арахидоновой кислоты из sn-1 положения мембранного фосфотидилхолина на аминогруппу фосфотидилэтаноламина (Cadas et al., 1997; Sugiura et al., 2002). Никаких конкретных трансацилаз, катализирующих данный процесс, на сегодняшний день не идентифицировано, однако некоторым исследователям удалось клонировать специфичную для N-арахидоноил фосфотидилэтаноламина фосфолипазу D (Okamoto et al., 2004). Возможны и другие варианты синтеза анандамида. Так, например, в желудке секреторная фосфолипаза А2 может катализировать конверсию N-ацил фосфотидилэтаноламина в N-ацил лизофосфотидилэтаноламид. Далее под действием лизофосфолипазы D образуются соответствующие N-ацилэтаноламиды, в том числе, анандамид (Sun et al., 2005). Другой альтернативный путь был описан в RAW246.7- макрофагах, где происходит гидролиз N-арахидоноил фосфотидилэтаноламина до фосфоанандамида с участием фосфолипазы С и дальнейшим действием фосфатазы (Liu et al., 2006).

Для N-ADA предполагались два возможных пути биосинтеза. Первый возможный путь - это прямое сопряжение арахидоновой кислоты и дофамина, а другой - через метаболизм предполагаемого N- арахидоноилтирозина (NA-тирозин) (рис. 3).

Рисунок 3 Два предполагаемых метаболических пути биосинтеза N-ADA (Hu et al., 2009)

Показано, что NA-тирозин не является промежуточным продуктом в ходе биосинтеза N-ADA, который синтезируется в первую путем ферментативного сопряжения арахидоновой кислоты с дофамином (Hu et al., 2009). Хотя это сопряжение, вероятно, включает в себя комплекс ферментов, показано прямое участие гидролазы амидов жирных кислот в биосинтезе N- ADA.

Эндоканнабиноиды не хранятся в синаптических везикулах, как другие нейротрансмиттеры. Напротив, они, благодаря своей липидной природе, через постсинаптическую мембрану попадают в синаптическую щель, где связываются с соответствующими рецепторами, часто расположенными пресинаптически.

Таким образом, ЭК могут выступать в качестве сигнальных молекул. Дальнейшие сигнальные пути, опосредуемые CBR, приводят к ингибированию реализации нейромедиаторов, главным образом ГАМК или глутамата, таким образом, ретроградно модулируя синаптическую передачу (Gуmez-Ruiz et al., 2007).

Чтобы прекратить влияние ЭКС, эндогенные лиганды СВR, как и другие нейротрансмиттеры, должны быть инактивированны. Эта инактивация происходит в 2 этапа: ЭК должны быть транспортированы в клетку, возможно, специальной транспортной системой, а затем гидролизованы под действием специальных ферментов (Bari et al., 2006). Анандамид гидролизуется до двух компонентов (арахидоновой кислоты и этаноламина) под действием гидролазы амидов жирных кислот (ГАЖК, FAAH), а 2-арахидоноилглицерол - до арахидоновой кислоты и глицерина под действием моноацилглицероллипазы (МАГЛ, MAGL) (Dinh et al., 2002).

В 1994 г. было обнаружено, что захват анандамида обратно в клетку происходит путем облегченной диффузии (Di Marzo et al., 1994), и что этот процесс зависит от ряда факторов (температуры, чувствительности к субстрату, насыщаемости). Также была показана его независимость от ионных градиентов и гидролиза АТФ, однако возможно влияние оксида азота (Maccarrone et al., 2000). Хотя в последние годы было предпринято немало попыток идентификации специфического транспортера ЭК, его природа до сих пор остается не известной, что порождает все новые споры о его существовании (Glaser et al., 2003). На сегодняшний день, как правило, принято считать, что движение анандамида через клеточную мембрану - процесс насыщаемый, а также предложены различные механизмы поглощения анандамида, в том числе облегченная диффузия (Fegley et al., 2004), простая диффузия с ГАЖК-опосредованным расщеплением анандамида, простая диффузия с внутриклеточной секвестрацией анандамида, или эндоцитоз (McFarland et al., 2004). В отличие от анандамида, об обратном захвате 2-AG практически ничего не известно. Некоторые авторы предполагают, что он попадает в клетку опосредованно специальным транспортером, другие - что использует транспортер анандамида (Bisogno et al., 2000), либо это происходит путем простой диффузии (Beltramo, Piomelli, 2000).

В дополнение к основным ферментам, в процессе утилизации анандамида и 2-AG могут участвовать различные оксигеназы, например, липоксигеназа, цитохром Р450, циклооксигеназа, превращая ЭК в соответствующие соединения простагландина (van der Stelt et al., 2002). Физиологическая роль данных реакций пока не ясна.

1.1.3 Каннабиноидные рецепторы и их локализация в головном мозге

Аминокислотная последовательность CBR разных видов животных практически идентична (97-99% гомологии). В состав CBR-1 человека входят 472 аминокислоты, а в CBR-1 мышей и крыс насчитывают 473 аминокислотных остатка. CBR-2 состоит из 360 аминокислот, состав и последовательность которых значительно отличаются от таковых для CBR-1. Сравнение аминокислотной последовательности у мыши и человека выявило 82% гомологии. При этом интересно отметить, что гомология между двумя типами рецепторов невысока и составляет всего 48% (68% в трансмембранных доменах), что свидетельствует о достаточно ранней эволюционной дивергенции СВR. Тем не менее, способность одинаково эффективно связывать некоторые каннабиноидные лиганды объединяет их в один класс. CBR - это типичные Gбi/o-протеин-ассоциированные рецепторы. Они блокируются коклюшным токсином, а их активация ингибирует аденилатциклазу (Howlett, 2005; Хаспеков, Бобров, 2006). Активация CBR-1 ингибирует N-, P/Q- и L-типы потенциал-зависимых кальциевых каналов (Twitchell et al., 1997). Также эти рецепторы модулируют некоторые типы калиевых каналов (Im, Ia) (Mackie et al., 1995). В то же время, активация CBR-2 не вызывает модулирования ионных токов через кальциевые каналы (Felder et al., 1995). При этом оба типа рецепторов могут активировать сигнальный каскад митоген-активируемой киназы (MARK) (Bouaboula et al., 1995; Bouaboula et al., 1996).

Что касается распределения CBR в головном мозге, первые исследования локализации CBR-1 в различных его структурах проводилось методом радиоавтографии, с дальнейшим подтверждением результатов на CBR-1-нокаутных мышах. Эти, а также дальнейшие иммуногистохимические исследования показали, что наибольшая плотность CBR-1 у животных и человека наблюдается в новой коре (особенно в ее фронтальных отделах), мозжечке, гиппокампе, стволе головного мозга, базальных ганглиях, миндалине, гипоталамусе (Herkenham et al., 1991; Mackie et al., 2005). В целом можно сказать, что CBR-1 присутствуют практически во всех отделах головного мозга и, по мнению ряда авторов, являются самыми распространенными рецепторами в центральной нервной системе. Активация CBR-1 в указанных структурах отвечает за поведенческие реакции животных, называемые, как указывалось выше, классической каннабиноидной тетрадой: гипотермия, каталепсия, анальгезия, сниженная двигательная активность (Adams, Martin, 1996; Zimmer et al., 1996; Compton et al., 1993). На субклеточном уровне CBR-1 преимущественно локализованы на пресинаптических аксонных терминалях, в том числе в пресинаптической активной зоне, где они участвуют в регуляции высвобождения нейромедиаторов (Katona et al., 1999; Kofalvi et al., 2007). Также показано их присутствие на мембранах митохондрий нейронов, где они непосредственно регулируют клеточное дыхание и выработку энергии. Активация митохондриальных CBR-1 экзогенными каннабиноидами снижала концентрацию цАМФ, активность протеинкиназы А, активность I ферментативного комплекса и дыхание в митохондриях нейронов. (Benard G. et al., 2012). Помимо нервной системы, CBR-1 обнаружены также в сердце, надпочечниках, костном мозге, легких, простате, тестикулах (Mackie et al., 2005).

Результаты ряда исследований указывают на возможность вне- и постсинаптической локализации CBR-1. Так, природные и синтетические каннабиноиды модифицируют возбудимость нейронов путем регуляции калиевых токов на пре- и экстрасинаптической поверхности дендритов (Lozovaya et al., 2005).

CBR-2 менее широко распространены в организме. В течение длительного времени считалось, что они экспрессируются исключительно в периферических тканях, в особенности, в органах иммунной системы: в селезенке, миндалинах, тимусе, костном мозге, на иммунных клетках: макрофагах, В-лимфоцитах, клетках микроглии (Munro et al., 1993). Однако работы недавнего времени могут изменить эти представления. Методами иммуногистохимии было показано наличие CBR-2 в мозжечке. Авторы связывают их экспрессию с нейронами или клетками микроглии. Кроме того, CBR-2 недавно были обнаружены на нейронах продолговатого мозга (Gong et al., 2006; Morgan et al., 2009; Brusco et al., 2008).

CBR присутствуют также и на глиальных клетках. Клетки микроглии, по-видимому, способны экспрессировать оба типа рецепторов. CBR-2 обнаруживаются на вершинах ламеллоподий и микрошипиков клеток микроглии, что указывает на их роль в процессах подвижности. Получены доказательства экспрессии CBR-1 и CBR-2 астроцитами в культуре ткани и в срезах мозга (Rodriguez et al., 2001). Экспрессия CBR обоих типов олигодендроцитами была недавно подтверждена экспериментами на культурах клеток и in vivo. Присутствие CBR на основных типах клеток нервной ткани свидетельствует об участии ЭКС в регуляции как их собственной активности, так и нейроглиальных взаимодействий (Хаспеков, Бобров, 2006). Однако, в отличие от CBR-1, активация CBR-2 не связана с психоактивными эффектами (Zhang et al., 2009).

Первый селективный антагонист CBR-1, SR151716, получивший название римонабант, был описан в 1994 году (Barth, Rinaldi-Carmona, 1999). На его основе были получены другие антагонисты (АМ251, АМ281, SR147778). Однако существуют также антагонисты CBR-1, принадлежащие к другим химическим классам (например, LY320135) (Pertwee, 2006).

Большинство антагонистов CBR не только блокируют эффекты экзо- или эндогенных агонистов, но и оказывают инверсивное агонистическое действие, т.е. ингибируют конститутивно активные CBR (Pertwee R., 2010). Однако недавно были синтезированы антагонисты без инверсивного действия (NESS0327, VCHSR, O-2654 (Szabo, 2008).

1.1.4 Прочие рецепторы, связывающие каннабиноиды

Поскольку не все эффекты, вызываемые каннабиноидами, можно объяснить активацией CBR-1 и CBR-2, предполагается также наличие других, еще не до конца охарактеризованных, типов каннабиноидных рецепторов. Особо следует обратить внимание на недавно описанный G- протеин-связанный орфановый рецептор 55 (GPR55, G protein receptor GPR), который экспрессируеся в различной степени у разных видов животных. Он активируется рядом фитоканнабиноидов и некоторыми синтетическими и эндоканнабиноидами (Ryberg et al., 2007). Его разновидность, GPR55А, не активирует Gi/o или Gs белки. Гомология между GPR55 и CBR-1 и CBR-2 низка и составляет менее 15%. Филогенетически эти рецепторы далеки друг от друга. Предполагается, что в пострецепторный каскад сигнальных реакций GPR55 вовлекаются Ga13 протеин и активируются малые GTP-связывающие протеины rhoA, cdc42 и rac1. Также существуют данные, показывающие, что этот рецептор активируется лизофосфатидилинозитолом, но не каннабиноидами. Таким образом, вопрос, является ли GPR55 рецептором каннабиноидов, остается открытым (Szabo, 2008).

Другим интересным альтернативным рецептором может быть «аномальный каннабидиоловый рецептор», чьим основным лигандом является аномальный каннабидиол. Это соединение является неактивным каннабиноидом, который не связывается с CBR-1, однако опосредует эффекты у дикого типа и CBR-1 и CBR-1/CBR-2 - нокаутных мышей. (Gуmez-Ruiz et al., 2007).

Еще одним типом рецепторов, с которым могут связываться эндо- и экзоканнабиноиды, является упомянутый выше TRPV1 (The transient receptor potential cation channel subfamily V member 1), иначе называемый капсаициновым рецептором или ванилоидным рецептором 1 типа. Было показано, что активировать TRPV1 способны три различных класса эндогенных липидов. Это ненасыщенные N-ацилдофамины, в том числе N- ADA, метаболиты арахидоновой кислоты, образующиеся после воздействия на нее липооксигеназы, и эндоканнабиноид анандамид и ряд его аналогов (Van der Stelt, Di Marzo, 2004). TRPV1 - неселективный катионный канал, принадлежащий к группе транзиторных потенциал-зависимых каналов. Он активируется большим числом различных эндо- и экзогенных физических и химических стимулов. Наиболее известным агонистом TRPV1 является капсаицин, а из физических факторов - температура свыше 43оС (Szabo, 2008). В периферической нервной системе TRPV1 играют фундаментальную роль в регуляции болевых и термических ощущений (Caterina et al., 1997; Cui et al., 2006; Szallasi et al., 2007). Также их активация вызывает вазодилатацию (McCollum et al., 2007). Данные об экспрессии и функции этих рецепторов в головном мозге противоречивы. Рядом исследований не обнаружено экспрессии мРНК TRPV1 рецепторов в мозге крыс (Caterina et al., 1997; Szallasi et al., 2007), в то время как другими авторами показано их присутствие в новой коре, гиппокампе, мозжечке и дорсальных спинных ганглиях (Sasamura, Kuraishi, 1999). Недавние исследования показали, что TRVP1 экспрессируются на нейронах и астроцитах гиппокампа, но не на клетках микроглии (Grabiec et al., 2012). Указывается также на крайне низкий уровень экспрессии TRVP1 почти во всех областях головного мозга, включая гиппокамп (Cavanaugh et al., 2011) CBR-1 и TRPV1 коэкспрессируются на сенсорных нервах с вазоактивными свойствами. Это свидетельствует о том, что активация этих рецепторов может оказывать эффект, действуя через TRPV1 (Ralevic et al., 2002)

1.2 Сигнальные пути, запускаемые эндоканнабиноидной системой

Взаимодействие агонистов с CBR-1 и CBR-2 приводит к диссоциации сопряженных с ними Gi-белков на б субъединицу и вг димер, которые участвуют в регуляции разнообразных путей внутриклеточной сигнализации. Свободная Giб-субъединица ингибирует аденилатциклазу (АЦ), снижая концентрацию цАМФ в клетке. Важно отметить, что в условиях функционально занятых Gi-белков CBR-1 могут взаимодействовать с Gs- белками и активировать АЦ (Glass, Felder, 1997). Кроме того, возрастание или снижение концентрации внутриклеточного цАМФ в результате активации CBR во многом зависит от экспрессии определенной изоформы АЦ в соответствующем типе клеток. Внутриклеточные реакции, связанные с активацией АЦ агонистами CBR, на сегодняшний день еще недостаточно изучены (Hashimotodani et al., 2007).

Ингибирование АЦ снижает уровень фосфорилирования калиевых каналов А-типа цАМФ-зависимой протеинкиназой А, что в свою очередь приводит к активации этих каналов. Регуляция ионных токов может осуществляться и без участия АЦ. Стимуляция CBR-1 с последующей активацией G-белков приводит к ингибированию потенциал-зависимых кальциевых каналов N-типа. Однако устойчивые к гидролизу аналоги цАМФ и ингибиторы фосфодиэстераз не влияли на действие каннабиноидов, что свидетельствует о непосредственном влиянии активированных G-белков на данный тип каналов. CBR-1 участвуют также в торможении кальциевых токов через расположенные пресинаптически потенциал-зависимые каналы P/Q-типа в нейронах гиппокампа (Kano et al., 2009).

Внутриклеточные протеинкиназы также являются мишенью регуляции для CBR-1. Так, например, они могут активировать р38 киназу, активируемую митогенами (р38-МАРК), при этом не влияя на активность киназы JNK, а также вызывать фосфорилирование киназы фокальной адгезии, которая является важным интегрирующим звеном в перестройках цитоскелета. За счет инактивации АЦ и ПКА ЭК активируют киназы, регулируемые внеклеточными сигналами (ERK1/2 - еxtracellular regulated kinase). Было показано, что каннабиноиды активируют ERK1/2 за счет усиления фосфорилирования соответствующих киназ MEK1/2, при этом фосфоинозитол-3-фосфаткиназы в данном пути сигнализации не участвуют (Derkinderen et al., 2001, 2003).

Введение животным ТГК либо анандамида приводит к экспрессии ранних генов c-fos, c-Jun и zif-268 в определенных областях мозга, а также экспрессию мРНК продуцируемого мозгом нейротрофического фактора (BDNF) в полях СА1 и СА2 гиппокампа (Glass, Dragunov, 1995; Patel et al., 1998).

Таким образом, влияние ЭКС на ионную проницаемость и активность киназ, а также на экспрессию «ранних» генов и нейротрофических факторов свидетельствует об ее участии в процессах синаптической пластичности и в реализации адаптивных механизмов в нервной ткани (Хаспеков, Бобров, 2006).

1.2.1 Ретроградная модуляция синаптической передачи эндоканнабиноидами

Наиболее изучено воздействие каннабиноидов на глутамат- и ГАМК- эргическую синаптическую передачу. Торможение пресинаптического выброса нейромедиаторов может происходить не только при экзогенном воздействии каннабимиметиков на CBR-1, но и под влиянием ЭК, синтезируемых из липидных предшественников в постсинаптическом нейроне в ответ на его деполяризацию афферентными стимулами. Постсинаптическая деполяризация вызывает поступление ионов Са2+ в постсинаптический нейрон через потенциал-зависимые кальциевые каналы, что ведет к активации синтеза и высвобождения каннабиноидов. Синтезированные постсинаптически, ЭК попадают в синаптическую щель и, активируя сопряженные с Gi/o-белками CBR-1, локализованные на пресинаптических терминалях, оказывают кратковременное (в течение одного-двух десятков секунд) негативное воздействие на высвобождение нейромедиатора (рис. 4).

Высвобождающаяся в/г- субъединица G-белка ингибирует потенциал зависимые кальциевые каналы на пресинаптическом окончании, что приводит к снижению [Ca2+]i и подавляет высвобождение нейромедиатора (Szabo et al., 1998, 2000; Kano, 2014)). Ретроградное ингибирование ГАМК- ергической синаптической передачи было названо подавлением торможения, индуцированным деполяризацией (depolarization-induced suppression of inhibition, DSI) (Alger, Pitler, 1995), а глутаматергической - подавлением возбуждения, индуцированным деполяризацией (depolarization-induced suppression of exitation, DSE) (Kreitzer, Regehr, 2001) (рис.4). Установлено, что первичным сигналом, необходимым и достаточным для активации синтеза ЭК, с последующей индукцией как DSI, так и DSE, служит потенциалзависимое повышение [Ca2+]i в деполяризуемом постсинаптическом нейроне. Блокаторы потенциал зависимых кальциевых каналов и постсинаптическая аппликация хелаторов кальция препятствует развитию механизмов DSI/DSE (Lenz, 1998; Ohno-Sosaku, 2002). Таким образом, DSI/DSE представляют собой сходные формы обратимых кратковременных пластических регуляторных процессов, запускаемых одними и теми же посредниками (ЭК) и обладающих аналогичными сигнальными механизмами индукции и экспрессии.

Рисунок 4 Ретроградное ингибирование синаптической передачи каннабиноидами (Szabo, 2008)

ЭК не накапливаются в клетке, а синтезируются по мере необходимости - "on demand", после чего высвобождаются кальций зависимо. Постсинаптическое повышение концентрации кальция и DSI/DSE происходит синхронно, поэтому количество выделенных каннабиноидов может отражать степень активации постсинаптических нейронов. Если бы каннабиноиды в одинаковой степени ингибировали и возбуждающие, и тормозные синаптические входы, они бы не изменяли возбудимость постсинаптического нейрона.

Однако возбуждающие и тормозные афференты обладают разной степенью чувствительности к каннабиноидам. В то время как возбуждающие терминали равномерно и умеренно чувствительны, тормозные подразделены на 2 группы, одна из которых высокочувствительна, а вторая не реагирует на ЭК. Поэтому ЭК в зависимости от их концентрации вокруг синапсов могут ретроградно контролировать баланс между возбуждающими и тормозными пресинаптическими входами (Szabo, Shikler, 2005).

Вследствие неравномерного распределения по соме и дендритам потенциал-зависимых кальциевых каналов и внутриклеточных депо кальция постсинаптическая деполяризация может индуцировать неравномерное повышение концентрации кальция, что приводит к гетерогенности концентрации ЭК, продуцируемых активированным нейроном. Поэтому вполне вероятно, что вклад той или иной формы подавления синаптической активности зависит от геометрии нейрона, а также распределения на нем синаптических контактов. Кроме того, показана прямая корреляция между выходом ЭК и стимуляцией метаботропных глутаматных рецепторов постсинаптического нейрона, которые сопряжены с Gq/11-белками и запускают каскад фосфолипазных реакций, участвующих в синтезе 2-АГ без существенного повышения кальция (Хаспеков, Бобров, 2006).

Таким образом, эндоканнабиноидная система играет важную роль в обеспечении нормального функционального состояния синапсов и может способствовать сохранению их функции и восстановлению при патологии ЦНС, связанной с нарушением регуляции нейромедиаторных процессов (Castillo et al., 2012). Однако механизмы действия различных каннабиноидов и, в том числе, N-ADA на уровне организации нейронных сетей изучены недостаточно полно и требуют дальнейших исследований.

1.3 Нейропротекторное действие эндоканнабиноидов

Острые и хронические повреждения нервной системы, в том числе, травмы, ишемические или воспалительные заболевания, остаются серьезной проблемой современной медицины, приводя к нарушениям моторной, сенсорной и когнитивной функции у пациентов. Поэтому поиск способов защиты нервной ткани при различных повреждениях является актуальной и социально значимой проблемой неврологии и нейробиологии в целом (Thurman et al., 1999; Kaur et al., 2013). Перспективным подходом для решения данной задачи представляется применение природных и синтетических нейроактивных липидов.

Накопленные на сегодняшний день данные указывают на то, что каннабиноиды могут выступать в качестве нейропротекторных факторов при различных механизмах повреждения мозга. Выяснению терапевтического потенциала различных ЭК посвящено большое количество работ. На различных моделях черепно-мозговой травмы, ишемического поражения мозга, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и эксайтотоксичности было продемонстрировано, что ЭК, такие как анандамид и 2-АГ, так же, как и синтетические лиганды CBR-1 и CBR-2, как, например, WIN55121-2, оказывают нейропротекторное действие (Nagayama et al., 1999; Sinor et al., 2000; Panikashvili et al., 2001; Moesgaard et al., 2003; Eljaschwitsch et al., 2006; Maresz et al., 2007; Mechoulam and Shohami, 2007; Koch et al., 2010; Kaur et al., 2013; Lai et al., 2013; Chiarlone et al., 2014). Часть этих работ свидетельствует о том, что защитное действие осуществляется преимущественно посредством активации нейрональных CBR-1 (Nagayama et al., 1999; Mechoulam and Shohami, 2007; Chiarlone et al., 2014). Кроме того, активация CBR-2 также может вносить свой вклад в нейропротекторное действие каннабиноидов (Benito et al., 2008; Howlett et al., 2002; Maresz et al., 2005; Murikinati et al., 2010; Pazos et al., 2013; Dhopeshwarkar, Mackie, 2014).

Первоначально исследования были направлены на активацию CBR-1 для защиты нейронов при эксайтотоксическом, ишемическом повреждении и аутоиммунных заболеваниях (Nagayama et al., 1999; van der Stelt, 2001; Muthian et al., 2004; Shouman et al., 2006).

Существует три основных механизма, запускающих гибель нейронов в ЦНС при различных физиологических и патологических состояниях. Это избыточная активация ионотропных глутаматных рецепторов, приводящая к накоплению в клетках ионов натрия и кальция и, как следствие, гибели клеток в течение нескольких часов, окислительный стресс, вызывающий гибель нейронов в результате накопления активных форм кислорода и азота, и деструкция нейронов в результате апоптоза (Mehta et al., 2013). Глутамат является основным возбуждающим нейромедиатором центральной нервной системы, воздействуя на синаптическую передачу посредством активации различных, прежде всего ионотропных, рецепторов, чувствительных к N- метил-D-аспартату (NMDA-рецепторы), б-амино-3-гидрокси-5-метил-4- изокса-золпропионовой кислоте (AMPA-рецепторы) и каинату (каинатные рецепторы). Активация постсинаптических рецепторов глутамата имеет решающее значение для нормальной реализации различных неврологических функций, в том числе, таких как обучение и память (Won et al., 2002). Многочисленными исследованиями было доказано, что глутамат также играет ключевую роль в развитии процессов, приводящих к гибели нейронов при нарушении кровоснабжения мозга при ишемии. Нарушение нормального поступления кислорода и глюкозы в нервные клетки вызывает энергетический дефицит, который приводит к деполяризации мембраны нейрона и усилению высвобождения глутамата из пресинаптического окончания, анормальному накоплению его в синаптической щели в результате нарушения захвата глутамата астроцитами, и, как следствие, чрезмерной активации глутаматных рецепторов, что приводит к быстрой гибели нейронов (Lai et al., 2013). Такое явление носит название глутаматной нейротоксичности, или эксайтотоксичности. Эксайтотоксичность играет ключевую роль при травмах головного и спинного мозга, инсультах, при развитии различных нейродегенеративных заболеваний, таких как эпилепсия, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Хангтингтона и др. (Mehta et al., 2013). Различают быструю и медленную эксайтотоксичность. Быстая эксайтотоксичности развивается преимущественно при активации NMDA- рецепторов. NMDA-рецептор является лиганд-управляемым ионным каналом, хорошо проницаемым для ионов кальция, а также натрия и калия. Это пентамер, основными субъединицами которого являются NR1 и NR2A, 2В, 2С и 2D субъединицы. Деполяризация постсинаптической мембраны устраняет ингибирующий «магниевый блок» и приводит к открытию канала для ионов Ca2+. Даже сравнительно краткой (> 3 мин) активации NMDA-рецепторов достаточно, чтобы вызвать гибель нейронов в результате чрезмерного поступления в клетку ионов Ca2+ (Lai et al., 2013). Также в реализации быстрой эксайтотоксичности принимают участие АМРА- рецепторы глутамата, обладающие высокой проницаемастью для ионов Na+ и К+. AMPA-рецептор состоит из различных комбинаций 4 субъединиц (GluR- 1, 2, 3, 4). В отличие от NMDA-рецептора, необходима длительная (более 60 мин) активация АМРА-рецепторов, чтобы вызвать гибель нейронов за счет повышения концентрации Na+ внутри клетки (Koh et al.,1990). Большинство нейронов экспрессирует GluR2 субъединицу AMPA-рецептора, которая делает такие рецепторы мало проницаемыми для Са2+. Экспрессия и функция GluR2-субъединицы снижается в нейронах, подвергающихся гипоксическому воздействию. Ишемия переднего мозга приводит к замедленной гибели нейронов в гиппокампе в поле СА1, чему предшествует снижение экспрессии GluR2 мРНК (Gorter et al., 1997). Изменение соотношения экспрессии GluR2-и GluR2-субъединиц AMPA-рецепторов обуславливает Ca2+-зависимую быструю АМРА-нейротоксичность, которая может лежать в основе потенциальных механизмов селективной гибели нейронов при гипоксическом/ишемическом повреждении мозга (Kim et al., 2001).