Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х =72,92%+5,01% F = 72,92 =14,54 5,01 F = 575,91 =14,54 39,61 Fкрит=2,57 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	2879,56	5	575,91
Случайное (внутригрупповое)	1069,39	27	39,61
Общее	3948,96	32	123,40

Таблица 22

Адгезия лейкоцитов к эндотелию, обработанному Цп (% адгезии, М+m;)

Группы сравнения	Лейкоциты	Гранулоциты	Лимфоциты
Контроль n=6	31,37+4,36; 10,68	71,05+3,03; 7,41	19,68+6,16; 15,09
+Цп 25% n=5	26,22+2,16; 4,83	69,02+1,33; 2,97	15,17+2,16; 4,82
+Цп 50% n=5	32,90+3,22; 7,19	74,94+4,52; 10,09	11,34+1,63; 3,64
+Цп 75% n=5	29,32+2,83; 6,27	72,92+5,44; 12,17	14,18+2,21; 4,94
+Цп 100% n=5	35,66+1,97; 4,39	96,81+1,59; 3,56 *	7,42+0,78; 1,74
+ Цп 150% n=5	28,97+1,21;2,70	94,33+1,94; 4,33 *	6,98+1,33; 2,98

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой контроля по t-критерию.

Таблица 23

Влияние Цп на изменение адгезивной способности гранулоцитов. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х =74,79%+6,63% F = 74,79 =11,28 6,63 F = 606,46 =11,28 53,78 Fкрит=2,74 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	3032,29	5	606,46
Случайное (внутригрупповое)	1021,88	19	53,78
Общее	4054,18	24	168,92

Вывод: влияние фактора достоверно в высшей степени для всех объектов данной категории. Влияние исследуемого фактора может составить (>0,95) не менее 56,62% и не более 92,97% от общего влияния всей суммы факторов.

Представляет интерес изучение влияния Цп на адгезию лейкоцитов к активированному эндотелию, которое имеет место и играет существенную роль в развитии воспалительного процесса.

На третьем этапе эксперимента изучали влияние Цп на адгезию лейкоцитов к активированному эндотелию. Для активации эндотелия использовали гистамин (4-(2-аминоэтил) - имидазолил). Гистамин является одним из медиаторов, участвующих в регуляции жизненно важных функций организма и играющих важную роль в патогенезе ряда состояний. Через Н2 - и в меньшей степени Н1 - рецепторы гистамин в том числе регулирует тонус и проницаемость сосудов, экспрессию адгезивных молекул на поверхности эндотелиальных клеток сосудов, способствует эмиграции лейкоцитов, стимулирует фагоцитоз (93). Гистамин использовался в концентрации 1550 нмоль/л, что в 3 раза превышает физиологическую. На данном этапе эксперимента воздействию различных доз Цп подвергали лейкоциты, а затем изучали их адгезивную способность к активированному гистамином эндотелию. Результаты эксперимента представлены в таблице 24.

Таблица 24

Влияние Цп на адгезию лейкоцитов к активированному гистамином эндотелию (% адгезии, М+m;)

Группы сравнения	Лейкоциты	Гранулоциты	Лимфоциты
Контроль n=5	53,86+3,35; 7,49	83,31+2,98; 6,67	12,11+1,79; 4,02
+Цп 25% n=5	51,49+3,08; 6,88	81,74+3,37; 7,53	16,64+2,44; 5,46
+Цп 50% n=5	54,43+3,06; 6,84	81,82+3,97; 8,88	19,79+1,50; 3,36*
+Цп 75% n=5	52,94+2,60; 5,82	83,11+2,79; 6,25	19,23+1,52; 3,40*
+Цп 100% n=5	64,78+1,82; 4,08*	96,68+1,34; 2,99 *	15,53+2,26; 5,05
+ Цп 150% n=5	60,69+1,58;3,54	99,59+0,19; 0,43 *	10,19+0,90; 2,02

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой контроля по t-критерию.

Необходимо отметить, что гистамин увеличивал адгезивную способность интактных лейкоцитов в 1,7 раза. Полагают, что механизм увеличения адгезии лейкоцитов к активированному гистамином эндотелию связан с транслокацией Е - и Р - селектинов из эндотелиальных секреторных гранул к поверхности клетки (334).

Цп изменяет адгезию лейкоцитов к активированному гистамином эндотелию. Примечательно, что большие дозы Цп (150% и 100% от физиологического уровня) повышают прилипание гранулоцитов, а средние дозы (75% и 50%) - лимфоцитов.

Проведенный дисперсионный однофакторный анализ показал, что влияние различных доз Цп на адгезию гранулоцитов и лимфоцитов статистически значимо (таблицы 25,26).

Таблица 25

Влияние Цп на изменение адгезии гранулоцитов. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=61,92%+10,58% F = 61,92 =5,85 10,58 F = 262,51 =5,85 44,84 Fкрит=2,77 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	1312,55	5	262,51
Случайное (внутригрупповое)	807,15	18	44,84
Общее	2119,69	23	92,16

Вывод: влияние фактора достоверно с вероятностью >0,01 для всех объектов данной категории. Влияние Цп может составить (>0,95) не менее 32,59% и не более 91,25% от общего влияния всей суммы факторов.

Таблица 26

Влияние Цп на изменение адгезии лимфоцитов. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=51,27%+13,54% F = 51,27 =3,79 13,54 F = 58,93 =3,79 15,56 Fкрит=2,77 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	294,64	5	58,93
Случайное (внутригрупповое)	280,03	18	15,56
Общее	574,66	23	24,99

Вывод: влияние фактора достоверно с вероятностью >0,05 для всех объектов данной категории. Влияние исследуемого фактора может составить (>0,95) не менее 13,74% и не более 88,80% от общего влияния всей суммы факторов.

Полученный факт может быть объясним следующим образом. Как известно, воспаление - типовой патологический процесс, при котором имеет место активация эндотелия медиаторами воспаления, в том числе гистамином. В то же время, клетками первой линии защиты при повреждении являются нейтрофилы, они первыми проникают в очаг. Вторую линию обороны составляют мононуклеары - лимфоциты и моноциты. Поэтому вполне целесообразным является то, что адгезию гранулоцитов увеличивают большие дозы Цп (100% - 150% от физиологического уровня), то есть высокий уровень Цп, который регистрируется через 48 часов после повреждения. На более поздних этапах, когда уровень Цп снижается (средние дозы - 50% - 75%), увеличивается адгезия лимфоцитов.

Возможно, что рост адгезивной способности лейкоцитов к активированному гистамином эндотелию под влиянием Цп обусловлен его влиянием на юкстакринную активацию лейкоцитов мембранно -ассоциированными молекулами ФАТ с последующей экспрессией СД 11а/СД 18 и СД 11b/СД 18 на поверхности лейкоцитов (116).

Возникает вопрос: изменение адгезивной способности лейкоцитов к активированному эндотелию обусловлено влиянием Цп на сами лейкоциты и/или на эндотелиальные клетки ? Для проверки второй гипотезы проведен четвертый этап эксперимента по изучению адгезии лейкоцитов к активированному гистамином эндотелию после его обработки различными концентрациями Цп. В заданных условиях Цп не изменял адгезивную способность лейкоцитов (таблица 27).

Таблица 27

Адгезия лейкоцитов к обработанному гистамином и Цп эндотелию

(% адгезии, М+m;)

Группы сравнения	Лейкоциты	Гранулоциты	Лимфоциты
Контроль n=5	53,86+3,35; 7,49	83,31+2,98; 6,67	12,11+1,79; 4,02
+Цп 25% n=5	44,84+3,59; 8,02	79,16+3,87; 8,65	16,26+0,89; 1,98
+Цп 50% n=5	45,79+4,57; 10,22	85,44+1,72; 3,86	10,76+2,07; 4,63
+Цп 75% n=5	46,52+3,04; 6,80	85,85+4,04; 9,04	17,04+2,11; 4,72
+Цп 100% n=5	47,68+2,18; 4,88	90,70+3,59; 8,03	16,94+2,11; 4,71
+ Цп 150% n=5	47,40+1,33;2,97	88,39+3,15; 7,05	17,19+3,27; 7,32

Итак, нами получены данные, свидетельствующие о том, что Цп в ходе воспалительного процесса обладает неоднозначным действием на количественный состав лейкоцитов. Во - первых, Цп при воспалении выступает как стимулятор пролиферативной активности белого ростка костного мозга, что должно способствовать увеличению количества зрелых лейкоцитов в периферической крови. Во - вторых, Цп обладает способностью увеличивать адгезию лейкоцитов к активированному гистамином эндотелию за счет изменения адгезивных свойств самих лейкоцитов, а не эндотелиальных клеток. Примечательно, что эта способность лейкоцитов выражена весьма значительно: 99,59% гранулоцитов прилипает к эндотелию сосудистой стенки. Отсюда становится ясным, что несмотря на гиперпродукцию лейкоцитов в костном мозге при воспалении и дополнительную стимуляцию лейкопоэза Цп, количество лейкоцитов в циркулирующем пуле периферической крови снижается за счет увеличения их адгезии к эндотелию и эмиграции в очаг воспаления.

Полученные результаты позволяют высказать предположение о механизмах изменения фагоцитарной функции лейкоцитов при воспалении. Уменьшение активности фагоцитоза напрямую связано со снижением количества фагоцитирующих клеток при воспалении. Как показали наши исследования, Цп снижает количество циркулирующих лейкоцитов в периферической крови за счет нейтрофилов, которые составляют основную часть фагоцитов. Рост интенсивности фагоцитоза свидетельствует об увеличении поглотительной способности фагоцитов под влиянием Цп. По данным литературы, Цп способен влиять на фагоцитарную функцию лейкоцитов, но не за счет опсонизации перевариваемых частиц (391). Как известно, захват отдельным фагоцитом частиц, то есть интенсивность фагоцитоза, представляет собой двусторонний процесс, который зависит от свойств поверхности поглощаемой частицы и фагоцита. В виду того, что Цп увеличивает адгезивные свойства фагоцитирующих клеток он участвует в начальной стадии фагоцитарной реакции - поглощении фагоцитируемых частиц. Последний сопровождается структурно - функциональными сдвигами в цитоплазматической мембране, которые через систему внутриклетоных мессенджеров инициируют функциональные сдвиги во многих системах, ответственных за эффекторные реакции, осуществляемые активированными фагоцитами (респираторный взрыв, движение клеткок, эндоцитоз, секреция и др.). Однако, завершенность фагоцитоза характеризуется образованием фаголизосомы и киллингом и перевариванием поглощенного материала.

3.3 Влияние церулоплазмина на функцию лейкоцитов на субклеточном уровне при асептическом воспалении

На следующем этапе исследования у нас возник вопрос о возможности влияния Цп на изменение функциональной активности лейкоцитов при воспалении на субклеточном уровне. Как изменяются под влиянием Цп эффекторные функции лейкоцитов: кислородзависимые и кислороднезависимые микробоцидные механизмы фагоцитирующих клеток ? Для изучения первых использовали метод хемилюминесценции цельной крови, усиленной люминолом. Показано, что ХЛ цельной крови, усиленная люминолом, отражает способность фагоцитов генерировать АФК (60, 61, 176). Кроме того, определяли внутриклеточное содержание миелопероксидазы. О состоянии кислороднезависимых эффекторных систем судили по содержанию катионных белков в лизосомах гранулоцитов.

Первоначально исследовали влияние Цп после двукратного введения в дозе 30 мг/кг через 6 и 12 часов от индукции воспалительного процесса (суммарная доза 60 мг/кг). Показатели определяли на 3 и 5 сутки эксперимента.

В контрольной группе животных на 3 сутки от индукции воспаления отмечен рост показателей ХЛ в относительных (таблица 28), но не в абсолютных величинах (таблица 29), что обусловлено нейтрофильным лейкоцитозом на этом этапе эксперимента, а не гиперфункцией фагоцитов. В это же время увеличилось внутриклеточное содержание МПО (таблица 30). Таким образом, на 3 сутки воспаления генерация АФК отдельным гранулоцитом не изменяется, а их суммарная продукция (по показателям ХЛ цельной крови) возрастает за счет количества клеток - продуцентов АФК. На 5 сутки у группы контрольных животных отмечено усиление генерации АФК лейкоцитами по показателям ХЛ, а также содержание МПО в гранулоцитах (таблицы 28 - 30). Причем, увеличилось как спонтанное, так и индуцированное свечение лейкоцитов в пересчете на абсолютные величины, то есть возрастала как базальная активность отдельной клетки, так и ее функциональный резерв.

Применение Цп в опытной группе животных привело к следующим изменениям функциональной активности лейкоцитов при воспалении. По результатам ХЛ исследования, Цп уменьшал интенсивность спонтанного и индуцированного свечения лейкоцитов на 3 и 5 сутки эксперимента, однако пересчет показателей на 105 гранулоцитов не обнаружил достоверных различий активности отдельной клетки в опытной и контрольной группах (таблицы 28, 29).

Отмечено снижение внутриклеточного содержания МПО на 3 и 5 сутки (таблица 30). МПО - система является поставщиком одних из наиболее реакционноспособнных активных форм кислорода - гипогалоидов. Основным продуктом МПО является НОСI, а ЭПО - HOBr и HOI (107, 218, 335). Причем пероксидазная активность эозинофилов выше, чем у нейтрофилов (398). Возможно, что снижение активности МПО при воспалении под влиянием Цп связано с лейкоцитозом в очаге воспаления ввиду возросшей эмиграции лейкоцитов, а значит необходимостью ограничивать их функцию с целью предупреждения излишней альтерации тканей.

Увеличение содержания КБ на 5 сутки эксперимента (таблица 30) может быть связано с тем, что в их состав кроме МПО входят лактоферрин, лизоцим, дефенсины, катепсин G и другие белки. Необходимо также отметить, что содержание МПО у животных опытной группы, несмотря на снижение, было достоверно выше, чем у интактных животных: на 3 сутки в 2 раза, а на 5 - в 1,5 раза.

Таблица 28

Влияние Цп на показатели хемилюминесценции цельной крови крыс при воспалении (М+m; )

Группа животных / Показатели хемилюминесценции	Группа 1 Интактные крысы n=8	Группа 2 Воспаление (контроль) n=7	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
		3 сутки	5 сутки	3 сутки	5 сутки
Спонтанное свечение	Светосумма, у.е. х мин	10,92+2,49; 7,04	19,03+3,50; 8,58*	38,01+4,89; 11,99*	8,45+1,87; 4,18**	21,83+2,79; 6,25*,**
	Максимальная светимость, у.е.	1,32+0,26; 0,73	2,69+0,42; 1,02*	4,67+0,71; 1,74*	1,04+0,18; 0,41**	2,85+0,34; 0,76*,**
Индуцированное свечение	Светосумма, у.е. х мин	23,19+5,12; 14,48	85,37+25,31; 61,99*	65,92+7,61; 18,65*	37,35+3,57; 7,99*,**(U)	33,46+8,68; 19,39**
	Максимальная светимость, у.е.	2,74+0,56; 1,57	10,78+3,34; 8,18* (U)	8,24+1,01; 2,46*	4,28+0,43; 0,97** (U)	4,28+0,96; 2,15**

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами ( р2-3) по t-критерию (U - критерий Манна - Уитни).

Таблица 29

Влияние Цп на показатели хемилюминесценции цельной крови крыс при воспалении в пересчете на 10 5 гранулоцитов (М+m; )

Группа животных / Показатели хемилюминесценции	Группа 1 Интактные крысы n=10	Группа 2 Воспаление (контроль) n=7	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
		3 сутки	5 сутки	3 сутки	5 сутки
Спонтанное свечение	Светосумма, у.е. х мин	4,04+0,68; 2,16	4,04+0,98; 2,41	9,58+1,25; 3,05*	3,69+0,73; 1,64	11,57+1,15; 2,57*
	Максимальная светимость, у.е.	0,53+0,08; 0,27	0,58+0,13; 0,32	1,16+0,19; 0,49*	0,46+0,07; 0,16	1,50+0,11; 0,24*
Индуцированное свечение	Светосумма, у.е. х мин	9,06+2,03; 5,73	14,73+2,41; 5,91	16,20+1,49; 3,64*	16,62+1,31; 2,93*	17,23+3,69; 8,27
	Максимальная светимость, у.е.	1,08+0,23; 0,64	1,84+0,31; 0,77	2,02+0,19; 0,47*	1,89+0,13; 0,28*	2,21+0,40; 0,89*

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3) по t-критерию.

Таблица 30

Влияние Цп на цитохимические показатели лейкоцитов при воспалении (М+m; )

Группа животных / Показатели СЦК, у.е	Группа 1 Интактные крысы n=23	Группа 2 Воспаление (контроль) n=7	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
		3 сутки	5 сутки	3 сутки	5 сутки
Катионные белки	0,87+0,06; 0,29	0,79+0,02; 0,05	0,91+0,03; 0,07	0,96+0,09; 0,21	1,16+0,04; 0,09 р1-3<0,05 р2-3<0,05
Миелопе-роксидаза	0,46+0,03; 0,18	1,34+0,03; 0,08 р1-2<0,05	1,31+0,01; 0,02 р1-2<0,05	0,91+0,05; 0,12 р1-3<0,05 р2-3<0,05	0,63+0,05; 0,12 р1-3<0,05 р2-3<0,05

Примечание. р - достоверность различий между группами по t-критерию.

На следующем этапе исследовали влияние Цп на показатели функциональной активности лейкоцитов после однократного применения в дозе 60 мг/кг на 3 сутки от индукции воспаления, то есть в той же суммарной дозе, что у предыдущих животных, но введенной одномоментно и во время максимального содержания эндогенного Цп при воспалении.

Интересна динамика сдвигов функциональной активности лейкоцитов у животных контрольной группы в ходе воспаления (таблицы 31,32). На 8 сутки эксперимента нами отмечено снижение генерации АФК фагоцитами по показателям ХЛ в абсолютных величинах, причем уменьшалась только базальная активность лейкоцитов, а их функциональный резерв не изменялся. Вероятно, к 8 суткам воспалительного процесса был исчерпан лимит эффекторных внутриклеточных систем фагоцитов, ответственных за генерацию АФК, но их функциональный резерв, то есть способность образовывать АФК после дополнительной стимуляции, сохранился. К 15 суткам эксперимента спонтанное свечение лейкоцитов несколько увеличилось, но все же было достоверно ниже, чем у интактных животных, однако примерно вдвое увеличился функциональный резерв лейкоцитов.

Под влиянием Цп на 8 сутки эксперимента у опытной группы животных сниженные показатели спонтанной и индуцированной ХЛ лейкоцитов увеличивались почти в 3 раза, приближаясь к значениям у интактных животных. На 15 сутки спонтанная светимость лейкоцитов в опытной группе возвращалась к норме, а в контрольной была достоверно ниже. Отмечено увеличение функционального резерва лейкоцитов по показателям индуцированного ХЛ - ответа на 5 и 8 сутки эксперимента по показателям СС и МС, а на 15 сутки - только МС. То есть, Цп улучшает готовность фагоцитов к реализации эффекторных функций.

Кроме того, рост содержания КБ в гранулоцитах под влиянием Цп при воспалении свидетельствует об опосредованном участии Цп в неспецифической защите организма через кислороднезависимые механизмы. В процессе пенетрации КБ через клеточные барьеры наблюдаются дезорганизация их упорядоченной структуры и подавление метаболических процессов (дыхание, окислительное фосфорилирование, биосинтез ДНК, РНК и белка), нормальная реализация которых сопряжена с цитоплазматической мембраной (76). Киллинговая способность КБ усиливается антителами и комплементом (248).Показано, что ряд КБ, будучи адсорбированы микробными клетками, достоверно увеличивают активность и интенсивность фагоцитоза (75), обладая, таким образом, проопсонизирующими свойствами.

Таблица 31

Влияние Цп на показатели хемилюминесценции цельной крови крыс при воспалении (М+m; )

Группа животных / Показатели хемилюминесценции	Группа 1 Интактные крысы n=10	Группа 2 Воспаление (контроль) n=5	Группа 3 Воспаление +Цп (опыт) n=6
		5 сутки	8 сутки	15 сутки	5 сутки	8 сутки	15 сутки
Спон-танное свечение	Светосумма, у.е. х мин	23,00+2,66; 8,42	121,16+37,38; 83,58*(U)	12,36+5,07; 11,33	35,85+5,62; 12,58	26,89+3,60; 8,83	9,59+1,49; 3,65*	30,18+9,85; 24,13
	Максимальная светимость, у.е.	3,08+0,35; 1,12	13,64+3,99; 8,93*(U)	1,76+0,67; 1,50	4,30+0,57; 1,27	3,39+0,43; 1,04	1,43+0,21; 0,50*	5,42+2,67; 6,54
Индуци-рован-ное свечение	Светосумма, у.е. х мин	17,85+2,44; 7,72	54,52+15,61; 34,89*(U)	39,14+13,77; 30,80*	143,63+23,98 53,62*	50,29+9,91; 24,26*	35,65+6,94; 17,01*(U)	71,24+18,52; 45,36*,**
	Максимальная светимость, у.е.	2,11+0,29; 0,90	6,81+2,01 4,49*(U)	5,30+2,02 4,53	16,74+2,45; 5,49*	6,11+1,17 2,87*	4,41+0,88 2,15*	9,74+2,27; 5,57*

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами ( р2-3) по t-критерию (U - критерий Манна-Уитни).

Таблица 32

Влияние Цп на показатели хемилюминесценции цельной крови крыс при воспалении в пересчете на 105 гранулоцитов (М+m; )

Группа животных / Показатели хемилюминесценции	Группа 1 Интактные крысы n=10	Группа 2 Воспаление (контроль) n=5	Группа 3 Воспаление +Цп (опыт) n=6
		5 сутки	8 сутки	15 сутки	5 сутки	8 сутки	15 сутки
Спон-танное свечение	Светосумма, у.е. х мин	11,98+1,52; 4,81	27,18+6,16 13,77	2,07+0,79 1,76*	5,44+0,72 1,60*	15,49+2,30 4,18	6,12+1,09 2,66*,**	12,08+3,87 9,49
	Максимальная светимость, у.е.	1,67+0,26; 0,83	3,09+0,66 1,48	0,29+0,10 0,23*	0,65+0,08 0,18*	1,92+0,22 0,53	0,91+0,16 0,38*,**	2,28+0,95 2,32
Индуци-рован-ное свечение	Светосумма, у.е. х мин	9,24+1,25; 3,96	13,06+3,69 8,26	6,60+2,08 4,64	22,44+4,28 9,57*	26,92+3,67 8,99*,**	22,63+4,79 11,73*,**	30,21+4,77 11,68*
	Максимальная светимость, у.е.	1,09+0,15; 0,48	1,62+0,47 1,06	0,89+0,31 0,68	2,61+0,43 0,97*	3,28+0,44 1,08*,**	2,79+0,60 1,48*,**	4,31+0,60 1,35*,**

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами ( р2-3) по t-критерию.

Итак, нами показано, что под влиянием Цп эффекторные функции фагоцитов при воспалении нормализуются, приближаются по своим значениям к показателям интактных животных, а сам Цп выступает в роли модулятора функциональной активности лейкоцитов при воспалении

Интересно, является ли влияние Цп на количественный состав и функциональную активность лейкоцитов проявлением самостоятельного эффекта или зависимым от рассматриваемой патологической ситуации: продукции цитокинов и других биологически активных веществ в ходе воспаления? Кроме того, на данном этапе нашего исследования нельзя однозначно ответить на вопрос: изменение функциональных возможностей лейкоцитов связано с влиянием Цп на зрелые клетки, циркулирующие в периферической крови, или модификация функции происходит на этапах их созревания в костном мозге?

С одной стороны, собственные данные по изучению адгезивной способности лейкоцитов свидетельствуют, что Цп изменяет функцию зрелых клеток. А изменение функциональной активности лейкоцитов при экспериментальном воспалении наблюдается на 3 - 6 - 13 сутки после однократного введения Цп, который, как известно, сохраняется в сыворотке в течение 48 часов. Но нельзя однозначно заявить, что изменение функции лейкоцитов на субклеточном уровне, в частности, генерация АФК, также связано с влиянием Цп на зрелые клетки. Может быть, оно носит опосредованный характер?

С целью ответа на поставленные вопросы нами предпринята попытка изучить влияние Цп на процессы генерации АФК по показателям ХЛ в условиях in vitro.

3.4 Влияние церулоплазмина на генерацию активных форм кислорода фагоцитами в условиях in vitro

Для изучения влияния Цп на процессы генерации АФК фагоцитами в условиях in vitro использовали цельную кровь здоровых людей - доноров крови, так как показано, что ХЛ цельной крови, усиленная люминолом, отражает способность фагоцитов генерировать АФК (60, 61, 176).

Растворы Цп вносили в реакционную среду кюветы прибора. Применяли следующие дозы препарата (мкг/мл): 50; 100; 200; 300; 400; 600, что соответствовало 12,5 %; 25 %; 50 %; 75 %; 100 %; 150 % от его физиологической концентрации в сыворотке крови.

После снятия спонтанного свечения цельной крови, разведенной в 20 раз раствором люминола, она инкубировалась при 370C в стеклянном стакане прибора. Адгезия лейкоцитов к стеклянной поверхности приводила к их активации и усилению наработки АФК. Таким образом, индуцированное свечение, снятое через 60 минут инкубации, отражало функциональный резерв лейкоцитов. Другие исследователи для определения последнего используют различные индукторы: опсонизированные бактерии или зимозан, полистирол, форбол-мерил-ацетат, конковалин А, иммуноглобулины, гетерологичные эритроциты и др. (176).

На первом этапе эксперимента растворы Цп добавляли непосредственно перед снятием показателей. Результаты ХЛ цельной крови сразу после добавления растворов Цп представлены в таблицах 33, 34.

Как видно из таблицы 33, Цп усиливал спонтанную СС и МС цельной крови сразу после добавления в дозах 12,5%, 50% , 75% и 100% от физиологического уровня.

Индуцированное свечение цельной крови (по показателям СС) снизилось при добавлении Цп в дозе 150 % и повысилось под влиянием Цп в дозе 75%.

Пересчет показателей на 105 гранулоцитов (таблица 34) показал стимулирующее влияние Цп на показатели спонтанного свечения гранулоцитов в дозах 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100% от физиологической концентрации. Однако, добавление Цп в дозе 150% привело к снижению СС после активации лейкоцитов, а в дозах 50% и 75% - к увеличению.

Поскольку индуцированная ХЛ отражает функциональный резерв фагоцитов, можно утверждать, что Цп сразу после добавления в высоких дозах (150% от физиологического уровня ) уменьшает его, а в средних (50% и 75%) - увеличивает.

Установлено, что МС, то есть величина пика ХЛ, зависит от фагоцитарной активности клеток, а СС за время измерения является интегральным показателем генерации АФК (176). По нашим данным, СС в целом отражала показатели МС.

Таблица 33

Хемилюминесценция цельной крови сразу после добавления растворов Цп

Показатели/ Группа сравнения	Спонтанное свечение	Индуцированное свечение
	Светосумма, у.е. х мин.	Максимальная светимость,у.е.	Светосумма, у.е. х мин.	Максимальная светимость, у.е.
	М+m		М+m		М+m		М+m
Контроль n=12	59,19 +11,79	40,87	10,32 +2,04	7,06	411,79 +50,61	175,32	40,38 +5,25	18,19
+Цп 12,5% (50мкг/мл) n=5	116,83 +10,32 р<0,01	23,08	20,72 +1,99 р<0,01	4,67	447,96 +42,39	94,78	47,28 +4,39	9,83
+Цп 25% (100мкг/мл) n=5	119,69 +30,52	68,24	21,84 +5,17	11,56	442,33 +69,26	154,88	45,24 +6,34	14,18
+Цп 50% (200мкг/мл) n=5	108,95 +17,45 р<0,05	39,03	17,88 +2,43 р<0,05	5,43	561,45 +55,48	124,07	59,80 +5,28 р<0,05	11,80
+Цп 75% (300мкг/мл) n=5	205,13 +32,43 р<0,01	72,51	24,91 +4,49 р<0,05	10,05	507,50 +49,34 р<0,05	110,32	55,03 +4,64	10,37
+Цп 100% (400мкг/мл) n=5	168,64 +22,66 р<0,01	50,68	21,60 +1,88 р<0,01	4,20	402,30 +38,68	86,48	42,57 +3,83	8,57
+Цп 150% (600мкг/мл) n=5	51,47 +10,21	22,83	7,13 +1,44	3,22	269,96 +23,61 р<0,05	52,79	30,80 +3,19	7,14

Примечание. р - показатель различия с контрольной группой по t-критерию.

Таблица 34

Хемилюминесценция цельной крови сразу после добаления растворов Цп (в пересчете на 105 гранулоцитов)

Показатели/ Группа сравнения	Спонтанное свечение	Индуцированное свечение
	Светосумма, у.е. х мин.	Максимальная светимость, у.е.	Светосумма, у.е. х мин.	Максимальная светимость, у.е.
	М+m		М+m		М+m		М+m
Контроль n=12	21,16 +4,75	16,44	3,73 +0,88	3,05	141,72 +24,64	85,35	14,62 +2,60	9,01
+Цп 12,5% (50мкг/мл) n=5	39,22 +2,39 р<0,01	5,34	6,96 +0,52 р<0,01	1,16	150,19 +9,82	21,96	15,86 +1,01	2,27
+Цп 25% (100мкг/мл) n=5	47,83 +13,10 р<0,05*	29,29	8,64 +2,08 р<0,05*	4,66	173,68 +21,29	47,60	18,48 +2,21	4,94
+Цп 50% (200мкг/мл) n=5	50,38 +7,63 р<0,05	17,06	8,31 +1,17 р<0,05	2,63	259,58 +24,45 р<0,01	54,68	27,68 +2,37 р<0,01	5,31
+Цп 75% (300мкг/мл) n=5	88,47 +15,82 р<0,01	35,38	10,71 +2,02 р<0,05	4,52	218,98 +28,56 р<0,05*	63,86	23,71 +2,74 р<0,05	6,13
+Цп 100% (400мкг/мл) n=5	55,66 +15,56 р<0,05*	34,79	6,93 +1,74	3,9	114,20 +15,99	37,76	12,13 +1,72	3,86
+Цп 150% (600мкг/мл) n=5	13,84 +1,24	2,78	1,90 +0,17	0,39	77,91 +11,47 р<0,05	25,65	0,39	2,53

Примечание. р - показатель различия с контрольной группой: при отсутствии обозначений - по критерию Стьюдента; * - критерию Манна-Уитни.

Для оценки силы и достоверности влияния различных доз Цп на изменение показателей ХЛ гранулоцитов из общей массы факторов использовали дисперсионный однофакторный анализ. Исследуемым фактором является доза препарата. Результаты дисперсионного однофакторного анализа показателей спонтанной ХЛ цельной крови в абсолютных величинах представлены в таблицах 35 и 36. Как видно, влияние Цп достоверно с высокой степенью вероятности.

Таблица 35

Изменение показателей спонтанной ХЛ цельной крови (СС, у.е. х мин/105гранулоцитов) сразу после добавления растворов Цп различных концентраций. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния. Исследуемый фактор - доза Цп

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х =54,96%+7,72% F = 54,96 =7,12 7,72 F = 3572,99 =7,12 501,97 Fкрит=2,37 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	21437,96	6	3572,99
Случайное (внутригрупповое)	17568,91	35	501,97
Общее	39006,86	41	951,39

Вывод: влияние фактора достоверно в высшей степени для всех объектов данной категории. Влияние исследуемого фактора может составить (>0,95) не менее 36,65% и не более 73,27% от общего влияния всей суммы факторов.

Таблица 36

Изменение показателей спонтанной ХЛ цельной крови (МС, у.е. /105гранулоцитов) сразу после добавления растворов Цп различных концентраций. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния. Исследуемый фактор - доза Цп

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=46,88%+9,11% F = 46,88 =5,15 9,11 F = 57,06 =5,15 11,08 Fкрит=2,37 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	342,36	6	57,06
Случайное (внутригрупповое)	387,89	35	11,08
Общее	730,26	41	50,92

Вывод: влияние фактора достоверно с вероятностью >0,999 для всех объектов данной категории. Влияние исследуемого фактора может составить (>0,95) не менее 25,29% и не более 68,48% от общего влияния всей суммы факторов.

Результаты дисперсионного однофакторного анализа показателей индуцированной ХЛ цельной крови в абсолютных величинах даны в таблицах 37 и 38. Влияние Цп на СС индуцированного свечения достоверно с вероятностью >0,999 для всех объектов данной категории, а сила влияния составляет 47,82%+ 8,94%. Влияние Цп на МС индуцированного свечения достоверно в высшей степени для всех объектов данной категории, а сила влияния составляет 55,70%+ 7,59%.

Таблица 37

Изменение показателей индуцированной ХЛ цельной крови (СС, у.е. х мин/105гранулоцитов) сразу после добавления растворов Цп различных концентраций. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния. Исследуемый фактор - доза Цп

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=47,82%+ 8,94% F = 47,82 =5,35 8,94 F = 19425,12 =5,35 3632,98 Fкрит=2,37 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	116550,7	6	19425,12
Случайное (внутригрупповое)	127154,3	35	3632,98
Общее	243705,0	41	5944,03

Таблица 38

Изменение показателей индуцированной ХЛ цельной крови (МС, у.е. /105гранулоцитов) сразу после добавления растворов Цп различных концентраций. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния. Исследуемый фактор - доза Цп

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=55,70%+ 7,59% F = 55,70 =7,33 7,59 F = 303,97 =7,33 41,44 Fкрит=2,37 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	1823,82	6	303,97
Случайное (внутригрупповое)	1450,52	35	41,44
Общее	3274,34	41	79,86

Итак, влияние Цп сразу после добавления на результативный признак, генерацию АФК гранулоцитами по показателям спонтанной и индуцированной ХЛ цельной крови, является доказанным.

На втором этапе эксперимента образцы крови перед снятием показателей инкубировали с растворами Цп различных концентраций в течение 30 минут при 37оС. Результаты исследования ХЛ цельной крови после 30 - минутной инкубации с растворами Цп представлены в таблицах 39, 40. Зафиксировано в пересчете на 105 гранулоцитов усиление спонтанной светимости по показателям СС и МС при добавлении Цп в дозах 25%, 50%, 75%, 100% от физиологического уровня. Отмечено увеличение индуцированного ХЛ - ответа под влиянием Цп в дозах 100% и 75% от физиологического уровня.

Нами обнаружено, что показатели ХЛ - ответа лейкоцитов отличаются в разные сезоны года. Показатели в таблицах 39, 40 получены весной, а в таблицах 33, 34 - летом. Причем, разные показатели ХЛ - ответа связаны только со спонтанной светимостью, а индуцированное свечение лейкоцитов в разные сезоны года статистически не отличалось друг от друга. То есть сезонным изменениям подвержена только базальная активность лейкоцитов, а их функциональный резерв остается постоянным. Данные литературы также свидетельствуют о сезонных колебаниях функциональной активности лейкоцитов. Рядом авторов отмечены сезонные изменения фагоцитарной активности нейтрофилов. У здоровых людей весной по сравнению с другими временами года она повышается (37).

Проведен однофакторный дисперсионный анализ для оценки силы и достоверности влияния Цп после 30 - минутной инкубации с цельной кровью на показатели спонтанной и индуцированной ХЛ. Показано, что влияние Цп на спонтанную светимость достоверно, а сила влияния Цп составляет не менее 20,72% и не более 53,19% для СС и не менее 12,61% и не более 48,41% для МС (таблицы 41, 42).

Таблица 39

Хемилюминисценция цельной крови после 30 - минутной инкубации при 370С с растворами Цп

Показатели / Группа сравнения	Спонтанное свечение	Индуцированное свечение
	Светосумма, у.е. х мин.	Максимальная светимость, у.е.	Светосумма, у.е. х мин.	Максимальная светимость, у.е.
	М+m		М+m		М+m		М+m
Контроль n=30	134,29 +14,03	76,85	15,79 +1,66	9,09	363,9 +23,41	128,25	38,29 +2,39	13,09
+Цп 12,5% (50мкг/мл) n=5	200,94 +38,23	85,48	22,10 +4,11	9,19	407,72 +47,24	105,62	43,70 +4,88	10,91
+Цп 25% (100мкг/мл) n=5	251,97 +34,74 р<0,05	77,68	27,13 +3,56 р<0,05	7,96	368,53 +23,82	53,26	39,66 +2,42	5,42
+Цп 50% (200мкг/мл) n=5	222,47 +29,81 р<0,05	66,66	24,26 +3,13	7,01	395,16 +72,59	162,33	42,05 +7,21	16,12
+Цп 75% (300мкг/мл) n=5	215,39 +62,55	139,87	29,33 +8,93	19,96	463,44 +52,72	117,88	48,19 +5,35	11,95
+Цп 100% (400мкг/мл) n=5	285,77 +38,39 р<0,05	85,86	31,72 +4,53 р<0,05	10,14	530,33 +30,87 р<0,01	69,02	55,09 +3,19 р<0,01	7,15
+Цп 150% (600мкг/мл) n=5	116,64 +30,71	68,66	14,43 +3,38	7,57	419,27 +34,61	77,39	44,28 +3,45	7,71

Примечание. р - показатель различия с контрольной группой по t- критерию.

Таблица 40

Хемилюминисценция цельной крови после 30 - минутной инкубации при 370С с растворами Цп (в пересчете на 105 гранулоцитов)

Показатели / Группа сравнения	Спонтанное свечение	Индуцированное свечение
	Светосумма, у.е. х мин.	Максимальная светимость, у.е.	Светосумма, у.е. х мин.	Максимальная светимость, у.е.
	М+m		М+m		М+m		М+m
Контроль n=30	41,59 +4,82	26,39	4,91 +0,59	3,17	110,84 +7,77	42,58	11,67 +0,80	4,39
+Цп 12,5% (50мкг/мл) n=5	60,67 +14,27	31,92	3,67 +0,99	2,22	120,41 +13,64	30,50	12,88 +1,36	3,04
+Цп 25% (100мкг/мл) n=5	78,39 +12,57 р<0,05	28,12	10,18 +1,95 р<0,05	4,35	113,44 +6,77	15,14	12,22 +0,74	1,65
+Цп 50% (200мкг/мл) n=5	66,71 +6,48 р<0,05	14,49	8,81 +1,46 р<0,05*	3,25	114,52 +12,29	27,41	12,26 +1,15	2,58
+Цп 75% (300мкг/мл) n=5	65,16 +9,40 р<0,05*	21,02	7,31 +0,73 р<0,05	1,64	157,04 +11,65 р<0,05	26,06	16,34 +1,29 р<0,05	2,88
+Цп 100% (400мкг/мл) n=5	91,13 +16,17 р<0,05	36,15	9,65 +0,89 р<0,01	2,01	164,47 +16,58 р<0,05	37,08	17,07 +1,68 р<0,05	3,75
+Цп 150% (600мкг/мл) n=5	29,58 +8,84	19,78	6,63 +1,47	3,29	103,36 +11,99	26,81	10,91 +1,21	2,72

Примечание. р-показатель различия с контрольной группой: при отсутствии обозначений - по критерию Стьюдента, * - критерию Манна-Уитни.

Таблица 41

Изменение показателей спонтанной ХЛ цельной крови

(СС, у.е. х мин/105гранулоцитов) после 30 - минутной инкубации с растворами Цп различных концентраций. Однофакторный дисперсионный комплекс по оценке силы и достоверности влияния. Исследуемый фактор - доза Цп

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=39,96%+7,13% F = 39,96 =5,18 7,13 F = 3283,09 =5,18 633,92 Fкрит=2,28 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	19,698,6	6	3283,09
Случайное (внутригрупповое)	33597,6	53	633,92
Общее	53296,2	59	903,32

Таблица 42

Изменение показателей спонтанной ХЛ цельной крови

(МС, у.е. /105гранулоцитов) после 30 - минутной инкубации с растворами Цп различных концентраций. Однофакторный дисперсионный комплекс по оценке силы и достоверности влияния. Исследуемый фактор - доза Цп

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=30,51%+ 7,87% F = 30,51=3,88 7,87 F = 37,93 =3,88 9,78 Fкрит=2,28 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	227,58	6	37,93
Случайное (внутригрупповое)	518,22	53	9,78
Общее	745,80	59	12,64

Влияние Цп на показатели индуцированной светимости после 30 - минутной инкубации с цельной кровью достоверно, но менее значимо: для СС влияние Цп составляет не менее 2,86% и не более 42,86% от общего влияния всей суммы факторов, а для МС - не менее 2,04% и не более 42,17% (таблицы 43, 44).

Таблица 43

Изменение показателей индуцированной ХЛ цельной крови

(СС, у.е. х мин/105гранулоцитов) после 30 - минутной инкубации с растворами Цп различных концентраций. Однофакторный дисперсионный комплекс по оценке силы и достоверности влияния. Исследуемый фактор - доза Цп

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=22,76%+ 8,74% F = 22,76 =2,60 8,74 F = 3502,37 =2,60 1345,60 Fкрит=2,28 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	21014,21	6	3502,37
Случайное (внутригрупповое)	71317,02	53	1345,60
Общее	92331,23	59	1564,94

Вывод: влияние фактора достоверно с вероятностью >0,95 для всех объектов данной категории. Влияние исследуемого фактора может составить (>0,95) не менее 2,86% и не более 42,86% от общего влияния всей суммы факторов.

Таблица 44

Изменение показателей индуцированной ХЛ цельной крови (МС, у.е./105гранулоцитов) после 30 - минутной инкубации с растворами Цп различных концентраций. Однофакторный дисперсионный комплекс по оценке силы и достоверности влияния. Исследуемый фактор - доза Цп

Разнообразие	Дисперсии (суммы квадратов)	Число степеней свободы	Вариансы (средние квадраты)	2х=22,10%+ 8,82% F = 22,10 =2,51 8,82 F = 35,53 =2,51 14,17 Fкрит=2,28 (при р<0,05)
Факториальное (межгрупповое)	213,37	6	35,53
Случайное (внутригрупповое)	751,26	53	14,17
Общее	964,44	59	16,35

Вывод: влияние фактора достоверно с вероятностью >0,95 для всех объектов данной категории. Влияние исследуемого фактора может составить (>0,95) не менее 2,04% и не более 42,17% от общего влияния всей суммы факторов.

На сновании полученных результатов выявлено, что Цп в диапазоне доз от 12,5% до 100% оказывает однонаправленное стимулирующее влияние на показатели ХЛ цельной крови через возрастание СС и МС независимо от времени контакта с лейкоцитами. Однако, это влияние сразу после добавления Цп выражено в большей степени, чем после 30 минут инкубации крови с растворами Цп. Об этом свидетельствуют результаты дисперсионного анализа: сила влияния дозы Цп на показатели ХЛ сразу после добавления составляет в среднем 54,96% для спонтанного свечения и 47,82% для индуцированного, а после 30 минут инкубации соответственно 39,96% и 22,76%.

Вероятно, как сразу после добавления, так и через 30 минут инкубации с Цп имеет место рецепторное взаимодействие Цп с лейкоцитами. Последнее приводит к увеличению активности внутриклеточных ферментативных систем, реализующих эффекторные функции фагоцитов. Поскольку ХЛ цельной крови, усиленная люминолом, в основном отражает наработку О2 и других АФК фагоцитами, можно предположить, что взаимодействие Цп с рецепторами на цитоплазматической мембране фагоцитов приводит к активации НАДФН - оксидазы и самосборке ферментативного комплекса, осуществляющего перенос электронов с цитозольного НАДФН на О2 с образованием О2 (214, 236). НАДФН - оксидаза структурно и функционально сопряжена с рецепторами, распознающими внешние сигналы, и активируется при связывании лигандов либо в результате неспецифической перестройки мембран (рисунок 4).

Интересен анализ соотношения между показателями спонтанной и индуцированной ХЛ лейкоцитов, то есть % прироста функционального резерва лейкоцитов (таблица 45).

Таблица 45

Влияние Цп на функциональный резерв лейкоцитов (% прироста)

Группы сравнения	Сразу после добавления	Через 30 минут инкубации
	М+m		р	М+m		р
Контроль	717,6+112,0 (n=12)	388,1		242,9+28,0 (n=30)	165,7
+ Цп 12,5 % (n=5)	284,1+17,4	38,9	<0,01	115,2+20,7	46,2	<0,01
+Цп 25,0 % (n=5)	316,6+54,9	122,7	<0,01	53,9+15,1	33,8	<0,001
+Цп 50,0 % (n=5)	450,9+75,2	168,1		136,8+34,6	77,5
+Цп 75,0 % (n=5)	164,9+33,2	74,2	<0,01	170,92+55,6	124,3
+Цп100,0 % (n=5)	170,1+60,5	135,2	<0,001	98,9+28,1	62,9	<0,01
+Цп150,0 % (n=5)	492,7+107,8	241,1		330,2+66,6	148,9

 Церулоплазмин

Рецептор цитоплазматической мембраны

О₂ НАДФН

НАДФН - оксидаза ГМФШ

О₂

НАДФ

Н₂О₂, ОН, О₂¹ ,ОСl

люминол

Рисунок 4. Предполагаемый механизм влияния Цп на генерацию АФК фагоцитами. НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, НАДФН - восстановленная форма НАДФ, h - квант света, ГМФШ - гексозомонофосфатный шунт

Как видно, максимальный % прироста функционального резерва лейкоцитов отмечен в контрольной группе, а его снижение в опытных группах в диапазоне доз 12,5 % - 100 % связано с увеличением спонтанного свечения лейкоцитов. Причем, наиболее значительное снижение этого показателя наблюдается сразу после добавления Цп, что объясняется более выраженным ростом спонтанного свечения лейкоцитов под влиянием Цп на этом этапе эксперимента. При применении дозы 150 % на втором этапе эксперимента имеет место тенденция к увеличению % функционального резерва лейкоцитов за счет снижения спонтанного свечения лейкоцитов.

Таким образом, нами получены весьма интересные данные о влиянии различных доз Цп на базальную активность и функциональный резерв лейкоцитов. С одной стороны, под влиянием Цп в дозах 50% сразу после добавления и 75% после 30 - минутной инкубации наблюдались наиболее значимые изменения функциональной активности лейкоцитов. Применение этих доз Цп приводит к увеличению как спонтанного, так и индуцированного свечения лейкоцитов, то есть имеет место рост и базальной активности, и функционального резерва лейкоцитов. Это находит отражение в показателях % прироста функционального резерва лейкоцитов: наблюдается его снижение. Возможно, это связано с тем, что при различного рода повреждениях концентрация Цп в сыворотке возрастает на 50 - 75 %, а потому именно средние дозы Цп вызывают активацию функциональной активности лейкоцитов. Однако, на обоих этапах эксперимента при применении Цп в дозе 150% имела место тенденция к снижению спонтанной активности лейкоцитов и достоверно уменьшалось индуцированное свечение после 30 - минут инкубации с Цп, что нашло отражение в тенденции к росту % функционального резерва лейкоцитов при применении Цп в дозе 150% по сравнению с другими дозами Цп.

Из вышесказанного вытекает ряд важных моментов по практическому применению различных доз Цп. В зависимости от функциональной активности лейкоцитов при различных патологических состояниях может быть рекомендовано применение разных доз Цп. Большие дозы Цп (150% от физиологической концентрации) могут применяться для ингибирования функциональной активности лейкоцитов, например при острых воспалительных процессах различной этиологии, когда возникает «лейкоцитарная буря» и необходимо ограничивать деструкцию тканей, опосредованную лейкоцитами. Следует отметить, что применение больших доз Цп наряду со снижением базальной активности лейкоцитов не изменяет их функциональный резерв, то есть, что очень важно, сохраняется исходный потенциал функциональной активности клеток.

Применение средних доз Цп (50% - 75% от физиологической концентрации) имеет значение при затяжных воспалительных процессах и других состояниях, сопровождающихся снижением реактивности неспецифического звена защиты организма. Такие дозы Цп могут усиливать функциональную активность лейкоцитов за счет увеличения продукции активных кислородных радикалов, реализующих эффекторные функции фагоцитов.

Итак, в зависимости от применяемой дозы Цп способен вызывать как уменьшение, так и увеличение генерации АФК лейкоцитами, выступая в качестве модулятора их функциональной активности. Результаты проведенного эксперимента, наряду с вышеизложенными, позволяют с полным основанием заключить, что Цп изменяет функциональную активность лейкоцитов при воспалении, влияя на зрелые клетки, находящиеся в периферической крови.

На данном этапе работы не ясным для нас остался только вопрос о самостоятельности влияния Цп на количественный состав и функциональную активность лейкоцитов независимо от какой - либо патологической ситуации. Для ответа на этот вопрос мы изучали воздействие Цп на количество и функцию лейкоцитов в условиях in vivo на интактных крысах.

3.5 Влияние церулоплазмина на количество и функцию лейкоцитов в условиях интактного организма

Первой группе интактных животных Цп вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 30 мг/кг. 30 мг/кг - доза, составляющая 75% от физиологической концентрации Цп в сыворотке. Именно в такой дозе Цп вызывал увеличение базальной активности и функционального резерва лейкоцитов по показателям ХЛ в модельных системах in vitro. Интересен вопрос об эффективности однократного введения Цп, так как в литературе имеются сведения о влиянии однократного введения Цп на эритропоэз у интактных животных (71). Показатели определяли через 30 минут, на 5 и 12 сутки от введения препарата.

В периферической крови не обнаружено достоверных изменений как в общем содержании лейкоцитов, так и в их популяциях в относительных и в абсолютных величинах (таблицы 46, 47).

Таблица 46

Показатели периферической крови крыс при введении Цп интактным животным (30 мг/кг однократно)

Группа животных / Показатели	контроль n=6	30минут n=6	5 сутки n=6	12 сутки n=6
	М+m		М+m		М+m		М+m
Количество лейкоцитов, х 109/л	11,66 +0,18	0,45	11,28 +1,03	2,53	9,89 +0,89	2,18	10,16 +0,64	1,56

Таблица 47

Показатели периферической крови крыс при введении Цп интактным животным (30 мг/кг однократно)

Группа животных / Показатели	Контроль (М+m; ) n=6	30 минут (М+m; ) n=6	5 сутки (М+m; ) n=6	12 сутки (М+m; ) n=6
	%	109/л	%	109/л	%	109/л	%	109/л
Нейтрофилы	П / яд.	3,00+0,68; 1,67	0,35+0,08; 0,20	2,67+0,84;2,07	0,29+0,09; 0,21	2,83+0,65; 1,60	0,29+0,09; 0,21	3,50+0,43; 1,05	0,36+0,06; 0,14
	С / яд.	13,67+2,28; 5,57	1,58+0,25; 0,62	17,17+1,35; 3,31	1,96+0,28; 0,69	12,67+1,65; 4,03	1,20+0,11; 0,27	16,17+1,64; 4,02	1,63+0,16; 0,40
	Всего	16,67+2,11; 5,16	1,94+0,23; 0,57	19,83+1,89; 4,62	2,25+0,32; 0,78	15,50+1,73; 4,23	1,49+0,16; 0,38	19,67+1,68; 4,13	1,99+0,19; 0,46
Эозинофилы	1,33+0,76; 1,86	0,15+0,09; 0,21	1,83+0,54; 1,33	0,19+0,06; 0,14	1,67+0,33; 0,82	0,17+0,04; 0,09	1,00+0,52; 1,26	0,10+0,05; 0,12
Лимфоциты	80,00+2,54; 6,23	9,33+0,36; 0,89	75,83+1,62; 3,97	8,54+0,76; 1,87	79,00+1,86; 4,56	7,83+0,73; 1,78	78,00+1,91; 4,69	7,93+0,55; 1,34
Моноциты	2,00+0,58; 1,41	0,23+0,07; 0,16	2,17+0,48; 1,17	0,24+0,06; 0,14	3,17+0,75; 1,83	0,32+0,08; 0,19	1,33+0,33; 0,82	0,14+0,04; 0,09

Однократное введение Цп не привело к изменению функциональной активности лейкоцитов по показателям ХЛ (таблицы 48, 49), цитохимическим показателям (таблица 50) и фагоцитарной активности лейкоцитов (таблица 51).

Возможно, доза однократно вводимого Цп - 30 мг/кг - слишком мала, чтобы вызвать изменения количественного состава и функциональной активности лейкоцитов у интактных животных. В литературе отсутствуют сведения о подобного рода исследованиях.

Таблица 48

Влияние Цп на показатели хемилюминесценции цельной крови у интактных животных (30 мг/кг однократно)

Показатели/ Группа животных	Спонтанное свечение	Индуцированное свечение
	Светосумма, у.е. х мин	Максимальная светимость, у.е.	Светосумма, у.е. х мин	Максимальная светимость, у.е.
	М+m		М+m		М+m		М+m
Контроль n=6	11,52 +2,18	5,34	1,49 +0,27	0,67	19,98 +2,76	6,76	2,52 +0,36	0,89
30 минут n=6	10,32 +1,99	4,88	1,42 +0,27	0,66	23,29 +2,73	6,68	2,78 +0,46	1,13
5 сутки n=6	11,05 +1,40	3,44	1,75 +0,19	0,47	23,89 +2,31	5,67	3,09 +0,30	0,74
12 сутки n=6	15,19 +1,63	3,99	1,98 +0,25	0,60	22,31 +1,19	2,91	2,59 +0,29	0,72

Таблица 49

Влияние Цп на показатели хемилюминесценции цельной крови в пересчете на 105гранулоцитов у интактных животных (30 мг/кг однократно)

Показатели/ Группа животных	Спонтанное свечение	Индуцированное свечение
	Светосумма, у.е. х мин	Максимальная светимость, у.е.	Светосумма, у.е. х мин	Максимальная светимость, у.е.
	М+m		М+m		М+m		М+m
Контроль n=6	6,25 +1,38	3,37	0,81 +0,18	0,45	11,64 +3,39	8,33	1,48 +0,44	1,08
30 минут n=6	4,34 +0,84	2,07	0,61 +0,11	0,27	10,33 +1,85	4,53	1,18 +0,22	0,54
5 сутки n=6	6,69 +0,58	1,43	1,06 +0,08	0,21	14,69 +1,28	3,13	1,88 +0,13	0,32
12 сутки n=6	6,53 +0,71	1,75	0,87 +0,10	0,25	9,68 +0,87	2,14	1,13 +0,16	0,39

Таблица 50

Цитохимические показатели лейкоцитов периферической крови крыс при введении Цп интактным животным (30 мг/кг однократно)

Группа животных/ Показатели, СЦК (у.е.)	Контроль (n=6)	30 минут (n=6)	5 сутки (n=6)	12 сутки (n=5)
	М+m		М+m		М+m		М+m
Миело-пероксидаза	0,37 +0,07	0,16	0,52 +0,12	0,29	0,21 +0,07	0,17	0,52 +0,24	0,54
Катионные белки	0,87 +0,06	0,29	0,98 +0,05	0,12	0,73 +0,03	0,07	0,92 +0,08	0,18

Таблица 51

Влияние Цп на фагоцитоз лейкоцитов периферической крови у интактных животных (30 мг/кг однократно)

Группа животных/ Показатели	Контроль n=37	30 минут n=5	5 сутки n=5	12сутки n=5
	М+m		М+m		М+m		М+m
Активность фагоцитоза, % клеток	25,46 +0,68	4,12	22,20 +2,35	5,26	25,40 +1,40	3,21	25,60 +0,87	1,95
Интенсивность фагоцитоза, у.е. / клетку	4,01 +0,18	0,95	4,25 +0,25	0,57	4,43 +0,21	0,47	4,61 +0,28	0,62

Выбор дозы Цп второй группе интактных животных определялся следующими моментами. По результатам исследований кафедры патофизиологии ЧГМА известно, что Цп в дозе 10 мг/кг обладает эритропоэтическим эффектом в условиях нормального и стимулированного кроветворения, усиливая пролиферацию и дифференцировку эритроидных элементов в костном мозге независимо от уровня эритропоэтина в крови (71, 82). Кроме того, в литературе имеются сведения о действии длительного введения Цп в дозе 10 мг/кг массы на показатели периферической крови у животных (29).

Интервал введения Цп определялся данными о том, что экзогенно введенный Цп сохраняет свою активность в периферической крови в течение 48 часов и для поддержания постоянного уровня Цп в организме необходимо его вводить через 1 - 3 суток (16, 71).

Учитывая вышеизложенное, второй группе животных Цп вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг через 48 часов семикратно в течение 15 суток. Суммарная доза введенного Цп составила 70 мг/кг. Контрольной группе животных вводили эквивалентное количество физиологического раствора. Показатели определяли на 5,8 и 15 сутки эксперимента.

Применение Цп в дозе 10мг/кг не привело к достоверному изменению общего количества лейкоцитов относительно исходных величин (таблица 52). Достоверно возросло количество палочкоядерных нейтрофилов в относительных цифрах на 8, 15 сутки, в абсолютных - на 5, 8, 15 сутки и общее количество нейтрофилов в относительных цифрах на 15 сутки эксперимента (таблица 53).

Таблица 52

Влияние Цп на количество лейкоцитов в периферической крови у интактных крыс ( 70 мг/кг)

Группа животных / Показатели	контроль n=6	5 сутки n=7	8 сутки n=7	15 сутки n=7
	М+m		М+m		М+m		М+m
Количество лейкоцитов, х 109/л	9,38 +0,87	2,13	11,59 +1,34	3,55	10,74 +0,49	1,31	10,66 +1,16	3,07

Таблица 53

Показатели периферической крови крыс при введении Цп интактным животным ( 70 мг/кг)

Группа животных / Показатели	Контроль (М+m; ) n=6	5 сутки (М+m; ) n=6	8 сутки (М+m; ) n=6	15 сутки (М+m; ) n=6
	%	109/л	%	109/л	%	109/л	%	109/л
Нейтрофилы	П / яд.	2,00+0,45; 1,09	0,18+0,05; 0,12	3,57+0,61; 1,62	0,39+0,07; 0,18*	9,43+1,43; 3,78*	0,79+0,14; 0,37*	7,08+0,47; 1,16*	0,72+0,09; 0,22*
	С / яд.	12,50+1,86; 4,55	1,15+0,16; 0,39	15,86+3,26; 8,63	1,99+0,65; 1,71	10,33+2,04; 5,55	0,82+0,22; 0,58	13,90+1,98; 4,20	1,42+0,29; 0,69
	Всего	14,50+1,82; 4,46	1,33+0,15; 0,38	19,43+3,22; 8,79	2,37+0,69; 1,84	18,57+1,57; 4,16	1,62+0,19; 0,49	20,42+1,82; 4,45*	2,15+0,36; 0,89
Эозинофилы	1,83+0,60; 1,47	0,32+0,13; 0,31	0,71+0,29; 0,76	0,07+0,03; 0,08	0,86+0,14; 0,38	0,08+0,01; 0,04	1,17+0,31; 0,75	0,12+0,03; 0,07
Лимфоциты	83,00+1,69; 4,03	7,78+0,73; 2,97	78,86+3,02; 7,99	9,03+0,88; 2,32	80,00+1,68; 4,43	6,97+0,58; 1,53	77,67+1,74; 4,26	7,94+0,96; 2,35
Моноциты	0,83+0,31; 0,75	0,08+0,04; 0,09	1,00+0,44; 1,15	0,09+0,04; 0,11	0,86+0,26; 0,69	0,09+0,02; 0,06	0,75+0,34; 0,82	0,08+0,04; 0,10

Примечание: * - показатель различия (р<0,05) с контрольной группой по t-критерию.

Проведенный дисперсионный однофакторный анализ показал, что влияние Цп на изменение количества палочкоядерных нейтрофилов достоверно, а сила влияния составляет 66,08%+4,63 % для относительных величин и 53,72%+6,31 % для абсолютных от общего влияния всей суммы факторов (таблицы 54, 55).

Таблица 54

Влияние Цп ( 70 мг/кг) на изменение количества палочкоядерных нейтрофилов (%) у интактных животных. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния