Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro
Ретроградная модуляция синаптической передачи эндоканнабиноидами. Культивирование первичных диссоциированных клеток гиппокампа. Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность культивируемых клеток гиппокампа при гипоксии.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | диссертация |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 21.06.2015 |
| Размер файла | 1,4 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Morris, 1984; Dalm et al. 2000). Установка для видеорегистрации движения животного представляет собой видеокамеру, расположенную над бассейном. Камера фиксирует треки животного. Эта информация подается на персональный компьютер и сохраняется в виде avi-файлов. Проводится видеорегистрация траектории движения и компьютерный анализ данных.
Через 24 часа после окончания обучения животные подвергались острой гипобарической гипоксии, через сутки после которой проводили тестирование на сохранение долговременной памяти. Тест состоял из одной пробы длительностью 60 с. При этом платформа в лабиринте отсутствовала. Определяли отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти (оКс), представляющий собой долю времени пребывания мыши в квадранте, где находилась платформа, по отношению в общему времени пребывания в водном лабиринте Морриса. При этом считается нормой, если животное провело в квадранте, где находилась платформа, около 25% общего времени пребывания в лабиринте (D'Hooge R. & De Deyn P.P, 2001).
Анализ данных выполнялся с помощью разработанного в программной среде Matlab оригинального пакета алгоритмов MouseTrack и Traceman. При оценке результатов значимыми считались следующие показатели: время достижения платформы, траектория свободного плавания при поиске платформы.
2.10 Статистическая обработка результатов
Полученные результаты in vivo и in vitro обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel, и SigmaPlot 11.0. Данные представлены в форме "среднее значение ± стандартная ошибка среднего". Проверка гипотезы о нормальном распределении проводилась с применением критерия Пирсона, который не зависит ни от вида распределения случайной величины, ни от ее размерности. Достоверность статистических различий выборок, имеющих нормальное распределение, проверялась с помощью t-теста Стьюдента. Различия между выборками, имеющими распределение, отличающееся от нормального, оценивались с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни в программе SigmaPlot 11.0. Различия между выборками считались статистически значимыми при p < 0,05.
3. Результаты исследования и обсуждение
3.1 Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия N-арахидоноилдофамина при моделировании гипоксии in vitro
3.1.1 Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии
На 21-й DIV в культурах наблюдалась стабильная спонтанная сетевая биоэлектическая активность. В течение 10-минутной гипоксии происходило значительное (более чем в 6 раз) снижение спонтанной активности, тогда как реоксигенация вызывала ее усиление. Во время острой 10 минутной нормобарической гипоксии происходило снижение числа пачек с 25,03±6,12 за 10 минут до 4,28±1,52 (р<0,05). В период реоксигенации спонтанная биоэлектрическая активность значительно усиливалась, число малых сетевых пачек составило 68,5±19,87, что достоверно выше исходных значений (рис. 7).
В дальнейшем в постгипоксическом периоде происходило необратимое достоверное снижение пачечной активности вплоть до ее практически полного прекращения к 7-м суткам, что свидетельствует о нарушении синаптических связей в сети, формирующей индивидуальный характер функционирования каждой культуры. Через 1 сутки после гипоксического воздействия количество малых сетевых пачек импульсов за 10 минут снижалось с 25,03±6,12 до 3,89±2,1, а через 7 суток - до 1,52±0,75.
Главной причиной угнетения спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети во время гипоксии является недостаточность энергетических субстратов, необходимых для поддержания активного метаболизма клеток. Резкое падение парциального давления кислорода приводит к разобщению процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях, и, как следствие, происходит снижение синтеза АТФ (Проблемы гипоксии, 2004). Гликолиз не может удовлетворить энергетические потребности нейрона.
Рисунок 7 Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (количество малых пачек импульсов за 10 минут), 21-28 DIV: 1 - до гипоксии, 21 DIV; 2 - гипоксия, 21 DIV; 3 -10 мин реоксигенации, 21 DIV; 4 - 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5 - 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 - 7 сутки после гипоксии, 28 DIV. * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни
Повышенная сетевая активность нейронов после реоксигенации может быть связана с усиленным высвобождением возбуждающего нейротрансмиттера глутамата из пресинаптических терминалей пирамидных нейронов в составе сети, либо со снижением активности тормозных ГАМК- ергических нейронов. Усиление высвобождения глутамата, вероятно, обусловлено стимуляцией экзоцитоза повышенной [Cа2+]i в пресинаптических терминалях в результате его выброса из внутриклеточных депо, в частности, из деполяризованных при гипоксии митохондрий (Stelmashook, 2010). Известно, что усиление выброса глутамата является критическим фактором развития эксайтотоксичности, опосредуемой повышением [Cа2+]i в постсинаптической клетке и запуском каскада патологических метаболических реакций, приводящих к гибели нейронов (Iwabuchi et al., 2013). Кроме того, недостаток кислорода стимулирует процессы свободно-радикального окисления в клетке, что может стать основной или дополнительной причиной гибели клетки при реоксигенации. Следует отметить, что структура малых сетевых пачек достоверно изменялась только в отдаленном постгипоксичеком периоде. Количество спайков в малой сетевой пачке импульсов в период гипоксии, при реоксигенации и через 2 часа после гипоксического воздействия изменялось незначительно, хотя наблюдалась тенденция к его увеличению (рис. 8). Через сутки после гипоксического воздействия число спайков в малой сетевой пачке достоверно снижалось (в 4-6 раз), в дальнейшем постгипоксическом периоде снижение количества спайков продолжалось и к 7 суткам постгипоксического периода число спайков в малых сетевых пачках импульсов снижалось в 10-20 раз относительно исходного уровня.
Длительность пачек также практически не изменялась во время острой гипоксии и в период реоксигенации, существенных изменений не наблюдалось вплоть до 7 суток постгипоксического периода (рис. 9), когда происходило ее достоверное снижение (исходная длительность малой сетевой пачки импульсов составляла 0,18±0,61 с, а через 7 суток после гипоксии - 0,05±0,03 с).
Аппликация N-ADA в концентрации 10 мкМ предотвращала нарушение биоэлектрической активности. Во время гипоксии количество сетевых пачек в присутствии N-ADA также достоверно снижалось относительно исходного уровня (9,58±2,1 пачки/10 мин), однако в период реоксигенации их число не отличалось от аналогичного показателя в культурах, не подвергавшихся гипоксии (рис.7).
Рисунок 8 Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (количество спайков в пачке), 21-28 DIV: 1 - до гипоксии, 21 DIV; 2 - гипоксия, 21 DIV; 3 - 10 мин реоксигенации, 21 DIV; 4 - 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5 - 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 - 7 суток после гипоксии, 28 DIV. * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни
Вероятно, аппликация N-ADA предотвращала гиперактивацию нейронных сетей во время реоксигенации, поскольку механизм DSE ингибировал чрезмерный выброс возбуждающих нейромелиаторов, что позволяло клеткам сохранять свои энергетические ресурсы.
В постгипоксическом периоде N-ADA поддерживал спонтанную биоэлектрическую активность нейронов, так что она по своим параметрам статистически не отличалась от исходного уровня (20,1±5,67 пачек/10 мин), в то время как в контрольных культурах уже на 1 сутки число пачек имульсов было достоверно ниже, чем до гипоксии.
На 7 сутки постгипоксического периода количество малых сетевых пачек в группе опытных культур, которым апплицировался N-ADA 10 мкМ, достоверно снижалось по сравнению с исходными значениями, однако оставалось существенно выше, чем в отсутствие N-ADA (8,66±2,01 и 1,5±0,27, соответственно). Кроме того, N-ADA предотвращал изменение длительности сетевой пачки и среднего числа спайков в пачке (рис. 8 и 9), как минимум, в течение 7 суток после гипоксического воздействия.
Рисунок 9 Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (длительность пачек импульсов), 21-28 день in vitro: 1 - до гипоксии, 21 DIV; 2 - гипоксия, 21 DIV; 3 - 10 мин реоксигенации, 21 DIV; 4 - 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5 - 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 - 7 сутки после гипоксии, 28 DIV. * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни
Построение графиков спайковой активности и растровых диаграмм, отражающих моменты возникновения спайков на электродах матрицы, позволило установить, что количество спайков в пачке за 50 мс в контрольных культурах через 24 часа после гипоксии в среднем статистически достоверно снижается относительно исходного уровня в 3,8 раза (р<0,05, критерий Манна-Уитни), с тенденцией к уменьшению длительности сетевой пачки импульсов (рис. 10).
Рисунок 10 Количество спайков за 50 мс (сверху) и растровые диаграммы спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа (снизу). А - контрольная культура; Б - культура с аппликацией N-ADA, 10 мкМ
При гипоксии в присутствии N-ADA наблюдалось лишь незначительное (менее, чем на 30%) снижение количества спайков за 50 мс относительно исходной активности нейронов через сутки после гипоксии, тогда как длительность пачки оставалась неизменной.
Таким образом, аппликация 10 мкМ N-ADA предотвращает вызванные гипоксией изменения структуры сетевой пачки импульсов и, следовательно, способствует сохранению паттерна функциональной активности нейронной сети.
При аппликации N-ADA в концентрациях как 10, так и 2,5 мкМ во время гипоксии и в первые сутки после нее негативное влияние гипоксии и реоксигенации на спонтанную биоэлектрическую активность снижалось (рис. 11).
Рисунок 11 Показатели спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа относительно исходного уровня, принятого за 100% (количество пачек импульсов за 10 минут), 21-28 день развития in vitro: 1 - интактные; 2 - контроль; 3 - N-ADA 2,5 мкМ; 4 - N-ADA 10 мкМ; 5 - N- ADA+SR1; 6 -- N-ADA+SR2; 7 - N-ADA+ Сpz; * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни
Данный эффект проявлялся в сохранении пачечной активности сети как в первые сутки постгипоксического периода, так и в последующий отдаленный период. Через сутки после гипоксии число пачек снижалось всего на 40% и 41% при использовании обеих концентраций N-ADA (в контрольных культурах число пачек снизилось в 5 раз). На 7 сутки при применении N-ADA в концентрации 10 мкМ число пачек уменьшалось в 4 раза и составило 25,74±9,89% относительно исходного уровня, а при концентрации 2,5 мкМ - в 10,41±2,76% (в контрольных культурах уровень сетевой биоэлектрической активности на 7 сутки постгипоксического периода составил 6,01±1,2% от исходного). Гипоксия/реоксигениция вызывала достоверное уменьшение среднего числа спайков в пачке в первые сутки после гипоксии более чем на 75% (рис. 12).
Рисунок 12 Показатели спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа относительно исходного уровня, принятого за 100% (среднее количество спайков в пачке), 21-28 день развития in vitro: 1 - интактные; 2 - контроль; 3 - N-ADA 2,5 мкМ; 4 - N-ADA 10 мкМ; 5 - N- ADA+SR1; 6 -- N-ADA+SR2; 7 - N-ADA+ Сpz; * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни
При концентрациях N-ADA 2,5 и 10 мкМ уменьшение среднего числа спайков в пачке на 1 сутки после гипоксии составляло 39,28% и 42,87%, соответственно. К седьмым суткам при 10 мкМ N-ADA отмечалось некоторое увеличение количества спайков в пачке, в то время как при 2,5 мкМ N-ADA продолжалось неуклонное снижение числа спайков (их число составило 26,25% от исходного уровня).
N-ADA может взаимодействовать с тремя типами рецепторов: CBR-1, CBR-2 и TRPV1. Вклад каждого типа рецепторов в реализацию антигипоксического эффекта N-ADA (10 мкМ) исследовался с использованием их селективных антагонистов: SR141716A (для CBR-1), SR14452 (для CBR-2) и капсазепина (для TRPV1). Спонтанная биоэлектрическая активность в данной серии экспериментов регистрировалась на 1 и 7 сутки после гипоксии.
Антагонисты CBR-1, CBR-2 и TRPV1 в интактной культуре клеток гиппокампа не оказывали влияния на активность сети. При гипоксии блокада CBR-1 антагонистом SR141716A (1мкМ) устраняла защитный эффект N- ADA, что выражалось в уменьшении количества малых сетевых пачек импульсов в 10 минут на 1 сутки после гипоксии более чем вдвое и составило 34,3±6,7% от исходного уровня, а на 7 сутки активность полностью отсутствовала (рис. 11). Капсазепин частично снижал антигипоксический эффект N-ADA. Через сутки после гипоксии с аппликацией N-ADA и капсазепина число пачек сетевых импульсов существенно (в 10 раз) снижалось и составляло 6,68±2,5% исходного уровня активности, однако дальнейшего торможения активности не происходило и далее ее уровень сохранялся неизменным вплоть до 7 суток постгипоксического периода. При блокаде CBR-2 антигипоксический эффект N-ADA сохранялся, уровень пачечной активности составил 70,1±14,5% от исходного на 1 сутки и 31,4±8,2 % на 7 сутки постгипоксического периода, что статичтисечки не отличается от группы N-ADA 10 мкМ.
Интересно отметить, что блокада CBR-1 приводила при реоксигенации к резкой активации нейронной сети, что выражалось в виде увеличения количества и частоты спайков в пачке при снижении количества пачек, а в дальнейшем к полному исчезновению биоэлектрической активности (рис. 12).
Мы предполагаем, что защитное действие N-ADA связано с предотвращением чрезмерного выброса возбуждающего нейромедиатора глутамата при гипоксии. При блокаде CBR-1 не происходит ретроградного ингибирования выброса глутамата из пресинаптических терминалей, нейронная сеть гиперактивируется. Чрезмерная стимуляция нейронов, очевидно, приводит к истощению энергетических ресурсов клетки и запуску каскада метаболических реакций, вызывающих гибель клетки.
Блокада CBR-2 при гипоксии достоверно снижала спонтанную биоэлектрическую активность (уменьшение количества спайков в малой сетевой пачке более, чем в 10 раз), однако активность сохранялась в течение всего срока наблюдения (7 суток после гипоксии) (рис. 11 и 12). Таким образом, устранение эффекта N-ADA было лишь частичным. Блокада TRPV1, также как и CBR-2, приводило к достоверному снижению активности нейронов и изменению ее паттерна (рис. 12), но в меньшей степени, чем при блокаде CBR-1. Количество спайков в пачке и их частота уменьшалось на 45,83% и 40,76% на первые сутки и на 52,13% и 36,76% на седьмые сутки, соответственно.
Поскольку реализация антигипоксических и нейропротекторных свойств N-ADA полностью ингибируется при блокаде CBR-1, можно предположить, что ключевым молекулярным механизмом в реализации данного эффекта является ретроградное ингибирование выброса глутамата из пресинаптических терминалей по механизму DSE (Kreitzer, Regehr, 2001; Szabo, 2008; Castillo et al., 2012). Активация CBR-1 играет решающую роль в предотвращении нейротоксичности, вызванной активацией глутаматных рецепторов к N-метил-D-аспартату (NMDA-Rs). Данный тип нейротоксичности является одним из важных молекулярных путей запуска ее механизмов при гипоксическом повреждении нервной системы (Won et al., 2012; Mehta et al., 2013). Предотвращая активацию NMDA-Rs путем ингибировая выброса глутамата из пресинаптических терминалей, активация CBR-1 контролирует кальциевые токи, не допуская повышения концетрации кальция до цитотоксического уровня. Следовательно, каннабиноиды, и в том числе N-ADA, могут контролировать уровень активации NMDA-Rs. Одним из аспектов физиологической роли каннабиноидной системы является поддержание NMDA-Rs-активности в безопасных пределах, тем самым осуществляется защита нервных клетки от эксайтотоксичности (Sбnchez- Blбzquez et al., 2014).
Таким образом, проведенные нами исследования возможных механизмов действия N-ADA на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей в культуре клеток гиппокампа при острой нормобарической гипоксии показало, что все три типа рецепторов участвуют в реализации антигипоксического эффекта, однако ключевую роль играет активация CBR- 1, блокада которых на фоне введения N-ADA приводит к полному устранению антигипоксического эффекта каннабиноида.
3.1.2 Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии
На 21-й день in vitro в клетках гиппокампа наблюдалась синхронизованная спонтанная кальциевая активность. Частота возникновения кальциевых осцилляций в нейронной сети составляла 6,83±1,78 осцилляций в 1 мин. Активность проявляло 83,9±5,57% клеток. При замене нормоксической культуральной среды на гипоксическую (0,37 мл/л О2) происходило снижение спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа вплоть до практически полного ее исчезновения к 3-й минуте наблюдения. Активность сохраняли всего 5,01±1,84 % клеток, частота осцилляций составила 0,14±0,03 осцилляции в минуту. После реоксигенации активность возобновлялась, однако процент активных клеток был существенно ниже, чем до гипоксического воздействия (22,1±7,2%) (рис.13).
Рисунок 13 Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа при моделировании гипоксии: А - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида) Б - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ)
Антигипоксический эффект N-ADA проявлялся в частичном сохранении спонтанной кальциевой активности во время гипоксии и нормализации кальциевой активности в постгипоксическом периоде. Во время гипоксического воздествия активность сохраняло 24,5±6,91% клеток, изначально проявляющих активность.
Частота кальциевых осцилляций во время гипоксического воздействия снизилась в пять раз (с 6,83±1,78 до 1,3±0,23 осцилляций в минуту). В период реоксигенации уровень кальциевой активности в группе культур, получавших аппликацию N-ADA 10 мкМоль во время гипоксии не отличался от контрольной группы.
Оценка гипоксического воздействия на кальциевую активность в отдаленном постгипоксическом периоде проводилась на 7 сутки после гипоксии. Доля клеток в поле зрения, в которых регистрировались спонтанные кальциевые осцилляции, через 7 суток после острой гипобарической гипоксии снижалось с 69,3±5,57 % до 19,06±7,0%. клеток (рис. 14).
Рисунок 14 Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность клеток гиппокампа через 7 суток после острой нормобарической гипоксии. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, критерий Манна-Уитни # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, критерий Манна-Уитни
Применение N-ADA 10 мкМ во время гипоксии и в первые сутки после него предотвращало потерю функциональной кальциевой активности клетками культур гиппокампа. В группе опытных культур, получавших аппликацию N-ADA, доля клеток, проявляющих кальциевую активность составила 56,37±8,69%, что достоверно больше, чем в контрольной группе культур, подвергшихся гипоксическому воздействию. Можно предположить, что существенное снижение уровня спонтанной кальциевой активности связано с гибелью части нейронов в постгипоксическом периоде (см. раздел 3.1.3.), редукцией синаптических контактов и разрушением нейронных сетей. У 60% культур длительность и частота генерации кальциевых осцилляций клетками, сохранившими активность, после гипоксии существенно не изменялась, еще у 40% происходила существенная модификация формы кальциевых осцилляций. 10-минутная гипоксия в таких культурах вызывала достоверное увеличение длительности и уменьшение частоты кальциевых осцилляций в отдаленном постгипоксическом периоде, по сравнению с культурами, не подвергавшимися гипоксическому воздействию (рис. 15-16). Следует отметить, что увеличение длительности осцилляций после гипоксического воздействия происходит за счет появления в профиле активности клеток «суперосцилляций», длительность которых составляет до 100 с (рис. 17).
В группе культур, подвергавшихся гипоксическому воздействию, длительность суперосцилляций составила 89,19±8,04 секунды. Обнаруженные нами изменения спонтанной кальциевой активности подтверждают гипотезу о том, что изменение активности нейронной сети после гипоксического воздействия связано с действием высоких концентраций возбуждающего нейромедиатора глутамата.
Рисунок 15 Длительность кальциевых суперосцилляций в культуре клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии. # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии в отсутствие N-ADA, парный критерий Стьюдента
Повышенная стимуляция глутаматных рецепторов приводит к накоплению в нейронах Са2+ в результате его усиленного поступления через ионные каналы и, соответственно, к стойкому повышению [Ca2+]i, что проявляется в развитии суперосцилляций. Соответственно увеличению длительностей осцилляций, также отмечается уменьшение их частоты.
Такие суперосцилляции могут быть разными по продолжительности, их характеризует временное повышение базовой [Ca2+]i, на фоне которого происходит несколько спонтанных осцилляций. Подобные суперосцилляции наблюдаются в ходе дифференцировки культур, однако их длительность не превышает 45-50 секунд (Митрошина с соавт., 2011, Широкова с соавт., 2013).
Рисунок 16 Параметры спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии: А - длительность кальциевых суперосцилляций Б - частота возникновения Са2+ осцилляций в культурах клеток гиппокампа. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, парный критерий Стьюдента, # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, парный критерий Стьюдента
Аппликация N-ADA при гипоксии и в первые сутки после нее оказывает дозозависимый нейропротекторный эффект на кальциевую активность нейронных сетей. N-ADA в концентрации 2,5 мкМ не влияет на длительность суперосцилляций, а в концентрациях 6 и 10 мкМ достоверно уменьшает ее (41,37±2,03 с и 48,66±5,74 с, соответственно).
Рисунок 17 Характерные профили кальциевой активности нейронов на 7 день после моделирования гипоксии в культурах клеток гиппокампа. По оси абсцисс - время, с, по оси ординат - интенсивность флуоресценции, усл ед.: 1 - интактные; 2 - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида); 3 - N-ADA 2,5 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 2,5 мкМ; 4 - N-ADA 6 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 6 мкМ/л); 5 - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ/л)
О нормализации профиля кальциевой активности можно судить по приведенным ниже характерным растровым диаграммам (рис. 18), на котором штрихами отмечены моменты возникновения кальциевых осцилляций в клетках.
Рисунок 18 Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа: А - до гипоксии, 21 DIV; Б - через 2 часа после гипоксии, 21 DIV; В - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 6 мкМ N-АДА; Г - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 10 мкМ N-АДА. По оси ординат указан номер рассматриваемой клетки, по оси абсцисс - время. Моменты возникновения кальциевых осцилляций отмечены штрихами
Таким образом, применение N-ADA в концентрациях 6 мкМ и 10 мкМ позволяет нормализовать кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа в отдаленном постгипоксическом периоде. Можно предположить, что в основе этого эффекта лежит реализация механизма DSE, описанного в обзоре литературы. Активация пресинаптических CBR тормозит пресинаптические кальциевые токи через потенциал-зависимые Са2+-каналы N- и P/Q-типов и в результате подавляется экзоцитоз глутамата, снижается вход кальция через постсинаптические NMDA рецепторы, что приводит к нормализации концентрации кальция в постсинаптическом окончании, зарегистрированной в наших экспериментах (Twitchell et al., 1997; Kano et al., 2009).
3.1.3 Влияние N-арахидоноилдофамина на выживаемость культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии
Оценка соотношения живых и погибших клеток в культурах гиппокампа проводилась через 1, 3, 7 и 10 суток после гипоксического воздействия. Число живых клеток в интактных культурах на протяжении всего периода наблюдения практически не изменялось. Гипоксическое воздействие вызывало морфологические изменения и гибель культивируемых клеток. Уже через сутки после гипоксии число живых клеток в культурах, подвергнутых гипоксии, было достоверно ниже по сравнению с интактной группой (73,19±3,95% и 89,37±1,33%, соответственно). В течение последующих дней доля живых клеток в культурах, подвергавшихся гипоксическому воздействию, неуклонно снижалась и на 10 сутки составила 20,84±4,78% (рис. 19). Стоит отметить, что наиболее резкое снижение жизнеспособности клеток в культурах отмечалось между 7 и 10 днями после гипоксии/реоксигенации.
Аппликация N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии и в первые сутки после реоксигенации существенно повышала выживаемость клеток. На первые сутки после гипоксии/реоксигенации в присутствии N-ADA происходило незначительное снижение жизнеспособности, сопоставимое с контрольными культурами, однако в дальнейшем она не снижалась и на 10 сутки после гипоксии/реоксигенации статистически значимых отличий между опытными и интактными культурами не обнаруживалось.
Рисунок 19 Количество живых клеток в культуре клеток гиппокампа после гипоксии, *- статистически достоверные различия в сравнении с контрольной группой, p<0.05, **- различия в сравнении с контрольной группой # - статистически достоверные различия с группой, подвергавшейся гипоксии (p<0,05, критерий Стьюдента)
Число жизнеспособных клеток в культурах, подвергавшихся 10- минутной гипоксии с аппликацией N-ADA, на 10 сутки после воздействия было более чем в 3 раза выше, чем в контрольных культурах (75,24±9,37% и 20,84±4,78%, соответственно). Таким образом, введение N-ADA во время гипоксии и в первые сутки после нее сохраняют жизнеспособность клеток как минимум в течение 10 суток после гипоксического воздействия.
Для выявления возможных механизмов антигипоксического действия исследуемого вещества в культуры добавлялся N-ADA в сочетании с блокаторами различных рецепторов, связывающих каннабиноид. В отсутствие гипоксии антагонисты CBR-1, CBR-2 и TRPV1 не влияли на выживаемость клеток. Блокада CBR-1 селективным антагонистом SR141716A на первые сутки после гипоксии/реоксигенации в культурах, подвергнутых гипоксии в присутствии N-ADA, вызывала, по сравнению с интактными культурами, достоверное снижение жизнеспособности клеток, которая на 3 сутки оставалась на прежнем уровне, но на 7 сутки продолжала снижаться. К 10 суткам постгипоксического периода число жизнеспособных клеток снижалось наиболее интенсивно (до 24,95±3,21%) и статистически не отличалось от контрольной группы, подвергутой гипоксии в отсутствие каннабиноида. Таким образом, блокада CBR-1 устраняла нейропротекторное действие N-ADA.
Исследование роли активации CBR-2 в реализации нейропротекторного эффекта N-ADA показало, что под воздействием селективного антагониста CBR-2, SR144528, в течение первых 7 суток происходит постепенное достоверное снижение жизнеспособности клеток, сходное с ее изменениями в контрольной группе. Однако к 10 суткам, в отличие от контрольной группы, резкого снижения числа живых клеток не происходило. Их количество в присутствии N-ADA и SR144528 на 10 сутки после гипоксии было достоверно выше, чем в контрольной группе культур (62,0±2,43%). Эти данные свидетельствуют о том, что активация CBR-2 не оказывает существенного влияния на реализацию нейропротекторного эффекта N-ADA.
Применение при гипоксии N-ADA (10 мкМ) в сочетании с антагонистом TRPV1 капсазепином (1 мкМ) не оказывало нейропротекторного эффекта. Количество жизнеспособных клеток снижалось уже на 1 сутки после гипоксического воздействия, а к 10 суткам постгипоксического периода их число в группе культур, инкубированных с N-ADA и капсазепином, составило всего 32,08±12,41, что не отличалось от контроля. Следовательно, активация TRPV1, так же, как и CBR-1, имеет важное значение в реализации нейропротекторного эффекта N-ADA при гипоксии.
Таким образом, аппликация N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии снижает гибель культивируемых клеток гиппокампа в постгипоксическом периоде, при этом защитный эффект эндоканнабиноида опосредуется прежде всего метаболическими каскадами, запускаемые при активации CBR-1 и TRPV1.
3.1.4 Влияние N-арахидоноилдофамина на распределение каннабиноидных рецепторов первого и второго типов в диссоциированных культурах гиппокампа при моделировании гипоксии
Для оценки распределения CBR в диссоциированных культурах гиппокампа проводили иммуногистохимическое маркирование глиальных клеток, нейронов, а также CBR-1 и CBR-2. Для визуализации астроцитов маркировали глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), для визуализации нейронов - нейрон-специфичный белок МАР2, который в значительных количествах содержится в цитоскелете сомы и дендритах нейронов.
Иммуноцитохимические исследования показали, что CBR-1 присутствуют в культурах на 28-й DIV, локализуясь на отростках нейронов (Рис. 20). Поскольку данные отростки не маркировались МAP2, мы предполагаем, что они являются аксонами нейронов.
Рисунок 20 Иммуноцитохимическое маркирование CBR-1 в культуре клеток гиппокампа на 28-й DIV: А - интактная культура, Б - на 7 сутки после гипоксии, В - на 7 сутки после гипоксии при аппликации N-ADA 10 мкМ. Масштаб 20 мкм
Полученные данные хорошо согласуются с существующими исследованиями, свидетельствующими о преимущественной локализации CBR-1 на аксонах (Katona et al., 1999), как синаптически, так и внесинаптически, хотя согласно литературным данным максимальная плотность экспрессии CBR-1 наблюдается на пресинаптической терминали, особенно в пресинаптической активной зоне (Kofalvi et al., 2007).
Для оценки воздействия острой гипоксии на распределение CBR-1 были охарактеризованы такие параметры, как количество кластеров этих рецепторов в расчете на 100 мкм длины отростка нейрона и средняя площадь кластера.
Анализ полученных изображений проводился с помощью программы ImageJ. Распределение CBR оценивалось на 7 сутки постгипоксического периода. Нами было показано, что гипоксическое воздействие не вызывает изменения количества кластеров CBR-1 на отростках нейронов, но приводит к статистически значимому уменьшению среднего размера кластеров (с 0,72±0,07 мкм2 до 0,51±0,07 мкм2, рис.21).
Рисунок 21 Распределение CBR-1 рецепторов в культурах клеток гиппокампа на 7 сутки после гипоксии. А - число кластеров СВ1 рецепторов на 100 мкм отростка нейрона, Б - средняя площадь кластера; * - статистически достоверные различия с показателями «до гипоксии» (р<0,05, критерий Стьюдента)
В группе культур, в которые при гипоксии в культуральную среду добавляли N-ADA, размер кластеров CBR-1 не отличался от их размеров в контрольной группе, не подвергавшейся гипоксии, а их количество достоверно увеличивалось.
Иммуноцитохимическое маркирование CBR-2 показало их присутствие в культурах на 28-й DIV. Для характеристики их распределения оценивалось количество кластеров CBR-2 на 100 мкм2 и средняя площадь кластера. CBR-2 преимущественно локализовались на глиальных клетках, что согласуется с данными литературы (Rodriguez et al., 2001), хотя встречались и на некоторых нейронах, что также показано другими авторами (Gong et al., 2006; Morgan et al., 2009; Brusco et al., 2008). В отдаленном постгипоксическом периоде количество кластеров CBR-2 существенно снижалось (рис. 22) на фоне достоверного уменьшения их среднего размера.
Рисунок 22 Распределение CBR-2 рецепторов в культурах клеток гиппокампа на 7 сутки после гипоксии. А - число кластеров СВR-2 рецепторов на 100 мкм2, Б - средняя площадь кластера; * - статистически достоверные различия различия с показателями «до гипоксии» (р<0,05, критерий Стьюдента)
При введении N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии и в первые сутки после нее в отдаленном постгипоксическом периоде количество и размер кластеров CBR-2 не отличались от аналогичных показателей в контрольной группе культур на фоне нормоксии.
Таким образом, наше исследование показало, что аппликация N- арахидоноилдофамина во время гипоксии вызывало повышение количества кластеров CBR-2, сохраняя их нормальный размер, а также предотвращало индуцированное гипоксией снижение их количества и размеров.
3.2 Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия N-арахидоноилдофамина при моделировании гипоксии in vivo
3.2.1 Влияние N-арахидоноилдофамина на выживаемость животных при моделировании острой гипобарической гипоксии
При моделировании острой гипобарической гипоксии ключевыми показателями, характеризующими устойчивость животных к гипоксии, являются время жизни на высоте (Тж, мин), коэффициент защиты, характеризующий выживаемость животных). Опытным группам животных за 45 минут до подъема на высоту внутрибрюшинно вводили N-ADA в концентрациях 2,5 мг/кг, 6 мг/кг и 10 мг/кг. Первой контрольной группе внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, второй - инъекционный раствор, использующийся для растворения N-ADA, группе сравнения - реамберин как эталонный препарат.
Время жизни "на высоте" - это параметр, отражающий непосредственно устойчивость организма к дефициту кислорода. Данный параметр измерялся от момента подъема на «смертельную площадку» высотой 10000-10500 метров до появления второго агонального вдоха. Этот критерий отражает непосредственно устойчивость организма к дефициту кислорода.
Превентивное введение N-ADA при моделировании ОГБГ дозозависимо увеличивало время жизни мышей на «высоте» (рис. 23). В дозе 2,5 мг/кг N-ADA увеличивал его до 8,2±0,67 мин, тогда как у контрольных животных оно составляло 5,82±1,06 мин. Время жизни контрольной группы, получавшей растворитель N-ADA, достоверно не отличалось от контрольной группы с физраствором (7,08±0,79 мин). Максимальный эффект отмечен при использовании дозы 10 мг/кг, когда время жизни «на высоте» возрастало в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой и составляло в среднем 8,95±0,55 мин, что даже несколько превосходило эффект реамберина (8,45±0,65 мин).
Рисунок 23 Оценка времени жизни на высоте мышей линии C57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии. * - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, p < 0,05 (Критерий Манна-Уитни)
По степени устойчивости к гипоксии всех животных можно было разделить на три группы: низко-, средне- и высокоустойчивые. Время жизни «на высоте» низкоустойчивых животных составляло менее 3 мин, среднеустойчивых - от 3 до 9 мин, высокоустойчивых - более 10 минут. Таким образом, различия между крайними группами были не менее чем трехкратными. Этот параметр, отражающий собственно устойчивость организма к дефициту кислорода, может быть использован в качестве одного из ключевых для оценки резистентности к повреждающему воздействию гипоксии. В контрольных группах, получавшей физиологический раствор и инъекционный раствор, встречались животные всех степеней устойчивости к гипоксии, при этом наиболее велика была численность среднеустойчивых животных (рис. 24). Распределение низко-, средне- и высокоустойчивых животных составило 20, 50 и 30% в первой контрольной группе и 8,3, 58,3 и 33,3% во второй контрольной группе, соответственно.
Рисунок 24 Распределение степени устойчивости в группах мышей линии С57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии (% от общего числа особей в группе)
При превентивном применении N-ADA доля животных, средне- и высокорезистентных к гипоксии, возрастала, низкоустойчивых в этих группах не отмечено. Аналогичный эффект оказывал и препарат сравнения. Следует отметить, что эффект N-ADA на степень устойчивости животных к гипоксии дозозависим, наиболее велика доля высокоустойчивых животных в группе, получавшей N-ADA в дозе 10 мг/кг. При применении N-ADA в дозе 2,5 мг/кг 60% составили среднеустойчивые животные и 40% - высокоустойчивые, 6 мг/кг - по 50%, 10 мг/кг - 37,5% и 62,5 % соответственно.
Еще одним ключевым показателем, позволяющим оценить антигипоксическое действие вещества, является выживаемость животных на «смертельной площадке». Для оценки выживаемости рассчитывался коэффициент защиты исследуемого вещества (табл. 3).
Таблица 3
Коэффициент защиты мышей линии C57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии
|
Группа животных |
Кз |
|
|
Контроль 2 (растворитель N-ADA) |
1,06 |
|
|
Реамберин 150 мг/кг |
1,50 |
|
|
N-ADA 2,5 мг/кг |
1,16 |
|
|
N-ADA 6 мг/кг |
1,33 |
|
|
N-ADA 10 мг/кг |
1,58 |
Растворитель, примененный для изготовления инъекционного раствора N-ADA, не проявлял антигипоксического действия. Коэффициент защиты реамберина (150 мг/кг) составил 1,5, тогда как N-ADA в дозах 2,5, 6 и 10 мг/кг - 1,16, 1,33 и 1,58, соответственно.
Таким образом, превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA при острой гипобарической гипоксии дозозависимо повышает время жизни животных «на высоте», долю высокорезистентных к гипоксии животных и их выживаемость на «смертельной площадке», при максимальном защитном эффекте N-ADA в дозе 10 мг/кг, сопоставимом с эффектом Реамберина. Увеличение выживаемости животных может быть связанно с действием N- ADA на поведение крыс в течение стрессорного воздействия, поскольку активация каннабиноидных рецепторов N-арахидоноилдофамином вызывает классическую каннабиноидную тетраду, включающую в себя снижение двигательной активности (Adams, Martin, 1996; Bobrov et al., 2008), что позволяет животным экономить энергетические ресурсы во время пребывания на "смертельной площадке", а также с действием N-ADA на метаболизм зрелых нервных клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что N-ADA обладает выраженным антигипоксическим эффектом, сопоставимым с действием антигипоксического препарата Реамберина.
3.2.2 Влияние N-арахидоноилдофамина на показатели двигательной и ориентировочно-исследовательской активности мышей в тесте «Открытое поле»
Эффект, оказываемый N-ADA на восстановление рефлекторной деятельности в постгипоксическом периоде оценивалась по уровню поведенческой активности животных в тесте «открытое поле». Поскольку мыши являбтся ночными норными животными, при попадании на открытое пространство с условиями усиленной освещенности, у них наблюдаются стрессовые поведенческие реакции - ориентировочно-исследовательские и защитно-оборонительные. Ориентировочно-исследовательская реакция животного оценивается по уровню горизонтальной и вертикальной двигательной активности (число пересеченных квадратов открытого поля и количество вертикальных стоек), количеству реакций принюхивания. Эмоциональный статус животного оценивают по времени замирания, количеству реакций дефекации, мочеиспускания, груминга, верчения и пячения (Буреш, 1991; Худякова, Баженова, 2012). Действие различных стресас-факторов приводит к изменениям структуры поведения животных, изменяя метаболические процессы в организме.
Исходный уровень горизонтальной двигательной активности (ГДА) статистически не отличался во всех группах животных. При исследовании воздействия N-ADA вне гипоксии на двигательную активность животных выявлено, что на 1 и 7 сутки после введения препарата изменений лвигательной активности не происходило. На 14 сутки отмечено снижение горизонтальной двигательной активности, Число пересеченных квадратов составило 73,3% от исходного уровня ГДА (рис. 25)
Рисунок 25 Влияние N-арахидоноилдофамина (6 мг/кг) на изменение горизонтальной двигательной активности мышей относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)
Данные по воздействию N-ADA при моделировани ОГБГ на уровень ориентировочно-исследовательской и защитно-оборонительной активности животных после моделирования ОГБГ представлены на рисунках 26-32.
На первые сутки после гипоксического воздействия двигательная активность животных, получавших физиологический раствор (1 контрольная группа), достоверно снижалась по сравнению с интактными. Число пересеченных квадратов составило 27% от исходного количества. Через 14 дней двигательная активность мышей нормализовалась (86,5%) и достоверно не отличалась от исходного уровня (рис. 26).
Рисунок 26 Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение горизонтальной двигательной активности мышей после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормализованы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни), ** - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, получавшей физ.раствор, p < 0,05 (критерий Манна- Уитни)
Во 2 контрольной группе, получавшей инъекционный раствор, также отмечалось снижение двигательной активности, однако к 14 дню она не нормализовадась и на 14 сутки была достоверно ниже, чем у интактной группы (60% от исходного уровня).
При превентивном введении N-ADA горизонтальная двигательная активность в первые сутки после гипоксического повреждения также снижалась, однако не так значительно, как в контроле. Статистически достоверных отличий двигательной активности мышей, получавших N-ADA перед моделированием ОГБГ, от интактных животных не обнаружено. Двигательная активность при введении N-ADA в дозах 2,5 и 6 мг/кг на первые сутки после гипоксии была достоверно выше по сравнению с 1 контрольной группой (59,5% и 77,1% от исходного уровня ГДА сообветственно). Аналогичная картина наблюдалась и у животных при введении реамберина. К 14 суткам постгипоксического периода отмечалась тенденция к дальнейшей нормализации двигательной активности животных, получавших как N-ADA, так и реамберин.
Ни в одной из опытных груп достовеного отличия количества пересеченных квадратов от интактных животных не обнаружено. Такой же эффект поддержания уровня двигательной активности выявлен в группе животных, получавших антигипоксический препарат Реамберин.
Для оценки уровня ориентировочно-исследовательской активности животных проводилаось исследование изменения уровня вертикальной двигательной активности (ВДА, количество вертикальных стоек) и числа реакций принюхивания. Нами установлено, что ОГБГ не оказывает достоверного влияния на вертикальую двигательную активность животных (рис. 27). Количество вертикальных стоек животных контрольных групп статистически не отличалось от тех же показателей у интактных животных. При применении N-ADA перед моделированием гипоксии достоверных отличий ориентировочно- исследовательской активности от интактных животных также не отмечено. Уровень вертикальной двигательной активности сохраняется на одном уровне в течение всего времени наблюдения за животными. Оценка непосредственного влияния N-ADA на ориентировочно-двигательную активность интактных животных показало, что число вертикальных стоек после введения препарата достоверно не изменяется (рис. 28).
Также не обнаружено изменения количества актов принюхивания в контрольных группах животных после моделирования ОГБГ. В группах, получавших превентивные инъекции N-ADA в дозах 2,5 6 и 10 мг/кг не обнаружено достоверных отличий от исходного уровня. Однако нами было выявлено воздействие N-ADA вне гипоксии на число актов принюхивания (рис. 29, 30).
Рисунок 27 Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение вертикальной двигательной активности мышей после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)
Рисунок 28 Влияние N-арахидоноилдофамина 6 мг/кг на изменение вертикальной двигательной активности мышей. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу
Рисунок 29 Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение количества актов принюхивания после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия по сравнению с исходным уровнем, p < 0,05 (критерий Манна- Уитни)
Рисунок 30 Влияние N-арахидоноилдофамина 6 мг/кг на изменение количества актов принюхивания мышей в тесте «открытое поле». Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые отличия по сравннию с исходным уровнем, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)
На первые сутки число актов принюхивания лдостоверно увеличилось относительно исходного уровня на 41,1%. На 7 сутки наблюдалось достоверное снижение количества реакций принюхивания и составило 74,7% от исходного уровня. К 14 сутки количество принюхиваний также было достоверно ниже исходного уровня (70%).
При исследовании времени замирания при тестировании в «открытом поле» отмечено достоверное увеличение суммарного времени замирания относительно исходного уровня во всех исследуемых группах животных во всех последующих тестах (рис. 31). Исходное суммарное время замирания статистически не отличалось во всех исследуемых группах животных и составляло 1-10 с, в среднем от 1,88±0,26 с до 5,75±2,20 с для разных групп. Время замирания в группе интактных животных на 1, 7 и 14 сутки исследования увеличилось в 8,54, 10,46 и 6,61 раза соответственно (рис. 30) относительно исходной соответственно и составило 31,71± 4,26, 38,86±8,35 и 24,57±11,15 с. Можно предположить, что это связано с стрессирующим воздействием навигационного обучения в «водном лабиринте Морриса», что ухудшило эмоциональный статус животных и привело к усилению пассивно- оборонительной стратегии поведения. В контрольной группе, получавшей физраствор, суммарная длительность времени замирания на 1, 7 и 14 сутки постгипоксического периода увеличилась в 10,9, 7,7 и 7,17 раза соответственно и составила 49,0±20,12 с, 34,7±10,6 с и 32,3±8,2 с. Во второй контрольной группе, получавшей инъекцию растворителя, длительности замираний увеличились в 13,5, 13,7 и 9,2 раза соответственно.
Достоверных отличий между опытными, контрольными и интактными животными в соответствующие сроки исследования не отмечено. Суммарное время замирания в группе. получавшей инъекцию Реамберина составило 29,44±10,36 с на 1-е сутки постгипоксического периода, 21,0±4,01 с на 7-е сутки и 45,86±10,78 с на 14-е сутки.
Рисунок 31 Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение времени замирания мышей после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые различия по сравнению с исходным уровнем, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)
В опытной группе животных, превентивно получавших N-ADA в дозе 2,5 мг/кг суммарное время замирания составило 39,86±9,12 с, 55,63±16,74 с и 61,38±17,8 с соответственно. В группе интактных животных, получавшей N- ADA 6 мг/кг также отмечено увеличение времени замирания в 4,57, 13,05 и 17,47 раза (рис. 32). В группе N-ADA 10 мг/кг суммарное времени замирания на 1-е, 7-е и 14-е сутки постгипоксического периода увеличилось в 9, 16 и 21 раз и составило 20,0±8,28, 35,2±10,48 и 46,0±12,47 с соответственно.
При исследовании собственного действия N-ADA вне гипоксии также отмечено достоверное увеличение времени замирания в течение всего периода наблюдения в 6,2 раза на 1-е сутки после введение эндоканнабиноида, 16,3 раза на 7-е сутки и 14,6 раза на 14-е сутки (рис. 31).
Рисунок 32 Влияние N-арахидоноилдофамина 6 мг/кг на изменение времени замирания мышей в тесте «открытое поле». Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу
Таким образом, нами было выявлено, что гипоксическое повреждение вызывает достоверное снижение двигательной активности контрольной группы животных, получавших инъекцию физиологического раствора, на первые сутки после моделирования гипоксии с последующим ее восстановлением к 14 суткам постгипоксического периода. Во 2 контрольной группе, двигательная активность 14 дню она не нормализовалась и на 14 сутки была достоверно ниже, чем у интактной группы. Превентивное внутрибрюшинное введение N-арахидоноилдофамина позволяет предотвратить вызванное гипоксией снижение двигательной активности. При введении N-ADA в дозах 2,5 и 6 мг/кг двигательная активность уже на первые сутки после гипоксии была достоверно выше по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор и не отличалась от уровня активности интактных животных. На 14 сутки во всех опытных группах уровень двигательной активности не отличался от интактной группы. Аналогичная картина наблюдалась и у животных при введении реамберина. Было отмечено достоверное увеличение веремени замирания во всех группах животных после навигационного обучения. Снижение двигательной активности и эмоциональлного статуса вероятно связано с развитием пассивно-оборонительной тактики поведения мышей в ответ на стрессорное воздействие «водного лабиринта Морриса».
Гипоксия провоцирует массовую апоптотическую гибель нервных клеток, вызванную активацией свободно-радикальных процессов и разобщением окислительного фосфорилирования, а также эксайтотоксичностью (Проблемы гипоксии... 2004). Взаимодействие N-ADA с каннабиноидными рецепторами способно не только предотвращать апоптотическую гибель клеток (Bobrov et al., 2008), но и, вероятно, сохранять функциональные связи между клетками в нейронных сетях, что предотвращает нарушение поведенческих реакций у мышей в постгипоксическом периоде.
3.2.3 Влияние N-арахидоноилдофамина на навигационное научение и долговременную память у мышей в тесте «Водный лабиринт Морриса»
Состояние долговременной памяти животных оценивалось через сутки после моделирования ОГБГ путем отсроченного тестирования в водном лабиринте Морриса. Тест состоял из одной пробы длительностью 60 секунд. При этом платформа в лабиринте отсутствовала. Были установлены основные стратегии поиска платформы. В процессе предварительного обучения у мышей наблюдалось формирование пространственной памяти. Время нахождения платформы сокращалось, поиск цели становился направленным, как правило, характеризующимся циркулярными и радиальными движениями. При проведении тестирования для оценки состояния долговременной памяти, платформу из лабиринта удаляли, и фиксировали траектория движения животного. Долговременная память оценивалась с помощью отсроченного коэффициента сохранения (оКс) - доли времени пребывания животного в секторе бассейна, где находилась платформа, по отношению в общему времени пребывания животного в лабиринте. При этом считается нормой, если оКс составляет 23-30% (D'Hooge, De Deyn, 2001).
Подобные документы
Общее описание и строение гиппокампа человека, его роль в пространственной памяти и при ориентации. Гиппокамп как когнитивная карта. Учёные из СССР, изучавшие данные явления. Важные направления когнитивной нейробиологии. Модульная организация клеток.
курсовая работа [1,3 M], добавлен 10.11.2015Метод пульс-электрофореза для разделения ДНК индивидуальных хромосом. Выделение ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки и измерение конечной концентрации ДНК. Выделение ДНК из культивируемых клеток: лимфоцитов, прокариот, грибов и растительных клеток.
контрольная работа [576,0 K], добавлен 11.08.2009Дефицит кислорода как стрессовый фактор для растений. Энергетическое состояние клетки в условиях гипоксии. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. Динамика активности фумаратгидротазы в зеленых листья кукурузы в условиях гипоксии.
курсовая работа [325,9 K], добавлен 09.08.2016Основные функции бокаловидных клеток как клеток эпителия слизистой оболочки кишечника и других органов позвоночных животных и человека. Форма клеток и особенности их локализации. Секрет бокаловидных клеток. Участие бокаловидных клеток в секреции слизи.
реферат [2,9 M], добавлен 23.12.2013Методы трансгенеза в животноводстве. Использование половых клеток семенников. Факторы повышения экспрессии трансгенов в организме животных. Особенности пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro. Перспективы генно-инженерных работ в животноводстве.
реферат [38,6 K], добавлен 26.09.2009Основные разновидности живых клеток и особенности их строения. Общий план строения эукариотических и прокариотических клеток. Особенности строения растительной и грибной клеток. Сравнительная таблица строения клеток растений, животных, грибов и бактерий.
реферат [5,5 M], добавлен 01.12.2016Клетка как единая система сопряженных функциональных единиц. Гомологичность клеток. Размножение прокариотических и эукариотических клеток. Роль отдельных клеток во многоклеточном организме. Разнообразие клеток в пределах одного многоклеточного организма.
реферат [28,6 K], добавлен 28.06.2009Строение и функции оболочки клетки. Химический состав клетки. Содержание химических элементов. Биология опухолевой клетки. Клонирование клеток животных. А была ли Долли? Клонирование - ключ к вечной молодости? Культивирование клеток растений.
реферат [27,3 K], добавлен 16.01.2005Химический состав клеток, функции внутриклеточных структур, функции клеток в организме животных и растений, размножение и развитие клеток, приспособления клеток к условиям окружающей среды. Положения клеточной теории по М. Шлейдену и Т. Шванну.
презентация [1,3 M], добавлен 17.12.2013Этиология, патогенез и клиника плацентарной недостаточности. Хроническая внутриутробная гипоксия плода. Гормоны плаценты при физиологически протекающей беременности и при хронической внутриутробной гипоксии плода. Катепсины - ферменты класса гидролаз.
дипломная работа [121,1 K], добавлен 15.12.2008
