Фактори фіброзу та деградації екстрацелюлярного матрикса в прогресуванні хронічної серцевої недостатності у хворих на хронічне обструктивне захворювання легень та артеріальну гіпертензію

1.3 Біомаркери екстрацелюлярного матриксу при хронічній серцевій недостатності, артеріальній гіпертензії і хронічному обструктивному захворюванні легень

Невід'ємну складову прогресування ХСН становить кардіоваскулярне ремоделювання [158], в основі якого лежать порушення процесів, які регулюють метаболізм ЕЦМ. Якщо синтез и деградація компонентів ЕЦМ контролюється місцевими (ММП, цитокіни, фактори фіброзу, ТІММП) i гормональними механізмами регуляції (соматотропний гормон, естрогени, альдостерон), то самий ЕЦМ являє собою складну структуровану мережу макромолекул і протеолітичних ферментів, що забезпечують взаємодію клітин і міжклітинної речовини між собою.

ЕЦМ в організмі людини відповідає за підтримання гомеостазу, визначаючи структуру органів і тканин, постійність тканинної проникності і водно-сольової рівноваги та імунологічний захист за допомогою запрограмованих природою механізмів мінливості. Компоненти матриксу є не тільки її структурними складовими, а й виконують в організмі безліч регуляторних функцій.

До складу ЕЦМ входять фібрилярні білки (колаген, еластин), структурні глікопротеїни (фібронектин, ламінін) і протеоглікани 3 класу (в їх складі 6 класів глікозаміногліканів (ГАГ), що приєднані до корових білків).

До фібрилярних білків відноситься колаген, що становить близько 6 % маси тіла. Розташування фібрил колагену забезпечує виконання їх головної функції - надавати тканинам міцність на розрив. Залежно від того, з яких альфа-ланцюгів складається тропоколаген, формуються генетично різні типи колагену: I, II, III, IV та ін. (близько 20 типів ізоколагенів). Кожен з них переважає в якійсь певній тканині: тип I - в кістках, дентіні, сухожиллях, шкірі, роговиці ока; тип II - в хрящі, міжхребцевих дисках, склоподібному тілі ока; тип III - в шкірі ембріона, в серцево-судинній системі і в патологічно змінених тканинах; тип IV - в базальних мембранах, забезпечуючи зв'язок клітинних шарів епітелію з підлеглою сполучною тканиною.

Інша складова ЕЦМ - глікопротеїни - сполуки, в молекулах яких залишки оліго- або полісахаридів зв'язані ковалентно з поліпептидними ланцюгами білка (О-або N-глікозідними зв'язками). Глікопротеїни широко поширені не тільки в сполучній тканині, але і в природі в цілому. До них відносять компоненти плазми крові (імуноглобуліни, трансферин), речовини, що визначають групу крові, деякі гормони, лектини, ферменти.

ГАГ є основними компонентами ЕЦМ і поділяються на 6 основних класів: гіалуронова кислота, хондроїтинсульфати, дерматансульфати, кератансульфати, гепарансульфати і гепарин. Перша складова частина ГАГ - це залишки гексуронових кислот, друга - гексозаміни. Характерна особливість всіх ГАГ - присутність сульфатних або / і карбоксильних груп, що забезпечують сильні аніонні властивості цих ланцюгів. Фізико-хімічна природа ГАГ і стрижневих білків визначає фізичні властивості та біологічні функції протеогліканів. За вмістом сульфатних груп ГАГ поділяються на сульфатовані і несульфатовані.

Хондроїтинсульфати разом з кератан-, дерматан-, гепарансульфатами та гепарином відносяться до сульфатованих ГАГ. Ці сполучення складаються з послідовно з'єднаних дисахаридних одиниць, кожна з яких містить гексозамін і уронові кислоти або галактозу. Фізико-хімічні властивості одних і тих самих типів ГАГ, виділених з різних типів сполучної тканини хребетних, можуть різнитись між собою, головним чином, за рахунок ступеню і місця сульфатування даних сполук [159, 160]. Класичним прикладом є хондроїтин-4- і хондроїтин-6-сульфати. Це ізомери, що відрізняються тільки локалізацією в їх молекулі сульфатної групи: у хондроїтин-4-сульфата вона приєднана до 4-го атома вуглецю в молекулі галактозаміну, а у хондроїтин-6-сульфата, відповідно, до 6-го атому. Kelliy G. S. та ін. також відзначають, що самі хондроїтин-4-сульфати і хондроїтин-6-сульфати можуть бути гетерогенні за структурою. Всередині їх ланцюгів часто присутні дисахаридні субодиниці, в яких сульфатна група або відсутня зовсім, або займає невластиве для даного ГАГ положення при 2, 4 або 6 атомах вуглецю; а молекула дисахариду може бути гіперсульфатована відразу в двох або трьох положеннях [161]. Якщо функціональні можливості клітин до синтезу хондроїтин-4-сульфату знижені, цей компонент заміщується іншими елементами з погіршенням якісних характеристик тканини.

Синтезуються ГАГ фібробластами та ендотеліальними клітинами. Продуцентами гепарину є тучні клітини, базофіли та ендотеліальні клітини. Тучні клітини розташовуються в безпосередній близькості до мікросудин тканини і мають виняткову чутливість до різних впливів, у тому числі патогенних. Tammi M. I. та ін. вважають, що секретуючи гепарин, гістамін, простагландин та інші біологічно активні речовини, а також являючись джерелом великої кількості цитокінів багатофункціональної дії, тучні клітини беруть участь в регуляції тканинного гомеостазу, впливають на кровообіг, ріст і активність сполучної тканини, рівень транскапілярного обміну, і, таким чином, можуть відігравати важливу роль у розвитку багатьох патологічних процесів [162, 163, 164]. Гепарин є одним з місцевих регуляторів мікроциркуляції, і чутливість мікросудин до нього дуже висока. Він здатен взаємодіяти з ендотелієм судинної стінки, визначати організацію та обсяг фібрилярних структур на поверхні ендотелію, в міжендотеліальних просторах і базальній мембрані, регулювати як міжендотеліальний, так і трансендотеліальний шлях транспорту речовин.

ГАГ входять і до структури серця. Так, ГАГ клапанів серця людини складаються, в основному, з гіалуронової кислоти, меншою мірою - з дерматан-сульфату, хондроїтин-4-сульфату та хондроїтин-6-сульфату і мінімальною кількістю гепарансульфату.

Toole B. та ін. було показано, що разом зі структурними функціями у складі глікокаліксу ендотелію ГАГ визначають його поверхневий заряд, проникність судинної стінки, антикоагулянтний потенціал крові, беруть участь у регуляції ангіогенезу та є ендогенними протекторами ендотелію [165, 166, 167, 168].

Роль ГАГ при патології серця залишається нез'ясованою. Так, Burgard G. та співавт. встановили, що у відповідь на підвищення АТ відбувається посилення ЕЦМ кровоносних судин, на що впливає присутність підвищеної кількості хондроїтин-4-сульфатних або хондроїтин-6-сульфатних ланцюгів. Посилення судинного ЕЦМ протягом тривалого періоду призводить до підвищення жорсткості судин, і як результат - до підвищення АТ. Автори продемонстрували, що застосування гіалуронідази призводить до зниження АТ шляхом руйнування надмірно посиленого ЕЦМ, і, переважно, хондроїтин-4-сульфатних і / або хондроїтин-6-сульфатних ланцюгів, що в результаті призводить до більшої пластичності судин та зменшення АТ [6].

Vuorio E. та співавт. показали, що хондроїтин-4-сульфат вивільнюється тромбоцитами і бере участь у регуляції згортання крові, перешкоджує утворенню тромбів і порушенню мікроциркуляції [169].

Продемонстровано, що ГАГ є складовою частиною і бронхо-пульмонального дерева [170]. Так, Monzon M. E. та ін. встановили, що в легенях людини кератансульфати представлені на апікальній поверхні миготливого епітелію, хондроїтинсульфати і дерматансульфати - в секреті клітин епітелію і підслизових залоз, а гепарансульфати - в структурних компонентах трахеї [171].

Kranenburg A. R. та Annoni R. звернули увагу, що ЕЦМ дихальних шляхів зазнає значних змін при ХОЗЛ, з потовщенням стінок і звуженням просвіту дрібних бронхів, що є причиною бронхообструкції [172, 173, 174].

Невипадково ГАГ знайшли своє застосування в клінічній практиці. Так, у хворих на цукровий діабет 2 типу та ішемічною хворобою серця продемонстрована ефективність ГАГ в профілактиці контраст-індукованої нефропатії. Застосування ГАГ створювало передумови для профілактики ниркової дисфункції, надаючи антипротеїнурічний ефект, коригуючи порушення ліпідного обміну та згортання крові [175].

Таким чином, враховуючи очевидну роль сполучно-тканинного матриксу в забезпеченні не тільки структури, але й функціональної здатності легень, міокарда та ендотелію, реологічних властивостей крові, судинної проникності, регуляції АТ, вивчення особливостей порушень метаболізму ЕЦМ при ХСН на тлі АГ в сполученні з ХОЗЛ дозволить розширити уявлення про механізми ремоделювання міокарда та легень при цій поєднаній патології та попередити їх розвиток.

1.4 Роль антитіл до колагену IV типу в формуванні хронічної серцевої недостатності при артеріальній гіпертензії та хронічному обструктивному захворюванні легень

На сьогоднішній день увага вчених багатьох країн прикована до ролі аутоімунної патології в розвитку і прогресуванні багатьох захворювань. Велике значення при цьому приділяється визначенню ролі специфічних аутоантитіл проти структурних компонентів органів-мішеней. Саме вони здатні чинити пряму пошкоджуючу дію на власні тканини, призводячи до втрати їх функціональної активності.

Нещодавні дослідження показали, що більшість хворих на ХОЗЛ мають підвищений рівень сироваткових антитіл, що реагують з аутоантигенами [176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184], а поява антитіл до конкретних аутоантигенів корелює з тяжкістю захворювання [179, 180, 181].

Дослідження аутоімунної етіології ХОЗЛ дає суперечливі результати. Так, Toyoshima M. та співавт. висловлюють припущення, що аутоантитіла при ХОЗЛ виникають внаслідок загального запалення і не відіграють істотної ролі в патології захворювання [185]. Проте наявність аутореактивної адаптаційної імунної відповіді в патогенезі захворювання підтверджується дослідженнями багатьох вчених. Так, Feghali-Bostwick C. A. та співавт. вдалось виявити аутоантитіла до легеневого епітелію в сироватці хворих на ХОЗЛ [177]. Kirkham P. A. та співавт. повідомляють про те, що карбоніл-модифіковані білки, що виникають в результаті окислювального стресу, сприяють виробці аутоантитіл, відображаючи здатність окислювального стресу керувати аутоімунною відповіддю при ХОЗЛ. При цьому концентрація аутоантитіл до власних білків корелювала з тяжкістю ХОЗЛ [179]. Аутоімунне походження ремоделювання легенів наглядно продемонстрували Lee S. H. з групою колег, визначивши, що тяжкість емфіземи при ХОЗЛ вірогідно асоціюється з рівнем аутоантитіл до еластину [181]. Пізніше була виявлена асоціація емфіземи у хворих на ХОЗЛ з високими рівнями аутоантитіл до агрекану, колагену і молекул сплайсосоми, а Rinaldi M. та співавт. в своїх дослідженнях зазначили, що аутоімунна відповідь саме до колагену, а не еластину пов'язана з тяжкістю ХОЗЛ [186].

Тож до теперішнього часу накопичено достатньо даних, що дозволяють стверджувати, що аутоімунна відповідь присутня у хворих на ХОЗЛ та має асоціацію з погіршенням структури та функції легень [187, 180].

Очевидно, що білки позаклітинного матриксу грають роль в ремоделюванні дихальних шляхів і кровоносних судин, а колаген IV типу як основний компонент базальних мембран ендотеліальних клітин має важливе значення в комунікаціях між компонентами ЕЦМ і кров'яного русла.

Порушення полімерної структури молекули колагену IV типу добре відомо при синдромі Гудпасчера [125]. Проте рядом дослідників показано, що колаген IV типу може накопичуватись і при інших захворюваннях. При цукровому діабеті його акумуляція в стінці судин мікроциркуляторного русла призводить до порушення бар'єру судинної стінки і стимуляції тромбоутворення [188, 189, 190]. При цьому надлишок колагену IV типу в субендотеліальному просторі призводить до екстравазації протеїнів з індукцією паравазального фіброзу. Так, накопичення колагену IV типу розцінюється, як одна з причин мікроангіопатії, в т.ч. нефропатії.

Nikolov A. та співавт. показали зв'язок підвищенних рівнів аутоантитіл проти колагену IV типу з розвитком мікроангіопатій при цукровому діабеті [191], Direskeneli H. - з системним васкулітом, Tiwana H. - з хворобою Крона [192, 193].

На сьогоднішній день залишається неясною роль аутоантитіл до колагену IV типу при ХСН, так само як при АГ і ХОЗЛ. При імуногістохімічному дослідженні у хворих на ХОЗЛ в неоінтимі встановлено збільшення накопичення колагену IV типу і фібронектину, а в медіальному шарі - ламініну [172].

Packard T. A. та співавт. пропонують визначати цілий ряд аутоантитіл у хворих на ХОЗЛ, що визначають статус захворювання [194]. Так, за їх даними у хворих на ХОЗЛ рівень антитіл до колагену IV типу більш, ніж в 2 рази перевищував значення здорових осіб. Daffa N. I. та ін. також повідомляли про їх підвищення при ХОЗЛ [13]. Але взаємозв'язків отриманих даних з клініко-функціональними параметрами легенів і серця автори не встановлювали.

Аутоантитіла проти колагену IV типу були виявлені і при кардіологічній патології [195, 196]. Згідно з даними Tandon R., кардит при ревматичній лихоманці є результатом імунної відповіді проти колагену IV типу, що чинить вплив на підлеглий ендотелій [198]. А раніше було показана здатність стрептококового білка, що індукує розвиток ревматизму, до зв'язування з колагеном IV типу. Продовженням цих знахідок стало відкриття підвищених титрів антитіл проти колагену IV типу у хворих на гострий ревматизм [199].

За останніми даними у хворих після інфаркту міокарда значно підвищені рівні IgM і IgG проти нативного колагену IV типу [14]. У дослідженні Matache C. та співавт. з використанням методу ELISA продемонстрована асоціація підвищених рівнів IgG антитіл до колагену IV типу з інфарктом міокарда та ідіопатичною дилатаційною кардіоміопатією [197].

Pontus Dunйr та співавт. показали, що аутоантитіла проти колагену типу IV пов'язані з інфарктом міокарда незалежно від традиційних факторів серцево-судинного ризику [14]. Nicoloff G. та співавт. виявили аутоантитіла проти колагену IV типу при АГ в поєднанні з цукровим діабетом I типу [200, 201].

За даними літератури високі рівні IgM до колагену IV типу пов'язані з більш низьким рівнем ММП-9. Проте експресія ММП-9 на поверхні фіброзної бляшки підвищує ризик її розриву, що заперечує її негативній кореляції з аутоантитілами до колагену IV типу. Але ММП-9 може сприяти стабільності бляшки, полегшуючи міграцію гладко-м'язових клітин. Ця гіпотеза підтверджується Johnson J. L., Fernandez-Patron C. та ін. в дослідженнях, в яких показана здатність ММП-9 інгібувати агрегацію тромбоцитів у відповідь на тромбін, а видалення гену ММП-9 у тварин призводило до збільшення пошкодження і нестабільності бляшки з меншою кількістю гладко-м'язових клітин [202, 203, 204].

Тож враховуючи асоціацію антитіл до колагену IV типу з серцево-судинним ризиком і ХОЗЛ, важливим є визначення їх ролі в прогресуванні ХСН у хворих з поєднаною кардіо-пульмональною патологією.

1.5 Можливості терапевтичної корекції хронічної серцевої недостатності у хворих на артеріальну гіпертензію з супутнім хронічним обструктивним захворюванням легень

Сполучення АГ і ХОЗЛ при ХСН накладає відомі обмеження як на вибір і комбінацію терапевтичних засобів, так і на тактику лікування даних хворих. Особливості лікування АГ в сполученні з ХОЗЛ обумовлені декількома факторами: деякі гіпотензивні засоби здатні підвищувати тонус дрібних і середніх бронхів, погіршуючи тим самим вентиляцію легенів і збільшуючи гіпоксемію; в осіб із тривалим анамнезом ХОЗЛ формується симптомокомплекс ХЛС і фармакодинаміка деяких препаратів при цьому змінюється, що варто обов'язково враховувати при підборі препаратів; лікування бронхообструкції, в свою чергу, у ряді випадків здатне змінювати ефективність терапії АГ. Патогенетичні механізми АГ і ХОЗЛ багато в чому подібні, але при поєднанні цих патологій лікування ХСН створює складну задачу.

На сьогоднішній день не існує доказової бази ефективності терапії ХСН у хворих з поєднанням АГ і ХОЗЛ. Сучасні міжнародні рандомізовані дослідження, в основному, вирішують питання порівняння ефективності різних класів препаратів або їх комбінацій при ХСН. Можливості використання результатів цих досліджень в реальній клінічній практиці часто обмежені, оскільки в список критеріїв виключення потрапляє велика кількість хворих на АГ з поєднаною патологією, в тому числі і ХОЗЛ. У зв'язку з цим при розгляді питання про особливості терапії ХСН у хворих на АГ та ХОЗЛ необхідно відзначити недоліки, а часом і відсутність рандомізованих клінічних досліджень щодо застосування окремих препаратів та їх комбінацій в лікуванні цієї категорії хворих [205].

З іншого боку, протоколи ведення хворих з ХОЗЛ не враховують поєднану кардіальну патологію. Так, ні в європейських рекомендаціях з ведення АГ, ні в рекомендаціях з ведення хворих із ХСН взагалі не виділяється такого клінічного варіанту - АГ в поєднанні з ХОЗЛ чи ХСН на тлі АГ і ХОЗЛ [1, 7]. У цих рекомендаціях в розділі «коморбідність ХСН з ХОЗЛ» обговорюються особливості ведення ХСН у хворих на ХОЗЛ, проблеми підбору в-блокаторів та глюкокортикоїдів, переважні терапевтичні стратегії. Зазначено, що «лікування ХСН у хворих на ХОЗЛ повинно проводитися у відповідності зі стандартними рекомендаціями, оскільки немає даних про те, що ХСН слід лікувати інакше при наявності ХОЗЛ» [1,7].

Труднощі терапії полягають у взаємовиключних підходах в лікуванні ХОЗЛ із супутньою кардіоваскулярною патологією. Спроби активного медикаментозного впливу на одне захворювання пов'язані з реальною загрозою ятрогенного загострення іншого. Згідно з даними дослідження Kramer J. M. та співавт., у хворих з ХСН, які отримують інгаляційні в2-агоністи, підвищений ризик смерті та госпіталізації [206]. Блокатори кальцієвих каналів у цієї категорії хворих можуть підсилити застійну серцеву недостатність і призвести до появи периферичних набряків [207]. Hawkins N. M. та ін. також відмічають, що терапія селективними в1-адреноблокаторами чинить істотний вплив на виживаність пацієнтів із ХСН, а наявність ХОЗЛ є найважливішою причиною, за якою дана категорія пацієнтів не отримує лікування в повному обсязі [208, 209].

Не викликає сумніву, що в лікуванні ХСН у хворих на АГ з ХОЗЛ виправдане призначення препаратів, які відповідають ряду вимог:

* адекватний контроль АТ в нічні та ранні ранкові години;

* сумісність препаратів з базисними засобами лікування ХОЗЛ;

* відсутність ефектів, що погіршують вентиляцію легень і поглиблюють гіпоксемію;

* позитивний вплив на гемодинаміку малого кола кровообігу;

* виражені кардіо- та вазопротективні ефекти;

* відсутність впливу на фармакодинаміку антигіпертензивних препаратів в умовах гіпоксії.

Також необхідно, щоб обраний препарат впливав на патогенетичні механізми формування ХСН при АГ та ХОЗЛ.

Добре відомо, що ведення хворого з ХСН включає призначення інгібіторів АПФ або антагоністів рецепторів до агіотензину II, в-адреноблокаторів та антагоністів альдостерону [7]. Сформовано чимало підстав для перегляду розуміння механізмів дії антагоністів альдостерону та розширення сфери застосування цих препаратів при ХСН. Приймаючи до уваги позитивні ефекти антагоністів альдостерону на нейрогуморальну систему, ремоделювання серця і судин, ефективність та безпеку застосування, можна вважати, що спіронолактон поліпшує виживання хворих із ХСН. Підтвердженням цьому стало рандомізоване дослідження RALES [210] з включенням 1663 хворих із ХСН ІІІ-ІV ФК і фракцією викиду ЛШ < 35 %. Застосування спіронолактону на фоні базисної терапії ХСН у цих хворих дозволило зменшити кількість летальних випадків на 30 %, госпіталізацій - на 36 %. Такий ефект препарату не залежав від ФВ ЛШ, етіології ХСН (ішемічна чи неішемічна), концентрації креатиніну в сироватці, віку, супутнього прийому інгібіторів АПФ чи серцевих глікозидів. Ризик смерті внаслідок серцевих причин зменшився на 31 %, зумовленої прогресуванням ХСН - на 35 %, раптової смерті - на 29 %.

Підсумком доказу токсичного системного впливу гіперальдостеронізму на стан організму хворих із ХСН стала поява рекомендацій, згідно з якими антагоністи альдостерону в разі відсутності протипоказань повинні призначатися всім хворим з ХСН з низькою ФВ ЛШ і важким перебігом ХСН (III-IV ФК). Пізніше ж ці рекомендації розширили показання до призначення антагоністів альдостерону у хворих з ХСН [7].

Ще однією перевагою антагоністів альдостерону, при порівнянні з іншими засобами лікування ХСН, є їх здатність запобігати інтерстиціальному і периваскулярному фіброзу, а відтак - процесам серцево-судинного ремоделювання [211].

На конгресі Європейського товариства кардіологів у Мюнхені були представлені результати дослідження Aldo-DHF, яке показало сприятливий ефект спіронолактону у 422 хворих на АГ з діастолічною дисфункцією лівого шлуночка (ДДЛШ), які отримували спіронолактон в цільовій дозі 25 мг / добу або плацебо протягом 12 місяців. Крім того, в основній групі виявили зворотний розвиток ремоделювання серця і зменшення гіпертрофії ЛШ, рівнів NTproBNP і АТ [212].

Позитивний ефект спіронолактону при кардіальній патології відзначений багатьма дослідниками [213, 214, 215]. При цьому, за даними Pit B. та співавт. такий ефект забезпечують навіть малі дози спіронолактону [216]. Доречно зазначити, що розуміння доцільності застосування спіронолактону саме в низьких дозах при лікуванні хворих з ХСН прийшло тільки в останні роки.

Спіронолактон знайшов своє застосування і в терапії ХЛС [217]. Так, додаткове призначення спіронолактону до інгібітора АПФ при декомпенсованому ХЛС призводило до поліпшення діастолічної функції правого і лівого шлуночків, зменшення систолічного і діастолічного розмірів обох шлуночків і передсердь, поліпшення їх систолічної функції і зниженню ЛГ [218].

Вищеописані ефекти застосування спіронолактону дослідники пояснюють встановленими в останні роки новими даними про механізми вторинного гіперальдостеронізму при ХОЗЛ і ЛГ. По-перше, було виявлено, що рівень альдостерону може істотно підвищуватись при ЛГ без ознак вираженої правошлуночкової недостатності, що вимагає більш раннього включення антагоністів альдостерону в комплексну терапію при ХЛС. По-друге, в експерименті було виявлено, що спіронолактон діє подібно антагоністів кальцію, викликаючи блокаду повільних кальцієвих каналів з вазодилатуючим і бронхорозширюючим ефектом [219]. По-третє, інгібування спіронолактоном альдостерону, який надає прозапальну активність, може мати певне значення в лікуванні хворих із загостренням ХОЗЛ.

Чучалін О. Г. та співавт. зазначили, що спіронолактон володіє прямою судинною дією у хворих з рефрактерною серцевою недостатністю - на тлі лікування спіронолактоном спостерігалось розширення не тільки системних, але і легеневих судин, знижувався тиск у правому передсерді, правому і лівому шлуночках; достовірно зменшувався легеневий судинний опір [19]. Дуже важливо, що Van Vliet A. A. з колегами продемонстрували здатність препарату зменшувати бронхіальну обструкцію [220].

Встановлено, що монотерапія спіронолактоном сприяє збільшенню виробки простагландину Е2, що надає вазодилатуючий і антиагрегантний ефекти. Зазначено, що судинорозширювальна та бронхолітична дії спіронолактону не пов'язані з впливом на нирки і розширюють можливості використання спіронолактону при ХЛС [19].

Цікаві дані представлені в роботах Kramer A. B. та ін., що показали зниження вмісту колагену IV типу в судинах під впливом спіронолактону у щурів при індукованому нефрозі [221]. Подібні ефекти спіронолактону можна пояснити його впливом на метаболізм ЕЦМ шляхом конкурентного антагонізму з альдостероном. На сьогоднішній день участь альдостерону в метаболізмі ЕЦМ пояснюється його так званими геномними ефектами: здатністю збільшувати експресію генів фіброгенних факторів росту (ТФР-в1), змінювати синтез колагену III і IV типів [222], а також ініціювати накопичення компонентів ЕЦМ. Важливо, що за даними Rude M. K. та співавт. ММП, сироватковий вміст яких значно змінюються при ХОЗЛ і АГ, активуються під впливом альдостерону і пригнічуються під впливом спіронолактону [68].

Zhao L. та співавт. повідомляють про зменшення легеневого фіброзу під впливом спіронолактону [57]. Agostoni P. та співавт. висловили думку, що підвищення альдостерону при ХСН потенціює інтерстиціальний фіброз легень саме на рівні рецепторів клітин легень до альдостерону шляхом місцевої дегідратації. Ця думка підтвердилась результатами їх дослідження, в якому у хворих із ХСН при використанні спіронолактону покращувалась дифузійна здатність легень [223]. Отже, відкриваються нові можливості імунологічної, регуляторної та терапевтичної дії на обмін ЕЦМ при ХСН на фоні АГ та ХОЗЛ.

Таким чином, необхідність подальших досліджень щодо визначення ролі факторів фіброзу та деградації ЕЦМ при ХСН на тлі АГ і ХОЗЛ продиктована їх безсумнівним значенням в патогенезі ремоделювання серця і легенів, прогресуванні ХСН, а крім того, відповідно до останніх наукових даних - у розвитку ХЛС і бронхообструкції. Вивчення ж ролі антагоніста альдостерону спіронолактону дозволить визначити його вплив на метаболізм ЕЦМ і можливість його використання в терапії ХСН при АГ у поєднанні з ХОЗЛ.

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1 Клінічна характеристика хворих

Проведено комплексне обстеження 105 хворих, що знаходилися на лікуванні в кардіологічному та терапевтичному відділеннях КЗОЗ Харківська міська клінічна лікарня №27, яка є базовим лікувальним закладом кафедри внутрішньої медицини №2 і клінічної імунології та алергології Харківського національного медичного університету МОЗ України.

Основна група обстеження склала 80 хворих із ХСН II А стадії, II-III ФК (NYHA) на тлі АГ II стадії в поєднанні з ХОЗЛ II-III ступенів бронхообструкції (ст.). Серед обстежених було 54 (67,5 %) чоловіка і 26 (32,5 %) жінок, середній вік 66,56±1,37 років. Для отримання інформативних даних необхідним було створення групи порівняння, яку склали 25 хворих з ХСН II А стадії, II-III ФК (NYHA) на тлі АГ.

В основній групі обстеження виділено наступні підгрупи в залежності від ступеня бронхообструкції: 1А підгрупа складала 39 хворих з ХСН на тлі АГ та ХОЗЛ II ст., серед них 29 (74,3 %) чоловіків і 10 (25,6 %) жінок, середній вік 63,9±1,43 років. 1 Б підгрупа - 41 хворий з ХСН на тлі АГ та ХОЗЛ III ст., серед них 25 (60,9 %) чоловіків і 16 (39,0 %) жінок, середній вік 69,0±1,54 років. В групі порівняння - 25 хворих з ХСН II А стадії, II-III ФК (NYHA) на тлі АГ, з них 13 хворих з II ФК ХСН, серед них 8 (53,3 %) чоловіків і 5 (33,3 %) жінок, середній вік 66,46±1,24 років; 12 хворих з III ФК ХСН, серед них 7 (58,3 %) чоловіків і 5 (38,4 %) жінок, середній вік 64,33±1,2 років. Група контролю включала 20 практично здорових осіб. Серед них 13 (65,0 %) чоловіків і 7 (35,0 %) жінок, середній вік 64,33±1,2 років. Клінічна характеристика хворих представлена в таблиці 2.1.

Таблиця 2.1

Клінічна характеристика хворих із ХСН при АГ за наявністю та відсутністю ХОЗЛ

Показник	ХСН на тлі АГ+ХОЗЛ, n=80	ХСН на тлі АГ, n=25
	Основна група	Група порівняння
	Абс.	%	Абс.	%
Чоловіки	54	67,5	15	60
Жінки	26	32,5	10	40
Вік	66,56±1,37		65,441,2
Тривалість АГ II ст., роки	7,28±5,83		8,4±2,63
Тривалість ХОЗЛ, роки	13,43±5,72		-
Анамнез паління, пачко-років	24,5±6,11		5,2±1,74
ХОЗЛ, група	B	44	55	-
	C	36	45	-
ХОЗЛ, ступінь бронхообструкції	II	39	48,7	-
	III	41	51,2	-
ЛН, ступінь	0	-		15	60
	I	32	40	7	28
	II	48	60	3	12
СН II А стадія	80	100	25	100
ХСН, ФК	II	42	52,5	13	52
	III	38	47,5	12	48

Діагностика ХОЗЛ проводилась на підставі типових симптомів, модифікованої шкали задишки (mMRC), шкали САТ і даних спірометрії відповідно до керівництва GOLD (2014) і наказу МОЗ України № 128 від 19.03.2007 року. Дані спірографічного дослідження обстежених хворих представлені в таблиці 2.2.

Таблиця 2.2

Дані спірографічного обстеження хворих

Показник	Контрольна група	ХСН при АГ	ХСН при АГ і ХОЗЛ II ст.*	ХСН при АГ і ХОЗЛ III ст.*
Кількість, n	20	25	39	41
ОФВ1 (л)	3,15±0,11	2,81±0,08 є	1,9±0,07 є /**	1,0±0,05 є /**/#
ФЖЄЛ (л)	4,10±0,18	3,8± 0,09	2,78±0,09 є /**	1,69±0,07 є /**/#
ОФВ1/ФЖЄЛ (%)	76,83±3,12	74,00±2,80	68,34±2,71 є /**	59,17±2,30 є /**/#
ЖЄЛ (л)	4,0±0,17	3,7±0,06	2,62±0,11 є /**	1,44±0,1 є /**/#
МОШ25% (л/хв)	5,2±0,17	4,86±0,11 є	2,68±0,16 є /**	1,64±0,09 є /**/#
МОШ50% (л/хв)	4,5±0,15	4,1±0,11 є	2,24±0,13 є /**	0,96±0,06 є /**/#
МОШ75% (л/хв)	2,11±0,1	1,81±0,04 є	1,20±0,1 є /**	0,53±0,05 є /**/#
ПОШ (л/хв)	4,01±0,12	3,88±0,09	3,1±0,18 є /**	1,94±0,11 є /**/#

Примітка: * - ХОЗЛ II ст. і ХОЗЛ III ст. - ступені вираженості бронхообструкції згідно спірометричної класифікації GOLD 2014.

є - відмінності порівняно з групою контролю (р<0,05); ** - відмінності порівняно з групою ХСН при АГ (р<0,05), # - відмінності порівняно з групою ХСН при АГ та ХОЗЛ II ст. (р<0,05).

Верифікацію діагнозу АГ проведено згідно критеріям, рекомендованим у 2013 році Європейським товариством гіпертензії (ESH)/Європейським товариством кардіологів (ESC) (Mancia G. et al., 2013) і рекомендаціями української асоціації кардіологів (К.М. Амосова, 2013; Л.Г. Воронков, 2013).

Наявність ХСН встановлювали відповідно до робочої класифікації Українського наукового товариства кардіологів, 2001 p., критеріїв серцевої недостатності NYHA, а також наказу МООЗ України №54 від 12.02.2002 р.

При визначенні стадії ХСН користувались класифікацією Василенка-Стражеска (1935 р.), ФК ХСН - застосовували тест з 6-хвилинною ходьбою.

Тест з 6 - хвилинною ходьбою проводили у відповідності зі стандартним протоколом (Enright, 1998). За допомогою тесту з 6-хвилинною ходьбою визначали толерантність до фізичного навантаження хворих з ХСН, ФК ХСН, контролювали ефективність проведеної терапії [224].

Тест з 6-хвилинною ходьбою високо вірогідний у хворих з ХСН, має прогностичне значення при проходженні дистанції 300 м. Тест проводили в лікарняному коридорі, довжина якого 30 метрів. Перед проведенням тесту оцінювали початковий стан хворого: контроль АТ, частоту серцевих скорочень (ЧСС), електрокардіографію (ЕКГ). Потім хворому пропонувалася ходьба протягом 6 хвилин у звичайному для нього темпі. Якщо в процесі виконання навантаження з'являлися симптоми серцевої недостатності, хворий повинен був уповільнити ходьбу або навіть зупинитися. Оцінювали пройдену дистанцію, проводили оцінку симптомів, що лімітують виконання тесту за шкалою Borg:

а) запаморочення;

б) ангінозний біль;

в) задишка;

г) втома;

д) пресинкопальний / синкопальний стан.

Критерії включення хворих в дослідження:

· хворі з ХСН II А стадії, II і III ФК на тлі АГ II стадії в поєднанні з ХОЗЛ II -III ступенів бронхообструкції;

· хворі з ХСН II А стадії, II і III ФК на тлі АГ II стадії;

Критерії виключення хворих із дослідження:

· перенесений інфаркт міокарду, стан після порушення мозкового кровообігу;

· наявність онкологічної, ендокринної, ниркової та аутоімунної патології;

· загострення хронічних чи наявність гострих запальних процесів;

· супутні психічні захворювання, алкоголізм, наркоманія;

· ХОЗЛ IV ступеня бронхообструкції і некомпенсоване ХЛС;

· ХСН III стадії;

· гіперкреатинінемія, гіперкаліємія, гіперурікемія, ожиріння;

На першому етапі дослідження проводилось первинне обстеження та розподіл хворих на групи, на другому - розподіл хворих на групи в залежності від терапії спіронолактоном та повторне обстеження через 3 місяці після лікування.

Хворі з ХСН при АГ II ст. (25 осіб) та АГ II ст. в сполученні з ХОЗЛ (80 осіб) отримували інгібітори АПФ (лізиноприл 10 мг на добу), при непереносимості - антагоністи рецепторів до ангіотензину II (валсартан у дозі 160 мг на добу), діуретики (індапамід 2,5 мг на добу). Хворі з ХСН при АГ II ст. та ХОЗЛ II ст. також отримували тіотропіуму бромід 18 мкг на добу і фенотерол 50 мкг за потребою, а хворі з ХСН при АГ II ст. та ХОЗЛ III ст. отримували флутиказону пропіонат 125 мкг і сальметерол 25 мкг 1 доза по 2 інгаляції 2 рази на добу, а також іпратропіуму бромід 0,2 мг за потребою.

Для порівняльної оцінки ефективності лікування хворих із ХСН при АГ та ХОЗЛ з основної групи було сформовано дві підгрупи хворих: перша підгрупа хворих з ХСН II А стадії на тлі АГ з ХОЗЛ, які отримували комплексну базисну терапію (41 особа), і друга підгрупа хворих з ХСН II А стадії на тлі АГ з ХОЗЛ, яким додатково було призначено терапію спіронолактоном в дозі 50 мг на добу протягом 3 місяців (39 осіб).

2.2 Методи дослідження

Всім групам хворих до та після лікування, а також контрольній групі проводилось комплексне клінічне обстеження, рентгенографія органів грудної клітини, визначення функції зовнішнього дихання (ФЗД), доплерехокардіографія, визначення показників обміну ЕЦМ - глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів, фракцій ГАГ, а саме - хондроїтин-6-сульфатів, хондроїтин-4-сульфатів / дерматансульфатів, гепарансульфатів / кератансульфатів; матриксної металопротеази-9, альдостерону, ТФР-в1, б2-макроглобуліну і антитіл до колагену IV типу.

Обов'язкові методи дослідження (наказ № 247 МОЗ України «Виявлення осіб з підвищеним АТ і принципи їх ведення») включали: визначення зросту та маси тіла пацієнтів; визначення АТ на обох верхніх кінцівках у стані спокою за методом Короткова з кратністю не менш ніж 3 вимірювання і подальшим обчисленням середніх значень; аускультацію серця, судин шиї та в точках проекції ниркових артерій; загальний аналіз крові; загальний аналіз сечі; аналіз крові на вміст цукру; аналіз сечі за Нечипоренком; біохімічний аналіз крові із визначенням кількості сечовини та креатиніну, калію, загальних ліпідів, загального холестерину, холестерину ліпопротеїнів низької щільності, холестерину ліпопротеїнів високої щільності, тригліцеридів; ЕКГ; ехокардіографії (Ехо-КГ), дослідження очного дна.

Відповідно до рекомендацій Європейського товариства гіпертензії та Європейського товариства кардіологів (2007 р.), АГ є підвищення систолічного АТ (САТ) до 140 мм рт. ст. і вище або діастолічного АТ (ДАТ) до 90 мм рт. ст. і вище, що підтверджено при повторних вимірюваннях АТ (не менш ніж 2-3 рази у різні дні протягом 4 тижнів). За рівнем АТ визначають ступені АГ (табл. 2.3).

Таблиця 2.3

Класифікація артеріальної гіпертензії за рівнем АТ

Категорії	САТ, мм рт. ст.	ДАТ, мм рт. ст.
Оптимальний	<120	<80
Нормальний	<130	<85
Високий нормальний	130-139	85-89
Гіпертензія	1 ступінь	140-159	90-99
	2 ступінь	160-179	100-109
	3 ступінь	>180	>110
Ізольована систолічна гіпертензія	>140	<90

Для визначення стадії АГ застосовували класифікацію за ураженням органів-мішеней. Ця класифікація розроблена експертами ВООЗ (1963, 1993) та прийнята в Україні в 1992 році згідно до наказу МОЗ України № 206 від 30.12.92р. і рекомендується до подальшого застосування згідно наказу № 247 від 1.08.98р. (табл. 2.4). Хворі з АГ III ст. виключались з дослідження.

Хворим проводили ЕКГ в 12 стандартних відведеннях за допомогою трьохканального електрокардіографа в стані спокою перед дослідженням та по закінченню дослідження.

Ехо-КГ дослідження проводили за стандартною методикою (Х. Фейгенбаум, 1999) на ультразвуковому апараті RADMIR (Ultima PRO 30) (Харків, Україна). У М-режимі визначали наступні параметри лівого шлуночка (ЛШ): кінцевий діастолічний розмір (КДР) (мм), кінцевий систолічний розмір (КСР) (мм), товщину задньої стінки (ТЗС ЛШ) (мм), товщину міжшлуночкової перетинки (ТМШП) (мм). Кінцевий діастолічний і систолічний об'єми (КДО і КСО) ЛШ (мл) розраховували за методом Simpson (1991), після чого обчислювали фракцію викиду ЛШ (%).

Таблиця 2.4

Класифікація АГ за ураженням органів-мішеней

Стадія I	Об'єктивні ознаки органічних ушкоджень органів-мішеней відсутні
Стадія II	Є об'єктивні ознаки ушкодження органів-мішеней без симптомів з їх боку чи порушення функції. ГЛШ (за даними ЕКГ, Ехо-КГ, рентгенографії) або генералізоване звуження артерій сітківки, або мікроальбумінурія та/або невелике збільшення концентрації креатиніну в плазмі (у чоловіків 115-133 мкмоль/л, у жінок 107-124 мкмоль/л), ураження сонних артерій - потовщення інтими-медії 0,9 мм або наявність атеросклеротичної бляшки
Стадія III	Є об'єктивні ознаки ушкодження органів-мішеней з симптомами з їх боку та порушенням функції
Серце	ІМ СН ІІ А-ІІІ ст. Інсульт
Мозок	Транзиторна ішемічна атака Гостра гіпертензивна енцефалопатія Судинна деменція
Очне дно	Крововиливи та ексудати в сітківці з набряком диску зорового нерва або без нього (ці ознаки патогномонічні також для злоякісної фази артеріальної гіпертензії)
Нирки	Концентрація креатиніну в плазмі: у чоловіків >133 мкмоль/л, у жінок > 124 мкмоль/л
Судини	Розшарування аорти Оклюзивне ураження периферичних артерій

Масу міокарда ЛШ (ММЛШ) обчислювали за формулою R. Devereux і співавт. (1986):

ММЛШ=1,04*((ТМШП+ТЗС ЛШ+КДР)3)-КДР3-13,6 (1)

Потім розраховували індекс маси міокарда ЛШ (ІММЛШ):

ІММЛШ (г/м2) = ММЛШ/S, (2)

де S - площа поверхні тіла хворих (м2).

Відносну товщину міокарда ЛШ (ВТС ЛШ) визначали за формулою:

ВТС ЛШ = (ТМШП+ТЗС ЛШ)/КДР ЛШ (3)

Також визначали розмір лівого передсердя (ЛП), правого передсердя (ПП) та правого шлуночка (ПШ) (мм).

Діастолічну функцію ЛШ визначали шляхом реєстрації трансмітрального діастолічного потоку. Визначали максимальні швидкості раннього і пізнього наповнення ЛШ (Е і А, см/с), їх співвідношення (Е/А, од), час ізоволюметричного розслаблення ЛШ (IVRT) (мс). Характер діастолічного наповнення ЛШ класифікували відповідно до традиційних критеріїв (М. Н. Алехин, В. П. Седов, 1996). Псевдонормальний тип трансмітрального діастолічного потоку ідентифікували за допомогою проби Вальсальви.

Для діагностики гіпертрофії міокарда лівого шлуночка (ГМЛШ) використовували значення ІММЛШ>125 г/м2 [225].

Для більш точної оцінки ГМЛШ методом ЕКГ у діагностиці використовували критерій Соколова-Лайона, що заснован на аналізі ЕКГ у 12 відведеннях:

a) SV1+RV5>35 mm (3,5 mV);

b) RAVL>11 mm (1,1 mV).

На підставі величини ІММЛШ та ВТС ЛШ (за A.Ganau і соавт., 1992) виділяли чотири структурно-геометричних типа ЛШ: нормальну геометрію (ІММЛШ=N, ВТС ЛШ?0,45), концентричне ремоделювання (ІММЛШ=N, ВТС ЛШ>0,45), концентричну гіпертрофію (ІММЛШ>N, ВТС ЛШ>0,45), ексцентричну гіпертрофію (ІММЛШ>N, ВТС ЛШ?0,45).

S - площа поверхні тіла, яку визначали за номограмою DuBois, м2:

S=0,007184*H0,725*W0,425, де Н - ріст у см, W - маса тіла, кг. (4)

Систолічний тиск в легеневій артерії (СТЛА) визначали в мм. рт. ст.

Для оцінки стану ФЗД використовували спірографію. Всі тестування легеневої функці були проведені тричі відповідно до стандартів Європейського респіраторного товариства у хворих в положенні сидячи, найбільші значення були включені в аналіз. Обстеження проводили натщерце, зранку, після 15-20 хвилинного відпочинку. Бронхолітичні препарати скасовували відповідно до їх фармакокінетики: в2-агоністи короткої дії - за 6 годин до дослідження, довготривалі в2-агоністи - за 12 годин, пролонговані теофіліни - за 24 години.

Перед кожним дослідженням хворого докладно інструктували. Визначали життєву ємність легень (ЖЄЛ). Тест ЖЄЛ проводили тричі з інтервалом 25-30 сек. Двостадійне визначення ЖЄЛ: після спокійного вдиху хворий робив максимально повний видих, потім повертався до звичайного спокійного дихання і після цього робив максимально повний вдих з положення спокійного видиху. Об'єм форсованого видиху за першу секунду (ОФВ1) - об'єм повітря, що видихається за першу секунду при максимально швидкому видиху. Виражається у відсотках від форсованої життєвої ємності легень (ФЖЄЛ).

Визначали ОФВ1, ЖЄЛ, ФЖЄЛ, відношення ОФВ1/ФЖЄЛ, максимальні об'ємні швидкості повітря на рівні видиху 25 %, 50 % і 75 % (МОШ 25 %, МОШ 50 %, і МОШ 75 %) і пікову об'ємну швидкість видиху (ПОШ).

Індекс Тифно представляє собою відношення ОФВ1 до ФЖЄЛ, в нормі становить 70-75 %.

МОШ 25 - максимальна об'ємна швидкість повітря на рівні видиху 25 % ФЖЄЛ.

МОШ 50 - максимальна об'ємна швидкість повітря на рівні видиху 50 % ФЖЄЛ.

МОШ 75 - максимальна об'ємна швидкість повітря на рівні видиху 75 % ФЖЄЛ.

Виділяють обструктивні, рестриктивні і змішані порушення вентиляції легень. Обструктивний тип виникає внаслідок звуження дихальних шляхів і збільшення опору видихуваному повітрю. Для обструкції дрібних бронхів характерне різке зниження МОШ 75, МОШ 50, збільшення залишкової ємності легень, при цьому ЖЄЛ змінюється незначно. Для обструкції великих бронхів характерне збільшення залишкової ємкості легень, різке зниження ОФВ1, індексу Тифно і ЖЄЛ. Рестриктивний тип порушення вентиляції обумовлений зменшенням дихальної поверхні легень або зменшенням спроможності легеневої тканини до розтяжності, характеризується зменшенням ЖЄЛ і залишкової ємкості легень. Змішаний тип порушення вентиляції характеризується наявністю ознак обструктивного і рестриктивного типів, зменшенням ЖЄЛ, залишкової ємності легень, ОФВ1, МОШ 75, МОШ 50.

Згідно з останніми рекомендаціями (GOLD, 2014), спірометрична класифікація тяжкості ХОЗЛ дає змогу виділити чотири ступеня (а не стадії, як раніше) порушення ФЗД. Так, у хворих з ОФВ1/ФЖЕЛ<0,70:

· GOLD 1: ОФВ1>80 % від належних величин;

· GOLD 2: 50 %<ОФВ1<80 % від належних величин;

· GOLD 3: 30 %<ОФВ1<50 % від належних величин;

· GOLD 4: ОФВ1?30 % від належних величин.

В останніх рекомендаціях GOLD 2014 наголошено на важливості проведення комплексної оцінки стану пацієнта із ХОЗЛ з виділенням групи - А, В, С, D. В основу такої класифікації лягли вираженість симптомів, ризики, що пов'язані зі ступенем бронхообструкції (ОФВ1<50 % - асоціюється з високим ризиком несприятливого перебігу), і кількість загострeнь в анамнезі (два і більше загострення ХОЗЛ за останні 12 міс - високий ризик несприятливих подій) [8].

Група А - ризик несприятливих подій низький, невелика кількість симптомів. Хворі зі ступенем порушення ФЗД GOLD 1 і 2 (ОФВ1>50 % від належних величин і/або ?1 загострення на рік, оцінкою симптомів за шкалою mMRC 0-1 бал або <10 балів згідно з oпитувальником САТ).

Група В - ризик несприятливих подій низький, велика кількість симптомів. Хворі зі ступенем порушення ФЗД GOLD 1 і 2 (ОФВ1>50 % від належних величин і/або 0-1 загострення на рік, оцінкою симптомів ?2 балів за шкалою mMRC або ?10 балів згідно з опитувальником САТ).

Група С - ризик несприятливих подій високий, невелика кількість симптомів. Хворі зі ступенем порушення ФЗД GOLD 3 і 4 (ОФВ1<50 % від належних величин і/або ?2 загострень на рік, оцінкою симптомів 0-1 бал за шкалою mMRC або <10 балів згідно з опитувальником САТ).

Група D - ризик несприятливих подій високий, велика кількість симптомів. Сюди належать пацієнти зі ступенем порушення ФЗД GOLD 3 і 4 (ОФВ1<50 % від належних величин і/або ?2 загострень на рік, оцінкою симптомів ?2 балів за шкалою mMRC або ?10 балів згідно з опитувальником САТ) (табл. 2.5).

Таблиця 2.5

Оцінка ступеня і тяжкості ХОЗЛ залежно від вираженості симптомів і ризику розвитку несприятливих подій у майбутньому

Група	Характеристики	Спірометрична класифікація	Загострення у рік	mMRC	CAT
A	Низький ризик Мало симптомів	GOLD 1-2	?1	0-1	<10
B	Низький ризик Багато симптомів	GOLD 1-2	?1	?2	?10
C	Високий ризик Мало симптомів	GOLD 3-4	?2	0-1	<10
D	Високий ризик Багато симптомів	GOLD 3-4	?2	?2	?10

Для оцінки ризику розвитку загострення при ХОЗЛ слід враховувати дані анамнезу і показники ФЗД: ?2 загострень на рік або ОФВ1<50 % від належних величин є індикаторами високого ризику загострення [226].

Для дослідження сироваткових параметрів забір крові проводився вранці натщесерце з ліктьової вени. Для здобуття сироватки пробірки з кров'ю інкубували 30 хв. при температурі +37єС. Відшаровували від стінки пастерівською піпеткою згусток, що утворювався, інкубували при температурі +4єС протягом 1 години для ретракції згустку. Переносили сироватку в скляні пробірки, центрифугували 15 хв. при 1500 обертах у хвилину, відокремлювали супернатант й розливали в пробірки типу «Епіндорф». Зберігали зразки при температурі - 20єС не більш 3 місяців до проведення дослідження [227].

Біохімічні дослідження маркерів метаболізму ЕЦМ включало визначення глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів, загальних ГАГ та їх фракційного складу.

Загальний рівень ГАГ у сироватці крові визначали запатентованим методом з поділом на фракції (при цьому I фракція включала хондроїтин-6-сульфати, II - хондроїтин-4-сульфати / дерматансульфати, III - кератан- / гепарансульфати) [228, 229]. Використовували 2 пробірки: дослідну (0,05 мл сироватки крові) та контрольну. Пробірки струшували і витримували при tє 25°С 30 хвилин, після чого вимірювали інтенсивність помутніння розчину на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 400 нм в кюветі з товщиною робочого шару 5 мм. Для визначення хондроїтин-6-сульфатів, хондроїтин-4-сульфатів і гепарансульфату в пробірки додавали по 0,05 мл 1М розчину натрію хлориду. Пробірки струшували і витримували 10 хвилин при t° 25°С, після чого вимірювали інтенсивність помутніння на фотоелектроколориметрі з довжиною хвилі 400 нм. За різницею в дослідній та контрольній пробі за калібрувальною кривою визначали концентрацію ГАГ. Будували 3 калібрувальних графіки з використанням стандартних розчинів з різним вмістом розчинів (0,2 г/л; 0,15 г/л; 0,1 г/л; 0,05 г/л; 0,01 г/л) хондроїтин-6-сульфату, хондроїтин-4-сульфатів та гепарансульфату.

Глікопротеїни визначали за модифікованим методом Штейнберг-Доценко [230]. Для цього готували робочі розчини трихлороцтової кислоти і молібденово-сульфатного реактиву, що додавали до дослідної проби з 0,2 мл сироватки крові та до контрольної проби. Перемішували, ставили на киплячу водяну баню на 20 хвилин, потім охолоджували на крижаній бані і центрифугували 5 хвилин 2000-3000 об/хв. Знову ставили у киплячу баню на 20 хвилин, охолоджували проточною водою і колориметрували у кюветах з товщиною шару 10 мм при світлофільтрі з довжиною хвилі 670 нм проти контрольної проби. Рівень глікопротеїнів визначали згідно з калібрувальним графіком, який складали за стандартними розчинами фруктози. Результат виражали у г/л.

Визначення хондроїтинсульфатів проводили за методом Nemeth-Csoka в модифікації Л. І. Слуцького [231]. Приготовували ацетатний буфер, цитратний буфер і розчин етакридину лактат. До 5 мл буфера добавляли 0,1 мл сироватки крові (мікропіпеткою), 0,1 мл розчину етакридину лактату. Через 5 хв вимірювали оптичну щільність на фотоелектроколориметрі з довжиною хвилі 540 нм. Результат розраховують на підставі відношення дослідної проби до стандартної, виражають у г/л.

Рівень альдостерону визначали методом імуноферментного аналізу з використанням набору для діагностики in vitro (DRG International Inc., США) відповідно до інструкцій виробника. Хід дослідження: приготувати робочі розчини кон'югату альдостерону і буфера. У лунки внести по 50 мкл кожного калібратора, контрольного та дослідного зразків. У всі лунки внести 100 мкл кон'югату робочого розчину. Промити лунки тричі 300 мкл розведеним розчином буферу. Внести по 150 мкл розчину TMB у кожну лунку. Інкубувати при кімнатній температурі протягом 15-20 хвилин. Внести по 50 мкл стоп-розчину. Враховувати результати на рідері при 450 нм.

Кількісне визначення MMП-9 було проведено методом ELISA за допомогою тест-набору (eBioscience, Відень, Австрія). Хід дослідження: Помістити потрібну кількість лунок в рамку для стрипів. Промити кожну лунку стрипів 400 мкл промивного буферу. Внести 100 мкл робочого буферу в дублях до лунок для стандартів. Внести приготовлені стандарти в лунки А1 і А2. Ретельно перемішати і перенести 100 мкл до лунок В1 і В2 відповідно. Повторити 5 разів, створюючи 2 рядки розведень від 15 до 0,23 нг/мл. Внести 100 мкл робочого буферу в дублях в пусті лунки. В дослідні лунки внести 90 мкл робочого буферу і по 10 мкл досліджуваних сироваток. Додати 50 мкл кон'югату біотину. Планшет інкубувати 2 години при кімнатній температурі. Потім лунки промити чотири рази промивним буфером і в кожну лунку додати по 100 мкл комплексу стрептавідину. Планшет інкубують 1 годину при кімнатній температурі. Потім лунки чотири рази промивають промивним буфером і в кожну лунку додають по 100 мкл субстратного розчину ТМБ. Планшет інкубують при кімнатній температурі 10 хвилин і реакцію зупиняють 100 мкл стоп-реагенту. Через 10 хвилин планшет спектрофотометрують при довжині хвилі 450 нм. Кількість ММП-9 в пробі визначають за калібрувальною кривою, що будують з використанням стандартів.

Вміст ТФР-в1 в сироватці крові хворих визначали імуноферментним методом із використанням набору реактивів TGF-в1 ELISA Kit виробництва фірми «DRG», Germany. У відповідні лунки планшета додають по 100 мкл контролів, стандартів і зразків сироватки та інкубують 8-16 годин при температурі 4єС. Рідину з лунок видаляють, кожну лунку промивають по 300 мкл тричі промивним буфером і додають по 100 мкл розчину антитіл. Планшет інкубують 2 години при кімнатній температурі, струшують і 3 рази промивають промивним буфером по 300 мкл. У кожну лунку додають по 100 мкл ензимного розчину і інкубують 45 хвилин при кімнатній температурі. Кожну лунку 3 рази промивають 300 мкл буферу і додають по 100 мкл субстратного розчину ТМБ. Планшет інкубують 15 хвилин при кімнатній температурі та реакцію зупиняють додаванням 50 мкл стоп-розчину в кожну лунку. Через 10 хвилин планшет спектрофотометрують при довжині хвилі 450 нм. Кількість ТФР-в1 в пробі визначають за калібрувальною кривою, яку будують згідно стандартів в наборі.

Вміст антитіл до колагену IV типу в венозній крові хворих визначали імуноферментним методом із використанням набору реактивів виробництва фірми «ИМТЕК», Росія. Стрипи з іммобілізованим колагеном IV типу звільнюють від поліетиленової упаковки. Лунки стрипів промивають розчином для промивання 2 рази по 200 мкл на лунку. В дві лунки (А1 і В1) стрипу внести по 100 мкл розчину 1:50 позитивного контролю. В дві лунки цього ряду (С1 і D1) внести по 100 мкл розчину 1:50 розчину негативної сироватки. В лунки (обов'язково в дублях) внести по 100 мкл досліджуваних зразків сироватки крові, розведених 1:50, 1:100 і 1:200. Стрипи з нанесеними розчинами контролів та досліджуваних зразків сироватки інкубувати при кімнатній температурі протягом однієї години. Лунки стрипа промити розчином для промивання тричі по 200 мкл на лунку. В лунки А1 і В1 внести по 100 мкл розведеного кон'югату для прояву позитивного зразка. У всі інші лунки внести по 100 мкл розведеного кон'югату для прояву аутоантитіл людини.

Стрипи інкубувати при кімнатній температурі протягом однієї години, промити розчином для промивання 3 рази по 200 мкл на лунку. У кожну лунку внести по 100 мкл робочого розчину. Інкубувати при кімнатній температурі протягом 2-10 хвилин в захищеному від світла місці до появи в лунках синього забарвлення різної інтенсивності. Зупинку реакції проводили додаванням в кожну лунку планшета по 50 мкл 10% сірчаної кислоти. Через 10 хвилин планшет спектрофотометрують при довжині хвилі 450 нм. Кількість антитіл до колагену IV типу в пробі визначають за калібрувальною кривою згідно стандартів в наборі.

Визначення б2-макроглобуліну проводили турбодіметричним методом з використанням набору реактивів фірми DIALAB, Австрія. Зразки сироватки розводили перед визначенням у співвідношенні 1:10 фізіологічним розчином.