Влияние эндогенных и экзогенных стимуляторов роста на механизмы репаративной регенерации костной ткани

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ

«УКРАИНСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНЫ ТРАНСПОРТА МОЗ УКРАИНЫ»

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Влияние эндогенных и экзогенных стимуляторов роста на механизмы репаративной регенерации костной ткани

14.03.04 - патологическая физиология

Павленко К.В.

Одесса - 2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ ЗАЖИВЛЕНИЯ ПЕРЕЛОМОВ И УЧАСТИЯ В НИХ СИСТЕМ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Современные взгляды на естественные механизмы регенерации костной ткани

1.2 Современные взгляды на влияние препарата с пчелиным ядом, при введении его с помощью фонофореза, на регенерацию костной ткани

1.3 Современные взгляды на влияние плазмы, обогащенной тромбоцитами, на регенерацию костной ткани

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 3. СТРУКТУРНАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В КОСТЯХ КРЫСЫ ПРИ СРАЩЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПЕРЕЛОМА

3.1 Структурно-функциональная характеристика состояния крыс на 3-и сутки после перелома малоберцовой кости

3.2 Структурная и биохимическая характеристика процесса репарации перелома кости у крыс на 7-е сутки опыта

3.3 Структурная и метаболическая характеристика процесса репарации перелома у крыс на 14-е сутки опыта

3.4 Структурная и метаболическая характеристика репарации перелома кости на 21-е сутки опыта

Глава 4. СТРУКТУРНАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В КОСТЯХ КРЫСЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ФОНОФОРЕЗА С КОМБИНИРОВАННЫМ ПРЕПАРАТОМ ПЧЕЛИНОГО ЯДА

4.1 Структурно-функциональная характеристика состояния крыс на 3-и сутки после перелома малоберцовой кости с применение фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда

4.2 Структурная и биохимическая характеристика процесса репарации перелома кости у крыс на 7-е сутки опыта при применении фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда

4.3 Структурная и метаболическая характеристики процесса репарации перелома у крыс на 14-е сутки опыта с применением фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда

4.4 Структурная и метаболическая характеристика репарации перелома кости на 21-е сутки опыта с применением фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда

Глава 5. СТРУКТУРНАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В КОСТЯХ КРЫСЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА СРАЩЕНИЕ ПЕРЕЛОМА ИНЪЕКЦИЕЙ ПЛАЗМЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ

5.1 Структурно-функциональная характеристика состояния крыс на 7-е сутки после перелома малоберцовой кости при применении инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами

5.2 Структурная и метаболическая характеристика процесса репарации перелома у крыс на 14-е сутки опыта при применении инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами

5.3 Структурная и метаболическая характеристика репарации перелома кости на 21-е сутки опыта при применении инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние годы неуклонно увеличивается травматизм во всех регионах земного шара. Возрастает число высокоэнергетических переломов, соответственно и число осложненных переломов. За последние 20 лет наблюдается значительное увеличение частоты замедленно срастающихся переломов и как следствие - ложных суставов. Белер Л. (1937) указывает как верхнюю границу частоты нарушения регенерации 5 % от числа всех переломов. По данным различных авторов, в наше время, нарушение репаративного остеогенеза наблюдается в 10-20 % случаях [8, 58, 160]. По данным исследования проведенного в 2008-2009 гг. «Институтом патологии позвоночника и суставов им. проф. М.И. Ситенко АМН Украины» и «Институтом травматологии и ортопедии АМН Украины» замедленная консолидация отмечалась у 32,7 % [54]. Замедленно консолидирующиеся, несросшиеся переломы, а также псевдоартрозы - это различные виды клинического проявления дисрегенерации костной ткани. Дисрегенерация является результатом нарушения и извращения кинетики воспалительно-репаративной реакции [109, 131]. По мнению других авторов, нарушение смен фаз пролиферации и дифференцировки, при воздействие разнообразных факторов, вызывает извращение регенераторного процесса. Результатом является гипер- или гипорегенерация [115].

Для консолидации перелома и восстановления функции поврежденной конечности следует создать оптимальные условия заживления костной раны. К таковым можно отнести: сохранение кровообращения или как можно раннее его восстановление, точное сопоставление костных отломков, и их надежная фиксация [115, 52], активное ведение послеоперационного периода, соблюдение правил асептики [56, 67]. Также в последнее время активно разрабатываются медикаментозные способы стимуляции репаративного остеогенеза. В настоящее время определен ряд биологически активных веществ - факторов роста, которые имеют высокий потенциал к стимуляции остеогенных и хондрогенных клеток [153, 177].

Для стимуляции репаративного остеогенеза предложено большое количество методов и способов, которые можно разделить на общие и местные. Также по природе воздействия на биологические, химические и физические. Наибольший эффект можно получить путем одновременного оптимального сочетания данных методов [6].

Стимуляция эндогенных факторов роста может осуществляться за счет введения, в место свежего перелома малой берцовой кости крысы, плазмы, обогащенной тромбоцитами. Использование обогащенной тромбоцитами плазмы для ускорения роста кости и мягких тканей в настоящее время стало одним из направлений в реконструктивно-восстановительной хирургии. [13, 105].

В пчелином яде 40-55 % сухого остатка составляет пептид - мелиттин, который разрушает эритроциты за счет лизиса клеточных мембран и является сильным гемолитиком. Также свойством разрушать фосфолипиды обладает Фосфолипаза А₂. В пчелином яде 10-12 % сухого вещества составляет этот фермент. Введение нативного пчелиного яда, содержащего эти факторы в область косной раны, способствует интенсивности процесса деструкции. Остальные ферменты данной группы пчелиного яда также обладают литическими свойствами, но гораздо менее выраженными [63]. Также в пчелином яде содержатся фермент Гиалуронидаза - очень сходный с Катепсином, по своей массе, а также оба фермента наиболее активны при одинаковых показателях pH среды. Катепсином способствует отщеплению от мембран клеток Т-лимфоцитов, макрофагов, тромбоцитов, трансформирующего фактора роста (ТФР-в). ТФР-в - является одним из основным хемотаксинов и митогенов - фактором остеобластов, играющий одну из ключевых ролей в сращении костей.

Пчелиный яд будет вводиться методом фонофареза. Использование ультразвука благотворно в связи с особенностями его биологического действия. Оно заключается в том, что механическая энергия, проходя через ткани, преобразуется в тепловую, что способствует ускорению биохимических реакций, улучшается кровообращение и лимфообращение, происходит болеутоляющее, сосудорасширяющее, рассасывающее и противовоспалительное действие, что приводит к освобождению остеоиндуктивных факторов и более раннему ангиогенезу [67].

Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертационная работа выполнена согласно с планом научный исследований ГП «Украинский научно-исследовательский институт медицины транспорта МОЗ Украины» (ГП «УкрНИИ МТ») (г. Одесса) «Научное обоснование и разработка медико-социальных мероприятий по снижению аварийности и тяжести последствий дорожно-транспортного травматизма» (№ государственной регистрация 0112U007442, сроки исполнения 2012-2014 гг.). Автор является непосредственно исполнителем фрагмента работы, посвященного исследованию влияния природных эндогенных и экзогенных стимуляторов роста (пчелиного яда и плазмы, обогащенной тромбоцитами) на механизмы репаративной регенерации костной ткани. Тема диссертационной работы утверждена на заседании Ученого совета ГП «УкрНИИ МТ» от 29 января 2012 г. (протокол № 12).

Цель исследования. Цель исследования - выявление механизмов репарации при переломах костей и определения возможности регулирования этими процессами природными экзо- и эндогенными соединениями: препаратом с пчелиным ядом и/или плазмой, обогащенной тромбоцитами.

Задачи исследования.

1. Изучить клиническую картину, изменения биохимических показателей сыворотки крови, структурно-функциональную характеристику процессов репарации костной ткани при неосложненных переломах - на примере экспериментального перелома малоберцовой кости крысы.

2. Изучить клиническую картину, изменения биохимических показателей сыворотки крови, структурно-функциональную характеристику и особенности течения неосложненного перелома у крыс под влиянием экзогенных регуляторных соединений пчелиного яда.

3. Изучить клиническую картину, изменения биохимических показателей сыворотки крови, структурно-функциональную гистологию и особенности течения неосложненного перелома под влиянием эндогенных регуляторных соединений плазмы, обогащенной тромбоцитами.

4. Сравнить эффективность влияния природных факторов (пчелиного яда, плазмы, обогащенной тромбоцитами) на механизмы регенерации костной ткани.

5. Сформулировать концепцию влияния природных факторов (пчелиного яда, плазмы, обогащенной тромбоцитами) на механизмы регенерации костной ткани.

Объект исследования: патогенез репаративной регенерации костной ткани.

Предмет исследования: влияние эндогенных и экзогенных стимуляторов роста на механизмы репаративной регенерации костной ткани.

Методы исследования: поставленная цель достигнута путем использования экспериментальных, биохимических, гистологических, статических методов исследования.

Научная новизна. Получило дальнейшее развитие представления о влиянии таких показателей состояния кальциевого обмена, как уровень ионов кальция (Са²⁺) в плазме крови, содержание ионов фосфора (РО₄^3-), активность щелочной фосфатазы на скорость течения и продолжительность этапов фазного процесса регенерации перелома трубчатых костей, а также регулирование изменениями этапов процесса. Это позволяет считать состояние кальциевого обмена важным фактором регулирования этим процессом и механизмом патогенеза заживления перелома трубчатых костей.

Установлено, что апифонофорез способствует сокращению продолжительности воспалительной стадии в процессе заживления перелома и стадии образования тканеспецифичних элементов кости за счет феномена «перекрестия», то есть появлением элементов из следующей фазы процесса в ту, что разворачивается в настоящее время. Механизмом, который осуществляет ускорение процесса заживления перелома, является повышение активности кальциевого обмена, на который влияют компоненты пчелиного яда.

По результатам исследования доказано, что введение в зону перелома кости плазмы, обогащенной тромбоцитами, сокращает процесс заживления костной раны за счет выключения фазы воспаления, резкой активации фазы образования тканеспецифических элементов и наличия феномена «перекрестия». Изменение интенсивности или соотношения компонентов кальциевого обмена при этом не происходит. Можно считать, что плазма, обогащенная тромбоцитами, является эндогенным самостоятельным фактором, который регулирует процесс регенерации костной ткани.

Практическое значение полученных результатов. Полученные данные расширяют и углубляют наши представления относительно патогенеза репаративных процессов в кости за счет определения роли кальциевого обмена как фактора регуляции интенсивности и продолжительности этапов фазного процесса репарации, а также фактора, который обеспечивает смену этапов процесса.

Вследствие проведенных исследований сформированы теории относительно механизмов действия экзогенных и эндогенных природных регуляторов репарации кости, которые могут совершать свое регулирующее влияние или за счет интенсификации кальциевого обмена (увеличения содержания Са²⁺; РО₄^3-; активность щелочной фосфатазы), или выступая как самостоятельный механизм, который сменяет присутствия и продолжительность фаз репарации (плазма, обогащенная тромбоцитами).

Полученные данные могут стать теоретической основой для разработки новых немедикаментозных методов коррекции дисрегуляторных процессов заживления перелома кости, которая обуславливает замедленную консолидацию и возможное появление псевдоартрозов.

Результаты работы внедрены в научно-преподавательский процесс на кафедрах Винницкого национального медицинского университета им. Н.И. Пирогова (г. Винница), Ивано-Франковского национального медицинского университета (г. Ивано-Франковск), Буковинского государственного медицинского университета (г. Черновцы), Тернопольского государственного медицинского университета им. И.Я. Горбачевского (г. Тернополь), Одесского национального медицинского университета (г. Одесса), материалы используются в научно-практической деятельности ГП «Украинский НИИ медицины транспорта МОЗ Украины».

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно провел патентно-информационный писк, выполнил все экспериментальные вмешательства и исследования на животных. Самостоятельно определил какие именно биохимические параметры следует исследовать в лаборатории. Диссертант самостоятельно провел статистические исследования. Автором самостоятельно написаны разделы диссертации, автореферат, подготовлены к печати статьи и тезисы.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации представлены на научно-практической конференции «XIII чтения им. В.В. Подвысоцкого» (г. Одесса, 2014), VІІ научно-практической конференции «Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів на організм» (г. Тернополь, 2014), научном конгрессе с международным участием «Проблемні питання медицини невідкладних станів: теоретичні та практичні їх аспекти» (г. Киев, 2015), научно-практической конференции «ХІV чтения им. В.В. Подвысоцкого» (г. Одесса, 2015); на заседании Ученого сонета ГП «УкрНИИ МТ» (23 декабря 2015 р., протокол №10).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 5 статей, из которых 3 - в научных специализированных изданиях Украины и 2 статьи в научном зарубежном издании медицинского направления (Польша), 3 тезисов докладов - в материалах научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного набора, состоит из вступления, обзора литературы, раздела материалы и методы исследования, трех разделов собственных наблюдений, обсуждения и анализа результатов, выводов, практических рекомендаций, список использованных источников литературы, который составляет 225 наименований (объемом 23 страниц) - (139 кириллицей и 89 латиницей). Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 23 рисунками (11 микрофотографий, 12 графиков), которые размещены по тексту.

ГЛАВА I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ ЗАЖИВЛЕНИЯ ПЕРЕЛОМОВ И УЧАСТИЯ В НИХ СИСТЕМ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Современные взгляды на естественные механизмы регенерации костной ткани

В последнее годы неуклонно увеличивается травматизм во всех регионах земного шара. По данным ВОЗ, в мире насчитывается 45 млн инвалидов в результате травм, в том числе 30 млн - вследствие дорожно-транспортных происшествий и 15 млн - производственных травм [91]. По данным ВОЗ, каждая страна теряет ежегодно 5 % общего количества рабочих дней из-за несчастных случаев на производстве или профессиональных заболеваний. Травма занимает 3-е место в общей структуре первичной инвалидности. Интенсивный показатель первичной инвалидности вследствие травм составляет 6-7 на 10 000 рабочих и служащих. Лечение больных с множественной и сочетанной травмой представляет значительные трудности. Более 20 % пострадавших становятся инвалидами [91, 119]. Приведенные данные констатируют тот факт, что данная проблема имеет не только медицинскую, но и социально-экономическую актуальность, которая обусловлена дороговизной и длительностью лечения и реабилитации этих больных [130].

Среди травм конечностей в последнее время возрастает число высокоэнергетических переломов, что обуславливает рост доли осложненных переломов в их общем объеме. За последние десятилетия среди осложненных переломов наблюдается значительное учащение замедленно срастающихся переломов и ложных суставов. Если Бёлер Л. (1937) [9] указывал как верхнюю границу частоты нарушения регенерации 5 % от числа всех переломов, то в наше время, по данным различных авторов, нарушение репаративного остеогенеза наблюдается уже в 20% случаях [8, 59, 160]. По данным исследования проведенного в 2008-2009 гг. «Институтом патологии позвоночника и суставов им. проф. М.И. Ситенко АМН Украины» и «Институтом травматологии и ортопедии АМН Украины» замедленная консолидация отмечалась у 32,7 % обследованных [54]. Замедленно консолидирующиеся, несросшиеся переломы, а также псевдоартрозы - это варианты клинического проявления дегенеративных процессов в костной ткани. Дегенеративные изменения в костной ткани возникают, как результате нарушений обычной кинетики воспалительно-репаративных реакций при переломе [109, 131]. По мнению других авторов, нарушение фазности пролиферации и дифференцировки клеточных элементов под воздействие разнообразных внешних факторов, меняет интенсивность регенераторного процесса. Результатом является гипер- или гипорегенерация [115]. Данные современных исследований о процессе остеогистогенеза, о способах и средствах, управляющих регенерацией костной ткани необходимы для понимания сущности данной проблемы [34, 38, 55, 67, 103, 125, 126, 155], особенно о роли реактивных изменений соединительной ткани в развитии процесса регенерации [15, 17, 57, 94]. Исходя из опубликованных данных были сформулированы довольно многочисленные классификации стадийности процесса регенерации костной ткани.

Часть авторов, с точки зрения морфологии процесса, смогли выделить два его этапа: к первому этапу относится образование регенерата, на этом этапе различают фазу образования соединительнотканной мозоли и фазу дальнейшего превращения ее в костную, ко второму - перестройку первичной мозоли в окончательную. В литературе присутствует и другой взгляд на этот процесс, когда выделяют пять этапов: 1 - образование ткани, сходной с мезенхимой; 2 - дифференциация клеточных элементов этой ткани; 3 - образование первичных костномозговых полостей; 4 - перестройка провизорной мозоли; 5 - обратное развитие костной мозоли [137]. Кроме того некоторые авторы опираясь на морфологические данные о заживлении костной раны, выделяют шесть стадий восстановления дефекта кости: 1 - дестабилизация клеточных элементов; 2 - клеточная пролиферация; 3 - дифференциация разного вида тканей (хрящевой, фибробластической, остеобластической, недифференцированной ткани, похожей на мезенхиму, и фибробластической соединительной ткани); 4 - эпигенез остеогенной ткани, когда все виды тканей путем прямой метаплазии и атипической энхондральной оссификации и остеоидной модификации переходят в остеоидную ткань; 5 - спонгизация остеоидной ткани и образование остеонов; 6 - создание пластинчатой кости [43]. Другие авторы предлагают различать четыре стадии: пролиферацию остеобластических клеток; образование коллагеновых волокон; образование аморфного углеводно-белкового вещества; импрегнацию межклеточного вещества минеральными солями [104].

Ряд авторов, исходя из данных морфологических преобразований в зоне перелома, выделяют следующие стадии регенерации: тромбирование гематомы; организация кровяного сгустка; образование фиброзного предкостного регенерата; формирование регенерата кости; образование вторичного регенерата кости; функциональная реконструкция костного регенерата [143]. Другие авторы по совокупности структурно-морфологических и биохимических изменений, происходящих в костном регенерате, выделяют следующие фазы регенерации кости: 1-я - катаболическая фаза с дезинтеграцией и деградацией, окружающих и входящих в состав кости структур; 2-я - прогрессирующая пролиферация и дифференцировка клеточных элементов с секрецией органической основы костного регенерата; 3-я - сложные биохимические, биофизические и физиологические процессы, приводящие к появлению первичной костной структуры; 4-я - образование пластинчатой костной структуры, обеспечивающей восстановление формы и функции кости [57]. Современное состояние методических подходов к проблеме регенерации костной ткани дало возможность более детального изучения процесса, благодаря чему концепция стадийно-зонального характера регенерации костной ткани, нашла дальнейшее развитие в работах отечественных и зарубежных ученых [15, 33, 178, 212, 224]. По данным [58] репаративная регенерация проходит следующие стадии: первая стадия - воспаление (0-5 дней после травмы); вторая стадия - дифференцировка клеток и формирование тканеспецифических структур в области травмированной кости (4-10 дней после травмы); третья стадия - реорганизация тканевых структур и минерализация (9-25 суток после травмы, до 16 недель); четвертая стадия - ремоделирование (25-50 суток после перелома); пятая стадия - исход (45 суток и более, после травмы). При сопоставлении с представленными выше концепциями стадийности процесса оригинально выглядит вариант стадий заживления перелома кости (воспаление, фагоцитоз, фиброзная мозоль, первичная и вторичная костные мозоли), в котором авторы [151], описывая морфологию и последовательность появления в зоне перелома разных типов клеток. На наш взгляд, они недостаточно обосновали отделение фагоцитоза от воспаления. В литературе по эмбриональному и посттравматическому остеогенезу [11, 16, 49, 110, 213] приведены факты, показывающие, что в зависимости от характера нагрузок меняется характер образования костной ткани: десмальный, хондральный и ангиогенный. В первых двух вариантах образуются провизорные ткани (ткань прародитель), которые позже подвергаются перестройке в костную ткань, при третьем типе новообразованная костная ткань образуется непосредственно вокруг сосудов. Таким образом, можно фиксировать отсутствие единой, общепринятой точки зрения по поводу трансформации тканей, образующихся в процессе заживления костных переломов и обеспечивающих восстановление дефекта.

Неосвещен в литературе и вопрос о клеточных источниках регенерации костной ткани. Значительное влияние на представление о репаративной регенерации костной ткани оказалось концепция о мезенхимном резерве полипотентных клеток взрослого организма, производных мезенхимы (рыхлая соединительная ткань, опорные) за счет которых происходят восстановительные процессы в тканях [22, 26, 38, 134, 135]. Четкость в это учение внесли работы [139], в которых отмечается образование остеобластов при формировании межклеточного вещества костной ткани за счет дифференцировки мезенхимальных адвентициальных клеток. В русле учения о мезенхимальном резерве и согласно камбиальной теории [38, 39], допускается и обосновывается наличие детерминированных клеточных источников остеогистогенеза.

Остеогенные клетки - это клетки поддерживающие популяцию количественно дифференцирующиеся в остеобласты, локализуются в трубчатой кости, во внутреннем слое надкостницы, в эндосте, и которые обнаруживаются среди клеток стромы костного мозга. Некоторые авторы утверждают, что остеобластические элементы располагаются в наружном слое надкостницы [22, 26, 29]. Существует точка зрения о рыхлой волокнистой соединительной ткани надкостницы, эндосте, каналах остеонов, являющихся продолжением тканевых элементов стромы костного мозга. Это точка зрения нашла отражения в разработке методов избирательного клонирования стромальных клеток костного мозга, кариотипирования в смешанных культурах клеток костного мозга в экспериментах на разнолинейных мышах, и формирование иммуно-цитохимических подходов в исследованиях дифференцировки клеток гемопоэтической и соединительной тканей. В экспериментах с мышами мутантных линий, имеющих дефект стромальных элементов и стволовых кроветворных клеток, по регуляции фенотипа остеогенных клеток, оценке дифференцировки механоцитов костного мозга, а также связи численности клеток костного мозга с активностью регенерации костной ткани и др. [46, 48, 67, 121, 122, 127], также проверялись положения вышеизложенной точки зрения.

Полученные результаты позволили сформировать положение о том, что костномозговые стромальные клетки гистогенетически отличны от кроветворных элементов. Благодаря чему к стромальным элементам костного мозга относят клетки, не имеющие происхождения от стволовой кроветворной клетки (ретикулярные, эндотелиоциты и другие клетки стенки синусоидных капилляров, липоциты и остеогенные клетки), причем ретикулоциты и остеогенные клетки рассматриваются как стромальные механоциты [12, 148, 165]. Однако окончательного решения вопроса о гистеогенезе стромальных клеток по-прежнему не существуют, о чем свидетельствуют электронно-микроскопические исследования клеточного состава эндоста мышей до и после воздействия на кроветворение циклофосфамидом и эндотоксином, которые показали, что в эндосте есть стволовые клетки, дающие начало кроветворным и стромальным элементам [161].

Ангиогенез является обязательным условием осуществления регенерационного остеогистогенеза, который зависит от условий васкуляризации. Зависимость интенсивности заживления костной раны прямо пропорционально объему кровоснабжения, что показано в работах по исследованию течения переломов, восстановлении кости после ее резекции [7, 102, 118], развития реконструктивно-воспалительных процессов [5, 32, 68, 81, 82], приживления хрящевых, или костных трансплантатов, пересаженной надкостницы [14, 67]. Васкуляризация зон посттравматического остеогенеза способствует оксибиотическому типу обменных процессов, что создает условия [59, 104] для дифференцировки малодифференцированных клеточных элементов в остеобласты. Внимание исследователей привлекают клетки кровеносных сосудов и элементы вокруг них, разрастающихся в зонах костеобразования. Согласно взглядам некоторых авторов, возможна дифференцировка эндотелиоцитов капилляров в остеобласты [26]. На основании радиоактивных методов исследования [77, 101] установлено, что в эмбриональном остеогенезе источниками остеобластов являются периваскулярные клетки. О сложности рассматриваемого вопроса свидетельствуют работы [78, 158, 159], по результатам которых периваскулярные клетки относятся к предшественникам хондрокластов, остеокластов, а также выявлена возможность резорбции хрящевого матрикса периваскулоцитами. Согласно данным некоторых авторов, последние относятся к хондроцитам. Накоплены данные, показывающие существенную роль периваскулярных клеток, как камбиальных элементов, которые активно участвуют в заживлении костного перелома, при применении дистракционпого остеосинтеза [23, 27, 28, 31, 79, 95, 107], или при регенерации костной ткани после огнестрельного повреждения [22, 24, 25].

В стенки капилляра, венулы, артериолы, содержатся высокодифференцированные соединительно-тканные клетки - перициты [21, 112, 129, 172]. Содержащиеся в их цитоплазме актин и миозин обеспечивают возможность их сокращения, что позволяет при контактировании периоцитов с эндотелиоцитами, влиять на тонус сосудистой стенки. Перициты также считают источником формирования остеобластов через стадию фибробластоподобной клетки в различных клеточных формах соединительной ткани [80, 108, 158].

В последнее время интенсивно начала развиваться концепция, согласно которой, в организме, клетки-предшественники присутствуют в двух видах: индуцибельные к костеобразованию клетки и детерминированные, т.е. способные к самоподдержанию и образованию костных клеток [17, 50, 53, 120, 183]. Последние исследования показали, что дифференциация мезенхимальных стромальных (стволовых) клеток по остеобластическому типу осуществляется под контролем факторов транскрипции, клеточных и матриксных взаимодействий, системных и местных факторов [140, 154, 162, 196]. К системным относятся транскрипционные факторы, такие как Sox9; BMP2; Cbfa 1; Wnt.

В свою очередь к местным факторам относятся достаточная трофика в области перелома, в том числе перемещение ионов Ca²⁺, которые транспортируются, в числе прочего, при помощи Wnt/Ca²⁺-сигнального пути. Ca²⁺-зависимый сигнальный путь, активируемый белками Wnt, включает цепь событий, связанных с освобождением ионов Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ [65]. Узнавание рецептора Fz лигандом Wnt приводит к диссоциации гетеротримерного G?белка на Gб- и Gв/г-субъединицы. Свободный комплекс Gв/г способен активировать фосфолипазу С (PLC), которая транслоцируется на мембрану и гидролизует фосфотидилинозитол(4,5)-бифосфаты (PIP2) до инозитол(1,4,5)-трифосфатов (IP3) и диацилглицерола (DAG). Диацилглицерол активирует киназу белка C (PKC), в то время как инозитол(1,4,5)-трифосфат индуцирует освобождение ионов Ca²⁺ из внутриклеточных депо. Повышение уровня цитоплазматического Ca²⁺, в свою очередь, стимулирует Ca²⁺-зависимые эффекторные молекулы. Среди них Ca²⁺/кальмодулин-зависимая киназа II (CaMKII), ядерный фактор, ассоциированный с Т-клетками (NFAT), и кальцинейрин [221]. Полагают, что Wnt/Ca²⁺-путь в основном задействован в регуляции организации цитоскелета и клеточной подвижности [220]. Не маловажную роль играет стабильная фиксация костных отломков. Значительное воздействие на процессы остеогенной дифференциации оказывает множество местных факторов, подавляющее большинство из которых продуцируется клетками остеобластической линии [155, 196, 216, 218, 225]. К этим факторам относят возникновение коротких псевдоподий у остеобластов и их миграция на поверхность разрыва кости. Ранее считалось, что эти клетки синтезируют только коллаген I типа [28]. Однако появились данные, полученные с помощью иммунофлуоресцентного метода, свидетельствующие о возможности остеобластов синтезировать коллаген разных типов в течение определенных стадий заживления перелома кости [23, 26, 27, 28], а также о возможности выработки остеобластами некоторых фракций аморфного веществ - хондроитин- и кератосульфанов, 0-фосфосерин- и 0-фосфо-треонинсодержащих фосфопротеидов [26, 27, 28].

Несмотря на существование приведенные выше концепций, остается актуальным предположение, что в регенерации костной ткани помимо гетерогенных клеточных источников, различной локализации и происхождения, которые имеют разные потенциалы к дифференцировке и остеогенным возможностям [50], участвуют элементы кровяного сгустка - фиброциты, тромбоциты, гистиоциты, жировые клетки, перициты, остеокласты, клетки миелоидного ряда, эндотелиоциты [109, 58, 72, 97, 189, 200, 223].

Таким образом многочисленные исследования, демонстрирующее на клеточном уровне участие разных клеточных популяций в регенерации костной ткани не содержат данных о регуляторных ролях молекул, обеспечивающих вовлечение этих популяций в процесс регенерации, а также данных об участии кальциевого обмена в регуляции этих реакциях.

В тоже время в единичных, разрозненных работах отмечается изменение активности щелочной фосфатазы и концентрация ионов кальция и фосфора в плазме крови в динамике процессов регенерации кости.

Термином «щелочная фосфатаза» - фосфогидролазу моноэфиров ортофосфорной кислоты (КФ 3.1.3.1) - обозначают группу ферментов, гидролизующих эфиры фосфорной кислоты в интервале рН от 8,6 до 10,1. Молекулярная масса в зависимости от источника фермента колеблется от 70 до 120 кДа. Источниками различных ферментных форм щелочной фосфатазы являются: костная ткань, печень, почки, плацента, слизистая оболочка тонкой кишки, нейтрофилы, опухоли (гепатома). Кроме того, известны отдельные формы щелочной фосфатазы: плацентоподобная, Regan (эмбриональная), Nagao, Kasahara [4, 193]. В сыворотке крови здорового особи млекопитающего чаще всего обнаруживают печеночный и костный изофермент. Фосфатазы катализируют перенос фосфата от донора данной группы на акцептор. При этом образуются соответствующий спирт и другой фосфорный эфир. В тех случаях, когда в качестве акцептора выступает вода, образуется неорганический ортофосфат. При физиологических значениях рН скорость гидролиза пирофосфатов и ортофосфатов сравнима. Это может указывать на то, что щелочная фосфатаза способна облегчать минерализацию кости путем удаления таких ингибиторов кристаллизации, как неорганический пирофосфат [195]. При гипофосфатазии выявлены нарушения обмена фосфоэтаноламина и пиридоксаль-5-фосфата, так же как и неорганического пирофосфата [175]. В связи с этим полагают, что основная функция щелочной фосфатазы сводится к облегчению поступления в клетку различных эфиров фосфорной кислоты путем их дефосфорилирования, в противном случае мембрана является для них непроницаемой [144]. Сывороточная активность щелочной фосфатазы отражает, прежде всего, повреждение костной ткани и печени, хотя более высокая активность щелочной фосфатазы обнаруживается в других тканях [191]. Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови повышается при таких заболеваниях опорно-двигательного аппарата как болезнь Педжета (повышение в 10-25 раз по сравнению с нормой), метастатические опухоли, остеогенная саркома, остеомаляция, рахит, заживление после переломов кости.

Кальций является наиболее распространенным минеральным веществом организма. Содержание кальция в организме составляет 1-1,5 кг. Кальций - это внеклеточный катион: в плазме крови содержание кальция - 2-2,8 ммоль/л, 99% кальция локализовано в костях и зубах, где вместе с фосфатом он образует кристаллы гидроксиапатита, составляющие структурный компонент скелета [10, 61, 76, 128]. Остеобласты - клетки, отвечающие за формирование костной ткани и ее минерализацию, остеокласты - за деминерализацию. Большая часть кальция кости не может свободно обмениваться с кальцием внеклеточной жидкости. Около 1 % кальция скелета составляет легкообменивающийся фонд, еще 1 % находится в периостальном пространстве (надкостнице), и эти два источника образуют мобильную фракцию Са²⁺ [111].

В крови ионы кальция присутствует в трех формах: 1) в комплексе с органическими и неорганическими кислотами; 2) в связанной с белками форме и 3) в ионизированном виде. В комплексы с цитратом, фосфатом и другими анионами вовлечено около 6 % общего кальция. Остальное количество Са²⁺ распределяется почти поровну между связанной с белками и ионизированной (несвязанной) формой.

Ион Са²⁺ и парный ему ион фосфата присутствуют в плазме крови в концентрациях, близких к пределу растворимости их соли. Поэтому связывание Са²⁺ с белками предупреждает возможность образования осадка и эктопической кальцификации [30].

Содержание фосфора в организме около 1 кг. Более 80 % фосфора находится в комплексе с ионами Са²⁺ в костях и зубах, около 10 % - в мышцах и крови в комплексе с белками, липидами и углеводами, остальные 10 % - в составе других органических компонентах [37, 116].

Функции: 1) компонент костей; 2) образование важнейших органических соединений (АТФ, ГТФ, креатинфосфат, фосфолипиды, фосфопротеины, нуклеиновые кислоты, коферменты - НАДФ⁺, пиридоксальфосфат и др.); 3) участие в регуляции активности молекул путем фосфорилирования-дефосфорилирования; 4) образование фосфатной буферной системы [179, 190].

Существующие и описанные нами представления о протекании процессов регенерации кости в случае ее перелома определяют характер и содержание стандартов их лечения. Основу его составляет фиксация отломков тем или иным способом и придание функционального покоя поврежденной конечности. Активация процесса регенерации достигается излитием крови в место перелома, появлением очага воспаления. При этом активность кальциевого обмена, и влияние на его регулирующую роль учитывается весьма слабо. Кроме того слабо используются природные факторы влияющие на интенсивность регенерации (пчелиный яд; плазма, обогащенная тромбоцитами). Последнее обстоятельство связано с недостаточной изученностью механизмов их влияния на процессы регенерации кости.

1.2 Современные взгляды на влияние препарата с пчелиным ядом, при введении его с помощью фонофореза, на регенерацию костной ткани

Несмотря на давнюю традицию использования апитерапии, многие считают это направление в медицине относительно новым. Первое обоснование данного метода в официальной медицине датируется 1894 годом, когда профессор Санкт-Петербургской академии лесного хозяйства Лукомский предложил пчелиный яд в качестве средства для лечения ревматизма и подагры [2, 42, 124, 138].

Первая половина прошлого века - период интенсивного развития научной базы применения пчелоужаливания: в 1941 году профессором Н.М. Артемовым [2] были проведены исследования по применению пчелиного яда, а в 1959 году была подготовлена и правовая база - ученый совет Минздрава СССР утвердил «Инструкцию по применению апитерапии путем пчелоужаливания».

Именно отечественная научная школа стала источником многих инновационных идей: научные исследования, проведенные академиком Ш.М. Омаровым начиная с 1965 года [84], положили основу применению пчелиного яда как антикоагулянта; произведена разработка фармакопейной формы «Апифор» - первого средства для электрофореза с пчелиным ядом в нехарактерной лекарственной форме - таблетках. Особенно хотелось бы отметить труды Э.А. Лудянского, который в 1972 году открыл пункт апитерапии при неврологическом отделении больницы в Вологде. Ученый и практик, он одним из первых доказал на многочисленных примерах, что апитерапия может применяться при лечении многих заболеваний и удачно сочетаться с традиционными методиками лечения.

Апитерапия сегодня понимается гораздо шире - это не только пчелоужаливание, но и применение других продуктов пчеловодства: известны многочисленные исследования и практический опыт применения маточного молочка, прополиса, меда В.А. Люсовым, Р.Д. Сейфуллой, Э.М. Алескер, Г.П. Зайцевым [40, 41, 42].

Свежеполученный от живых пчел секрет ядовитых желез представляет собой густую, прозрачную жидкость горько-жгучего вкуса, кислой реакции (pH водных растворов 4,5-5,5), плотностью 1,08-1,13, быстро высыхающую на воздухе. Летучие вещества пчелиного яда - это вода и сложные эфиры: изоамилацетат, изоамилпропионат, изоамилбутират и др. Считается, что в процессе ужаливания выделяющиеся эфиры вызывают сигнальную реакцию "тревоги" в пчелиной семье и активируют других пчел к ужалеванию. Объем выделяющегося от одной пчелы секрета составляет около 1 мкл жидкости массой 0,5-1 мг. Секрет легко растворим в воде, заключает 12 % нерастворимых примесей. Высушенный яд имеет вид прозрачной массы, составляющей 30-40 % от нативного секрета, которая при размоле превращается в порошок от белого до желтоватого оттенка [2, 40, 84, 138].

Высушенный пчелиный яд представляет собой многокомпонентную смесь из неорганических и органических веществ. Минеральные вещества, остающиеся после сжигания яда при температуре 500-800°С (зольность яда), составляют 2-4% сухой массы яда. В золе установлены кальций, фосфор, магний, медь, хлориды. Нет точных данных о присутствии в нативном, без примесей, яде таких распространенных в биологических тканях элементов, как калий и натрий.

Органические вещества яда представлены практически всеми группами соединений, встречающихся в животном организме - углеводы, жиры, белки, пептиды, аминокислоты, биогенные амины, ароматические и алифатические соединения и т.д. Установлено наличие в яде 2-6 % сахаров (глюкоза, фруктоза). Однако чем меньше загрязняется секрет при получении, тем меньше содержание углеводов. Жироподобные вещества имеются в яде в еще меньших концентрациях и составляют 1-3 %. Около 1 % яда составляют свободные аминокислоты.

Основная часть сухого вещества яда представлена белками и пептидами - около 80 %. Так, присутствие пептида мелиттина в яде в количестве 40-50 % от массы всего секрета затрудняет выделение компонентов, имеющих примерно равную молекулярную массу, но присутствующих в количествах, менее 1 % [1, 20, 63, 66]. В состав пчелиного яда входит множество белковых и других органических компонентов. Наибольшее значение сегодня придают, содержащейся в яде фосфолипазе и другим ферментам.

Фосфолипаза А₂- Относится к группе ферментов, осуществляющих липолиз. Примерно 80 % всех липидов, составляющих бислойную структуру мембран, - это фосфолипиды. Содержащиеся в клеточных органеллах - вакуолях, лизосомах и др. - фосфолипазы участвуют в обновлении тканей по мере их износа - путем разрушения отработанных, старых мембран [128, 190].

Именно это свойство -- разрушение клеточных мембран и проявляется главным образом при действии на организм фосфолипазы пчелиного яда. При этом фосфолипаза А₂ яда, в отличие от фосфолипаз А₁, В и Д, расщепляет эфирную связь глицерина и жирной кислоты во 2-ом положении, возможно, наиболее труднодоступном. Во всяком случае, известно, что при расщеплении жиров липазами связи 1 и 3-триацилглицерида гидролизуются быстро, и лишь потом идет медленный гидролиз 2-моноглицерида. Поэтому можно предположить, что при высоком содержании в яде (на втором месте после мелиттина) фосфолипаза А₂ весьма эффективно сплавляется с функцией разрушения мембраны клетки.

Габерманн и Нейман [180, 181], впервые выделившие активный фермент из пчелиного яда, определили его содержание около 14 % в расчете на высушенный яд. Позднее Шаполини с сотр. [211] установили, что фосфолипаза яда состоит из разных "субформ", различающихся по содержанию в них углеводов. Поэтому трудно дать точное определение молекулярной массы фермента. Она варьирует, видимо, в зависимости от степени очистки, от 14000 до 20000 дальтонов. Тем не менее, Шаполини с сотрудниками определили, что фермент состоит из 128 аминокислотных остатков и установили их последовательность. Фосфолипаза А₂ превращает фосфолипиды в токсические соединения (гемолитический яд), вследствие чего нарушаются процессы тканевого дыхания, одновременно она является наиболее активным антигеном и аллергеном. Фосфолипаза отщепляет лецитин и кефалин от фосфолипидов, что уменьшает поверхностное натяжение. Шаполини [211] установил, что этот энзим (2 % состава яда) состоит из 183 аминокислотных остатков, к которым примыкают сахара. Активизирование энзима происходит в присутствии хлорида натрия и ионов железа [71].

Гиалуронидаза - фермент, разрушающий полисахариды, входящие в состав соединительной ткани и клеточных мембран, термоустойчива, обладает аллергическими свойствами. Помогает увеличивать проницаемость клеток и тканей. Активность фермента снижается гепарином в сыворотке крови. Гиалуронидаза повреждает мембраны митохондрий и блокирует проводимость синаптических структур нервной системы.

Кислая фосфатаза (фосфомоноэстераза), выделенная Benton [152], присутствует в яде в количестве около 1 % и способствует разрушению фосфолипидов фосфолипазой А₂. Она не разрушает аденозиновых фосфатов, но активно отщепляет фосфаты с 1 и 2 позициями у глицериновых и с 1 места - сахарных фосфатов. Фермент термолабилен, его масса лежит в пределах 45000-90000, оптимум pH составляет 4-3, проявляет высокие антигенные свойства.

Альфа-глюкозидаза содержится в яде в еще меньших количествах - 0,5 %. Представляет собой гликопротеид и имеет самую большую молекулярную массу - 170000 (Шкендеров, [132]). Проявляет альфа-гликозидазную активность при температурном оптимуме 46°С. Является антигеном, однако не проявляет токсических свойств.

Лизофосфолипаза - еще один фермент пчелиного яда, работающий комплексно с другими фосфолипазами [133]. Авторы установили, что фермент является гликопротеидом с молекулярной массой 22000 дальтонов. В аминокислотном составе не обнаружено цистина, метионина и тирозина. Фермент расщепляет лизолецитин. Он отщепляет единственную жирную кислоту, находящуюся на первом месте молекулы токсичного лизолецитина, превращая его в нетоксичное соединение. В условиях, когда лизолецитин образуется под влиянием фосфолипазы пчелиного яда, это действие лизолецитина можно определить как защитное, антитоксическое. Биологический смысл такого эффекта непонятен.

Основную массу сухого остатка пчелиного яда составляет пептид мелиттин, процентное содержание в яде 40-50 % в зависимости от очистки. В 1952 году (Нейман и Габерманн [180, 182]) методом электрофореза разделили белки пчелиного яда на две фракции. В первой фракции, более подвижной в направлении анода, был выявлен полипептид, непосредственно разрушающий эритроциты и вызывающий сокращение гладких мышц, впоследствии названный мелиттином - от видового названия пчелы - мелифера (медоносная). Авторы определили его первичную структуру. Молекула пептида содержит 26 аминокислотных остатков.

Основное биологическое действие мелиттина связано со способностью нарушать структуру мембран. В частности, он вызывает лизис различных клеток и является сильным гемолитиком. Ныне свойства пептида хорошо изучены. Мелиттин разрушает различные природные и искусственные мембраны, однако, в отличие от других лизирующих веществ (лизолецитин, детергенты и др.), в небольших концентрациях не вызывает растворения мембран полностью. В клетках образуются поры, сквозь которые высвобождается их содержимое, а мембраны (тени клеток) могут сохранять целостность [181, 182]. Действует мелиттин уже в концентрации 10-⁶ м. При этом образуются поры, через которые может происходить утечка не только ионов, но и макромолекул типа гемоглобина. Клеточная мембрана может быть устойчива к действию низких концентраций пептида, тогда как внутриклеточные органеллы, которых достиг мелиттин, (лизосомы, митохондрии и др.) могут быть разрушены.

Физиологические и фармакологические эффекты мелиттина будут определяться теми субстратами, клетками, тканями, с которыми соприкасается этот пептид. Часть мелиттина, введенного под кожу, связывается с белками, липидами, мукополисахаридами подкожной клетчатки и соединительной ткани. С одной стороны, это существенно уменьшает токсичность пептида - установлено, что в этих условиях токсическая доза мелиттина в 15-20 раз выше, чем при внутривенном введении [133]. Однако, с другой стороны, происходит лизис фибробластов и тучных клеток. Это приводит к выбросу лизосомальных ферментов, а также серотонина, гистамина. Активируется находящаяся во многих клетках собственная фосфолипаза А₂ организма, которая запускает синтез простагландинов -- производных полиеновых жирных кислот, содержащих циклические группы, являющихся мощными биологическими регуляторами. Установлено, что синтез простагландинов начинается с гидролиза фосфолипидов, содержащих арахидоновую кислоту, под действием клеточной фосфолипазы А₂- Кроме регуляторных свойств (тонус гладких мышц, иммунный статус и др.) простагландины являются эффекторами воспаления, пирогенами и т.д. Они же участвуют в развитии болевого эффекта. Все эти местные реакции, вызывающие воспалительную реакцию, приводят к расширению кровеносных сосудов, увеличению проницаемости капилляров, снижению кровяного давления, спазмам гладкой мускулатуры бронхов. Внешне это проявляется в возникновении боли, покраснения и отека в месте инъекции мелиттина.

Ст. Шкендеров и Ц.Иванов [133] обнаружили, что мелиттин ослабляет воспалительное действие лизосом, что несколько противоречит общепринятым данным о влиянии мелиттина на воспаление. Ими также выявлено стимулирующее действие пептида на функции костного мозга. Следует все же отметить, что исследователи работали с малыми разведениями мелиттина.

Кузина Н.Г. [64] в своей работе указывала на особенность мелиттина повышать концентрацию ионов Nа⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ в клеточной стенке. Как при подкожном введение животным, так и при внутримышечном введении. К таким же выводам пришли Звонкова М.Б. и др. [45] в своих исследованиях, авторы вводили подопытным крысам препараты пчелиного яда с гепарином и отдельно мелиттин, проверяя разницу в сократительной способности миокарда, а также замеряя концентрацию электролитов в сосудистой стенке животных. Такой точки зрения придерживается ряд зарубежных авторов [163, 182, 197, 199].

Еще в 1937 г. (Фельдберг и Келловэй) установили, что пчелиный яд освобождает эндогенной гистамин. Н.В.Корнева [62] показала, что под влиянием гистамина изменяется микроциркуляция и реактивность кожных капилляров. Мелиттин и фосфолипаза А₂ влияют не только на эритроциты, но и лейкоциты.

Б.Н. Орлов с сотр. [85, 86, 87, 88, 89] выявили, что внутривенное введение мелиттина в дозе 0,1-0,5 мг/кг снижает тонус сосудов большого круга кровообращения, увеличивается пульсовое наполнение сосудов мозга и конечностей, улучшается функциональное состояние миокарда. Малые дозы мелитина уменьшали вязкость крови.

Апамин. Как полагает (Габерманн [181, 182]), впервые выделивший этот пептид (1964, 1965 гг.), несмотря на присутствие в яде в количестве не более 2%, апамин может обладать эффектами и скрытыми физиологическими возможностями в не меньшей мере, чем основной пептид - мелиттин, составляющий половину массы яда. Апамин один из самых маленьких пептидов, он состоит всего из 18 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 2039 Да. Сегодня структура апамина расшифрована [211].

Апамин не обладает гемолитическим действием, малоэффективен при воздействии на многие клетки млекопитающих. Однако он обладает ярко выраженным действием на постсинаптические мембраны нервных клеток как в периферической, так и центральной нервной системе. Это вызывает блокирующий эффект на альфа-адренореактивные, холинэргические и пуринергические рецепторы. Но наиболее ярко свойства пептида проявляются по отношению к кальцийзависимым калиевым каналам в мембранах клеток. Причем, если раньше это утверждалось только дня нейронов [211], то недавно показано и для других тканей [18].

Проблема введения пчелиного яда в организм больного является серьезной проблемой, поскольку пчелоужаливание переносится далеко не всеми людьми. Другие способы введения яда электрофорез, перорально весьма проблематичны, т.к. возможна инактивация ряда его составляющих: энзимов (гиалуронидазы и фосфолипазы А₂) и токсических полипептидов мелиттина, апамина и др.). Ультразвук является физическим агентом с мощным физическим действием, однако не влияющим на структуру хим. соединений. Под его влиянием возможно введение активных ингредиентов пчелиного яда в ткани. Введение пчелиного яда посредством ультразвука внедрила в практику болгарский врач-терапевт П. Починкова (1972) [99, 100] причем получается суммарное воздействие двух факторов, из которых один физического, а другой биологического происхождения. По сравнению с их раздельным применением, это дает весьма ярко выраженный терапевтический эффект. Также данный способ введения яда предлагали в своих работах такие авторы: в 1987 году Л.С. Дроздовский предложил оригинальные методики электрофореза и фонофореза с ядом.