Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vintro

Каинатные рецепторы нейронов быстро активируются и десенситизируются, проводят ионы Na+/K+ и проницаемы для Ca2+. Как и в случае АМРА-опосредованной медленной эксайтотоксичности, необходимо длительное (более 1 ч) воздействие каината, чтобы вызвать гибель нейронов (Won et al., 2002).

Чрезмерное повышение [Ca2+]i приводит к активации нескольких ферментативных систем, в том числе NO-синтазы, протеаз, фосфолипазы А2 (ФлА2) и эндонуклеаз, что приводит к окончательной гибели клеток (Kostandy, 2012). Концентрация свободного Ca2+ в цитоплазме нейрона крайне низка (приблизительно 100 нМ), тогда как его внеклеточная концентрация достигает 1-2 мМ. Уровень [Ca2+]i в нейронах поддерживается следующими механизмами: (1) поступление Ca2+ в клетку из внеклеточной среды через лиганд-зависимые рецепторы или потенциал-управляемые Ca2+ каналы; (2) высвобождение Ca2+ из эндоплазматического ретикулума посредством стимуляции IP3-рецепторов или из митохондрий через Na+/Ca2+ обменник; (3) выход Ca2+ из клетки через Ca2+-АТФазу или Na+/Ca2+ обменник в плазматической мембране; (4) связывание Ca2+ кальций- связывающими белками цитоплазмы; (5) депонирование Ca2+ в эндоплазматическом ретикулуме при участии Са2+-АТФазы или в митохондриях по градиенту электрического потенциала. Гипоксически-ишемическое воздействие вызывает накопление внутриклеточного свободного Ca2+ за счет усиления его поступления в клетку, прежде всего, через NMDA-рецепторы, и нарушения АТФ-зависимого удаления Ca2+ из клетки и его депонирования (Won et al., 2012). Длительное повышение [Ca2+]i приводит к запуску метаболических реакций и необратимой смерти нервныхклеток с участием множества механизмов, которые включают в себя активацию Са2+-зависимых эффекторных белков. Одним из таких белков является внутриклеточная протеаза кальпаин I. Активированный кальпаин расщепляет жизненно важные белки, такие как спектрин, фодрин, Ca2+- АТФазу и протеинкиназу С, транскрипционный фактор NF кВ. Это влечет за собой редукцию дендритов, разрушение плазмалеммы, модуляцию экспрессии генов и нейродегенерацию (Wang, 2000). Активация кальций- зависимого кальпаина-I приводит к превращению ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. При реперфузии, после поступлении О2 в ишемизированную ткань, происходят окисление ксантина и накопление большого количества супероксидного аниона. Активация фермента Сa2+/кальмодулин-зависимой NO-синтазы обусловливает избыточную продукцию радикала NO-. В результате создаются условия для образования пероксинитрита, что стимулирует генерацию гидроксильных радикалов и способствует нитрированию тирозиновых радикалов белков. Свободные радикалы индуцируют реакции белков с другими компонентами клетки, вызывая фрагментацию белковых молекул и нарушение их функций (Won et el., 2002).

В процесс эксайтотоксичности вовлекаются и другие протеазы, такие как катепсин D, а также эндонуклеазы и фосфолипазы. Чрезмерное накопление Ca2+ в нейронах приводит к транслокации фосфолипазы А2 в мембране. Активация ФлA2 может способствовать гибели нейронов при эксайтотоксичности и гипоксии/ишемии за счет продукции свободных жирных кислот (например, арахидоновой кислоты) из глицерофосфолипидов. Арахидоновая кислота далее используется для производства простагландинов и лейкотриенов и сопутствующей продукции супероксида. Также увеличение концентрации свободной арахидоновой кислоты дополнительно ингибирует митохондриальное дыхание и оказывает непосредственное цитотоксическое действие (Sapirstein и Bonventre, 2000).

Прерывание метаболических каскадов, приводящих к индуцированной глутаматом гибели клеток при ишемии, может предотвратить или уменьшить ишемическое повреждение мозга. Однако, несмотря на тот факт, что многочисленные исследования in vivo и in vitro показали нейропротекторное действие антагонистов различных глутаматных рецепторов при ишемии, последние клинические испытания не смогли доказать эффективность данных соединений. Кроме того, терапевтический потенциал блокаторов NMDA-рецепторов ограничивается побочными поведенческими эффектами, такими как психоз и гиперлокомоция (Won et al., 2002; Xiong, 2009; Chao, Sheng-Tian, 2013). Таким образом, представляется необходимым поиск новых, более результативных препаратов для предотвращения глутаматной токсичности при ишемическом повреждении, одним из которых являются соединения класса эндоканнабиноидов, которые за счет специфического механизма - ретроградной регуляции синаптической передачи - препятствуют избыточному выбросу нейромедиаторов (в том числе, глутамата) в синаптическую щель, защищая таким образом клетку от эксайтотоксичности (рис. 5) (Mechoulam R. et al., 2002; Генрихс с соавт., 2010).

Одной из первых работ, показавших нейропротекторный эффект эндоканнабиноидов, было исследование, обнаружившее, что синтетические агонисты CBR, WIN55,212-2 и CGS19755, уменьшают гибель клеток, вызванную низким содержанием магния в среде, причем нейропротекторный эффект блокировался римонабанотом (Shen, Thayer, 1998). При закрытой травмой головы у крыс 2-АГ уменьшал отек мозга и объем инфаркта, причем эффект блокировался SR141716А (Panikashvili et al., 2001). У CBR-1- нокаутных мышей 2-АГ не оказывал защитного эффекта, а восстановление животных после травмы шло медленнее, чем у контрольной группы (Panikashvili et al., 2005).

Рисунок 5 Механизмы нейропротекторного эффекта эндоканнабиноидов (Mechoulam R. et al., 2002). Пояснения в тексте

Молекулярные механизмы, лежащие в основе защитного действия каннабиноидов, изучены недостаточно. Показано, что активация CBR-1, вызванная эксайтотоксичностью, приводит к увеличению продукции нейротрофических факторов, таких как основной фактор роста фибробластов (bFGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) (Marsiano et al., 2003; Khaspekov et al, 2004; Aguado et al., 2007), а также регулирует продукцию оксида азота (Kim et al., 2006) и провоспалительных цитокинов, прежде всего, фактора некроза опухолей ФНОб (Mechoulam et al., 2002; Panikashvili et al., 2006) и ингибирует экспрессию транскрипционного фактора NFkB (Panikashvili et al., 2005).

Показано, что защитное действие каннабидиола от бета-амилоид (Aв)- индуцированной токсичности в культуре клеток PC12 обусловлено его антиоксидантными и антиапоптотическими свойствами, независимыми от СВR (Harvey et al., 2012). Другие исследователи обнаружили, что Д9-ТГК через активацию CBR-1 защищает нейроны спинного мозга крыс от токсичности, вызванной каиновой кислотой (Van der Stelt et al., 2001;

Shouman et al., 2006). Cинтетический каннабиноид WIN55212-2, как и Д9- ТГК, с участием CBR-1 защищал культивируемые нейроны гиппокампа от эксайтотоксичности (Gilbert et al., 2007). Вероятно, защитный эффект каннабиноидов может быть связан с регулированием деятельности NMDA- рецепторов. Так, например, дексанабинол выступает в качестве стереоселективного ингибитора NMDA- рецепторов и препятствует NMDA- индуцированной нейротоксичности (Darlington, 2003), при которой степень нейропротекторного эффекта синтетических каннабиноидов WIN55212-2 и CP-55940 в культуре клеток гиппокампа прямо коррелирует с концентрацией каннабиноидов в среде и блокируется антагонистом CBR-1. Механизм защитного эффекта связан со снижением концетрации ионов Са2+ в клетке вследствие торможения активности ПКА с последующим ингибированием кальциевых каналов эндоплазматического ретикулума (ЭПР), сопряженных с рианодиновыми рецепторами (Хаспеков, Бобров, 2006; Zhang et al., 2007).

Большое число исследований подтверждает, что изменение уровня экспрессии CBR-1 ассоциировано с развитием различных нейродегенеративных заболеваний. Одним из факторов патогенеза болезни Хангтингтона является резкое снижение количества CBR-1, предшествующее развитию двигательных нарушений (Glass et al., 2000; Dowie et al., 2009). Плотность CBR-1 у пациентов с болезнью Альцгеймера может снижаться (Westlake et al., 1994). Также имеются данные об изменении экспрессии CBR-1 у трансгенных мышей с различными моделями болезни Альцгеймера (Fowler et al., 2010). Эксайтотоксичность, индуцированная каиновой кислотой, повышала уровень мРНК CBR-1 в гиппокампе крыс (Aguado et al., 2007).

Целый ряд работ демонстрирует нейропротекторный эффект эндоканнабиноидов, не связанный с активацией CBR-1. Marsiano с соавт. исследовали нейропротективное действие ряда эндогенных и синтетических каннабиноидов при оксидативном стрессе, вызванном воздействием пероксида водорода. На культурах клеток мозжечка мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену CBR-1, показано, что реализация нейропротекторного эффекта каннабиноидов не зависит от экспрессии клетками CBR-1. Д9-ТГК и синтетический каннабиноид СР55,940 повышали выживаемость клеток мозжечка при оксидативном стрессе, а WIN 55,212-2 и метанандамид не оказывали нейропротекторного эффекта как в культурах клеток дикого типа, так и нокаутных животных. Этот эффект авторы связывают с наличием в структуре молекулы Д9-ТГК и СР55940 фенольной группы, которая отсутствует у WIN 55,212-2 и метанандамида (Marsicano et al., 2002).

Появление сведений об иммунорегуляторной роли активации CBR-2 привело к увеличению интереса к этим рецепторам как терапевтическим мишеням, способным уменьшить воспалительные явления при травмах ЦНС и нейродегенеративных заболеваниях, так как и острые, и хронические поражения головного мозга всегда имеют в своем патогенезе воспалительную компоненту. Основным патогенетическим фактором воспаления является повышение уровней воспалительных цитокинов в головном мозге, активация микроглии и появление лейкоцитов в результате повреждения гематоэнцефалического барьера. Активированная микроглия и астроциты выделяют большое количество провоспалительных и нейротоксических соединений (Dirnagl еt al., 1999; Centonze et al., 2007; Kadhim et al.,2009). Наличие CBR-2 на активированных клетках микроглии и иммунной системы позволяют предположить, что агенты, модулирующие их функции, могут иметь потенциально полезные свойства в терапии нейродегенеративных расстройств, причем, поскольку психотропное действие каннабиноидов, как правило, связано с активацией CBR-1 на нейронах, CBR-2-опосредованное нейропротективное действие каннабиноидов представляется особенно интересным в связи с отсутствием их центральных побочных эффектов (Ashton, Glass, 2007).

Первые доказательства того, что селективная активация CBR-2 оказывает защитный эффект при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (EAE), были получены при исследовании действия каннабиноида WIN55212-2 на прогрессирование ЕАЕ у мышей. Применение этого синтетического каннабиноида, который является агонистом как CBR-1, так и CBR-2, ослабляло прогрессирование EAE. Присутствие антагониста CBR-1, SR141716А, не влияло на защитный эффект, а антагониста CBR-2, SR144528, блокировало его. Был сделан вывод, что нейропротекторное действие WIN55212-2 опосредовано активацией CBR-2. Однако возможно, что активация CBR-1 играет нейропротекторную роль на более поздних стадиях заболевания (Baker et al., 2000; Maresz et al., 2007). В другом исследовании было показано, что трансгенные мыши с гиперэкспрессией CBR-2 более устойчивы к поведенческим и нейродегенеративным изменениям, вызванным интрацеребральным введением 6- гидроксидофамина. У трансгеных мышей были менее выражены реактивный астроглиоз, активация микроглии, изменения активности тирозингидроксилазы в черной субстанции и хвостатом ядре, моторные и эмоциональные изменения в поведении (Ternianov et al., 2012).

Таким образом, накоплен большой объем данных, свидетельствующих об эффективной защитной роли ЭКС при различных патологических состояниях нервной системы, однако многие эндоканнабиноиды, входящие в ее состав, пока остаются мало исследованными (Pertwee et al., 2010).

Одним из перспективных нейропротекторных соединений является N- арахидоноилдофамин (N-ADA). Ранее было показано, что N-ADA обладает антиоксидантными свойствами и оказывает защитное действие на культивируемые нейроны мозжечка крысы в моделях окислительного стресса, апопотоза и глутаматной токсичности (Bobrov et al., 2008). При моделировании NMDA-зависимой эксайтотоксичности in vitro N-ADA оказывал защитный эффект на клетки зубчатой извилины, причем его нейропротекторные свойства в низких (1 нмоль), но не высоких (10 ммоль) концентрациях блокировались антагонистом CBR-1, АМ251, и не проявлялись у CBR-1-нокаутных мышей. Антагонисты CBR-2 и TRPV1 не влияли на защитный эффект (Grabiec et al., 2012). Однако данные о механизмах нейропротекторного действия N-ADA на сегодняшний день остаются противоречивыми и являются предметом дальнейших исследований.

1.4 Роль эндоканнабиноидов в коррекции гипоксических/ ишемических состояний головного мозга

Гипоксия - широко распространенное состояние организма, возникающее как из-за дефицита кислорода во внешней среде, так и при самых различных патологиях, связанных с нарушениями кровообращения, дыхания и транспортной функции крови (Мухина, 2000). При гипоксии происходит снижение доставки кислорода к тканям до уровня, недостаточного для поддержания фунции, метаболизма и структуры клетки (Лукьянова, 1997). Кислородная недостаточность служит основой разнообразных патологических процессов, часто наблюдающихся в клинике, и является одной из центральных проблем медицины.

При любом виде гипоксии в основе всех характерных для нее изменений лежит нарушение системы окислительного фосфорилирования в митохондриях (Лукьянова с соавт., 2007). Энергодефицит при гипоксии способствует накоплению Са2+ в цитоплазме клеток, активации Cа2+- зависимых фосфолипаз, что ведет к распаду фосфолипидов клеточных мембран (Оковитый, Смирнов, 2001; Won et al., 2002).

Нарушение поступления кислорода к нервной ткани приводит к изменению процессов синаптической передачи, гибели клеток и разрушению нейронных сетей головного мозга. В постгипоксическом периоде наблюдаются также нарушения в системах вторичных мессенджеров, таких как аденилатциклазной и инозитолфосфотазной систем (Nagakura, 2002; Чеснокова, 2006), что может играть определенную роль в отсроченной гибели нейронов. Изменяется активность таких ферментов, как МАО и аминотрансфераза (Рубанова с соавт., 1991, Захарова, 1991). В совокупности все дегенеративные процессы приводят к избирательной гибели нейронов. Гипоксия может сопровождаться исчезновением целого слоя пирамидных нейронов гиппокампа (Проблемы гипоксии… под ред. Лукьяновой, Ушакова, 2004). Избирательно повреждается неокортекс, особенно сенсомоторный, а также гиппокамп (Netto et al., 1993; Hodges et al., 1996; Virley et al., 1999). В подкорковых структурах, в частности, в базальных ганглиях, также отмечаются значимые повреждения. Суммарно все эти изменения приводят к мнестическим и когнитивным патологиям (Netto et al., 1993; Yamamoto et al., 1993; Karasava et al., 1994; Tanaka et al., 1998; Nagakura, 2002).

В зависимости от причин и механизма развития различают следующие основные типы гипоксии:

1. Экзогенная гипоксия, которая возникает при действии на систему обеспечения кислородом внешних факторов, и, в свою очередь, подразделяется на несколько типов:

а) гипоксический тип (гипо- и нормобарический);

б) гипероксический тип (гипер- и нормобарический).

2. Респираторная (дыхательная) гипоксия.

3. Циркуляторная (сердечнососудистая) гипоксия/ишемия.

4. Гемическая гипоксия, возникающая при анемии и вследствие инактивации гемоглобина.

5. Цитологическая гипоксия, возникающая при нарушении способности тканей поглощать кислород или при разобщении окисления и фосфорилирования (гипоксия разобщения).

6. Субстратная гипоксия (развивается на фоне дефицита энергетических субстратов).

7. Перегрузочная гипоксия ("гипоксия нагрузки"), возникающая при увеличении нагрузки на систему обеспечения кислородом;

8. Смешанная гипоксия (возникает при сочетании нескольких форм гипоксии).

Независимо от этиологии гипоксических состояний, в развитии и исходе основного патологического процесса решающую роль играет насыщение тканей кислородом и его участие в метаболических процессах (Проблемы гипоксии..., 2004; Лукьянова с соавт., 2007).

Поиск способов коррекции повреждающего действия гипоксии является весьма актуальной задачей медицины и нейробиологии. В большинстве экспериментальных моделей гипоксии in vivo используют модель циркуляторной гипоксии (локальной ишемии) либо острой или хронической гипобарической гипоксии. Наиболее подходящим условием для изучения молекулярных и клеточных нейропротекторных механизмов служит моделирование гипоксической гипоксии in vitro. Как правило, для осуществления методики in vitro используются специальные инкубаторы, в которых можно вытеснять кислород при помощи вакуумного насоса.

В экспериментах по моделированию циркуляторной гипоксии in vivo было показано, что ЭК, в том числе и N-ADA, способствуют защите нейронов от повреждений. Так, было обнаружено нейропротекторное действие синтетического каннабиноида WIN55212-2 при ишемическом повреждении мозга, причем снижение объема очага инфаркта блокировалось антагонистом CBR-1 римонабантом (Nagayama et al., 1999). Также одними из наиболее убедительных свидетельств нейропротекторного действия каннабиноидов, реализующегося через СВR-1, являются исследования, показавшие, что у мышей, нокаутных по гену CB1-/-, больше площадь очага инфаркта, ниже кровоток в области пенумбры и более выражен неврологический дефицит при окклюзии средней мозговой артерии, чем у гетерозигот CB1-/+ и у мышей дикого типа (Parmentier-Batteur et al, 2002). Кроме того, нокаутные животные были более чувствительны к эксайтотоксичности, вызванной глутаматом, инъецировынным непосредственно в кору головного мозга, и к оксидативной травме при интрацеребральном введении FeCl2 (Parmentier-Batteur et al, 2002; Kim et al., 2005). При фокальном ишемическом повреждении, индуцированном фототромбозом кровеносных сосудов коры головного мозга крысы, N-ADA препятствовал увеличению объёма очага инфаркта (Бобров с соавт., 2011; Генрихс, 2012). Такое же нейропротекторное действие оказывали и N- ацилэтаноламины, в частности, пальмитоилэтаноламин. Интересным представляется тот факт, что блокада СВR-1 и TRPV1 не препятствовала способности пальмитоилэтаноламина снижать объем очага инфаркта и неврологический дефицит у животных, подвергшихся воздействию ишемии/реперфузии. Применение пальмитоилэтаноламина существенно уменьшало развитие апоптоза и предотвращало вызванное ишемией увеличение экспрессии ряда белков, в том числе индуцибельной NО синтазы и фактора транскрипции NFkB (Garq et al., 2010).

Исследования in vitro, проведенные Grabiec с коллегами, выявили, что аппликация N-ADA при моделировании NMDA-эксайтотоксичности на органотипических срезах гиппокампа предотвращает дегенерацию и гибель клеток-зерен зубчатой извилины и снижает количество клеток микроглии. Применение антагониста CBR-1 АМ630 полностью блокировало нейропротекторный эффект, оказываемый малыми дозами N-ADA, но эффект высоких доз сохранялся. Антагонисты CBR-2 и TRPV1 не оказывали влияния на нейропротекторный эффект N-ADA. У CBR-1-нокаутных мышей N-ADA протективного действия не оказывал (Grabiec et al., 2012). При индукции апоптоза и цитотоксическом действии глутамата в культуре клеток мозжечка и новой коры N-ацилдофамины оказывали дозозависимый нейропротекторный эффект, опосредуемый CBR-2 (Генрихс с соавт., 2010). Однако оценка воздействия N-ADA на сохранение когнитивных, мнестических и поведенческих функций при ишемических и гипоксических поражениях ЦНС на сегодняшний день не проводилась.

Показано, что активация CBR-2-cелективными агонистами уменьшает воспалительные реакции, сопровождающие различные повреждения ЦНС. Продемонстрирован нейропротекторный эффект синтетического селективного агониста CBR-2 О-1966 при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите и при моделировании церебральной ишемии/реперфузии у мышей. Было обнаружено снижение адгезии лейкоцитов к капиллярам мозга, уменьшение инвазии иммунных клеток в паренхиму мозга и улучшение неврологических функций после инсульта. Применение агонистов CBR-2 препятствовало увеличению объема очага инфаркта через 24 часа после реперфузии (Zhang et al., 2009), а в присутствии антагониста CBR-2 SR144528 очаг инфаркта увеличивался. Антагонист CBR-1 SR141716А также оказывал нейропротекторный эффект, снижая объем очага инфаркта. Совместное применение селективного агониста CBR-2 и антагониста CBR-1 вызвало усиление мозгового кровотока во время периода окклюзии сосудов (Zhang et al., 2008). Аналогичные данные, свидетельствующие о нейропротекторном действии антагонистов CBR-1 при ишемии головного мозга, приводят и другие авторы (Berger et al., 2004; Muthian et al, 2004). Существует несколько объяснений подобного расхождения результатов. Один из возможных вариантов может быть связан с температурным режимом. Существует большое число работ, в которых активация CBR-1 не оказывала защитного эффекта при поддержании нормальной температуры тела у животных. Предполагается, что протекторный эффект связан с гипотермией, вызываемой активацией CBR-1 (Leker et al., 2003; Hayakawa et al., 2004). У CBR-1-нокаутных животных возможны нарушения при развитии ЦНС, которые усиливают чувствительность к ишемии. При этом нейропротекторный эффект антагониста CBR-1 SR141716A связан со свойствами самой молекулы антагониста, а не с блокированием рецепторов.

В целом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что каннабиноиды, и, в частности, N-ADA, могут обладать потенциальным терапевтическим потенциалом, предотвращая патологические изменения клеток, инициирующие нейродегенеративные процессы, и таким образом способствуя восстановлению нормальных функций мозга (Campbell et al., 2008). Однако в связи с неоднозначностью экспериментальных данных требуются дальнейшие исследования нейропротекторных и антигипоксических свойств эндоканнабиноидов, и, в том числе, N-ADA in vitro и in vivo для раскрытия механизмов их действия, что может явиться основой разработки новых лекарственных средств для коррекции ишемических и гипоксических повреждений нервной системы. Одним из адеватных методов оценки изменений функционального состояния нейронов при действии патогенетических факторов гипоксии/ишемии и фармакологической коррекции этих изменений является исследование биоэлектрической активности нейронных сетей, культивируемых на мультиэлектродной матрице.

1.5 Изучение сетевой активности нейронов

Нейронная сеть мозга является структурно-функциональной единицей, отвечающей за процессы обработки, хранения и воспроизведения информации. Одним из маркеров функционирования нейронной сети является ее спонтанная биоэлектрическая активность, имеющая свои закономерности развития в онтогенезе и под воздействием факторов окружающей среды. В настоящее время наиболее оптимальной методикой изучения нейрональной активности на сетевом уровне является мультиэлектродная система регистрации внеклеточных потенциалов действия (multielectrode arrays) (Мухина с соавт., 2009).

Нейроны гиппокампа после нескольких дней культивирования на мультиэлектродной матрице образуют между собой синаптические связи, о чем свидетельствует генерирование клетками случайных спайков (внеклеточных потенциалов действия) и типичных паттернов электрической активности в виде спайков (Gross and Kowalski, 1999). Спонтанная биоэлектрическая активность нейронов в культурах с высокой плотностью клеток отличается склонностью к синхронизации. В зависимости от возраста культуры, условий культивирования, фармакологических воздействий происходит изменение рисунка пачки (Boehler et al., 2007; Xiang et al., 2007; Ham et al., 2008).

Сетевая пачечная активность - это моментальная пространственно- временная последовательность внеклеточных потенциалов действия (спайков) одного или нескольких нейронов, детектируемая на внеклеточных электродах, с короткими межспайковыми интервалами (Li et al., 2007; Madhavan et. al., 2007).

Пачка (Burst) внеклеточно регистрируемых спайков характеризуется следующими признаками:

1. Количество спайков в пачке не менее 4.

2. Межспайковый интервал не более 100 мс (частота более 10 Гц).

3. Наличие пространственной и временной синхронизация пачечной активности в нейронной сети (Madhavan et. al., 2006; Pimashkin et al., 2011).

В отличие от традиционных электрофизиологических методов, применение данной методики имеет ряд преимуществ:

1. Клеточная неинвазивность, отсутствие необходимости помещать электроды вручную.

2. Возможность одновременной регистрации сигналов и стимуляции клеток.

3. Возможность проведения хронических экспериментов (месяцы).

4. Изучение нейрофизиологии сетей.

5. Возможность фармакологических манипуляций, в том числе, лекарственный скрининг.

Использование мультиэлектродных матриц дает уникальную возможность совмещения электрофизиологических методов с методами прижизненной визуализации (в частности, конфокальной лазерной микроскопии, КФЛМ) с использованием трансгенных флуоресцентных белков, ионных индикаторов. Совмещение культуры клеток с мультиэлектродной системой регистрации и стимуляции активности нейронов позволяет моделировать в динамике различные стадии развития нейронных сетей, а также может быть использовано для изучения на клеточном и сетевом уровне таких свойств нервной системы, как научение и память (Мухина с соавт., 2009).

2. Объект и методы исследования

2.1 Объект исследования

Объектом исследований in vitro служили первичные диссоциированные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных мышиных эмбрионов линии CBA (вид Mus musculus). Всего в экспериментах была использована 361 культура.

В опытах in vivo использовано 116 4-х недельных самцов мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и были согласованы с этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России.

2.2 Схема экспериментов

2.2.1 Схема экспериментов in vitro

Распределение экспериментальных групп представлено в табл.1. Культуры подвергали гипоксии на 21-й день in vitro (DIV). В интактной группе культур осуществлялась смена нормоксической культуральной среды. В культурах контрольной группы нормоксическую среду на 10 минут заменяли на гипоксическую, затем клетки возвращали нормоксическую среду, т.е. подвергали реоксигенации. В культуры других групп во время гипоксии, при реоксигенации и в течение суток после нее добавляли N-ADA 2,5 и 10 мкМ (синтезирован в лаборатории оксилипинов ИБХ РАН) и N-ADA в комбинации с антагонистом CBR-1, SR141716A (Sanofi), 1 мкМ, антагонистом CBR-2, SR144528 (Sanofi), 1 мкМ и антагонистом TRPV1, капсазепином (Tocris), 1 мкМ.

Таблица 1

Распределение экспериментальных групп in vitro