Влияние эндогенных и экзогенных стимуляторов роста на механизмы репаративной регенерации костной ткани

Б.А. Охотский с сотр. [92, 93] применял пчелиный яд с ультразвуком УТП-1 880 мгц. электроды 4 см 0,4-0,6 вт/см 5-10 минут 10-15 процедур. Добились стойкой аналгезии и длительной ремиссии при лечение неспецифических артритов. А.И. Балтушкявичус с сотр. [3] предложили унгаливен для электрофореза, они считали, что наиболее эффективно сочетание яда и ультразвука. Э. Щербан [136] с целью сравнения лечил две группы пациентов, страдающих артрозом одного или обоих коленных суставов. Перед применением ультразвука (10 процедур при интенсивности звука 0,5 Вт/см² в течение 5-10 мин) одной группе втирали препарат яда «Форапин», а другой - гидрокортизоновую мазь. Терапия ультразвуком с «Форапином» дала лучшие результаты, чем с гидрокортизоном. В первой группе у 70 % лечившихся установлено исчезновение болей и припухлости, улучшение подвижности суставов, а у 25 % пациентов этой группы боли исчезли или уменьшились, но припухлость или ограниченность движений суставов осталась. Во второй группе процентное соотношение составляло соответственно 52 и 30 %.

Исходя из данных доступной литературы, нельзя сделать вывод о возможных механизмах воздействия пчелиного яда в сочетании с фонофорезом на костную ткань во время репаративной регенерации костной ткани. Также мы не обнаружили упоминания о фактах применения апифонофореза в острую стадию заживления костной ткани, соответственно данных о возможной стимуляции регенерации костной ткани.

1.3 Современные взгляды на влияние плазмы, обогащенной тромбоцитами на регенерацию костной ткани

Первые кто начал применять фибрин и производные из него препараты для ускорения заживления костных ран - стоматологи [215]. Один из таких препаратов был фибриновый клей, который активно применялся при прикреплении тканей во время различных пластик [83, 185, 203, 188]. Одной из модификаций фибринового клея является обогащенная тромбоцитами плазма. Так как готовится она из аутологической крови содержащиеся в ней в большом количестве цитокины, которые регулируют течение процесса воспаления привлекая в очаг нейтрофилы и моноциты/макрофаги и усиливают их адгезию к клеткам эндотелия и не вызывают иммунологических реакций. Вводимые цитокины обеспечивают гуморально-клеточную кооперацию крови и костной ткани и сдерживают развития воспалительной реакции [123, 156]. Наряду с этим цитокины принимают участие в костной перестройки, дифференцировке клеток предшественников иммунной системы, в клеточной активации и пролиферации, а также обеспечивают экспрессию молекул адгезии и острофазового ответа [47, 135, 208, 217]. Эта разновидность фибринового клея вызывает миграцию и деление всех мезенхимальных клеток, в том числе хондроцитов и мезенхимальных стволовых клеток, а также эпителиальных клеток, кроме того стимулирует синтез коллагена и матрикса соединительной ткани [201, 198, 210, 142].

При выполнении инъекций плазмой обогащенной тромбоцитами в случае не осложненного течения перелома, меньше выражена отечность в поврежденных тканях, меньше признаки острого и хронического воспаления, фаза альтерации быстрее сменяется регенераторно-репаративными процессами. В ряде работ показана целесообразность применения препаратов фибрина для ускорения регенерации тканей в клинике и эксперименте [8, 13, 72, 73, 74, 75, 150]. Использование обогащенной тромбоцитами плазмы для ускорения репарации кости и мягких тканей в настоящее время стало одним из направлений в реконструктивно-восстановительной хирургии. В настоящее время эта биотехнология привлекает все большее внимание клиницистов, а понимание механизмов ее лечебного действия - теоретиков [13, 19, 35, 114, 52, 105, 106, 149, 169, 173, 177, 186, 192, 209]. Известно, что при разрушении мембран клеточных элементов выделяются факторы роста. Следует отметить, что основные из них содержащиеся в богатой тромбоцитами плазме это тромбоцитарный фактор роста (PDGF-aa, PDGF-bb, PDGF-ab), трансформирующий фактор роста (TGF-вI, TGF-в2), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эпителия (EGF). Эти естественные факторы роста находятся в ней в биологически предопределенных соотношениях, что отличает обогащенную тромбоцитами плазму от рекомбинантных факторов роста [146, 192, 206, 207, 214].

В естественном сгустке содержатся фибрин, фибронектин и витронектин, их еще называют адгезивными молекулами, необходимыми для миграции клеток, остеокондукции, эпителизации и остеоинтеграции. Т. Kawase с соавторами [186] экспериментально доказали, что биологические свойства плазмы обогащенной тромбоцитами обусловлены не только наличием в ней факторов роста (TGF-в и PDGF), она и без них немедленно индуцирует образование фибринового сгустка с последующей стимуляцией клеточной адгезии и синтеза коллагена.

К. Aketla с соавторами [205] сообщили, что ауто плазма обогащенная тромбоцитами может быть использована как источник анаболических факторов роста для стимуляции хондроцитов в хрящевых тканеинженерных конструкциях, в связи с усилением синтеза протеогликанов и коллагена. Однако, необходимо отметить, что плазма, обогащенная тромбоцитами не обладает остеоиндуктивными свойствами, т.к. последняя не может инициировать образование новой кости без наличия костных клеток. Индуцировать образование кости tie novo, способны только костные морфогенетические белки, т.к. они единственные обладают таким эффектом. Плазма, обогащенная тромбоцитами, стимулирует ангиогенез и митоз клеток, участвующих в процессе регенерации, а также является аутогенным источником факторов роста. Факторы роста и дифференциации представляют собой класс биологических медиаторов, которые играют важную роль в стимуляции и регулировании заживления ран, а также ускоряют ключевые клеточные процессы, включая митогенез, хемотаксис, дифференциацию и метаболизм. При этом: улучшается регенерация тканей и стимулирование гисто- и ангиогенеза; нет реакции болевой и костной тканей на температурные раздражители; сокращаются сроки лечения (за счет ликвидации первой фазы процесса регенерации - лизиса сгустка и воспаления); улучшается самочувствие пациента в послеоперационном периоде; отсутствует отечность мягких тканей после проведения операции [19].

Все способы применения плазмы, обогащенной тромбоцитами, описанные в литературе, можно разделить на несколько основных групп. Плазма, обогащенная тромбоцитами, может быть смешана с костным материалом; нанесена на принимающее ложе перед применением костного материала; нанесена поверх костного материала; использована в качестве биологической мембраны.

Плазма, обогащенная тромбоцитами, должна быть коагулирована непосредственно перед использованием. Свертывание крови сопровождается активацией тромбоцитов, которые при этом высвобождают факторы роста [114, 146, 192, 204, 207, 214]. В течение первых 10 мин тромбоциты выделяют около 70 % факторов роста. Полное высвобождение последних происходит в течение часа. После этого тромбоциты продолжают синтезировать дополнительное количество факторов роста приблизительно в течение 8 дней, после чего погибают.

Обогащенная тромбоцитами плазма содержит фибриллярный и клеточный компоненты и способна действовать как носитель клеток, важных для регенерации мягких и костных тканей [176]. Она может усиливать прикрепление остеобластов человека к мембранам [149, 184] и, как следствие, индуцировать остеогенез [171]. Многие авторы являются сторонниками стимулирующего воздействия плазмы, обогащенной тромбоцитами, на репаративпый остеогенез [19, 105, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 176, 219, 141]. В.Л. Брехов [13] считает, что применение богатой тромбоцитами аутоплазмы, оптимизирует процессы репаративного остео- и хондрогенеза, что улучшает результаты хирургического лечения больных с дефектами костной и хрящевой (суставной) тканей, уменьшает количество реостеосинтезов в 7 раз и приводит к сокращению сроков нетрудоспособности на 15 %.

Несмотря на перечисленные выше работы ряд авторов не склонны рассматривать плазму обогащенную тромбоцитами как стимулятор остеогенеза, поскольку не обнаружили отличий в темпах репаративной регенерации в группах сравнения и при добавлении обогащенной тромбоцитами плазмы [153, 187, 202, 209, 222].

Есть другая группа авторов, считающая, что статистически значимая активизация остеогенеза происходит только в ранние сроки, т.е. на начальных стадиях регенерации кости. Спустя 3 месяца (12 недель) никаких различий в течение регенераторного процесса не наблюдают [147, 164, 168, 206].

Исходя из специфики наших экспериментов, мы считаем, что стоит указать факт появление в последнее время, все большего количества сообщений о антимикробной активности богатой тромбоцитами плазмы [145, 194]. D.J. Moojen с соавторами [194] изучали активность тромбоцитарно-лейкоцитарного геля при инфекциях, вызванных Staphylococcus aureus, и отметили потенциальную возможность его применения, но корреляции между этой активностью и активностью миелопероксидазы не обнаружили. Т.М. Bielecki с соавторами [145] анализировали антибактериальный эффект in vitro, обогащенной тромбоцитами плазмы, взятой у 20 добровольцев. В результате было отмечено подавление роста Staphylococcus aureus и Escherichia coli и одновременно индуцирование роста Ps. Aeruginosa, что свидетельствует о разной устойчивости микроорганизмов к плазме обогащенной тромбоцитами. Авторы считают, что комбинация индуктивных и антимикробных свойств богатой тромбоцитами плазмы может улучшать результаты лечения больных с инфицированными переломами и ложными суставами. В.Г. Самодай с соавторами [105] при лечении псевдоартрозов и инфицированных дефектов костной ткани применяли богатую тромбоцитами аутоплазму, насыщенную антибиотиками. В некоторых случаях для создания «фокуса регенерации» они использовали губчатую аутокость. Авторы отметили прямое стимулирующее и антимикробное воздействие данного комплекса на регенераторную способность костной ткани. В среднем удалось ускорить сращение костных отломков на 18 % по сравнению с традиционными методами лечения.

Следует отметить, что в доступной литературе основное внимание уделено влиянию плазмы, обогащенной тромбоцитами на клеточный компонент регенерации, тогда как ее влияние на биохимические процессы в процессе регенерации кости остаются мало изученными.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для данного исследования послужили результаты, полученные при комплексном экспериментальном исследовании на 180 белых крысах самцах линии Вистар весом 180-200 г, возрастом 10-12 месяцев. Все животные содержались в стандартных условиях вивария в соответствии с общепринятыми правилами (Директива ЕС № 609 (19886) и приказом МОЗ Украины № 281 от 01.11.2006).

В соответствии с задачами работы животные были разделены на 4 групп.

I группа (45 крыс) - составляли крысы, которые содержались в стандартных условиях вивария, не подвергались никакому воздействию. Данные, полученные при исследовании животных этой группы, служили контролем.

II группа (45 крыс) - составляли крысы, которым был осуществлен перелом малой берцовой кости, наблюдение за его регенерацией проходило без каких-либо вмешательств.

III группа (45 крыс) - составляли животные, у которых со второго дня после перелома малой берцовой кости производился фонофорез с мазью. Плотность потока мощности ультразвукового излучения - 2 вт/секІ, продолжительность процедуры составляло 2 мин, курс - 11 процедур, через день, мазью содержащей нативный пчелиный яд, 1,0 г - содержащий 0,3 мг стандартизованного пчелиного яда (что соответствует укусу одной пчелы).

IV группа (45 крыс) - крысы, у которых после перелома с периодичностью раз в четыре дня производилась инъекция, в место перелома, плазмы, обогащенной тромбоцитами в количестве 0,1 мл в течение 21-х суток.

Моделирование перелома малоберцовой кости у наркотизированных крыс производилась путем оперативного вмешательства. После введения крысы в медикаментозный сон, производился разрез кожи в области средней трети голени правой лапы в проекции малоберцовой кости. При помощи листоновских кусачек производилась остеотомия малоберцовой кости. Рана промывалась раствором антисептика, ушивалась наглухо. В процессе опыта производилась динамическое наблюдение за состоянием поврежденной лапы (наличие отека, вынужденное положение, интенсивность ее использования). Животные выводились из эксперимента на 3-и, 7-е, 14-е, 21-е сутки путем декапитации под легким эфирным наркозом.

Фонофорез с комбинированным препаратом для наружного применения в виде мази, у которой следующий состав: пчелиный яд - 0,003 %, метилсалицилат - 10 %, горчичное эфирное масло (аллилизотиоцинат) - 1 %, вспомогательные вещества, применяли на область перелома. В 1,0 г мази содержится количество яда, полученного от одной летной пчелы - 0,3 мг. Продолжительность ультразвукового излучения 2 мин. Курс состоял из 11 процедур через день.

Инъекцию плазмы, обогащенной тромбоцитами, производили в область перелома, в объеме - 0,1 мл, концентрация тромбоцитов составляла 2500-3500Ч10⁹/л. Плазму, обогащенную тромбоцитами, мы получали путем центрифугирования 5,0 мл свежей крови, полученной у декапитированых под легким эфирным наркозом интактных животных. Кровь центрифугировали при скорости 2000 обр/мин в течение 2 мин, после чего отбирали плазму. Полученную плазму центрифугировали при скорости 4000 обр/мин в течение 15 мин. После этого отбирали 1/3 объема плазмы, которая находилась в пробирке. Плазму, которая осталась вводили в область перелома в количестве 0,1 мл. У крыс при переливании крови не происходит изогемагглютинации, то есть кровь этих животных совместима.

Наблюдение за процессом регенерации состояло из визуального клинического контроля за поведением животных, осмотром и измерением объема поврежденной конечности. Длительность исследования - 21-е сутки. Животные выводились из эксперимента на 3-и, 7-е, 14-е, 21-е сутки после оперативного вмешательства.

Животные выводились из эксперимента путем декапитации под легким эфирным наркозом.

После декапитации у животных забирали 4,0-5,0 мл крови для последующих биохимических исследований и отсекали прооперированную конечность. Конечность после очисти ее от кожи, подкожно-жировой клетчатки, мышц подвергали декальцинации в 5 % растворе азотной кислоты. После декальцинации изготовляли блок из области перелома, который проводили через спирт возрастающей концентрации и заливали в целлоидин согласно стандартной методики. С целлоидиновых блоков производили гистологические срезы толщиной 7,0-9,0 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизону. Полученные препараты исследовали при помощи светового микроскопа, определяя изменения, которые происходят в зоне перелома.

Биохимическими методами определяли содержания ионов кальция в плазме крови (фторметрическим методом), фосфора (фотометрическим методом с молибденом в кислой среде) и активность щелочной фосфатазы (нитрофениловым методом).

Определение концентрации ионов кальция в сыворотке крови

Фотометрический тест. Метод с о-крезолфталеинкомплексоном.

Ионы кальция реагируют с о-крезолфталеинкомплексоном в щелочной среде с образованием комплекса красно-фиолетового цвета. Оптическая плотность этого комплекса пропорциональна концентрации кальция в пробе.

Реактивы

Буфер

Лизиновый буфер (pH = 11,1) 0,2 моль/л

Азид натрия 0,095 %

Окрашивающий реагент

8 - гидроксихинолин 14 ммоль/л

о-Крезолфталеинкомплексон 0,1 ммоль/л

Соляная кислота 40 ммоль/л

Приготовление рабочего реагента: смешивали буфер и окрашивающий реагент в равных объемах в требуемом количестве. Смеси давали постоять не менее 10 минут перед использованием. Полученный реагент добавляли в пробирку с плазмой в отношении 1/50.

Перемешивали, инкубировали 5 минут. Измерили оптическую плотность (А) проб и стандарта против холостой пробы, проводили на спектрофотометре. Окраска стабильна в течение 50 минут.

Концентрация ионов СаІ⁺ определяется по формуле:

А пробы

С = 2,0 Ч ---------------- [ммоль/л ]

А станд

2,0 ммоль/л - концентрация в стандарте.

Концентрация в стандарте указывается на этикетке флакона.

Метод линеен до концентрации кальция 15 мг/дл (3,75 ммоль/л). Если содержание кальция в пробе выше 3,75 ммоль/л, разбавьте пробу дистиллированной водой в отношении 1+1 и повторите исследование. Полученный результат умножьте на 2 (коэффициент разведения).

Определение концентрации фосфора в сыворотке крови

Фотометрический тест, измерение проводят в ультрафиолетовом диапазоне.

Фосфаты реагируют с молибдатом в сильнокислой среде с образованием комплекса. Оптическая плотность образующегося комплекса в ультрафиолетовой области прямо пропорциональна концентрации фосфатов.

Химизм процесса, описывается следующим уравнением:

7 H₃PO₄ + 12 [Mo7O24] 6- + 51 H + -------------> 7 [P(Mo12O40)] 3- + 36 H2O

Реагент

Гептамолибдат аммония 0,3 ммоль/л

Серная кислота (рН < 1,0) 160 ммоль/л

Детергент 1 %

Активаторы и стабилизаторы

Стандарт фосфора

Фосфор 3,2 ммоль/л (10 мг/дл)

В пробирку к сыворотке крови добавляли реагент в отношении 1/100

Перемешивали и инкубировали 1 мин при 20...25°С. Измерение оптической плотности (А) проб и стандарта против холостой пробы проводили на спектрофотометре. Окраска стабильна в течение 60 минут.

Концентрацию фосфора в пробе вычисляли по формуле:

А пробы

С = 3,2 Ч ------------- [ммоль/л]

А станд

3,2 ммоль/л - концентрация в стандарте.

Концентрация стандарта указывается на этикетке флакона.

Тест линеен до концентрации фосфора 20 мг/дл или 6,4 ммоль/л. Если содержание фосфора в пробе выше 6,4 ммоль/л, разбавьте пробу физиологическим раствором в отношении 1+1 и повторите исследование. Полученный результат умножьте на 2 (коэффициент разведения).

Определение концентрации щелочной фосфатазы в сыворотке крови

Принцип метода

Щелочная фосфатаза (ALP) в щелочной среде катализирует перенос фосфатной группы от 4-нитрофенилфосфата к диэтаноламину (DEA), с высвобождением 4-нитрофенола. Интенсивность образующейся окраски, измеренной при длине волны 405(±10) nm, пропорциональна активности ALP^1,2. Химизм процесса, описывается следующим уравнением:

4-нитрофенил фосфат + DEA ---------------> DEA - фосфат + 4-нитрофенол

Reagent А - 100 ml: диэтаноламин 1,0 mol/l; магния хлорид 0,5 mmol/l; рН 9,8.

Reagent В: при растворении 4-нитрофенилфосфат 12 mmol/l.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

1. Доводили температуру Рабочего Реагента и фотометра до температуры реакции.

2. Внесите в кювету: 1,0 ml Рабочего Реагента и 20 мl оцениваемой пробы.

3. Смешивали их и помещали кювету в фотометр.

4. Измеряли начальную абсорбцию, затем измеряли абсорбцию через интервалы в 1 минуту в течение 3 минут. Использовали спектрометр.

5. Вычисляли разницы между последовательными абсорбциями и среднюю разницу абсорбции за 1 минуту (ДА/min) проводили по формуле:

V_tЧ10⁶

ДА/min х-------------------= U/l

е Ч l Ч V_s

Где:

е - молярная абсорбция 4-нитрофенила при 405 nm = 18450;

l - длина светового пути = 1 cm;

V_t - общий объем реакции = 1,02 ml;

V_s - объем образца = 0,02 ml;

1 U/l = 0,0166 мkat/l.

Для вычисления каталитической концентрации выведены следующие формулы:

ДА/min Ч 2764 = U/lЧ 4608 = мkat/l

Полученные нами в результате эксперимента биохимические данные, забор производился из плазмы крови, а именно активность щелочной фосфатазы, РО₄^3-, Са²⁺ мы подвергали статистической обработки при помощи Microsoft Exel, с использованием t-критерия Стьюдента. Данные, которые получили, считались достоверными при р ? 0,05.

ГЛАВА III. СТРУКТУРНАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В КОСТЯХ КРЫСЫ ПРИ СРАЩЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПЕРЕЛОМА

3.1 Структурно-функциональная характеристика состояния крыс на 3-и сутки после перелома малоберцовой кости

Через трое суток после перелома крысы чувствовали себя удовлетворительно, шерсть у крыс в целом опрятная, глаза ясные, нос теплый, прием пищи, потребление воды были в норме. Передвигались крысы по клетки, не опираясь на поврежденную конечность. Поврежденная лапа была увеличена в диаметре вследствие выраженного отека 0,93±0,02 см, при норме 0,75±0,1 см, у нескольких крыс отсутствовали швы на коже. Динамика изменения диаметра поврежденной конечности в зависимости от срока эксперимента и вида воздействия, указаны в таблице 3.1.1. В большинстве случаев послеоперационная рана была прикрыта сухим струпом. В единичных случаях из под струпа выделялись одна-две капли серозно-геморрагического отделяемого. При пальпации лапы отмечалось наличие небольшой патологической подвижности, крепитация отломков, также в половине случаях отмечается повышение температуры поврежденной конечности.

При макроскопическом исследовании поврежденной конечности наблюдается отечность тканей окружающих перелом, отломки отделяются друг от друга с некоторым усилиям. При исследовании целой конечности отмечается подвижность в зоне перелома.

Таблица 3.1.1

Диаметр поврежденной конечности в зависимости от срока эксперимента и вида воздействия (см), (М±m)

Сроки Группы	Норма	3-и сутки	7-е сутки	14-е сутки	21-е сутки
Перелом трубчатой кости (n=45)	0,75±0,01	0,93±0,02*	0,84±0,01*	0,80±0,01*	0,76±0,01*
Перелом + фонофорез с нативным пчелиным ядом (n=45)	0,75±0,01	0,90±0,02*	0,80±0,01*	0,72±0,03*	0,75±0,03*
Перелом + инъекция плазмы, обогащенной тромбоцитами (n=45)	0,75±0,01	0,92±0,02*	0,80±0,01*	0,76±0,02*	0,76±0,02*

* р ? 0,05 по отношению к норме.

При гистологическом исследовании, мышцы, окружающие перелом, отечно разволокнены, сосуды резко полнокровны. При микроскопическом исследовании мышечные волокна с набухшей нечеткой внешней границей, поперечная исчерченность смазана, ядра овальные крупные с нечеткой границей. Вокруг области перелома в мягких тканях мощные скопления лимфоцитов с сочными ядрами и гистиоцитов. Такие же скопление клеточных элементов определяются в зоне между отломками и во внутреннем канале кости. Надкостница отломков утолщена возле места нарушение целостности кости и на значительном отдалении от него. Утолщение надкостницы связано с отечным разволокнением фиброзных волокон и увеличением количества клеточных элементов. Клеточные элементы характеризуются крупными, сочно окрашенными ядрами. Располагаются клетки, в отличии от нормы, не в один ряд, а довольно хаотично, местами формируя наплывы. Отломки разделены некоторой щелью заполненной лимфоидными и гистиоцитарными элементами, единичными волокнами, ярко эозинофильными белковыми образованиями разных размеров. Такие же включения отмечаются и в костном канале (рис. 3.1.1).

Рис. 3.1.1. Перелом малоберцовой кости крысы. Канал кости. Скопление лимфоидных элементов и гистиоцитов. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: Ч300.

Перелом кости и последующее его сращение сопровождаются изменениями кальциевого и фосфорного обмена. Результаты исследования этого обмена отражены в таблице 3.1.2. Как следует из данных таблицы 3.1.2 на третьи сутки опыта содержание кальция в плазме крови недостоверно (статистически) снижалось, одновременно вдвое снизилось содержание фосфора. Поскольку транспортировка кальция в места его депонирования осуществляется исключительно при участие ионов фосфора, можно полагать, что мы наблюдаем активацию этого тканепорта, вплоть до истощения запасов, использования фосфора. Также отмечается резкое снижение активности щелочной фосфатазы, практически в два раза, что может свидетельствовать о нейтрализации ее в месте воспаления в перелом.

Таблица 3.1.2

Показатели кальциевого и фосфорного обмена, а также щелочной фосфатазы у крыс с переломом малой берцовой кости (М±m)

Показатель Группа	Са2+, ммоль/л	РО43-, ммоль/л	Щелочная фосфатаза, Ед/л
Контроль	2,66±0,41	3,0±0,74	369,19±12,41
Перелом трубчатой кости	3 суток	2,56±0,03*	1,52±0,23*	206,0±28,7*
	7 суток	2,45±0,02	1,72±0,35*	221,18±28,32*
	14 суток	2,70±0,04	1,60±0,21*	263,06±30,06*
	21 сутки	2,82±1,33	1,28±0,11*	206,19±28,25*

* р ? 0,05 по отношению к норме.

3.2 Структурная и биохимическая характеристика процесса репарации перелома кости у крыс на 7-е сутки опыта

Наблюдение за подопытными животными показало, что через 7 суток после перелома животных достаточно активно передвигаются по клетке, периодически используют травмированную конечность для опоры. Шерсть у подопытных крыс гладкая, ухоженная, глаза ясные. Травмированная конечность сохраняет увеличенный диаметр, однако он меньше чем после 3 суток опыта 0,84±0,01 см; (норма 0,75±0,01 см), данные указаны в таблице 3.1.1. Пальпаторное исследование болезненно, крысы сопротивляются, пищат, крепитация отломков не прощупывается, определяется ограниченная тугая подвижность в месте перелома. Температура конечности соответствует здоровой лапе. При визуальном исследовании у большинства животных послеоперационная рана зажила, определяется нежный рубец. У крыс, у которых на 3-и сутки опыта из-под струпа выделялось серозно-геморрагическое отделяемое, раны сухие прикрыты струпом, струп сухой, от поверхности не отделяется.

При визуальном исследовании кости она представляется целостной, в области перелома имеет место некоторое тугоподвижное утолщение. Окружающие ткани отечны.

При гистологическом исследовании интерстициальные прослойки между мышцами расширены, отечные. Мышечные волокна также набухшие, их поперечная исчерченность смазана, хотя ядра и сами волокна имеют четкие границы. Сосуды умеренно полнокровны. В тканях, окружающих область перелома, негрубая инфильтрация лимфоидными и гистиоцитарными элементами, последних значительно больше. Надкостница вблизи зоны перелома утолщена, за счет отечного разволокнения, клетки надкостницы с крупными сочными ядрами, располагаются в основном упорядочено, хотя есть небольшие участки, где они формируют наплывы. Плотное вещество кости создает впечатление целостности за счет гомогената, заполняющего пространство между отломками. Гомогенат включает в себя короткие грубые фиброзные волокна, некоторое количество ретикулоцитов и ярко-эозинофильные округлые образования. Кроме того со стороны собственного плотного вещества отломков в этот гомогенат вдаются «языки» этого вещества, в которых определяются гнезда из 1-2 остеоцитов, характеризующихся сочными достаточно большими ядрами. В канале кости обнаруживаются эозинофильные включения и плотные скопления гистиоцитов (рис. 3.2.1).



Рис. 3.2.1. Малоберцовая кость крысы. Область перелома, 7-е сутки опыта. «Языки» плотного вещества кости в области перелома. Скопление гистиоцитов в области перелома и прилегающем канале. Окраска: по Ван Гизону. Увеличение: Ч200.

Как и в предыдущем сроке наблюдения, репарация костной ткани сопровождается изменением показателей кальциевого и фосфорного обменов. Согласно данным таблицы 2 содержание СаІ⁺ в сыворотке крови практически не отличается от данных контроля. В то же время содержание фосфора сохраняется существенно меньшим, чем в контроле. Можно полагать, что истощение фосфорного обмена не восстанавливается и депонирование СаІ⁺, в том числе в месте восстановления перелома хотя и сохраняется активированным, все же не обеспечивает быстрой оссификации тканей, хотя кальция в плазме крови достаточно большое количество. Поскольку активность щелочной фосфатазы, близка к данным трех суток опыта, можно полагать, что напряженность в поступлении кальция в зону репарации сохраняется.

3.3 Структурная и метаболическая характеристика процесса репарации перелома у крыс на 14-е сутки опыта

Наблюдение за поведением крыс показало, что на 14-е сутки опыта животные активно перемещаются по клетке, используя при этом поврежденную конечность. Правда, использование конечности носит щадящий характер. Крысы демонстрируют хороший аппетит, обычную интенсивность приема воды, шерсть у них гладкая, ухоженная, глаза ясные, нос чистый теплый. При исследовании прооперированной лапы, ее диаметр практически не отличается от диаметра лапы здоровой крысы, данные приведены в таблица 3.1.1. Температура обеих конечностей подопытных животных одинакова. Послеоперационная рана полностью эпителизирована у большинства животных. У тех животных, у которых предыдущие сроки наблюдений отмечалось отделяемое из раны, сохраняются небольшие, остаточные, участки струпа.

При гистологическом исследовании в окружающих зону перелома тканях отечные явления не фиксируются. Межпучковые прослойки тонкие плотные, мышечные волокна обычного вида. Инфильтрация в зоне перелома проявляется единичными гистиоцитами, лимфоидные элементы не определяются. Надкостница сплошная, утолщенная. Утолщение ее обусловлено большим числом грубых фиброзных волокон, располагающихся параллельно поверхности кости. Клетки непосредственно над переломом располагаются в надкостнице неупорядочено, в остальных зонах они располагаются в один ряд, ядра их плотные темные. Плотное вещество кости в области перелома имеет достаточно яркую эозинофильность, и представлено многочисленными выростами, которые отходят от отломка, проникают к противоположному отломку, очень близко располагаются между собой, что позволяет говорить об образование плотной «сети» из них. В каждом выросте определяются немногочисленные гнезда остеоцитов, содержащие 2-4 клетки с большими светлоокрашенными ядрами. В костном канале также определяются островки разных размеров сливающихся между собой и состоящие из упакованных остеоцитов с большими светлыми ядрами (рис. 3.3.1).

При биохимических исследованиях (таблица 3.1.2) отличие в содержании СаІ⁺ и (РО₄^3-) в плазме крови от данных предыдущего срока наблюдений не выявлено, то же самое касается активности щелочной фосфатазы, то есть можно полагать, что имеет место некоторая стабилизация этих видов обмена.

Рис. 3.3.1. 14-е сутки перелома малоберцовой кости крысы. «Языки» плотного вещества кости, формирующие сеть. Островки гистио- и остеоцитов. Окраска: по Ван Гизону. Увеличение: Ч300.

3.4 Структурная и метаболическая характеристика репарации перелома кости на 21-е сутки опыта

Наблюдение за крысами показало, что 21-й день опыта они выглядят совершенно нормально. Активно перемещаются по клетке, используя все конечности в одинаковой мере. Шерсть гладкая, ухоженная, нос чистый теплый, глаза ясные. Прием пищи и воды без особенностей. При визуальном исследовании поврежденной конечности видна полная эпителизация послеоперационной раны, пальпаторно конечность безболезненная. Диаметр и температура поврежденной конечности соответствует данным здоровой, контралатеральной (таблица 3.1.1).

При гистологическом исследовании ткани окружающие перелом обычного вида, межмышечные перегородки тонкие, плотные, миоциты обычного вида. Инфильтрирования ткани клеточными элементами не выявлено. Вокруг зоны бывшего перелома сформирована тонкая муфта из негрубых фиброзных волокон. Надкостница над областью перелома такая же тонкая как и над остальной костью. Ядра клеток мелкие темные, располагаются в один ряд. Сохраняются грубые короткие фиброзные волокна плотно упакованные (рис. 3.4.1).

Рис. 3.4.1. Область перелома малоберцовой кости крысы, 21-й день опыта. Сплошная пластина кости, очаги фиброза, скопление остеоцитов, остаточные пучки фиброзных волокон. Окраска: гематоксилин. Увеличение: Ч100.

Плотное вещество кости сплошное, в наружной части однородное темно-эозинофильное с рассеянными гнездами остеоцитов. В гнезде 2-3 остеоцита со средних размеров ядрами, хорошо прокрашенными, средних размеров. Часть плотного вещества, располагающаяся ближе к костному каналу в целом сходна с вышеописанным костным веществом, но отличается наличием островков коллагеновых волокон в своей толще. В костном канале определяются тонкие костные балки, не создающие единую структуру, в их ткани определяются небольшие группы базофильных фиброзных волокон.

Данные биохимических исследований (таблица 3.1.2) свидетельствуют, что у подопытных животных сохраняется резко повышенная активность щелочной фосфатазы, хотя она достоверно ниже, чем через 14 суток опыта, это наглядно видно из (рис. 3.4.2).

плазма перелом тромбоцит пчелиный

Рис. 3.4.2. Отношение активности щелочной фосфатазы у животных с переломом, на который не оказывали внешних воздействий, в различные сроки опыта, к интактным животным.

Содержание СаІ⁺ также сохраняется близким к данным контроля и предыдущих сроков наблюдения. При этом индивидуальные различия у отдельных животных этого показателя значительны, о чем свидетельствует широкий диапазон среднего показателя группы. Можно полагать, что интенсивность кальциевого обмена не меняется по сравнению с 14-ми сутками опыта (рис. 3.4.3).



Рис. 3.4.3. Отношение концентрации Са²⁺ плазмы крови у животных с переломом, на который не оказывалось внешних воздействий, в различные сроки опыта, к интактным животным.

Интенсификации его депонирования в область перелома не наблюдается, о чем свидетельствует сохранение на прежнем уровне содержание (РО₄^3-) в плазме крови (рис. 3.4.4).

Рис. 3.4.4. Отношение концентрации (РО₄^3-)плазмы крови у животных с переломом, на который не оказывалось внешних воздействий, в различные сроки опыта, к интактным животным.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что репаративные процессы в области перелома у крыс, при отсутствие внешних влияний происходит по хондрогенному типу остеогенеза. Состояние кальциевого обмена нарушается за счет снижения усвоения кальция в виду сдвигов в фосфорном обмене.

ГЛАВА IV. СТРУКТУРНАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В КОСТЯХ КРЫС ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ФОНОФОРЕЗА С КОМБИНИРОВАННЫМ ПРЕПАРАТОМ ПЧЕЛИНОГО ЯДА

4.1 Структурно-функциональная характеристика состояния крыс на 3-и сутки после перелома малоберцовой кости с применение фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда

Через трое суток после перелома крысы чувствовали себя удовлетворительно, шерсть большинства крыс опрятная, у нескольких крыс шерсть взъерошена в области поясницы, крыс глаза ясные, нос теплый, умеренно влажный, прием пищи незначительно снижен, потребление воды в норме. Перемещение крыс по клетки неохотное, поврежденную конечность щадят, на нее не опираются. Поврежденная лапа была значительно увеличена в объеме вследствие выраженного отека (0,90±0,02 см) (таблица 3.1.1), у нескольких крыс отсутствовали швы на коже, края ран зияли, отмечалось незначительное геморрагическое отделяемое. В большинстве случаев послеоперационная рана была без признаков воспаления, прикрыта сухим струпом. В единичных случаях из под струпа выделялись одна-две капли серозно-геморрагического отделяемого. При пальпации области перелома отмечалось резкая болезненность, животные вели себя при осмотре агрессивно, отмечается наличие патологической подвижности, крепитация отломков, однако повышение температуры поврежденной конечности отмечается только в трети случаев. В целом визуальное наблюдение за животными данной группы не вывило значительных отличий от состояния крыс с переломом, на который не оказывалось никакого воздействия.

При макроскопическом исследовании поврежденной конечности крыс окружающих перелом мягкие ткани отечны, костные отломки отделяются друг от друга со значительным усилим.

При гистологическом исследовании места перелома малоберцовой кости, в окружающих мягких тканях отмечается следующее: мышцы, окружающие перелом, резко отечны, разволокнены, сосуды полнокровны. При микроскопическом исследовании мышечных волокон, последние резко набухшие смазаны внешние границы, поперечная исчерченность выражена не четко, крупные ядра с нечеткой границей овальной формы. В мягких тканях окружающих перелома наблюдаются мощные скопления гистиоцитов и лимфоцитов с сочными ядрами. Также гистиоциты с лимфоцитами в большом количестве определяются в зоне между отломками и внутри костномозгового канала кости (рис. 4.1.1).

Рис. 4.1.1. Область перелома малоберцовой кости крысы. 3-и сутки фонофорез с препаратом, содержащим пчелинный яд. Скопление гистиоцитов и фиброзных волокон в области разрыва кости. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: Ч100.

В отличие от крыс с переломом, на который не оказывалось воздействие, клеточная инфильтрация наблюдается в непосредственной близости перелома, на отдалении она если и есть, то незначительна. В области отломков надкостница значительно утолщена. Утолщение надкостницы происходит за счет отечного разволокнения фиброзных волокон и увеличения количества клеточных элементов. Клетки с крупными, сочно окрашенными ядрами располагаются не в один ряд как в норме, а хаотично, местами формируя наплывы одного ряда на другой. Между отломками четко прослеживается щель, которая заполнена лимфоидным и гистиоцитарными элементами и множеством пучков фиброзных волокон, а также разных размеров эозинофильными белковыми включениями. Наличие таких же включений определяются в костномозговом канале малоберцовой кости. В целом гистологическая картина весьма сходна с наблюдаемой у крыс из группы, где на перелом ни оказывалось каких-либо воздействий.

Регенерация костной ткани после перелома всегда сопровождается метаболическими изменениями, о чем свидетельствуют нарушения активности щелочной фосфатазы, содержания ионов кальция и фосфора. Результаты биохимических исследований плазмы крови подопытных животных показаны в таблице 4.1.1. Исходя из данных таблицы 4.1.1. Можно утверждать, что на третьи сутки опыта содержание кальция в плазме крови резко увеличивается, одновременно незначительно увеличилось содержание фосфора. Поскольку транспортировка кальция в места его депонирования осуществляется исключительно при участии ионов фосфора. Можно полагать, что мы наблюдаем активацию, вплоть до истощения запасов, использования фосфора. Активность щелочной фосфатазы снижается в полтора раза по сравнению с контрольной группой животных.

Таблица 4.1.1

Показатели кальциевого и фосфорного обмена, а также щелочной фосфатазы у крыс с переломом малой берцовой кости при воздействие на сращении перелома фонофореза с нативным пчелинным ядом (М±m)

Показатель Группа	Са2+, ммоль/л	РО43-, ммоль/л	Щелочная фосфатаза, Ед/л
Контроль	2,66±0,41	3,0±0,74	369,19±12,41
Перелом + фонофорез с нативным пчелинным ядом	3 суток	3,97±0.027*	3,7±0.11*	190,7±13,7*
	7 суток	5,50±0,067*	1,82±0,22	244,84±14,79*
	14 суток	2,39±0,052*	1,54±0,046	242,84±4,56*
	21 сутки	5,60±0,035*	1,41±0,33	213,68±4,32

* р ? 0,05 по отношению к норме.

При сравнение результатов наблюдения за животными, результатов микроскопических и гистологических исследований поврежденной конечности, тканей окружающих место перелома и состояние костных отломков можно сформулировать предварительные выводы. Внешний вид и самочувствие животных практически идентичны, за исключением отдельных случаев. В группе животных, которым производились процедура фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда, у двух животных наблюдалась взъерошенная шерсть, у этих же животных отсутствовали швы на ранах. Снижение аппетита можно объяснить плохими погодными условиями, на протяжении двух дней после операции была пасмурная погода с периодическими осадками. Микроскопические и гистологические исследования особых различий не выявили, очевидно, для проявления влияния комбинированного препарата пчелиного яда прошло недостаточно времени. В обеих группах наблюдалась отечность мягких тканей в области, прилегающей к перелому, полнокровие сосудов, разволокнение мышечных волокон и надкостницы, присутствие в месте перелома и костномозговом канале большого количества гистиоцитов и лимфоцитов. Однако у крыс получавших процедуры фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда визуально больше фиброзных волокон. Вместе с тем выявлены различия в динамике биохимических показателей. Под влиянием препарата содержащего пчелиный яд снижается активность щелочной фосфатазы и возрастает количество СаІ⁺ и фосфора в плазме крови, т.е. усвоение кальция замедляется таблица 4.1.1.

4.2 Структурная и биохимическая характеристика процесса репарации перелома кости у крысы на 7-е сутки опыта при применение фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда

Наблюдение за подопытными животными на 7-е сутки после операции показали следующее. Все животные активно передвигаются по клетке, используя поврежденную конечность, при этом они не растопыривают пальцы, что свидетельствует о незначительной болезненности при опоре на оперированную лапу. Шерсть у подопытных крыс гладкая, ухоженная, глаза ясные. При визуальном осмотре травмированных конечностей только у отдельных крыс сохраняется умеренная отечность оперированной лапы. Отечность отмечается у тех крыс, у которых раны сохраняют обширный струп. У остальных животных раны зажившие, без признаков воспаления, диаметр поврежденной лапы - 0,80±0,01 см, динамика показана в таблице 3.1.1. Пальпаторно отмечается умеренная болезненность конечности, крысы вяло сопротивляются осмотру. Крепитация отломков не прощупывается, определяется некоторая тугая подвижность в месте перелома. Температура кожных покровов поврежденной конечности соответствует здоровой.

При визуальном исследовании кости в области перелома она представляется целостным конгломератом костной и соединительной ткани, имеет место некоторая тугая подвижность. Окружающие ткани в подавляющем большинстве случаев не отечны, отечность мягких тканей отмечается только у животных, имеющих проблемы с заживлением послеоперационной раны.

Гистологическое исследование области перелома малоберцовой кости у животных этой группы показало следующее. Межуточное вещество между пучками мышц несколько отечно с отдельными вкраплениями лимфоцитов, мышцы несколько разрыхлены, ядра и сами волокна имеют четкие границы. Сосуды умеренно полнокровны. Надкостница уширена за счет фиброзных волокон и увеличения количества неупорядочено расположенных клеток надкостницы с увеличенными, умеренно окрашенными ядрами. В области перелома широкая зона из фиброзных волокон и остеоцитов, местами они располагаются неупорядочено, местами формируются пучки волокон в которых присутствуют группы остеоцитов. Остеоциты собранны в группы по 2-3 клетки. Кроме того, обычно от одного из отломков, вглубь массива отходит один или несколько выростов разных размеров связанные с плотной частью кости и состоящие из остеонов, и из переплетающихся или отдельных волокон, связанных с плотным веществом кости (рис. 4.2.1). От выроста ко второму отломку наблюдается масса остеоцитов и гистиоцитов, в которой у второго отломка отличают отдельные или небольшие пучки коротких фиброзных волокон. Отличие гистологической картины области перелома у крыс данной группы, от крыс с некоррегируемым переломом, состоит в практическом отсутствии отечных и воспалительных изменений в тканях окружающих область перелома. Наличествуют признаки активации репаративных возможностей клеток надкостницы (наползание). В области непосредственно перелома отличие состоит в преобладании клеточных элементов и фиброзных волокон. При этом волокна и остеоциты уже формируют балкоподобные образования (в разных количествах у разных крыс). В костном канале также наблюдается скопление фиброзных плотных волокон и остеоцитов с сочным ядром и утолщенной мембраной, которые заполняют просвет канала.

Рис. 4.2.1. Область перелома малоберцовой кости крысы. 7-е сутки опыта, фонофорез с препаратом, содержащим пчелинный яд. Выросты плотного матрикса, скопление лимфо- и гистиоцитов. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: Ч200.

Наблюдение за биохимическими показателями плазмы крови при репарация костной ткани, с применением фонофареза с комбинированным препаратом пчелиного яда, выявили определенные их изменения. Показатели кальциевого и фосфорного обменов, и активности щелочной фосфатазы, приведенные в таблице 4.1.1, свидетельствуют, что содержание СаІ⁺ в сыворотке крови в два раза увеличиваются по сравнению с данными контроля и значительно превосходят данные 3-х суток опыта. В то же время содержание фосфора незначительно увеличивается по отношению к группе с переломом, на который не оказывалось воздействий, но при этом на треть ниже данных контрольной группы. Активность щелочной фосфатазы недостоверно выше, чем в предыдущем сроке наблюдений. Сопоставляя данные гистологических и биохимических исследований можно полагать, что процессы, способствующие усвоению кальция, ослабевают, по сравнению с предыдущим сроком наблюдений, возможно, это промежуточное истощение процессов усвоения кальция.

Сравнив данные, полученные в результате наблюдений, и лабораторных исследований, данного срока эксперимента после операции, можно заключить следующее. По общему самочувствию и внешнему виду, а также потребления пищи и воды особых отличий нет. В обеих группах животные ведут себя активно, по клетке перемещаются, но при этом щадят поврежденную конечность, стараясь полной опоры не давать. Пальпаторное исследование у крыс данных групп умеренно болезненно, крепитация отломков не прослеживается, хотя незначительная подвижность в месте перелома имеет место быть. Следует особо отметить, что у крыс принимающих процедуры фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда визуально отечность оперированной лапы практически не наблюдается, за исключением крыс, у которых проблемы с первичным заживлением ран. При микроскопическом и гистологическом исследованиях, у крыс, которые получали физиотерапевтическое лечение отечность интерстициальной ткани, мышечных волокон, надкостницы - выражении гораздо меньше, чем при исследовании крыс с переломом без воздействий. Со стороны биохимических исследований отмечается резкий подъем концентрации ионов кальция в плазме крови животных прошедших курс фонофореза с препаратом, содержащим нативный пчелиный яд. Концентрация ионов данного элемента в два раза выше, чем в группе с самостоятельно срастающимся переломом. Это может свидетельствовать о депонирование ионов СаІ⁺ для кальцификации остеонов с остеоцитами.

4.3 Структурная и метаболическая характеристики процесса репарации перелома у крыс на 14-е сутки опыта с применение фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда

При наблюдении за поведением крыс на 14-е сутки опыта отмечалось, что животные активно перемещаются по клетке, используя поврежденную конечность, пальцы при этом растопырены, что свидетельствует о безболезненности осевой нагрузки на нее. Шерсть у крыс гладкая, ухоженная, прием пищи, воды - без особенностей, глаза ясные, носы чистые, теплые. Исследование лапы пальпаторно, безболезненно, - ее объем не отличается от противоположной, кожные покровы одинаковой температуры. Послеоперационная рана, у подавляющего большинства животных, зажила первично без признаков воспаления, у крыс с проблемами заживления на месте раны образовался плотный рубец - отделяемого нет.

Через 14 суток опыта (6 сеансов фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда) - при гистологическом исследовании окружающие область перелома мышцы обычного вида, инфильтрация или отек в них не определяются. Надкостница сплошная, утолщена за счет фиброзных волокон, клетки надкостницы располагаются в несколько рядов, но их визуально меньше чем в предыдущем сроке наблюдений. Плотная часть кости сплошная, но в области бывшего перелома в ней несколько больше базофильных грубых фиброзных волокон (рис. 4.3.1). Внутрь, в костный канал отходят хаотично расположенные сливающиеся балки, состоящие из фиброзных грубых волокон, плотного костного вещества и гнезд остеоцитов с плотной фиброзной капсулой. Сами остеоциты частью с бледными ядрами, частью с нормохромными ядрами. Лимфоидной инфильтрации в костном канале не наблюдается.



Рис. 4.3.1. Область перелома малоберцовой кости крысы. 14-е сутки опыта, фонофорез с препаратом содержащим пчелинный яд. Сплошная костная пластина, множество гнезд остеоцитов, фиброзные волокна, канал заполненный гистиоцитами и остеоцитами. Окраска: гематоксилин. Увеличение: Ч100

При биохимических исследованиях (таблица 4.1.1) отмечается резкое снижение в содержании СаІ⁺ и (РО₄^3-) в плазме крови, концентрация ионов кальция в плазме меньше в два раза меньше чем в контроле, меньше оно и чем в группе с переломом, на который не оказывалось воздействий, но при этом снижение содержания ионов фосфора незначительно. Щелочная фосфатаза остается, практически, на том же уровне, что и в предыдущий срок. Это может говорить о том, что интенсивность механизмов, обеспечивающих поглощение кальция тканями нормализуется, кроме того оно становится более сбалансированным. Очевидно, это связано с восстановлением, хотя и неокончательным, целостности плотного вещества поврежденной кости.

4.4 Структурная и метаболическая характеристика репарации перелома кости на 21-е сутки опыта с применение фонофореза с комбинированным препаратом пчелиного яда

Наблюдение за подопытными животными на 21-й день опыта показало, что они выглядят совершенно здоровыми. Активно перемещаются по клетке, используя все конечности в одинаковой мере. Шерсть гладкая, ухоженная, носы чистые теплые, глаза ясные. Прием пищи и воды без особенностей. При визуальном исследовании поврежденной конечности видна полная эпителизация послеоперационной раны, пальпаторно конечность безболезненная. Объем и температура поврежденной конечности соответствует данным здоровой, при пальпации в области перелома определяется небольшое бугристое утолщение.

При гистологическом исследовании ткани окружающие перелом обычного вида, межмышечные перегородки тонкие, плотные, миоциты обычного вида. Инфильтрирования ткани клеточными элементами не выявлено. Вокруг зоны бывшего перелома сформирована тонкая муфта из негрубых фиброзных волокон. Надкостница над областью перелома такая же тонкая как над остальной костью. Ядра клеток с нежным рисунком хроматина, небольшие располагаются в один ряд.

Плотное вещество кости сплошное, с выраженной остеоновой структурой, т.е. в однородном эозинофильном веществе определяются рассеянные гнезда остеоцитов (рис. 4.4.1). В большинстве гнезд их 1-2 в некоторых 4-6 штук. Они средних размеров с небольшими ядром, капсула гнезда плотная. Ближе к костному каналу остеоциты располагаются в скоплениях, гнезд они не формируют, т.к. нет капсулы вокруг. Сами клетки с большим светлым ядром. В костном канале определяются тонкие балки, создающие единую структуру, в их ткани определяются небольшие группы базофильных фиброзных волокон.