Влияние эндогенных и экзогенных стимуляторов роста на механизмы репаративной регенерации костной ткани

Рис. 4.4.1. 21-е сутки перелома малоберцовой кости крысы. Фонофорез с препаратом содержащим пчелинный яд. Восстановление кости, остатки фиброзных пучков. Гнезда остеоцитов. Окраска: гематоксилин. Увеличение: Ч100.

Данные биохимических исследований (таблицы 4.1.1) свидетельствуют, что у крыс в плазме крови, снова, происходит резкий подъем концентрации ионов СаІ⁺, до уровня - более чем в два раза выше показателей контроля и группы с переломом, на который не оказывалось внешних воздействия. Однако при этом продолжается незначительное снижение концентрации ионов фосфора и снижения активности щелочной фосфатазы. Это свидетельствует о том, что поступление кальция в кровь остается очень интенсивным, в то время как усвоение его приходит к норме.

Подводя итог данного срока наблюдений следует отметить, что внешне все крысы выглядят абсолютно здоровыми, прием пищи, воды без особенностей. На поврежденную лапу, животные, дают полную нагрузку. Гистологическая картина практически не отличается от таковой у здоровых крыс. У подопытных животных клинически и морфологически наступила не только консолидация перелома, но в отличие от подопытной группы II - произошло полное восстановление структуры кости.

Интересным остается тот факт, что в биохимических исследованиях происходит значительное увеличение концентрации ионов СаІ⁺, до уровня - более чем в два раза выше показателей контроля и группы, на перелома в которой не оказывалось внешнего воздействия (рис. 4.4.2), но при этом продолжается незначительное снижение концентрации ионнов фосфора (рис. 4.4.3) и активности щелочной фосфатазы (рис. 4.4.4), т.е. можно полагать, что усвоение кальция нормализуется, однако мобилизация его из пищи или депо сохраняется на повышенном уровне.

Рис. 4.4.2. Отношение концентрации Са²⁺ плазмы крови у животных при воздействие на сращении перелома фонофореза с нативным пчелинным ядом, переломом на который не оказывалось внешних воздействий, в различные сроки опыта, к интактным животным.

Рис. 4.4.3. Отношение концентрации (РО₄^3-)плазмы крови у животных при воздействие на сращении перелома фонофореза с нативным пчелинным ядом, переломом, на который не оказывалось внешних воздействий, в различные сроки опыта, к интактным животным.

Рис. 4.4.4. Отношение активности щелочной фосфатазы у животных при воздействие на сращении перелома фонофореза с нативным пчелинным ядом, переломом, на который не оказывалось внешних воздействий, в различные сроки опыта, к интактным животным

ГЛАВА V. СТРУКТУРНАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В КОСТЯХ КРЫСЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА СРАЩЕНИЕ ПЕРЕЛОМА ИНЪЕКЦИЕЙ ПЛАЗМЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ

5.1 Структурно-функциональная характеристика состояния крыс на 7-е сутки после перелома малоберцовой кости при применении инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами

Через семь суток после операции (одна процедура инъекции плазмы обогащенной тромбоцитами) общее состояние крыс удовлетворительное. Шерсть у подавляющего большинства крыс лоснится, но у части крыс шерсть взъерошена. Глаза у крыс ясные, носы чистые, теплые, умеренно влажные. Прием пищи, абсолютно не отличается от здоровых животных, потребление воды также в достаточном количестве. Перемещение крыс по клетки активное, на поврежденную конечность они только приступают. При сравнении здоровой и прооперированной лапы первая незначительно отечна и незначительно увеличена в диаметре (таблица 3.1.1). У большинства крыс рана затянувшиеся, но у двух крыс отсутствовали швы на ране (очевидно, они их сгрызли), края раны разошлись и из раны незначительное геморрагическое отделяемое. За исключением упомянутых выше животных, послеоперационные раны у остальных были без признаков воспаления, прикрыты сухим струпом. При пальпаторном исследовании области перелома отмечалось незначительная болезненность, крысы сопротивляются осмотру - стремятся вырваться. Крепитация отломков не прощупывается, определяется тугая подвижность в месте перелома. Температура кожных покровов поврежденной конечности соответствует здоровой.

При макроскопическом исследовании области перелома поврежденной конечности, у подопытных животных, наблюдается целостный конгломерат, с незначительной, тугой подвижностью. Окружающие ткани в подавляющем большинстве случаев обычного вида, умеренная отечность тканей имеет место только у животных, имеющих проблемы с первичным заживлением послеоперационной раны.

При гистологическом исследовании малоберцовой кости, прооперированных животных, в динамике сращения перелома прослеживается следующая картина. Окружающие перелом ткани обычного вида. Непосредственно вокруг области перелома скопление клеток с палочковидными ядрами сходными с хондроцитами. Плотное вещество клети в области бывшего перелома сплошное, однако, ширина его меньше, чем в других частях кости (рис. 5.1.1). Много гнезд остеоцитов, содержащих 2-3 клетки. Капсула гнезд ярко синяя. Внутри плотного вещества, а также вблизи его снаружи короткие пучки из грубых фиброзных волокон. Отдельные костные «язычки» выходят наружу плотного вещества кости. Канал кости резко сужен в нем определяются мощные скопления клеток сходные с хондроцитами по своей структуре и волокна соединительной ткани. Следует отметить, что наблюдаемая у животных данной группы гистологическая картина существенно отличается от наблюдаемой у животных с переломом, без воздействий или переломом леченым препаратом с пчелиным ядом. Эти отличия составляли: в отсутствии отечных и воспалительных изменений (лимфоидная инфильтрация) в окружающих тканях; обычного вида надкостницы; наличии вокруг области перелома скопления клеток сходных с хондроцитами; восстановления целостности плотного вещества кости; наличие «Языков» плотного вещества отводящих в окружающие ткани; наполнение костномозгового канала хондроцитами; небольшом количестве фиброзных волокон. В целом гистологическая картина позволяет полагать, что у животных данной группы имеет место другой тип репаративных процессов нежели у крыс с переломом, на который не оказывалось внешних воздействий.

Рис. 5.1.1. Перелом малоберцовой кости крысы. 7-е сутки опыта, однократное введение плазмы, обогащенной тромбоцитами. Сплошной матрикс, скопление остеоцитоподобных клеток. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: Ч100

При применении инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами во время репаративной регенерации костной ткани малоберцовой кости, отличались изменения биохимических показателей, характеризующих обмен кальция. Исходя из данных таблицы 5.1.1 следует, что концентрация ионов СаІ⁺ в плазме подопытных животных незначительно снижена по сравнению с контрольной группой и группой с переломом без воздействий, но при этом более чем в два раза ниже группы леченой с применением фонофореза с препаратом пчелиного яда. Несколько иная картина имеет место в отношении концентрацией ионов фосфора. Их концентрация снижена по сравнению со здоровыми животными, а также с животными в группах с переломом, на который не оказывали внешних воздействий и переломом, на который воздействовали фонофорезом с комбинированным препаратом пчелиного яда. Что касается активности щелочной фосфатазы, то она недостоверно снижена по отношению к показателям контроля, но остается на треть выше чем этот показатель у животных II-й групп, и переломом заживление которого происходило при применении фонофореза с препаратом, содержащим пчелиный яд.

Таблица 5.1.1

Показатели кальциевого и фосфорного обмена, а также активность щелочной фосфатазы у крыс с переломом малой берцовой кости при воздействие на сращении перелома инъекцией плазмы, обогащенной тромбоцитами (М±m)

* р ? 0,05 по отношению к норме.

Произведя сравнения данных, полученных при наблюдении и лабораторных исследованиях, животных на этом сроке эксперимента 7 суток после перелома, можно прийти к следующему заключению. По общему состоянию здоровья и внешнему виду, потреблению пищи и воды в сравниваемых трех группах особых отличий не обнаружено. При всех подходах к лечению, представленному в данной работе, животные ведут себя активно, по клетке перемещаются, но активно прооперированной лапой не пользуются - стараясь полной опоры не давать. Пальпаторное исследование у всех крыс умеренно болезненно, крепитация отломков в отличие от группы перелома, сращение которого протекало без внешних воздействий, не прослеживается, в группах животных у которых проводилось лечение с применением фонофореза препаратом содержащим пчелиный яд или инъекциями плазмы, обогащенной тромбоцитами. Но незначительная подвижность области перелома сохраняется во всех группах. Следует особо отметить, что у крыс получавших процедуры фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда и инъекции плазмой, обогащенной тромбоцитами визуально отечность оперированной лапы отсутствовала, за исключением крыс, у которых были проблемы с заживлением ран. Диаметр поврежденной конечности либо соответствовал диаметру здоровой конечности, либо был недостоверно увеличен таблица 3.1.1. При макроскопическом и гистологическом исследованиях, у крыс, которые получали плазму, обогащенную тромбоцитами окружающие место перелома ткани обычного вида и не просматривается линия перелома из-за плотного расположение клеток, а также наличие клеток сходных и хондроцитами. Вышеперечисленные особенности гистологической картины отличают данную группу от двух предыдущих. Что касается анализа биохимических исследований оно приведено выше.

5.2 Структурная и метаболическая характеристика процесса репарации перелома у крыс на 14-е сутки опыта при применении инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами

На 14 сутки после оперативного вмешательства (животным произведено три инъекции плазмой, обогащенной тромбоцитами) общее состояние крыс удовлетворительное. Прием пищи, потребление воды не отличается от здоровых животных. Шесть гладкая, ухоженная у всех без исключения животных. Глаза ясные, носы чистые, влажные. Перемещение по клетке активные, большая часть крыс дают полную нагрузку на прооперированную лапу, о чем свидетельствует растопыренные пальцы конечности при ходьбе. Периодически хромают только те животные, которые имели проблемы с заживлением ран. У них на месте ран сохранены небольшие участки струпа, отделяемого нет. У остальных раны зажили, на месте послеоперационной раны нежные рубцы не подпаянные с подлежащими тканями, без признаков воспаления. Пальпаторно: осмотр безболезненный, не вызывает у животных тревоги, крепитация не определяется, патологическая подвижность также отсутствует. Объем и температура прооперированной конечности у всех крыс соответствует контралатеральной.

Через 14 дней после начала опыта макроскопически мягкие ткани окружающие место перелома не отечны, нормального вида, определить место перелома можно только по значительному утолщению кости. Гистологическая картина области перелома следующая: ткани окружающие эту область обычного вида, определяются лишь единичные лимфоидные элементы. В надкостнице сохраняются участки многорядного расположения клеток, у большинства из них ядра небольшие овальные хорошо прокрашены. Вокруг области перелома скопление небольшого числа фибробластов и волокон фиброзной ткани. Плотное вещество кости представляет собой сплошную пластину, хотя и несколько суженную, по сравнению с таковой над и под областью перелома. В ней много гнезд с 1-2 остеоцитами, капсула гнезда утолщена ярко базофильная. Внутрь от пластины костной ткани скопление из гистиоцитов, клеток похожих на хондроциты, островков плотного костного вещества (рис. 5.2.1). Костный канал над областью перелома заполнен такой же смесью, но имеются еще и переплетающиеся балки.

Рис. 5.2.1. Внутренняя часть области перелома. 14-е сутки опыта, 3-х кратное введение плазмы, обогащенной тромбоцитами. Островки плотного матрикса, сливающиеся между собой, очаги скопления «остеоцитарных» клеток. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: Ч100.

Биохимические показатели состояния обмена ионов кальция, фосфора и активности щелочной фосфатазы в плазме крови подопытных животных, при применении инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами, на 14-е сутки эксперимента изменялись следующим образом. Исходя из данных таблицы 5.1.1 концентрация ионов СаІ⁺ в плазме крови крыс при репаративной регенерации костной ткани в четырнадцати суточный срок, практически равен концентрации оных у контрольной группы животных. По сравнению с семидневным сроком применения исследуемого способа лечения, концентрация ионов недостоверно выше, но все еще не достигает уровня контрольной группы. Если концентрацию данного элемента сравнить с показателями на том же сроке но в других группах, можно увидеть отличия. По сравнению с группой перелома, на который не оказывали внешних воздействий, уровень ионов СаІ⁺ в данной группе недостоверно ниже, но в глаза особо бросается разница в концентрации этого элемента по сравнению группой лечения перелома осуществлялось с применением фонофореза с препаратом, содержащим пчелиный яд, где она примерно в два раза выше. Картина изменения концентрации ионов фосфора, в описываемой группе подопытных животных, выглядит так. Концентрация ионов (РО₄^3-) по сравнению с контрольной группой выше в полтора раза и в два раза выше концентрации тех же ионов в семисуточный срок эксперимента с применением инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами. Если сравнить этот биохимический показатель с соответствующими в группах II и III, то можно отметить следующее. Содержание ионов фосфора в плазме крови животных у которых лечение переломов не проводилось и леченых с применением фонофореза препаратом пчелиного яда в сроке 14 суток после оперативного вмешательства, примерно равны и по отношению к контрольной группе в два раза снижены, а по отношению к группе леченых переломах плазмой, обогащенной тромбоцитами, снижены в три раза. Активность щелочной фосфатазы в группе при лечении перелома малоберцовой кости применялась инъекция плазмы, обогащенной тромбоцитами, по срокам выглядит следующим образом. На 14-е сутки активность щелочной фосфатазы на 1/5 выше чем в контрольной группе, и почти в два раза чем в 7-дневный срок это же группы. Если сравнивать с описанными выше группами, то активность щелочной группы с применением обогащенной тромбоцитами плазмы, в этот срок завершения эксперимента, выше почти в два раза выше. Снижение содержания ионов СаІ⁺ при повышенном содержании ионов (РО₄^3-) и активности щелочной фосфатазы позволяет считать, что усвоение и использование СаІ⁺ у этих животных очень активное, что способствует восстановлению кости.

Сравнив данные полученные при наблюдении за животными на этом сроке эксперимента после проведения оперативного вмешательства, видно что, по общему состоянию и по внешнему виду, потреблению пищи и воды в сравниваемых трех группах особых отличий не обнаружено. При всех видах лечения, которые применялись в работе, животные ведут себя активно, по клетке перемещаются, на прооперированную лапу наступают. Пальпаторное исследование безболезненно, крепитация отломков не прослеживается в группах леченых с применением фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда и инъекцией плазмой, обогащенной тромбоцитами. Но незначительная подвижность в месте перелома сохраняется в первых двух группах. Следует особо отметить, что у крыс принимающих процедуры фонофореза с препаратом пчелиного яда и инъекцией плазмой, обогащенной тромбоцитами визуально отечность оперированной лапы отсутствует. При макроскопическом и гистологическом исследованиях, у крыс, которые получали плазму обогащенную тромбоцитами окружающие место перелома ткани обычного вида и не просматривается линия перелома из-за плотного расположение клеток, а также наличие клеток сходных и хондроцитами. Вышеперечисленные особенности гистологической картины отличают данную группу от двух предыдущих. Что касается анализа биохимических исследований оно приведено выше.

5.3 Структурная и метаболическая характеристика репарации перелома кости на 21-е сутки опыта при применении инъекции плазмы, обогащенной тромбоцитами

Наблюдение за подопытными крысами показало, что на 21-й день опыта они выглядят совершенно нормально и неотличимы от здоровых. Перемещение по клетке активное, в процессе используя все конечности в одинаковой мере. При нагрузке на прооперированную конечность пальцы растопырены.
Шерсть гладкая, лоснится, носы чистые теплые, глаза ясные. Прием пищи и воды такое же как и у здоровых животных. При визуальном исследовании поврежденной конечности видна полная эпителизация послеоперационной раны, пальпаторно конечность безболезненная, пальпируется плотная избыточная мозоль на месте экспериментального перелома. Диаметр конечности незначительно больше за счет гипертрофированной костной мозоли. Температура поврежденной конечности соответствует данным здоровой, контралатеральной.

При изучении гистологической картины ткани окружающие перелом обычного вида, межмышечные перегородки тонкие, плотные, миоциты обычного вида с выраженной поперечной исчерченностью. Инфильтрирование ткани клеточными элементами не выявлено. Вокруг зоны бывшего перелома сформирована тонкая муфта из негрубых фиброзных волокон. Надкостница расположенная над областью экспериментального перелома такая же тонкая как и над остальной костью. Клеточные ядра мелкие темные, располагаются в один ряд. Сохраняются образовавшиеся из грубых коротких фиброзных волокон, плотно упакованных снаружи от надкостницы.

Плотное вещество кости сплошное, в наружной части однородное темно-эозинофильное с рассеянными гнездами остеоцитов (рис. 5.3.1). В гнезде 2-3 остеоцита со средних размеров ядрами, хорошо прокрашенными, средних размеров. Располагающаяся ближе к костному каналу часть плотного вещества в целом сходна с вышеописанным костным веществом, но отличается наличием островков коллагеновых волокон в своей толще. Также в костном канале определяются тонкие костные балки, переплетающиеся, но не создающие единую структуру, в их ткани определяются небольшие группы базофильных фиброзных волокон.

Рис. 5.3.1. Перелом малоберцовой кости крысы. 21-е сутки опыта, введение плазмы, обогащенной тромбоцитами. Крупные гнезда остеоцитов в костной балке, внутрикостный канал. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: Ч100.

Биохимические данные исследований (таблица 5.1.1) свидетельствуют, что у подопытных животных концентрация ионов СаІ⁺ примерно на 20% ниже, чем в контрольной группе и примерно на столько же, чем в 14-тисуточный срок эксперимента (рис. 5.3.2). Также он снижен и по сравнению к 7-мидневному сроку эксперимента в этой же группе. Если сравнить эти биохимические данные с аналогичными на 21-е сутки эксперимента с переломом, на который не оказывалось воздействий, и лечением перелома при помощи фонофореза с препаратом пчелиного яда, то оказывается что концентрация ионов СаІ⁺ самая низкая. Так по сравнению с группой, где специфического лечения перелома не проводилось, концентрация снижена почти на треть, и более чем в два раза ниже группы с применением лечения фонофореза.

Рис. 5.3.2. Отношение концентрации Са²⁺ плазмы крови у животных при воздействие на сращении перелома фонофореза с нативным пчелинным ядом, инъекцией плазмы, обогащенной тромбоцитами, переломом, на который не оказывалось внешних воздействий в различые сроки опыта, к интактным животным.

Ионы фосфора на 21-е сутки после значительного увеличения в 14-тисуточный срок, практически вернулись к величине в 7 дней, но все также осталась на треть ниже контрольной группы. Но среди таких же показателей двух других групп на 21-е сутки эксперимента, остается самой высокой, примерно на четверть (рис. 5.3.3). А вот активность щелочной фосфатазы на данном этапе эксперимента такая же, как в контрольной группе, но по отношению к 14-тидневному сроку, при лечение инъекцией, снижен на четверть. При сравнении с двумя оставшимися группами, на 21-е сутки, уровень активности щелочной фосфатазы на треть выше. Можно полагать, что интенсификация кальциевого обмена нормализуется в связи с восстановлением кости (рис. 5.3.4).

Рис. 5.3.3. Отношение концентрации (РО₄^3-) плазмы крови у животных при воздействие на сращении перелома фонофореза с нативным пчелинным ядом, инъекцией плазмы, обогащенной тромбоцитами, переломом, на который не оказывалось внешних воздействий в различные сроки опыта, к интактным животным.

При сравнении всех групп экспериментальных животных в 21-суточный срок после выполнения экспериментального перелома можно констатировать следующее. Животные в эксперименте по внешнему виду, поведению, потреблению пищи и воды абсолютно не отличаются от здоровых. При визуальном осмотре оперированной конечности выделяется только тот факт, что в группах с применением лечение перелома фонофорезом с препаратом, содержащим пчелиный яд или инъекция, в место перелома, плазмы, обогащенной тромбоцитами, конечность незначительно увеличена в объеме из-за гипертрофированной костной мозоли. Избыточная мозоль на функцию конечности не влияет.

Рис. 5.3.4. Отношение активности щелочной фосфатазы у животных при воздействие на сращении перелома фонофореза с нативным пчелинным ядом, инъекцией плазмы, обогащенной тромбоцитами, переломом, на который не оказывалось внешних воздействий в различные сроки опыта, к интактным животным.

ГЛАВА VI. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Обобщая полученные нами результаты, прежде всего, хотим отметить, что в ходе эксперимента мы наблюдали наличие всех стадий регенерации костной ткани в области перелома, описанные Н.А. Коржом, Н.В. Дедух, О.А. Никольченко [60]. Следует только отметить, что выраженность каждой из стадий была индивидуальна, а протяженность много короче, чем указано в цитируемой работе. Последнее, очевидно, обусловлено особенностями биологии подопытных животных.

Особенности нанесения травмы кости в наших экспериментах состояло в том, что гематома, излившаяся в область пересечения кости, была выражена незначительно. В связи с незначительным количеством излившейся, в области повреждения, крови - как источника факторов роста костной ткани, мы вправе полагать, что у подопытных животных имело место вторичное сращение кости, включающее энхондральную и интрамембранную оссификацию.

Гистологические изменения в области костной травмы в первые трое суток эксперимента выявили резкое полнокровие кровеносных сосудов, в окружающих тканях, но не выявило новообразования сосудов. Последнее обстоятельство вместе с выявленным выраженным отеком создает условия для ухудшения кислородного обеспечения области травмы и согласно мнению Н.А. Коржа [58] определяет преимущественно хондрогенный путь процесса репарации кости. Кроме того отсутствие выраженной гематомы определяет незначительное количество нейтрофилов и тромбоцитов в области травмы, преимущественное количество лимфоцитов и гистиоцитов, а также быстро проходящие признаки воспаления. Можно полагать, что хотя количество цитокинов и монокинов при этом будет умеренным, отсутствие развернутого воспалительного процесса способствует ускорению перехода в фазу тканеспецифических структур. Об этом свидетельствует увеличение числа надкостничных клеток, появление в области дефекта матриксных веществ и пучков волокон (коллагеновых). Последнее свидетельствует о существующей возможности дисрегенирации. Следует отметить, что ведущие специалисты травматологи выделяют процессы оссификации и минерализации костного регенерата в более поздние стадии процессы заживления, в то же время у наших подопытных крыс уже на 3-и сутки опыта обнаруживались изменения кальциевого обмена. Суть этих изменений сводилась к увеличению содержания кальция в плазме крови, т.е. можно полагать, что имеет место мобилизация его из депо, в том числе и неповрежденных костей. Такая мобилизация описывается в литературе [59] в завершающих стадиях репарации кости. Очевидно, такого жесткого деления на стадии в действительности не происходит и уже в начальных стадиях репарации имеет место выделение Са²⁺ из депо и удержание его в русле крови (рис. 6.1).

Рис 6.1. Сравнительная оценка показателей кальциевого обмена у крыс с переломом при разных способах коррекции и разных сроках эксперимента.

Об удержании Са²⁺ в русле свидетельствует сохранение близким к контролю уровня фосфора в плазме и некоторое ослабление активности щелочной фосфатазы. Без адекватного количества фосфора и активности щелочной фосфатазы усвоение кальция тканями не проходит, т.е. можно говорить о подготовке к кальцификации восстанавливаемого дефекта, но не о протекании его на стадии воспаления.

В дальнейшем (7-14-е сутки опыта) мы наблюдали процессы формирования тканеспецифических структур кости в области перелома, т.е. можно полагать, что мы наблюдали вторую стадию процесса регенерации. Такое заключение позволяет сделать наблюдаемое число клеточных элементов надкостницы и признаки повышенной функциональной активности этих клеток. В этой стадии мы наблюдали в области перелома большое количество фибринозных волокон, при этом большая их часть не организована, т.е. вероятность возникновения дисрегенерации в этот период еще возможна, т.к. остеобластическая дифференцировка клеток происходит с умеренной активностью [8]. Уместно говорить только о вероятности дисрегенерации, т.к. наряду с обилием фиброзных волокон наблюдаются достаточно большие участки гомогенного матрикса и сформированные или формирующиеся гнезда из клеток сходных по внешнему виду с остеобластами. Одновременно наблюдается увеличение содержания кальция в плазме крови, т.е. процесс его мобилизации продолжается. Одновременно отмечается увеличение содержания фосфора и повышение, правда, недостоверное, активности щелочной фосфатазы. Можно полагать, что в этот период несколько ослабевает процесс усвоения кальция тканями. Следует отметить, что к моменту завершения этой фазы (14-е сутки опыта), когда микроскопические признаки оссификации уже отчетливо видны, активность щелочной фосфатазы и содержание фосфора существенно выше, чем в начале ее. Интенсивность процесса кальцификации, очевидно, коррелирует со скоростью и массивностью структурных преобразований в зоне регенерации. Об этом свидетельствует наличие в зоне регенерации участков плотного костного вещества с гнездами остеобластов. Эти участки разных размеров, частью соединяются между собой, в некоторых местах сливаются. Кроме того в костномозговом канале появляются выросты фиброзной ткани, содержащие гнезда остеобластов и внешне похожие на костные балки.

На следующем этапе эксперимента мы наблюдали переход процесса репарации в стадию ремоделирования. Гнезда остеобластов располагаются в основном по продольной оси кости, их структура соответствует той, что наблюдается у здоровых животных. Плотное вещество кости однородное, фиброзные волокна если и встречаются, то только в виде единичных нетолстых пучков. В надкостнице клетки утрачивают признаки повышенной функциональной активности, а структурно-функциональная организация ее приближается к норме. При этом сохраняется корреляция с интенсивностью обмена кальция, хотя его уровень остается много выше контроля, но поскольку содержание фосфора и активность щелочной фосфатазы относительно Са²⁺ снижены. Интенсивность поступления его в клетки органической кости остается высоким, кроме того формируется неорганический матрикс.

Согласно существующим представлениям [4] поступление Са²⁺ в клетку осуществляется через сопряжение его с ионами фосфора, которые в свою очередь высвобождаются за счет активности щелочной фосфатазы. Кальций относится к макроэлементам и его роль в организме весьма многообразна. Он не только в составе минеральных солей обеспечивает твердость тканей опорно-двигательной системы, а также участвует в регуляции процессов торможение-возбуждение нервной ткани и в регуляции многих метаболических процессов, в том числе и окислительно-восстановительных процессов энергообеспечения, трансмембранного транспорта. Соответственно повышение его в крови в ионной форме оказывает стимулирующее влияние на транспортировку его в место репарации кости и образования Са₃(РО₄)₂ - основного ее компонента. Активация проникновения Са²⁺ в ткани и переход его нерастворимую фосфатную форму тесно коррелирует со снижение уровня фосфора в плазме крови. Можно полагать, что в данной фазе репарации имеет место уплотнение минеральной компоненты костной ткани, что обуславливает интенсификацию усвоения и отложения кальция - снижение содержания фосфора в плазме. При этом наблюдается снижение активности щелочной фосфатазы. Поскольку щелочная фосфатаза - фермент обеспечивающий фосфоролиз и высвобождение (РО₄^3-) из соединений [69, 117], то повышение ее активности может способствовать повышенному высвобождению (РО₄^3-) и благодаря избытку ионов Са²⁺ в плазме существенно массировать поступление его в область регенерации кости. Однако, фосфор-содержащие соединения играют ведущую роль во многих метаболических процессах, и особенно в процессах энергообразования и аккумуляции энергии, поэтому избыточное высвобождение (РО₄^3-) может повредить оптимальному развитию этих процессов (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Сравнительная оценка показателей фосфорного обмена у крыс с переломом при разных способах коррекции и разных сроках эксперимента.

Очевидно, необходимость предотвратить подобные нарушения и обуславливает снижение активности щелочной фосфатазы в фазе воспаления и фазе ремоделирования костной мозоли. Очевидно, что время на процессы транспорта, усвоения и преобразования кальция в Са₃(РО₄)₂ можно с одной стороны влиять на скорость репарации перелома, а с другой контролировать возможную дисрегенерацию кости во второй фазе процесса заживления.

Согласно данным литературы [86, 99] одним из природных соединений, активно влияющим на состояние кости и обмен кальция являются пчелиный яд и препараты из него произведенные. Мы использовали мазь, содержащую нативный пчелиный яд, вводимую ультрафонофорезом в область перелома для регулирования процессов регенерации костной ткани.

Полученные нами данные свидетельствуют о положительном влиянии такого воздействия. Внешне это проявлялось в том, что уже на 7-е сутки опыта, т.е. на 7 суток раньше, чем в предыдущей группе у животных нормализовывался внешний вид и подвижность, а также активность использования поврежденной конечности. Полное соответствие их поведения, внешнего вида и подвижности мы фиксировали на 14-е сутки опыта, а не на 21-е сутки, как в предыдущей группе.

Особенностью гистологической картины области перелома на 3-е сутки опыта было выраженное отечное изменение тканей окружающих перелом (очевидно влияние пчелиного яда) и сконцентрированность лимфоцитов с гистиоцитами в области дефекта. В отличие от подопытных животных II-й группы, где на перелом не оказывалось внешних воздействий, отмечалось более диффузное распространение инфильтрата. Кроме того в области дефекта определялись короткие пучки довольно грубых фиброзных волокон. В остальном гистологическая картина области перелома совпадала с описанием данного срока наблюдений у крыс предыдущей группы. В целом можно говорить о неяркой воспалительной реакции и активном появлении элементов фазы образования тканеспецифических структур.

Что касается состояния кальциевого обмена, то согласно данным таблицы 6.1 содержание кальция в плазме крови в этом периоде было наибольшим за весь период наблюдений, кроме того в начале этого периода отмечается резкое повышение его содержания в первые трое суток и снижение до нижней границы нормы к 7-м суткам.

Таблица 6.1

Сравнительная оценка показателей кальциевого обмена у крыс с переломом при разных способах коррекции (М±m)

* р ? 0,05 по отношению к норме.

Хотя в работах П.А. Починковой и соавт. [99, 100] отмечается, что у здоровых животных пчелиный яд не влияет на активность щелочной фосфатазы, по нашим данным под его влиянием ослабляется снижение активности этого фермента у крыс с переломом кости. Таким образом можно говорить о том, что в условиях применения пчелиного яда в начальный период регенерации перелома не происходит угнетения поступления Са²⁺ в клетки и область самого перелома. Благодаря биологическим свойствам кальция это ослабляет интенсивность воспалительной реакции и обеспечивает более ранее его влияние на процессы пролиферации и дифференциации остеобластов.

Продолжение наблюдения за крысами данной подопытной группы показало, что на 14-е сутки опыта поведение и внешний вид животных полностью соответствует норме. Поврежденная конечность пальпаторно и визуально, по своим характеристикам, соответствует противоположной здоровой конечности.

Гистологическая картина области перелома отличается от таковой здоровой кости только наличием отдельных пучков грубых коротких фиброзных волокон в надкостнице, в плотном веществе кости и новообразующихся балках в костном канале. Все вышеописанное позволяет говорить о завершении этапа формирования тканеспецифических структур, но и этапа ремоделирования и кальцификации. В пользу последнего предположения свидетельствует снижение содержания кальция и фосфора в плазме при относительно высокой активности щелочной фосфатазы, т.е. имеются проявления активного проникновения кальция в область перелома и реализация его биологического потенциала.

Наконец к моменту завершения эксперимента (21-е сутки после перелома) поведение животных, их внешний вид, визуальное и пальпаторное состояние поврежденной лапы полностью соответствовали данным здоровых животных.

Гистологическое исследование области перелома не выявило отличий от таковой у здоровых животных. Единственной особенностью подопытных животных было наличие в балках костномозгового канала отдельных небольших пучков грубых фиброзных волокон. В это же время уровень кальция в плазме резко повышался, однако активность щелочной фосфатазы и соответственно содержание фосфора было достоверно ниже нормы. Можно полагать, что высвобождение кальция из депо сохраняется на высоком уровне активности, в то же время поступление его в зону перелома резко ограничено, в связи с завершением процесса репарации (рис. 6.3).

Рис. 6.3. Сравнительная оценка показателей активности щелочной фосфатазы у крыс с переломом при разных способах коррекции и разных сроках эксперимента.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о сокращении времени регенерации перелома кости при применении фонофореза с препаратом, содержащим пчелиный яд. Это проявлялось в сокращении длительности каждой из фаз процесса репарации и появлении эффекта «перекреста», т.е. на пике каждой из фаз мы наблюдали выраженные проявления следующей. Еще одним моментом определяющим сокращение длительности фаз было уменьшение выраженности воспалительных изменений. Следует заметить, что описанные особенности течения процесса регенерации напрямую коррелировали с особенностями кальциевого обмена. Во-первых уровень Са²⁺ в плазме крови у крыс, получавших препарат, содержащий нативный пчелиный яд, выше чем у крыс с переломом на который не оказывалось воздействий. Во-вторых, активность щелочной фосфатазы на протяжении опыта была выше, чем у II-й группы подопытных животных, а в-третьих фосфор в плазме понижался к 7-м, а не 3-м суткам опыта. Эти особенности позволяют полагать, что под влиянием пчелиного яда усиливается мобилизация кальция из депо, но первоначально он в основном циркулирует в крови в силу этого стимулирующее действие Са²⁺ на секреторную активность тучных клеток в тканях в области перелома ограничена. Кроме того сам пчелиный яд тормозит секрецию медиаторов воспаления из тучных клеток. Совокупность этих влияний и обеспечивает невыраженность воспаления в области перелома. Высокая активность щелочной фосфатазы, которая сохраняется под влиянием пчелиного яда, обеспечивает достаточное образование (РО₄^3-), за счет чего к 7-м суткам в клетки содержащиеся в дефекте кости поступает Са²⁺ в большом количестве. В клетках ретикуло-гистиоцитарной системы, определяемых в переломе за счет стимулирующего действия Са²⁺ активизируется образование фибробластов и синтез хондроитина сульфатов, что благоприятно сказываются на формировании тканеспецифических элементах кости. Следовательно, под влиянием препарата содержащего пчелиный яд, происходит повышение эффективности влияния кальция на процессы пролиферации и «перекрест» фаз восстановления кости.

На заключительном этапе исследований мы оценивали влияния фактора непосредственно действующего на регуляцию проницаемости сосудистой стенки, дифференциацию клеток зоны регенерации кости и кальциевый обмен (плазма, обогащенная тромбоцитами) на характер и скорость процесса восстановления перелома.

Результаты исследований показали, что внешний вид крыс уже на 7-е сутки опыта (1 инъекция плазмы) не отличался от такового у здоровых крыс. В предыдущих группах крысы так выглядели на 21-е сутки (II группа) или 14-е (III группа).

Осмотр поврежденной конечности выявил остаточные явления отечности, незначительную болезненность. Животные пользовались поврежденной конечностью, но весьма осторожно. Это соответствует 14-м суткам группы, где перелома не сопровождался внешним воздействиям, и 7-м суткам группы с использования комбинированного препарата пчелиного яда. Другими словами скорость восстановления животных после перелома при использовании обогащенной тромбоцитами плазмы резко возрастает. Макроскопическое исследование самого перелома выявило формирование на месте перелома достаточно плотной соединительной муфты, что является проявлением своеобразия течения репаративного процесса у этих животных.

Гистологическое исследование не выявило признаков воспалительных изменений в окружающих тканях, это отмечает течение патологического процесса у животных данной группы от его развития у животных двух предыдущих. Можно полагать, что при травме кости не сопровождающейся формированием гематомы роль регулятора репаративных процессов выполняют биоактивные соединения, содержащиеся в тромбоцитах, а не выделяющиеся клетками гематомы.

Еще одним отличием животных данной группы является наличие, уже на 7-е сутки опыта сплошной пластины плотного вещества, соединяющей края отломков. От этой пластине отходят многочисленные «язычки» состоящие из пучков коротких грубых фиброзных волокон. В сформировавшейся пластине гнезда остеоцитов многочисленны. Включают 3-4 клетки и окружены плотной капсулой из ярко окрашенных соединительнотканных волокон. В целом можно говорить о резком ускорении репарации костной ткани при использовании плазмы, обогащенной тромбоцитами, за счет исключения из процесса фазы воспаления и развития фазы образования тканеспецифических элементов уже в первые дни после инъекции. Очевидно, это происходит за счет биоактивных компонентов тромбоцитов. Подтверждает такую возможность действия тромбоцитарной массы и сохранение интенсивности кальциевого обмена, в этом сроке наблюдений, близким к контролю, т.е. в реализации механизма регуляции репаративной активности через действие ионов кальция в условиях избытка тромбоцитов нет.

Дальнейшее наблюдение за развитием процесса репарации кости выявило, что на 14-е сутки опыта поведение, внешний вид, степень использования поврежденной конечности полностью соответствует здоровым животным. Визуальное и пальпаторное обследование поврежденной конечности не выявило отличий от здоровой конечности. Единственная особенность состояла в том, что в области перелома прощупывалось утолщение кости с неровной поверхностью, однако пальпация этого плотного образования было безболезненна для подопытных животных. При микроскопическом исследовании в области перелома мягкие ткани полностью соответствуют таковым у здоровых животных. В надкостнице, в этой области имеют место единичные участки с двух-трехрядным расположением клеток, однако ядра этих клеток плотные, мелкие, т.е. имеет место нормализация состояния надкостницы. Что касается собственно кости, то она также практически полностью соответствует норме. Единственные отличия состоят в ярко базофильной окраске капсул остеоцитов, наличии небольших групп фиброзных волокон с наружной части кости и небольших скоплений гистиоцитов с ее внутренней стороны и в просвете костного канала. Кроме того в просвете канала определяется не до конца оформленная сеть костных балок. Что касается обмена кальция, то определяется только достоверное увеличение содержания (РО₄^3-) и активности щелочной фосфатазы, содержание Са²⁺ соответствует нижней границе физиологической нормы. В целом мы можем утверждать, что на 14-е сутки опыта, при введении крысам плазмы, обогащенной тромбоцитами, имеет место завершающий этап фазы ремоделрования костной ткани и обусловлено оно не столько изменениями кальциевого обмена, сколько непосредственным влиянием тромбоцитов.

Наконец, в заключительный период эксперимента - 21-е сутки после перелома малоберцовой кости наблюдение за подопытными животными не выявило отличий от здоровых крыс. Визуально-пальпаторные исследование поврежденной конечности не выявило отличий от контрлатеральной здоровой лапы за исключением небольшого утолщения на линии перелома.

При гистологическом исследовании костная ткань в области перелома полностью совпадает по своим характеристикам с остальной костью. Особенность, позволяющая обособить область перелома, это короткие пучки грубых фиброзных волокон прилегающих к кости с наружной стороны. Показатели обмена кальция находятся в приделах нормы.

Таким образом, результаты данной группы позволяют говорить о резкой интенсификации под влиянием тромбоцитарной массы, второй и третьей фазы процесса регенерации кости в области перелома, что резко (приблизительно на 30%) сокращает время его заживления и нивелирует возможность редегенерации кости в фазе формирования тканеспецифических элементов.

Поскольку в течение всего эксперимента показатели обмена кальция остаются в приделах нормы, можно полагать, что биоактивные соединения, находящиеся в тромбоцитах осуществляют непосредственное регуляторное влияние на процессы репарации и дифференциации клеточных элементов в области перелома, а также на интенсивность минерализации новообразованной кости.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при фазном процессе регенерации костного перелома, в процессе механизма управления выступает интенсивность обмена кальция (рис. 6.1). На первом этапе, когда в область перелома сформируется гематома, и биорегуляторные молекулы (цитокины, интерлейкины и др.) выделяются клетками лимфоидного ряда обеспечивают мобилизацию кальция из депо, снижение активности щелочной фосфатазы и соответственно снижения содержания (РО₄^3-) в плазме (рис. 6.2) сдерживает массированное поступление Са²⁺ в область перелома и тем самым предотвращает нерегулируемую активацию пролиферацию и дифференциации тканеспецифических элементов кости. Затем происходит постепенное увеличение активности щелочной фосфатазы (рис. 6.3), что обеспечивает повышение поступления кальция в область перелома, что стимулирует процессы формирования специфических тканей кости, т.е. происходит переход ко второй фазе регенерации - формировании костной ткани и кальцификации. Снижение содержания кальция в крови за счет инактивации щелочной фосфатазы, очевидно, обуславливает переход к окончательному формированию кости. Использование пчелиного яда в качестве стимулятора репарации не меняет этот механизм регуляции, а только интенсифицирует обмен кальция, что сокращает длительность каждой фазы и создает условия для их «перекреста», т.е. выраженном появлении компонентов последующей фазы в существующей. Поступление большого числа тромбоцитов в область перелома меняет обычный порядок регуляции репараций, самостоятельность кальциевого обмена снижается (колебания активности компонентов его более размашисты), а регуляция процессом, очевидно, осуществляется биорегулятоными молекулами из тромбоцитов (возможно гепарином). За счет такого вмешательства первая фаза (воспаления) практически сворачивается, а для остальных более отчетлив эффект «перекреста», что резко сокращает длительность всего процесса заживления.

Другими словами интенсивность кальциевого обмена является существенным патогенетическим механизмом репарации перелома, а коррекция его активности может влиять на интенсивность, скорость и качество восстановления кости.

ВЫВОДЫ

В диссертационной работе приведены теоретические обобщения результатов экспериментального исследования и достигнуто решение актуальной научной задачи - обосновать патогенетически значащие механизмы регуляции процессами репарации при переломах костей и определения возможности регуляции этих процессами природными факторами: препаратом, содержащим пчелиный яд, и/или плазмой, обогащенной тромбоцитами.

1. Состояния обмена кальция, в частности его высвобождение из депо и усвоение в костной ткани, - важный фактор процесса регуляции репарации кости. Так как фазность процесса сращение кости при переломе сопровождается колебаниями активности кальциевого обмена в виде интенсификации в фазе воспаления и ремоделирования (на 10-15 %), и снижение его активности в фазе образования тканеспецифических элементов. Колебание содержания кальция в крови животных позитивно коррелирует с содержанием (РО₄^3-), как основного проводника Са²⁺.

2. Изменение активности щелочной фосфатазы, которая обеспечивает мобилизацию (РО₄^3-) из соединений, является фактором регулирования интенсивности обмена кальция, так как ее активность в фазах процесса регенерации, в которых происходит пролиферация и дифференцировка клеточных элементов костной ткани, снижена на 30-35 %.

3. Введение пчелиного яда в область перелома ускоряет процесс регенерации кости до ? 30 %. Поскольку при этом характер колебаний показателей кальций-фосфорного обмена не меняется по отношению к данным о протекании процесса регенерации без вмешательств, можно считать, что он приводит к интенсификации этих процессов и появления эффекта «перекреста» - появлении последующей фазы при незавершенной предыдущей - изменения концентрации Са²⁺ в период ремоделирования происходит в пределах 200 %.

4. Введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, в область костной раны сокращает продолжительность процесса на 30% за счет выключения фазы воспаления, низкой интенсификации фазы формирования тканеспецифических элементов, которые в большом количестве присутствуют в тромбоцитарных факторах роста. Непосредственно влияние тромбоцитарных факторов роста на процесс регенерации сопровождается снижением влияния кальциевого обмена на этот процесс, об этом свидетельствует сохранения его показателей и активности щелочной фосфатазы относительно интактных животных.

5. Регулирования скорости интенсификации процесса регенерации костной ткани, при переломе, осуществляется за счет изменения интенсивности обмена кальция, важным механизмом которого является активность щелочная фосфатаза. Скорость процесса регуляции регенерации кости можно ускорить путем коррекции интенсивности кальциевого обмена или непосредственно воздействием на скорость появления тканеспецифических элементов кости факторами роста тромбоцитов.

6. С целью ускорения восстановления поврежденной кости при экспериментальных переломах у крыс положительное влияние выявлено при применении пчелиного яда и плазмы, обогащенной тромбоцитами, что обосновывает целесообразность их применения в клинической практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пчелиный яд при его применении следует вводить путем фонофореза. Применение ультразвука может быть благоприятным в связи с особенностями его биологического воздействия. Это воздействие состоит в том, что механическая энергия, проходя через ткани, трансформируется в тепловую, что способствует ускорению биологических реакций, улучшает кровообращение, лимфоотток и обеспечивает обезболивающее, сосудорасширяющее, рассасывающее и противовоспалительное действие. Процедуры следует выполнять в период спустя одну неделю после получения перелома, или оперативного лечения.

2. Введение в область перелома кости плазмы, обогащенной тромбоцитами, ускоряет сращение за счет непосредственного влияния на скорость пролиферации клеточных элементов, поэтому этот метод следует применять в случаях, когда отягощен явлениями остеопороза. Инъекцию следует выполнять раз в неделю в сроки от двух недель с момента получения травмы или первичном хирургическом вмешательстве, или с пятых суток после хирургического лечения псевдоартрозов.

3. Наличие разных механизмов воздействия на скорость регенерации делает применение пчелиного яда или плазмы, обогащенной тромбоцитами методом выбора, который зависит от состояния больного. При комплексном применении апифонофореза с инъекцией плазмы, обогащенной тромбоцитами, следует придерживаться следующей схемы: четыре сеанса апифонофореза, через сутки инъекция, сутки на отдых. Продолжительность терапии определяется индивидуально у каждого пациента.