Влияние пентраксинов на продукцию АФК фагоцитами неоднозначно и может быть определено как модуляция: исходно высокий кислородный метаболизм клеток они снижают, а исходно низкие показатели, наоборот, стимулируют (132, 135, 138).

Заметными иммунорегулирующими свойствами обладает б1 - кислый гликопротеин (орозомукоид). Показано, что этот белок супрессирует ответ лимфоцитов на некоторые митогены и клеточно - опосредованную цитотоксичность (317). б1 - кислый гликопротеин снижает активность естественных и антителозависимых киллеров, стимулирует синтез ИЛ - 1в и ИЛ - 1 ra в культурах мононуклеаров периферической крови человека (311, 317, 413). В модельных экспериментах установлено, что сорбция б1 - кислого гликопротеина на нейтрофилах приводит к подавлению продукцию ими АФК (156), а сам белок способен активно активно связывать и транспортировать низкомолекулярные продукты основного характера (157, 159). б1 - кислый гликопротеин - естественный фактор ограничения деструктивных процессов в местах воспалительной реакции (155).

Характер влияния гаптоглобина на функции лейкоцитов свидетельствует о его противовоспалительной активности. Гаптоглобин ингибирует метаболизм нейтрофилов, снижает реакцию моноцитов на хемоаттрактаны, угнетает пролиферативный ответ мононуклеаров крови человека in vitro на митогены и подавляет продукцию антител (363, 364, 388). Гаптоглобин ингибирует также катепсин В (397).

Показано, что влияние гаптоглобина на фагоциты опосредуется интегринами СД 11b / СД 18, с которыми этот РОФ взаимодействует (260). Полагают, что воздействие гаптоглобина на моноциты через интегрины может активировать синтез цитокинов типа ИЛ - 1 и ИЛ - 6 и тем самым влиять на синтез РОФ в печени (275).

Представитель нейтральных РОФ б2 - макроглобулин и особенно его комплексы с активными протеиназами обладают иммуномодулирующими свойствами. Эндоцитоз комплексов сопровождается ингибицией контактных функций макрофагов (снижается экспрессия Iа - антигенов в ответ на ИФНг) и ативацией синтеза и секреции некоторых белков (например, активатора плазминогена). Кроме того, б2 - макроглобулин способен связывать цитокины и ростковые факторы (292).

В регуляции функциональной активности фагоцитов принимают участие матриксные металлопротеиназы (ММР), активность которых возрастает во время воспалительной реакции. В частности, ТНФб - конвертирующий фермент (ТАСЕ) осуществляет шеддинг L - селектина в активированных лейкоцитах, тем самым, регулируя их миграцию и переход в ткань (310, 375, 376, 426).

фагоцит церулоплазмин лейкоцит воспаление

1.5 Церулоплазмин как представитель реактантов острой фазы

Одним из представителей РОФ третьего эшелона является Цп - исключительно активный гликопротеин 2 - глобулиновой фракции сыворотки крови человека и высших позвоночных (148).

Цп кодируется геном СР, находящимся на хромосоме 3 (3q25) и содержащим 19 экзонов. Локус Цп принадлежит к одной группе сцепления с локусом трансферрина (418). Цп имеет довольно высокую гомологию с факторами свертывания V (1q2/F5) и VIII (Xq28/F8C). Предполагают, что все 3 белка являются членами одного и того же мультигенного семейства (146, 147, 149, 242, 442).

Основным местом синтеза Цп являются мембранно - связанные полисомы гепатоцитов (7). Кроме того, Цп может синтезироваться в клетках моноцитарного происхождения: ИФН индуцирует синтез церулоплазминовой мРНК и белка в моноцитах (341). Синтез и секреция Цп гепатоцитами регулируется ионами меди, а индуктором синтеза выступает ИЛ - 6 (7, 216).

Молекула зрелого Цп массой 132 кДа состоит из одной полипептидной цепи, включающей 1046 аминокислотных остатков (8, 147, 408), в которой выделены 6 структурно - функциональных доменов (354, 355, 368, 377, 386, 444). Цп - типичный гликопротеин, на долю углеводного компонента приходится около 8% массы молекулы. Он представлен 9 олигосахаридными цепями, которые содержат глюкозамин, галактозу, мальтозу, фукозу и сиаловые кислоты. На концах углеводных цепей находятся сиаловые кислоты, которые оказывают существенное влияние на физиологические и электрофоретические свойства Цп, но не отражаются на оксидазной активности или абсорбции при 610 нм (146, 160, 262).

В составе Цп находятся 6 - 7 ионов меди (8, 22). Хотя медь в структуре Цп составляет 0,27 - 0,32 % от массы, он содержит 98% всей меди плазмы крови (124, 328).

Нормальное содержание Цп в сыворотке крове человека 0,25 г/л - 0,45 г/л, у крысы - несколько выше (59, 160). Однако Цп крысы заметно не отличается от Цп человека по содержанию меди, молекулярной массе, N-концевым аминокислотам и каталитическим свойствам, что делает крысу удобной моделью для изучения процессов с участием Цп (160).

Основными функциями Цп являются транспорт меди и поддержание ее баланса в организме, фероксидазная, аминоксидазная и супероксиддисмутазная активность.

Белок относится к оксидазам меди, которые содержат 3 разных центра ее связывания: 1 - го типа, или голубой, 2 - го типа, или обычный и 3 - го типа, или бинуклеарный. Одна молекула Цп прочно связывает 6 ионов меди, менее прочно - до 10 атомов. Показано, что лигандами меди в активном центре Цп являются SH-группа цистеина, атомы азота гистидина и остатки метионина (106, 189, 262). Церулоплазмин человека связывает также ионы серебра и снижает их эмбриотоксический эффект (190, 394).

Участвуя в регуляции обмена железа: Fe2+ Fe3+ трансферрин синтез гема, Цп рассматривается как компонент системы антианемических факторов (71, 150, 158, 160). В эксперименте продемонстрирован его эритропоэтический эффект в условиях нормального и стимулированного кроветворения за счет усиления пролиферации и дифференцировки эритроидных элементов в костном мозге (71, 82).

Обладая СОД - активностью, Цп взаимодействует с ОН и О2 (24, 285, 286, 309), а снижение активности СОД при патологических состояниях может компенсироваться увеличением содержания Цп в сыворотке (89). Интересно, что Цп не оказывает какого - либо кинетического влияния на декомпозицию О2 и не катализирует реакцию диспропорционирования как СОД, а взаимодействует с предшественниками кислородных радикалов (392). Цп гораздо более эффективно ингибирует OCl , чем трансферрин, альбумин, СОД или IgG (191, 286), выполняя ведущую роль в защите клеток при лейкоцит - индуцированном окислительном стрессе.

Дисмутируя О2 , Цп является антиоксидантом, препятствующим ПОЛ (27, 58, 101, 210).

Цп может быть также сильным прооксидантным фактором, вызывающим окислительную модификацию липопротеинов низкой плотности (259, 266).

Цп связывается с лактоферрином - железопереносящим белком и аполипопротеином, продуцируемым клетками молочной железы и лейкоцитами крови (445). Поскольку лактоферрин связывает Fe3+ - продукт ферроксидазной активности Цп, считают, что включение Fe3+ в лактоферрин происходит при физическом контакте с Цп.

Особого внимания заслуживают свойства Цп как реактанта острой фазы.

В эксперименте показано, что Цп оказывает антиэкссудативное действие, способствует торможению активации кининовой системы, существенно уменьшает степень альтерации, приводит к ускоренному морфологическому восстановлению тканей в очаге воспаления (104).

В литературе есть сообщения о косвенном антимикробном эффекте Цп. В очаге воспаления лейкоциты усиленно выделяют в среду содержимое своих гранул, в том числе лактоферрин. Повышение уровня Цп с усилением контактной передачи лактоферрину Fe3+ предупреждает использование Fe3+ патогенными микробами (445).

В эксперименте показано, что применение в остром периоде гриппозной инфекции Цп увеличивает резистентность мышей к вирусу гриппа, уменьшает иммунодепрессивное действие вируса и улучшает биохимические показатели (18).

Изучена модулирующая активность Цп в модельной системе выделенных лимфоцитов, установлена зависимость эффекта от его дозы, причем именно малые дозы Цп способствуют иммуностимуляции. Имеются данные о том, что Цп усиливает реакцию бласттрансформации лимфоцитов, повышает уровень цАМФ и снижает уровень цГМФ в иммунокомпетентных клетках мышей-опухоленосителей. Установлены иммуномодулирующие эффекты действия Цп (12, 13, 17, 65, 105).

Цп оказывает стимулирующее влияние на классический путь активации комплемента, а также усиливает «респираторный взрыв» нейтрофилов в системе крови здоровых людей (45). Продемонстрирована одна из функций Цп при воспалении - инактивация свободных радикалов и гипогалоидов, образованных фагоцитами (282, 390).

Применение Цп в остром периоде у больных, перенесших критические состояния, сопровождается защитным действием на клеточное звено иммунитета, ростом спонтанной и стимулированной ХЛ нейтрофилов (14).

Есть сообщения об изменении количественного состава лейкоцитов под влиянием Цп. Так, введение Цп крысам при воздействии радиации приводило к сохранению более высокого уровня лейкоцитов и эритроцитов (16). Отмечены клинические результаты применения Цп при лечении больных с токсической нейтропенией на фоне химиотерапии злокачественных опухолей. У таких больных Цп вызывал увеличение количества нейтрофилов в периферической крови, причем этот эффект был сопоставим с таковым при применении Г-КСФ (55). Кроме того, клинические наблюдения свидетельствуют о повышении показателей периферической крови, в том числе лейкоцитов, при использовании Цп у больных с апластической анемией (395).

Из представленных в обзоре литературы данных следует, что большое внимание многих научных групп уделяется проблеме регуляции неспецифической защиты организма и участию в ней фагоцитов.

Объектом внимания по данному вопросу является, в том числе, РОФ Цп. Однако, в литературе отсутствуют работы, освещающие результаты комплексного подхода по изучению влияния Цп на количественный состав и функциональную активность лейкоцитов в интактном организме и при различных патологических ситуациях, а имеющиеся данные весьма малочисленны и противоречивы. Результаты подобного рода исследований позволили бы выяснить процесс вовлечения Цп в регуляцию неспецифической защиты организма.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 350 белых беспородных крысах и крови 100 здоровых людей - доноров областной станции переливания крови.

Все исследования на животных выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977).

Использовали препарат церулоплазмин (активность - 10 усл. ед. на 1 мг белка), произведенный в НПО «Иммунопрепарат» (г. Уфа). Перед введением препарат церулоплазмин растворяли в стерильном физиологическом растворе.

2.1 Экспериментальные модели

Для изучения роли Цп в условиях in vivo использовали интактных животных (таблица 2) и экспериментальные модели нарушения качественного и количественного состава лейкоцитов. Среди последних выделяли лейкоцитозы:

· асептическое воспаление (таблица 3),

· «невоспалительные» лейкоцитозы в ответ на экзогенный пироген и интоксикацию хлоридом бария (таблица 4);

и лейкопении:

· цитостатическая лейкопения (таблица 5),

· асептическое воспаление на фоне лейкопении (таблица 6).

Влияние Цп на процессы СРО в фагоцитирующих клетках периферической крови людей - доноров областной станции переливания крови изучали в модельных системах in vitro (таблица 7). Исследовали влияние Цп на адгезивную способность лейкоцитов к интактному и активированному эндотелию (таблица 8).

Таблица 2

Схема введения Цп интактным животным

Группа животных	Схема введения Цп	Исследование показателей
1.	Внутрибрюшинно, 30 мг/кг однократно	30 минут, 5 сутки, 12 сутки
2.	Внутрибрюшинно, 10 мг/кг семикратно через 48 часов (суммарная доза 70 мг/кг)	5 сутки, 8 сутки, 15 сутки
3.	Внутрибрюшинно, 30 мг/кг шестикратно через 48 часов (суммарная доза 180 мг/кг)	3 сутки, 5 сутки, 12 сутки

Введение Цп интактным животным осуществляли для решения нескольких поставленных задач. Во - первых, для изучения влияния Цп на изменение количественного состава и функциональной активности лейкоцитов в условиях интактного организма. Во - вторых, для выбора оптимальной дозы Цп, которая могла быть использована в дальнейшем для изучения роли Цп при патологических процессах. В - третьих, для определения самостоятельности влияния Цп на количество и функцию лейкоцитов независимо от какого - либо патологического процесса. Суммарная доза Цп, введенная первой группе интактных животных составила 30 мг/кг (75% от физиологической концентрации Цп в сыворотке крови), второй группе - 70 мг/кг, а третьей - 180 мг/кг. Причем, первоначально изучали эффект однократного введения Цп, а показатели снимали через 30 минут после введения и на 5, 12 сутки, ожидая возможность пролонгированного действия Цп.

Таблица 3

Схема введения Цп при воспалении

Модель эксперимента	Группа животных	Схема введения Цп	Исследование показателей
Асептическое воспаление (1,0 мл скипидара под кожу спины)	Опыт	Внутрибрюшинно, 30 мг/кг двукратно через 6 и 12 часов от индукции воспаления (суммарная доза 60 мг/кг)	3 сутки, 5 сутки
	Контроль	Стерильный физиологический раствор	3 сутки, 5 сутки
Асептическое воспаление (1,0 мл скипидара под кожу спины)	Опыт	Внутрибрюшинно, 60 мг/кг однократно на 3 сутки от индукции воспаления	5 сутки, 8 сутки, 15 сутки
	Контроль	Стерильный физиологический раствор	5 сутки, 8 сутки, 15 сутки.

В качестве модели воспалительного процесса было выбрано асептическое воспаление, которое воспроизводили подкожным введением 1,0 мл скипидара (187). Суммарная доза вводимого Цп составила 60 мг/кг. Причем, первой группе животных Цп вводили в ранние сроки развития воспалительной реакции двукратно (через 6 и 12 часов от индукции воспаления), а второй группе - однократно на 3 сутки. Таким образом, изучали возможность влияния Цп на количество и функцию лейкоцитов в разные сроки воспалительного процесса.

Таблица 4

Схема введения Цп при «невоспалительных» лейкоцитозах

Модель эксперимента	Группа животных	Схема введения Цп	Исследование показателей
Пирогенал внутримышечно 5 мкг/кг однократно	Опыт	Внутрибрюшинно, 60 мг/кг однократно одновременно с введением пирогенала	8 часов, 24 часа
	Контроль	Стерильный физиологический раствор	8 часов, 24 часа
Бариевая интоксикация (BaCl2 подкожно 10 мг/кг через 48 часов в течение 20 суток).	Опыт	Внутрибрюшинно 30 мг/кг на 7, 10 и 13 сутки эксперимента (суммарная доза 90 мг/кг)	11 сутки, 18 сутки, 22 сутки, 30 сутки.
	Контроль	Стерильный физиологический раствор	11 сутки, 18 сутки, 22 сутки, 30 сутки.

Термин «невоспалительные» лейкоцитозы использован для экспериментальных моделей патологических процессов, сопровождающихся развитием лейкоцитоза без альтерации тканей. Первой группе животных вводили экзогенный пироген - пирогенал по методике (165). Пирогенал представляет собой растворимый липополисахарид клеточной стенки Ps. аeruginosa (93). Введение пирогенала приводит к мобилизации костно - мозгового резерва лейкоцитов и развитию лейкоцитарной реакции периферической крови (112, 119, 125, 126). У второй группы животных вызывали бариевую интоксикацию путем подкожного введения хлористого бария в количестве 10 мг на кг массы тела в течение 20 суток. Показано, что бариевая интоксикация приводит к миелоидной гиперплазии костного мозга за счет увеличения продукции КСФ (77, 143).

Таблица 5

Схема введения Цп при лейкопении

Модель экперимента	Группа животных	Схема введения Цп	Исследование показателей
Циклофосфан внутрибрюшинно 250 мг/кг однократно	Опыт	Внутримышечно, 60 мг/кг однократно одновременно с введением циклофосфана	4 сутки, 8 сутки, 12 сутки.
	Контроль	Стерильный физиологический раствор	4 сутки, 8 сутки, 12 сутки.

В качестве модели лейкопении была выбрана цитостатическая лейкопения, которую вызывали внутрибрюшинным введением циклофосфана (3, 40, 41). Для изучения влияния Цп на процессы регенерации лейкопоэза, подавленного цитостатиком, Цп вводили в суммарной дозе 60 мг/кг. Сроки исследования показателей определялись данными литературы о восстановлении лейкопоэза после воздействия цитостатика (39, 41, 192). После этого исследовали роль Цп при воспалительном процессе, протекающем на фоне цитостатической лейкопении.

Таблица 6

Схема введения Цп при воспалении на фоне лейкопении

Модель эксперимента	Группа животных	Схема введения Цп	Исследование показателей
Асептическое воспаление на 3 сутки цитостатической лейкопении (циклофосфан внутрибрюшинно 125 мг/кг однократно)	Опыт	Внутримышечно, 60 мг/кг однократно одновременно с введением циклофосфана	4 сутки, 8 сутки, 11 сутки, 16 сутки.
	Контроль	Стерильный физиологический раствор	4 сутки, 8 сутки, 11 сутки, 16 сутки

Таблица 7

Схема применения Цп в экспериментах in vitro

Модель	Схема применения Цп	Исследование показателей
1.	Цп в дозах 12,5%; 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови добавляли в цельную кровь.	Хемилюминесценция цельной крови сразу после добавления растворов Цп.
2.	Цп в дозах 12,5%; 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови инкубировали 30 минут при 37оС с цельной кровью.	Хемилюминесценция цельной крови после 30 минут инкубации с растворами Цп.

Оценку дозо - зависимого влияния Цп на процессы СРО в фагоцитах изучали in vitro методом ХЛ цельной крови. Показано, что ХЛ цельной крови, усиленная люминолом, отражает способность фагоцитов генерировать активные формы кислорода (15, 60, 61, 176, 177). Применяли следующие дозы препарата (мг/мл): 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; что соответствовало 12,5%; 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от его физиологической концентрации в сыворотке крови.

Таблица 8

Схема применения Цп при изучении адгезии лейкоцитов

Мо-дель	Схема применения Цп	Исследование показателей
1.	Цп в дозах 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови инкубировали 30 минут при 37оС с цельной кровью.	Адгезия лейкоцитов к интактному эндотелию после 30 минут инкубации с растворами Цп.
2.	Цп в дозах 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови обрабатывали эндотелий.	Адгезия лейкоцитов к обработанному Цп эндотелию.
3.	Цп в дозах 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови инкубировали 30 минут при 37оС с цельной кровью.	Адгезия лейкоцитов к активированному гистамином (1550 нмоль/л) эндотелию.
4.	Цп в дозах 25%; 50%; 75%; 100%; 150% от физиологического уровня в сыворотке крови обрабатывали активированный гистамином эндотелий.	Адгезия лейкоцитов к обработанному гистамином (1550 нмоль/л) и Цп эндотелию.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методы исследования количественного состава лейкоцитов

Периферическую кровь для анализа получали из хвостовой вены. Для сбора крови использовали стерильные пластиковые одноразовые пробирки для микропроб. Объем взятой однократно крови не превышал 0,15 мл. В качестве антикоагулянта использовали гепарин из расчета 50 - 75 ЕД / мл крови в соотношении 1:5.

Количество лейкоцитов в периферической крови определяли общепринятым меланжерным методом в камере Горяева (171).

Лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках крови, фиксированных метиловым спиртом и окрашенных азур II-эозином по методу Романовского-Гимза (68, 74, 171). Дифференцированно подсчитывали лейкоциты на 200 клеток с помощью 11-клавишного счетчика с выделением палочкоядерных нейтрофилов, сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов, моноцитов.

Количество клеток выражали в относительных (% клеток) и абсолютных (х109/л) величинах.

% клеток х количество лейкоцитов (109/л)

Абсолютное количество клеток =

100%

Для оценки лейкопоэза проводили морфологический анализ клеток костного мозга (2, 31, 38, 72, 73, 114).

Мазки-отпечатки костного мозга большеберцовых костей фиксировали в метаноле и окрашивали азур II-эозином по методу Романовского-Гимза. Рассчитывали миелограмму на 500 клеток костного мозга с дифференцировкой следующих миелокариоцитов: миелобласты, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты, палочкоядерные нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты, плазмоциты, мегакариоциты.

Количество клеток выражали в относительных (% клеток) и абсолютных (106/100г массы тела) величинах, для этого подсчитывали количество ядросодержащих клеток (ЯСК, 106/бедро, которое пересчитывалось на единицу массы тела - 106/100г массы тела) в костном мозге (198).

% клеток х ЯСК (106/100г массы)

Абсолютное количество клеток =

в костном мозге 100%

Рассчитывалось лейкоэритробластическое отношение, которое выражалсь в долях единицы.

2.2.2 Методы исследования функциональной активности лейкоцитов

Адгезивную способность лейкоцитов изучали по их способности прилипать к эндотелию сосудистой стенки по разработанной оригинальной методике.

У крысы под эфирным наркозом производили срединную тораколапаротомию. Выделяли аорту. Через начальный отдел аорты устанавливали полиэтиленовый катетер, на него накладывали две фиксирующие лигатуры. Через катетер осуществляли забор крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин (50 - 75 ЕД/мл). На уровне начального отдела брюшной аорты устанавливали второй катетер и фиксировали его лигатурой. Функционально активный участок эндотелия аорты имел площадь 75 мм2. Ветви аорты подвергали электрокоагуляции. Проксимальный катетер соединяли с полиэтиленовым резервуаром, в котором находилась цельная гепаринизированная кровь в количестве 1 мл. Движение крови осуществлялось благодаря давлению воздуха в резервуаре, которое создавалось компрессором. Причем, создаваемое таким образом давление крови было близко по значениям к физиологическому и составляло 100+10 мм. рт. ст. Во время манипуляции сосуд орошался теплым физиологическим раствором. Прошедшую через участок сосуда кровь собирали в пластиковую пробирку для микропроб. Продолжительность всей манипуляции составляла 10 - 12 минут. Подсчитывали общее количество лейкоцитов и лейкоформулу до и после адгезии и вычисляли % адгезии лейкоцитов и их популяций

Необходимо отметить, что в настоящее время не существует стандартизированных методов оценки адгезии лейкоцитов. Известные модификации принципиально отличаются по объекту, к которому происходит адгезия: нейлоновое волокно, стекло и др (50, 56). Разработанный нами метод оценки адгезивной способности лейкоцитов является наиболее приближенным к физиологическим условиям: в качестве объекта адгезии выбрана эндотелиальная стенка, давление потока крови было постоянным и приближалось по своим значениям к физиологическому.

Фагоцитарную способность лейкоцитов оценивали по способности поглощать частицы монодисперсного (Ш 1,7 мкм) полистирольного латекса (180).

В ячейку иммунологического планшета помещали 0,1 мл цельной гепаринизированной крови и добавляли 0,1 мл взвеси стандартных частиц латекса в концентрации 108 частиц/мл, инкубировали в термостате при 370С 30 минут. Приготовленные мазки фиксировали метанолом, окрашивали азур II-эозином по методу Романовского-Гимза. Под иммерсионной микроскопией после подсчета 200 клеток учитывали активность фагоцитоза - число фагоцитов, содержащих частицы латекса в цитоплазме (% клеток) и интенсивность фагоцитоза - число частиц латекса в подсчитанных клетках в пересчете на 1 клетку (у.е./клетку).

Цитохимическими методами определяли внутриклеточное содержание миелопероксидазы и катионных белков в гранулоцитах.

Миелопероксидазу определяли по методу Грехема-Кнолля (100, 186).

Мазки крови, фиксированные в парах спирта-формалина, заливали на 5 минут реактивом следующего состава:

6 мл 96% спирта,

бензидин на кончике ножа,

4 мл дистиллированной воды,

0,02 мл 3% раствора Н2О2.

Затем промывали в проточной воде 2 минуты и докрашивали азур II - эозином по методу Романовского - Гимза. Под иммерсионной микроскопией учитывали пероксидазопозитивные клетки (содержащие гранулы от светло - желтого до темно - коричневого цвета), которые делили на 4 группы:

0 - отсутствие гранул в цитоплазме,

1 - 1/3 площади цитоплазмы заполнена гранулами,

2 - до 2/3 цитоплазмы заполнено гранулами,

3 - вся цитоплазма заполнена гранулами.

Всего подсчитывали 100 нейтрофилов. Результат выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК):

0А+1В+2С+3Д

СЦК = , у.е.,

100

где А, В, С, Д - число клеток соответственно 0, 1, 2, 3 групп.

Катионные белки гранулоцитов определяли по методу Пигаревского (121 - 123 ).

Высушенные на воздухе мазки крови погружали на 15-20 мин. в забуференный спиртовой раствор прочного зеленого с рН 8,15. Затем препараты ополаскивали в двух сменах дистиллированной воды. Ядра докрашивали 0,1% раствором сафранина.

Спиртовой раствор красителя готовили на метаноловом буфере трис-соляная кислота с конечной величиной рН 8,1 - 8,2. Для этого 0,8г сухого порошка три(оксиметил) - аминометана (НПО «Биохимреактив») растворяли в 50 мл метилового спирта и к полученному раствору добавляли 47,3 мл дистиллированной воды и 2,75 мл 1н. соляной кислоты, которую готовили из фиксанала. В приготовленном метаноловом трис-буфере растворяли 0,1г сухого красителя прочного зеленого (Colour index 42053). Получали 0,1%-ный раствор прочного зеленого в 50%-ном метиловом спирте, забуференном до рН 8,1 - 8,2.

Под иммерсионной микроскопией учитывали клетки с гранулами, окрашенными в различные оттенки зеленого цвета, которые делили на 4 группы:

0 - отсутствие окраски цитоплазмы или ее слабое окрашивание до 2/3 площади цитоплазмы, или средней интенсивности окраска до 1/3 площади;

1 - слабо окрашена (бледно-зеленые гранулы) вся цитоплазма или средняя интенсивность окраски (светло-зеленые гранулы) до 2/3 площади цитоплазмы, или сильная окраска до 1/3 площади (темно-зеленые гранулы);

2 - вся цитоплазма заполнена гранулами средней интенсивности окраски или сильная окраска до 2/3 цитоплазмы;

3 - вся цитоплазма заполнена темно-зелеными гранулами.

После подсчета 100 клеток определяли СЦК (у.е.) по описанной выше формуле.

О генерации АФК фагоцитами судили по интенсивности хемилюминесценции цельной крови, усиленной люминолом (60, 176).

Регистрацию ХЛ осуществляли аппаратом «Хемилюминомер-003» с компьютерным обеспечением и выводом хемилюминограмм на принтер. ХЛ цельной крови изучали по методу (176). К 2 мл забуференного физиологического раствора (20мМ КН2РО4, 105 мМ КСl на 1л дистиллированной воды, рН 7,5 ед.) с растворенным в нем люминолом (0,1 х 10-5 М) добавляли 0,1 мл крови. Кювету помещали в камеру прибора, где поддерживалась постоянная температура 370С и регистрировали запись в течение 10 минут. Затем пробу инкубировали 60 минут при 370С в стеклянном стаканчике, к стеклянной поверхности которого происходила адгезия лейкоцитов и активация внутриклеточного метаболизма. Таким образом изучали спонтанную и индуцированную светимость лейкоцитов. Запись свечения осуществляли также в течение 10 минут.

Подсчитывали светосумму свечения (СС, у.е. х мин) и максимальную светимость (МС, у.е.). Полученные результаты выражали в единицах (у.е.) по отношению к эталону свечения, суммарный световой поток которого составлял 5,2х105 квант/с. Об активности отдельной клетки судили, пересчитывая результаты на 105 гранулоцитов в исследуемой пробе.

2.2.3 Биохимические методы

Определение активности церулоплазмина.

Активность Цп определяли по методу Тэна Э.В. (175). В пробирку вносили 0,1 мл сыворотки крови, 1 мл 0,4М ацетатного буфера (рН 5,6), 0,5 мл 1%-ного водного раствора п-фенилендиамина солянокислого. Ставили на 10 минут на водяную баню при температуре 600С, реакцию останавливали добавлением 3,5 мл охлажденного 25%-ого раствора гидроксида натрия. Полученную жидкость калориметрировали при длине волны 440 нм. В контрольной пробирке компоненты смешивали также, но раствор гидроксида натрия добавляли до нагрева фермент-субстратной смеси. Активность Цп измеряли в единицах оптической плотности.

2.2.4 Статистическая обработка результатов

Результаты проведенных исследований обрабатывали на ПЭВМ IBM PC/AT прикладными статистическими программами, используемыми в биологии и медицине. Учитывались и анализировались следующие основные параметры: среднее арифметическое значение (М), ошибка среднего арифметического (m) и среднее квадратичное отклонение (). Оценка достоверности различий сравниваемых показателей проводилась с использованием t - критерия Стьюдента, когда распределение подчинялось нормальному закону, и непараметрических критериев - в случаях отклонения распределения от нормального (36, 128).

При анализе данных использовался метод дисперсионного однофакторного анализа, позволяющий определить степень и силу влияния какого - либо фактора на величину исследуемых показателей (127).

Глава 3. Патофизиологическая роль церулоплазмина при воспалении

3.1 Влияние церулоплазмина на количественный состав и фагоцитарную функцию лейкоцитов при асептическом воспалении

Воспалительные процессы различной этиологии сопровождаются появлением в организме реактантов острой фазы. В настоящее время РОФ рассматриваются как маркеры наличия и распространенности воспалительного процесса, а также динамики его в ходе лечения. Функции отдельных РОФ точно не установлены, но в целом считается, что они вмешиваются в воспалительную реакцию как настоящие регуляторы. Это осуществляется путем их взаимодействия с лигандами различного происхождения и образования комплексов, очищение которых происходит в клетках мононуклеарной фагоцитарной системы или гепатоцитах. РОФ, таким образом, способствуют инактивации протеаз, токсичных молекул, супероксидных ионов, эвакуации обломков мембран лейкоцитов и др. (51, 111, 261).

Цп относится к третьей группе острофазных белков, его концентрация через 48 - 72 часа после повреждения увеличивается на 40 - 50 % (9, 258). Вероятно, повышение уровня Цп через 48 - 72 часа после воздействия повреждающего агента связано не только с кинетикой его синтеза в гепатоцитах под влиянием ИЛ - 1 и ИЛ - 6, но и с его патофизиологической ролью в ходе воспалительного процесса. Последняя может быть обусловлена, в том числе, его влиянием на количественный состав и функциональную активность лейкоцитов.

Первоначально изучали динамику активности Цп в сыворотке крови при асептическом воспалении. Результаты представлены в таблице 9. Активность Цп в сыворотке на 3 сутки воспалительного процесса возросла на 34 %, а на 5 сутки на 22 % по сравнению с интактными животными.

Таблица 9

Активность Цп в сыворотке крови при асептическом воспалении

Группы животных / Показатель	Интактные животные n=12	Воспаление
		3 сутки n=7	5 сутки n=7
	М+m		М+m		М+m
Активность Цп, усл. ед.	72,09+2,84	9,42	96,71+8,76 р<0,05	23,17	88,14+2,01 р<0,001	5,30

Примечание. р - достоверность различий с группой интактных животных по t - критерию.

Первой группе животных Цп вводили внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг двукратно через 6 и 12 часов после индукции асептического воспаления. 30 мг/кг - доза, составляющая 75% от физиологического уровня Цп в сыворотке крови. Суммарная доза введенного Цп составила 60 мг/кг. Показатели изучали на 3 и 5 сутки эксперимента и сравнивали с группой контрольных животных, которой на фоне асептического воспаления вводили стерильный забуференный физиологический раствор.

Цп вводился через непродолжительное время от воздействия флогогенного фактора, поскольку мы предполагали, что возможный механизм его действия связан с ограничением альтерации в очаге воспаления за счет количественной и качественной перестройки лейкоцитов.

У контрольных животных с воспалением на 3 сутки отмечена тенденция, а на 5 сутки достоверное увеличение общего количества лейкоцитов в периферической крови (таблица 10). На 3 и 5 сутки эксперимента зафиксирован рост содержания нейтрофилов за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм в относительных и абсолютных величинах, а также относительная перераспределительная лимфоцитопения (таблицы 11, 12).

Применение Цп на фоне воспаления у животных опытной группы привело к снижению общего количества лейкоцитов в периферической крови на 5 сутки эксперимента (таблица 10). На 3 и 5 сутки наблюдалось уменьшение в периферической крови клеток нейтрофильного ряда за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм в относительных и абсолютных величинах (таблицы 11, 12).

Кроме изменения количественного состава в ходе воспалительного процесса нами отмечены изменения функциональной активности лейкоцитов на клеточном уровне, в частности фагоцитарной функции (таблица 13). Так, в контрольной группе активность фагоцитоза возросла на 3 и 5 сутки эксперимента, а интенсивность - на 5 сутки. На фоне применения Цп отмечено снижение активности фагоцитоза на 3 сутки, что может быть связано с меньшим количеством фагоцитирующих клеток в периферической крови у животных опытной группы. Интенсивность фагоцитоза на 3 сутки эксперимента, а также показатели фагоцитоза на 5 сутки эксперимента достоверно не отличались от показателей в контрольной группе, но были выше, чем у группы интактных животных.

Таблица 10

Влияние Цп на количество лейкоцитов в периферической крови крыс при воспалении (х 109 /л, М+m; )

Группа 1 Интактные n=12	Группа 2 Воспаление (контроль) n=7	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
	3 сутки	5 сутки	3 сутки	5 сутки
10,91+0,96; 2,84	13,89+2,38; 6,30	13,74+0,99; 2,61 р1-2<0,05	8,79+0,63; 1,41	9,01+0,67; 1,49 р2-3<0,05

Примечание: р - показатель различия между группами по t - критерию.

Таблица 11

Влияние Цп на показатели периферической крови крыс при воспалении (М+m; )

Показатели, % клеток	Группа 1 Интактные крысы n=12	Группа 2 Воспаление (контроль) n=7	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
		3 сутки	5 сутки	3 сутки	5 сутки
Нейтрофилы	П / яд.	5,75+0,65; 2,26	8,57+1,23; 3,26	11,71+1,08; 2,87*	6,20+1,49; 3,35	7,20+0,49; 1,09**
	С / яд.	15,33+1,43; 4,96	29,14+4,06; 10,76*	22,57+2,07; 5,47*	19,60+1,43; 3,21**	13,40+1,40; 3,13**
	Всего	21,08+1,84; 6,36	37,71+4,51; 11,94*	34,29+2,36; 6,24*	25,80+2,85; 6,38**	20,60+1,44; 3,21**
Эозинофилы	0,75+0,18; 0,62	1,00+0,44; 1,15	0,57+0,29; 0,79	0,60+0,24; 0,55	0,40+0,24; 0,55
Лимфоциты	77,63+1,95; 6,75	61,00+4,79; 12,69*	64,86+2,43; 6,44*	72,60+3,44; 7,70	78,40+1,03; 2,30**
Моноциты	0,54+0,14; 0,49	0,29+0,18 0,49	0,29+0,18; 0,49	1,00+0,54 1,22	0,60+0,40 0,89

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами ( р2-3) по t- критерию.

Таблица 12

Влияние Цп на показатели периферической крови крыс при воспалении (М+m; )

Показатели, х 109 / л	Группа 1 Интактные крысы n=12	Группа 2 Воспаление (контроль) n=7	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
		3 сутки	5 сутки	3 сутки	5 сутки
Нейтрофилы	П / яд.	0,62+0,08; 0,27	1,09+0,12; 0,32*	1,62+0,19; 0,53*	0,51+0,08; 0,18**	0,65+0,07; 0,15**
	С / яд.	1,65+0,16; 0,55	4,32+1,26; 3,33*	3,13+0,42; 1,11*	1,69+0,08; 0,18**	1,19+0,01; 0,23**
	Всего	2,23+0,22; 0,76	5,42+1,33; 3,52*	4,76+0,56; 1,48*	2,21+0,11; 0,24**	1,84+0,12; 0,28**
Эозинофилы	0,08+0,02; 0,07	0,17+0,11; 0,29	0,08+0,04; 0,11	0,05+0,02; 0,05	0,03+0,02; 0,05
Лимфоциты	8,59+0,72; 2,49	8,36+1,31; 3,46	8,86+0,59; 1,58	6,45+0,69; 1,55*	7,07+0,58; 1,29
Моноциты	0,06+0,02; 0,07	0,18+0,16; 0,43	0,04+0,03; 0,08	0,08+0,04; 0,08	0,06+0,04; 0,09

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами ( р2-3) по t- критерию.

Таблица 13

Влияние Цп на фагоцитоз лейкоцитов периферической крови крыс при воспалении (М+m; )

Группа животных / Показатели фагоцитоза	Группа 1 Интактные крысы n=37	Группа 2 Воспаление (контроль) n=7	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
		3 сутки	5 сутки	3 сутки	5 сутки
Активность, % клеток	25,46+0,68; 4,12	41,80+ 1,59; 3,56 р1-2 < 0,05	34,40+1,25; 2,79 р1-2 < 0,05	35,80+1,28; 2,86 р1-2 < 0,05 р2-3 < 0,05	35,40+1,63; 3,65 р1-2 < 0,05
Интенсив-ность, у.е./клетку	3,78+0,16; 0,95	5,24+0,71; 1,59	5,38+0,56; 1,26 р1-2 < 0,05	4,54+0,41; 0,91	4,52+0,23; 0,52 р1-2 < 0,05

Примечание. р - достоверность различий между группами по t-критерию.

Итак, двукратное применение Цп в суммарной дозе 60 мг/кг при асептическом воспалении приводит к снижению количества циркулирующих нейтрофилов, а интенсивность фагоцитоза при этом не изменялась.

На данном этапе исследования у нас возник вопрос об эффективности однократного применения Цп в той же суммарной дозе (60 мг/кг). Кроме того, интересным представлялось изучить влияние Цп на количественный состав и функциональную активность лейкоцитов во время его максимального содержания в сыворотке крови при воспалении, то есть на 3 сутки от индукции воспалительного процесса. Поэтому второй группе животных с асептическим воспалением Цп вводили по следующей схеме: 60 мг/кг внутрибрюшинно однократно на 3 сутки от индукции воспалительного процесса. Показатели определяли на 5, 8 и 15 сутки.

В контрольной группе животных воспаление сопровождалось лейкоцитозом, увеличением количества палочкоядерных и сегментоядерных форм нейтрофилов, относительной перераспределительной лимфоцитопенией на 5 - 8 - 15 сутки эксперимента и относительной эозинопенией на 5 сутки (таблицы 14 - 16). В опытной группе животных применение Цп при воспалении привело к уменьшению общего количества лейкоцитов на 5, 8 и 15 сутки за счет клеток нейтрофильного ряда.

На 5 - 8 - 15 сутки воспаления возросла активность и интенсивность фагоцитоза лейкоцитов периферической крови. Применение Цп на 5 сутки эксперимента приводило к снижению активности фагоцитоза до уровня интактных животных, но интенсивность фагоцитоза при этом возросла (таблица 17). В другие сроки эксперимента показатели фагоцитоза достоверно не отличались от контрольной группы, несмотря на то, что количество фагоцитирующих клеток в опытной группе было ниже, чем в контрольной.

Таблица 14

Влияние Цп на количество лейкоцитов в периферической крови крыс при воспалении (х 109 / л, М+m; )

Группа 1 Интактные крысы n=9	Группа 2 Воспаление (контроль) n=5	Группа 3 Воспаление +Цп (опыт) n=6
	5 сутки	8 сутки	15 сутки	5 сутки	8 сутки	15 сутки
11,86 +1,11; 3,32	17,75 +1,76; 3,93 р1-2<0,01	17,56 +1,69; 3,77 р1-2<0,01	20,02 +1,67; 3,77 р1-2<0,01	11,58 +1,31; 3,22 р2-3<0,05	12,73 +1,22; 2,98 р2-3<0,05	14,28 +1,81; 4,44 р2-3<0,05

Примечание: р - показатель различия между группами по t - критерию.

Таблица 15

Влияние Цп на показатели периферической крови крыс при воспалении (М+m; )

Показатели, %	Группа 1 Интактные крысы n=9	Группа 2 Воспаление (контроль) n=5	Группа 3 Воспаление +Цп (опыт) n=6
		5 сутки	8 сутки	15 сутки	5 сутки	8 сутки	15 сутки
Нейтрофилы	П / яд.	2,45+0,45; 1,51	3,60+0,68; 1,52	6,00+1,14; 2,55*	11,40+1,75; 3,91*	2,33+0,42; 1,03	2,50+0,34; 0,84**	3,50+0,50; 1,22**
	С / яд.	10,00+1,34; 4,45	18,48+2,48; 5,55*	24,80+2,46; 5,49*	20,00+1,58; 3,54*	12,83+1,76; 4,31	9,67+0,61; 1,51**	9,17+0,75; 1,83**
	Всего	12,45+1,65; 5,47	22,00+2,41; 5,39*	30,80+1,93; 4,32*	31,40+0,60; 1,34*	15,17+1,62; 3,97**	12,17+0,65; 1,60**	12,67+0,67; 1,63**
Эозинофилы	2,36+0,39; 1,29	1,20+0,20; 0,45*	1,20+0,37; 0,84	1,60+0,40; 0,89	1,00+0,37; 0,89*	0,83+0,40; 0,98*	2,50+0,50; 1,22
Лимфоциты	85,00+1,59; 5,29	76,60+2,25; 5,03*	68,00+2,19; 4,89*	67,00+0,63; 1,41*	83,67+1,80; 4,41**	87,00+0,97; 2,37**	84,67+0,71; 1,75**
Моноциты	0,18+0,12; 0,40	0,20+0,20; 0,45	0	0	0,14+0,14; 0,38	0	0,17+0,17; 0,41

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами ( р2-3) по t- критерию.

Таблица 16

Влияние Цп на показатели периферической крови крыс при воспалении (М+m; )

Показатели, х 109 / л	Группа 1 Интактные крысы n=9	Группа 2 Воспаление (контроль) n=5	Группа 3 Воспаление +Цп (опыт) n=6
		5 сутки	8 сутки	15 сутки	5 сутки	8 сутки	15 сутки
Нейтрофилы	П / яд.	0,34+0,08; 0,27	0,68+0,21; 0,47	1,01+0,14; 0,32*	2,28+0,40; 0,89*	0,26+0,06; 0,14	0,30+0,04; 0,09**	0,48+0,07; 0,18**
	С / яд.	1,31+0,20; 0,68	3,16+0,42; 0,95*	4,32+0,47; 1,05*	3,83+0,31; 0,69*	1,48+0,24; 0,58**	1,22+0,13; 0,32**	1,36+0,25; 0,61**
	Всего	1,65+0,27; 0,91	3,84+0,52; 1,17*	5,33+0,34; 0,77*	5,80+0,32; 0,72*	1,74+0,23; 0,56**	1,52+0,11; 0,28**	1,84+0,29; 0,71**
Эозинофилы	0,28+0,04; 0,13	0,20+0,03; 0,06	0,21+0,06; 0,14	0,31+0,07; 0,16	0,11+0,04; 0,10	0,10+0,06; 0,14	0,34+0,07; 0,17
Лимфоциты	11,13+1,05; 3,47	13,44+1,56; 3,48	12,02+1,48; 3,30	13,45+1,25; 2,79	9,71+1,13; 2,78	11,11+1,12; 2,73	12,09+1,54; 3,76
Моноциты	0,02+0,01; 0,05	0,05+0,05; 0,11	0	0	0,02+0,02; 0,05	0	0

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами ( р2-3) по t- критерию.

Таблица 17

Влияние Цп на фагоцитоз лейкоцитов периферической крови крыс при воспалении (М+m; ).

Группа животных / Показатели фагоцитоза	Группа 1 Интактные крысы n=11	Группа 2 Воспаление (контроль) n=5	Групп 3 Воспаление +Цп (опыт) n=5
		5 сутки	8 сутки	15 сутки	5 сутки	8 сутки	15 сутки
Активность, % клеток	23,00+0,74; 2,45	29,40+1,83 4,09 р1-2<0,05	31,20+1,16 2,59 р1-2<0,001	27,00+0,71 1,58 р1-2<0,01	23,67+1,02 2,50 р2-3<0,05	30,00+1,63 4,00 р1-3<0,01	25,00+1,14 2,55
Интенсивность, у.е. / клетку	3,45+0,26; 0,85	5,30+0,32 1,17 р1-2<0,01	6,73+0,42 0,95 р1-2<0,01	5,15+0,16 0,35 р1-2<0,001	6,31+0,31 0,77 р1-3<0,001 р2-3<0,05	6,01+0,31 0,76 р1-3<0,01	4,74+0,23 0,52 р1-3<0,01

Примечание. р - показатель различия между группами по t-критерию.

Таким образом, применение Цп при воспалении в суммарной дозе 60 мг/кг независимо от схемы применения приводит к снижению количества лейкоцитов в периферической крови за счет клеток нейтрофильного ряда, причем как молодых, так и зрелых форм нейтрофилов. Нами отмечено, что Цп при воспалении изменяет фагоцитарную функцию лейкоцитов: снижает активность, но увеличивает интенсивность фагоцитоза.

Однако, полученные результаты вызвали у нас целый ряд вопросов. Во - первых, почему Цп при воспалении приводит к снижению количества лейкоцитов ? Во - вторых, каков механизм изменения фагоцитарной функции лейкоцитов под влиянием Цп ?

Количественная перестройка лейкоцитов периферической крови может быть связана с несколькими причинами: влиянием Цп на пролиферативную активность белого ростка костного мозга, процессы выхода зрелых клеток из костного мозга в периферическую кровь, изменением адгезивной способности лейкоцитов и /или эндотелиальных клеток. Для проверки первой гипотезы мы изучали влияние Цп на процессы костномозгового кроветворения при воспалении. Результаты представлены в таблицах 18,19.

В костном мозге у контрольных животных наблюдалась увеличение пролиферативной активности клеток гранулоцитарного ростка на 5 сутки от индукции воспалительного процесса. При этом, увеличивалось количество незрелых (промиелоциты, миелоциты) и зрелых (сегментоядерные нейтрофилы, базофилы) форм гранулоцитов как в относительных, так и в абсолютных величинах. Отмечено уменьшение содержания лимфоцитов и ЯСК эритроидного ряда (таблицы 5,6). Интересно, что в костном мозге у животных опытной группы на 5 сутки зафиксировано повышение количества ЯСК и еще большая стимуляция гранулоцитопоэза, чем у контрольных животных: увеличение общего количества клеток нейтрофильного ряда за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм, рост лейкоэритробластического отношения (таблицы 18,19). Кроме того, имело место увеличение содержания лимфоцитов в костном мозге. Цп, таким образом, проявлял эффект, подобный лейкопоэтическому, в условиях стимулированного кроветворения. В работе (71) показан эритропоэтический эффект Цп в условиях нормального и стимулированного кроветворения при его применении в дозе 10 мг/кг. В данном эксперименте нами не зафиксировано влияния Цп на эритропоэз. Однако, необходимо учитывать, что Цп вводился нами по другой схеме и при другой патологической ситуации - на фоне воспалительного процесса, когда имеет место продукция цитокинов с лейкопоэтическимим свойствами (ИЛ - 1, ИЛ - 6 и др.). Цп, возможно, оказывает стимулирующее влияние на пролиферацию ранних - клеток предшественников лейкопоэза в костном мозге, а позднее цитокины с лейкопоэтическими свойствами определяют направление дифференцировки. Такое предположение высказано нами на основании данных, свидетельствующих о гемопоэтических свойствах Цп, направленных на эритроидный и мегакариоцитарный ростки кроветворения (54, 71). Это позволяет предположить, что мишенями для Цп являются ранние клетки - предшественники гемопоэза.

Примечательно, что применение Цп при воспалении, несмотря на стимуляцию лейкопоэза, приводит к снижению количества нейтрофилов в периферической крови. Полученный факт, вероятно, связан с влиянием Цп на адгезивную и/или миграционную способность лейкоцитов периферической крови при воспалении, что может приводить к усилению эффекта аккумуляции лейкоцитов в очаге воспаления. Как известно, очаг воспаления не является пассивным отражением событий, происходящих в костном мозге и периферической ткани. А количество лейкоцитов в циркулирующем пуле периферической крови не отражает их истинное содержание в организме и распределение по основным компартаментам при воспалении. Кроме того, следует учитывать фазный характер активации гранулоцитопоэза при воспалении и возможность влияния Цп на нейрогуморальные механизмы перераспределительных реакций и активации лейкопоэза, обеспечивающих лейкоцитоз и участвующих в поддержании инфильтрации очага воспаления (97, 192).

Таблица 18

Влияние Цп на показатели морфологического исследования костного мозга крыс при воспалении на 5 сутки эксперимента

Группа животных / Показатели, % клеток	Группа 1 Интактные крысы n=8	Группа 2 Воспаление (контроль) n=5	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
	М+m		М+m		М+m
Миелобласты	1,40+0,28	0,80	0,85+0,28	0,62	0,68+0,19	0,41
Промиелоциты	0,30+0,08	0,24	1,15+0,28*	0,62	0,72+0,21	0,46
Миелоциты	3,00+0,53	1,50	5,35+0,41*	0,91	3,81+0,44	0,99
Метамиелоциты	7,43+0,76	2,14	9,30+1,05	2,36	4,76+0,69*,**	1,56
П/яд. нейтрофилы	13,80+0,59	1,66	13,15+0,85	1,90	13,64+0,38	0,84
С/яд. нейтрофилы	11,20+1,39	3,95	23,85+2,29*	5,12	38,99+4,47*,**	9,99
Все нейтрофилы	37,00+1,71	4,85	53,65+2,34*	5,24	62,60+4,49*	10,05
Эозинофилы	8,68+0,88	2,49	8,25+0,58	1,29	7,28+0,91	2,03
Базофилы	0,28+0,11	0,32	0,80+0,11*	0,24	0,68+0,15	0,33
Моноциты	3,08+0,58	1,65	3,70+0,46	1,06	2,04+0,48**	1,07
Лимфоциты	12,90+1,61	4,54	5,60+1,00*	2,25	8,48+1,64	3,66
Мегакариоциты	0,38+0,08	0,19	0,35+0,04	0,09	0,72+0,32	0,72
Плазмоциты	0,18+0,07	0,23	0,40+0,09	0,20	0,40+0,12	0,26
ЯСК эритр. ряда	37,43+2,11	5,98	27,25+2,85*	6,38	17,96+3,02*,**	6,76
Лейко / эритро	1,71+0,17	0,49	2,95+0,57	1,27	5,26+1,28* **(U)	2,87

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами (р2-3) по t-критерию (U - критерий Манна-Уитни).

Таблица 19

Влияние Цп на показатели морфологического исследования костного мозга крыс при воспалении на 5 сутки эксперимента

Группа животных / Показатели, х 106/100 г массы тела	Группа 1 Интактные крысы n=8	Группа 2 Воспаление (контроль) n=5	Группа 3 Воспаление + Цп (опыт) n=5
	М+m		М+m		М+m
ЯСК	57,63+2,27	6,42	54,32+3,09	7,99	76,64+2,67*, **	5,97
Миелобласты	0,82+0,17	0,48	0,43+0,12	0,26	0,54+0,16	0,36
Промиелоциты	0,18+0,05	0,14	0,63+0,17*	0,38	0,54+0,14*	0,32
Миелоциты	1,69+0,35	0,99	2,92+0,29*	0,66	2,91+0,32	0,73
Метамиелоциты	4,35+0,46	1,31	5,10+0,71	1,59	3,69+0,63	1,41
П/яд. нейтрофилы	7,94+0,34	0,95	7,08+0,51	1,13	10,43+0,28*, **	0,62
С/яд. нейтрофилы	6,64+1,05	2,96	12,65+0,60*	1,35	29,89+3,57*, **	7,98
Все нейтрофилы	21,53+1,69	4,79	28,83+0,95*	2,11	47,99+3,77*, **	8,43
Эозинофилы	4,96+0,49	1,38	4,46+0,36	0,81	5,62+0,82	1,84
Базофилы	0,17+0,07	0,21	0,43+0,05*	0,12	0,51+0,09*	0,22
Моноциты	1,78+0,34	0,97	1,94+0,16	0,36	1,55+0,35	0,77
Лимфоциты	7,37+0,97	2,74	3,04+0,60*	1,35	6,45+1,19**	2,67
Мегакариоциты	0,21+0,04	0,10	0,19+0,03	0,06	0,55+0,24	0,53
Плазмоциты	0,10+0,04	0,11	0,23+0,06*	0,13	0,18+0,08	0,18
ЯСК эритроидного ряда	21,40+1,13	3,20	15,21+2,15*	4,81	13,81+2,49*	5,57

Примечание. * - достоверность различий с интактными животными (р1-2, р1-3), ** - между опытной и контрольной группами (р2-3) по t-критерию.

Итак, нами получены, на первый взгляд, противоречивые данные о влиянии Цп на количественный состав лейкоцитов в ходе воспалительной реакции: в периферической крови отмечено снижение количества лейкоцитов, а в костном мозге - усиление пролиферативной активности гранулоцитарного ростка. Мы предположили, что Цп может влиять на адгезивную способность лейкоцитов и/или эндотелиальных клеток и посредством этого изменять количественный состав лейкоцитов в циркулирующем пуле периферической крови. Поэтому на следующем этапе исследования мы поставили перед собой задачу исследовать в эксперименте роль Цп в процессе адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам сосудистого русла.

3.2 Влияние церулоплазмина на адгезивные свойства лейкоцитов и эндотелия

На первом этапе эксперимента к цельной крови добавляли растворы Цп различных концентраций (мкг/мл): 100,0; 200,0; 300,0; 400,0; 600,0; что соответствовало 25%, 50%, 75%, 100%, 150% от физиологической концентрации. После инкубации в условиях термостата при 37ОС в течение 30 минут изучали адгезивную способность лейкоцитов. Полученные результаты сравнивали с таковыми у контрольной группы, где при тех же условиях добавляли эквивалентное количество забуференного физиологического раствора.

Результаты исследования представлены в таблице 20. Как видно, Цп повышал адгезию всех популяций лейкоцитов в дозе 100% от физиологического уровня, а в дозе 150% увеличивал адгезию только гранулоцитов.

Проведенный дисперсионный однофакторный анализ показал, что влияние различных доз Цп на адгезивную способность гранулоцитов достоверно в высшей степени для всех объектов данной категории и может составить (>0,95) не менее 60,02% и не более 85,82% от общего влияния всей суммы факторов (таблица 21).

Увеличение адгезии лейкоцитов к эндотелию сосудистой стенки могло быть обусловлено, во - первых, влиянием Цп на экспрессию адгезивных молекул на поверхности гранулоцитов и лимфоцитов, во - вторых, на эндотелиальных клетках.

Для проверки последней гипотезы на втором этапе эксперимента изучали адгезию лейкоцитов к эндотелию, предварительно обработанному различными дозами Цп.

Как видно из таблицы 22, применение Цп в дозах 100% и 150% от физиологического уровня привело к увеличению адгезии гранулоцитов. Адгезивная способность общего количества лейкоцитов не изменилась, поскольку имелась тенденция к снижению адгезии лимфоцитов.

По данным дисперсионного однофакторного анализа, влияние различных доз Цп на адгезию гранулоцитов достоверно, а сила влияния составляет 74,79 % + 6,63 % (таблица 23).

Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что Цп увеличивает адгезию гранулоцитов преимущественно в высоких дозах (100 % и 150 % от физиологического уровня) за счет влияния как на лейкоциты, так и за счет изменения адгезивных свойств эндотелиальных клеток. Воздействие Цп в дозе 100 % приводит к увеличению адгезии лимфоцитов.

Таблица 20

Влияние Цп на адгезивную способность лейкоцитов

(% адгезии, М+m; )

Группы сравнения	Лейкоциты	Гранулоциты	Лимфоциты
Контроль n=6	31,37+4,36; 10,68	71,05+3,03; 7,41	19,68+6,16; 15,09
+Цп 25% n=5	27,02+2,03; 4,54	64,13+4,69; 10,51	18,28+2,84; 6,36
+Цп 50% n=5	27,98+2,19; 4,89	71,76+3,78; 8,46	17,49+2,39; 5,34
+Цп 75% n=6	24,85+2,63; 6,43	73,41+0,91; 2,22	10,89+2,91; 7,12
+Цп 100% n=6	50,34+1,57; 3,85 *	93,54+0,58; 1,42 *	35,09+2,05; 5,03 *
+ Цп 150% n=5	39,42+1,38;3,09	79,27+1,26; 2,93 *	23,75+2,24; 5,00

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой контроля по t-критерию.

Таблица 21

Влияние Цп на изменение адгезивной способности гранулоцитов. Дисперсионный однофакторный комплекс по оценке силы и достоверности влияния