Клинико-патоморфологический анализ хронических вирусных гепатитов в сочетании с алкогольной болезнью, опийной наркоманией и после интерферонотерапии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КЛИНИКО-ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ В СОЧЕТАНИИ С АЛКОГОЛЬНОЙ БОЛЕЗНЬЮ, ОПИЙНОЙ НАРКОМАНИЕЙ И ПОСЛЕ ИНТЕРФЕРОНОТЕРАПИИ

Пурлик Игорь Леонидович

14.03.02 - патологическая анатомия

14.01.04 - внутренние болезни

Новосибирск - 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Томск).

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Перельмутер Владимир Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Белобородова Эльвира Ивановна

Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Сидорова Лидия Дмитриевна

доктор медицинских наук, профессор Лапий Галина Анатольевна

доктор медицинских наук Кливер Евгений Эдуардович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Омская государственная медицинская академия Росздрава.

Защита диссертации состоится «____»_________2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2)

Автореферат диссертации разослан «___»________2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.037.01

доктор биологических наук Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. HBV- и HCV-инфекция широко распространены в мире [Zhang T. et al., 2006; Mauss T., 2009]. Число больных ХГВ превышает более 400 млн., а число страдающих ХГС более 200 млн. [Alter M.J., 2007; Bedogni G. et al., 2008]. Длительная персистенция гепатотропных вирусов приводит к формированию цирроза и ГЦК, заболеваемость и смертность от которых имеет тенденцию к увеличению [Bosch F., 2005; Cеров В.В., Апросина З.Г., 2004]. Цирротическая трансформация в исходе ХГС является наиболее частым показанием для проведения трансплантации печени в Западной Европе и США [Fattovich G., 2008]. Более 600 000 ежегодно выявляемых случаев ГЦК в мире ассоциированы с HBV-инфекцией [Gomaa A., 2008].

В Российской Федерации ситуация с заболеваемостью хроническими вирусными гепатитами крайне напряженная [Онищенко Г.Г., 2002; Шахгильдян Д.И., 2004; Рахманова А.Г., 2005]. Социально-экономическая нестабильность, неконтролируемая миграция, рост числа лиц, употребляющих наркотики и этиловый алкоголь, привели к созданию естественного крупнейшего резервуара гепатотропной, часто скрыто протекающей, инфекции [Губергриц Н.Б., 2002; Ивашкин В.Т., 2008].

Одновременное течение ХВГ и алкогольной болезни у жителей Российской Федерации, употребляющих алкоголь в гепатотоксичной дозе, скорее правило, чем исключение [Лопаткина Т.Н., 2000; Хазанов А.И., 2002; Буеверов А.О., 2005; Маевская М.В., 2006]. Более 90% лиц принимающих наркотики - это больные вирусными гепатитами [Кожевникова Г.М., 2000; Асратян А.А., 2005]. Охват этой категории пациентов - наиболее трудная задача, что связано с низкой комплаентностью данной группы общества.

Нередкое превалирование хронической алкогольной интоксикации, опийной наркотизации приводит к уходу в тень хронической вирусной патологии печени [Гармаш И.В., 2002; Циммерман Я.С., 2004; Серов В.В., Апросина З.Г., 2004]. Чаще всего, печень является центральной мишенью для всего спектра разных по силе и механизму действия экзогенных факторов, таких как вирус, этанол, дериваты опия сырца. Все это приводит к существенному изменению всего пейзажа клинических, параклинических и морфологических проявлений вирусного страдания. Данное обстоятельство может вызывать трудности в своевременной диагностике, интерпретации лабораторных, инструментальных данных и результатов биопсийного исследования при всех вариантах течения хронической гепатотропной инфекции.

Прижизненное морфологическое исследование печени, являясь «золотым» стандартом в гепатологии, с появлением новых методов диагностики и лечения гепатотропной инфекции не потеряло свою актуальность [Friedman S.L., 2003; Demetris A.J., 2005]. К сожалению, в Российской Федерации биопсия для оценки характера изменений в печени при естественном течении хронического вирусного поражения, до и после интерферонотерапии нередко не проводится [Хазанов А.И., 2003; Блохина Н.П., 2003; Ивашкин В.Т., 2008]. Подобная практика делает невозможным оценку характера дистрофических, некрозовоспалительных, склеротических изменений в печеночной паренхиме, что может сопровождаться диагностическими ошибками при ведении пациентов, страдающих ХВГ как при изолированном течении, так и в сочетании с алкогольной болезнью и опийной наркоманией [Непомнящих Г.И. и др., 2003; Блюм Х.Е., 2005; Непомнящих Д.Л., 2006].

Несмотря на существенный прогресс в разработке схем лечения хронической гепатотропной инфекции, отрицательный вирусологический ответ на интерферонотерапию может достигать 30% [Bruno R. et al., 2004; Корочкина О.В., 2005; Маевская М.В., 2005]. Высокая стоимость препаратов интерферона, развитие побочных эффектов нередко делают терапию ХВГ невозможной, либо мало эффективной [Alberti A., 2004; Fung, J., 2008]. Установление скорости цирротической трансформации гепатотропной инфекции, замедление избыточного коллагенообразования, нередкая безуспешность интерферонотерапии являются проблемой современной гепатологии. Прогнозирование темпа развития цирроза и варианта ответа на интерферонотерапию ХВГ являются ключевыми звеньями в будущей победе над гепатотропной инфекцией.

Несмотря на широкое распространение сочетанного поражения печени вирусами, этанолом и опиатами, работ, касающихся комплексного морфоклинического исследования случаев гепатотропной инфекции, недостаточно [Толоконская Н.П., 1999; Сахарова Е.Г., Филимонов П.Н., 2005; Непомнящих Д.Л. и др., 2006].

В настоящее время установлены крайне немногочисленные предикторы избыточного коллагенообразования и варианта ответа на противовирусное лечение [Powell E.E. еt al., 2000; Marcellin P. 2002; Asselah T. еt al., 2003; Zarski J.P., 2003; Игнатова Т.М., 2005; Mauss T., 2009]. Работ, касающихся поиска и обнаружения предикторов избыточного фиброза, эффективности интерферонотерапии хронической гепатотропной инфекции, крайне мало [Rosenberg W.M.C., 2003; Iredale J.P., 2005; Goodman Z.D., 2007].

Поиск предикторов предцирротической трансформации, эффективности противовирусного лечения должен базироваться на комплексном анализе качественных, количественных морфологических показателей, в том числе иммуногистохимических, оценке составляющих протеазно-антипротеазной системы, цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров периферической крови с учетом подробной клинико-лабораторной характеристики всех вариантов течения HBV- и HCV-инфекции, как при изолированном течении, так и в сочетании с алкогольной болезнью и опийной наркоманией.

Цель исследования: комплексная морфоклиническая характеристика хронической HBV-и HCV-инфекции при естественном изолированном течении, сочетании с алкогольной болезнью, опийной наркоманией и после интерферонотерапии.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту встречаемости хронической HBV- и HCV-инфекции при изолированном течении и их сочетании с алкогольной болезнью, опийной наркоманией.

2. Оценить взаимосвязь индекса гистологической активности, стадии хронизации при ХГВ, ХГС с вариантом течения, длительностью заболевания, возрастом инфицирования.

3. Установить влияние типа и фазы жизненного цикла вируса на морфологические показатели альтерации, некроза, воспаления и фиброза в печени при ХГВ и ХГС.

4. Оценить влияния алкогольной болезни, опийной наркомании на характер дистрофических, некрозовоспалительных изменений, склероза в ткани печени при хронической HBV- и HCV-инфекции.

5. Выявить клинико-лабораторные особенности течения ХВГ при изолированном течении, с опийной наркоманией, алкогольной болезнью.

6. Установить взаимосвязь между выраженностью клинических, параклинических синдромов, симптомов с характером и тяжестью альтеративных, некрозовоспалительных, склеротических изменений в печени при ХГВ, ХГС.

7. Установить морфологические предикторы септального фиброза при изолированном течении ХГС и в сочетании с алкогольной болезнью, опийной наркоманией.

8. Выявить характер взаимосвязи между показателями протеазно-антипротеазной системы и характером морфологических изменений в печени при хронической HCV-инфекции.

9. Установить характер взаимосвязи между показателями цитокинпродуцирующей способности клеток крови и характером альтеративных, некрозовоспалительных, склеротических изменений при хронической HCV-инфекции.

10. Оценить влияние интерферонотерапии на качественные и количественные морфологические показатели альтерации, воспаления и фиброза в печени при ХГС.

11. Установить морфологические предикторы варианта ответа на интерферонотерапию хронической HCV-инфекции.

12. Оценить влияние липосом, нагруженных сфингомиелином и церамидом на характер и выраженность альтеративных, некрозовоспалительных, склеротических изменений в печени в эксперименте CCl4 -индуцированного токсического гепатита с исходом в цирроз.

Научная новизна. Впервые установлено, что при ХГВ у наркоманов более высокий индекс гистологической активности ассоциирован с ранним возрастом инфицирования, но не длительностью гепатотропной инфекции. Впервые выявлено, что при ХГС с алкогольной болезнью, опийной наркоманией более высокая морфологическая активность и стадия хронизации сопряжены с наименьшей длительностью вирусной инфекции и наиболее ранним возрастом инфицирования.

Впервые установлено, что опийная наркомания при ХГС с алкогольной болезнью не способствует утяжелению всего спектра альтеративных, некрозовоспалительных изменений в печени и выраженности всех клинических, биохимических синдромов. Выявлено, что при опийной наркомании при ХГС дефицит массы тела и выраженность энцефалопатии ассоциированы с встречаемостью гранулемоподобных инфильтратов в портальных трактах и внутри долек.

Впервые при ХГС установлена взаимосвязь между морфологическими параметрами альтерации, воспаления, фиброза в печени с одной стороны и уровнем содержания про- и противовоспалительных интерлейкинов в сыворотке с другой. Также установлено, что алкогольная болезнь, опийная наркомания при ХГС существенно влияют на характер и силу взаимосвязи между морфологическими показателями альтерации и уровнем содержания про- и противовоспалительных цитокинов.

Впервые выявлены морфологические предикторы порто-портального и порто-центрального фиброза при ХГС. Установлено, что внутриклеточный холестаз, перигепатоцеллюлярный фиброз, мелкокапельная жировая дистрофия, пролиферация желчных протоков являются показателями, определяющими высокое ожидание шансов развития септального склероза при изолированном ХГС и в сочетании с алкогольной болезнью. Обнаружено, что экспрессия CK7, СK19 эпителием желчных протоков, экспрессия б-SMA миофибробластоподобными клетками значительно повышают шансы развития септальной перестройки при изолированном течении НСV-инфекции.

Впервые при ХГС установлена взаимосвязь между гистологическими параметрами альтерации, воспаления, фиброза и экспрессией клетками воспалительного инфильтрата ряда ИГХ-маркеров. Развитие порто-портального, порто-центрального фиброза, повышенная встречаемость внутриклеточного холестаза, перигепатоцеллюлярного фиброза, пролиферация желчных протоков ассоциированы с экспрессией CK7, CK19 дуктальным эпителием, а выраженность перигепатоцеллюлярного фиброза, зональных некрозов напрямую взаимосвязана с экспрессией б-SMA миофибробластоподобными клетками, как в портальном тракте, так и внутри долек. Установлено, что повышенная экспрессия TIMP-2 клетками портального, зонального воспаления напрямую определяла выраженность перигепатоцеллюлярного фиброза и выраженность жировой дистрофии гепатоцитов при ХГС.

Впервые установлено, что только при ХГС с алкогольной болезнью наибольшее снижение коллагеназной активности сыворотки сопряжено с большей выраженностью гидропической, жировой дистрофией гепатоцитов всех зон, зональных, ступенчатых некрозов в печени.

Впервые установлено, что только при ХГС с опийной наркоманией встречаемость спленомегалии, лимфоидных фолликулов в портальных трактах, обнаружение гранулемоподобных инфильтратов повышает ожидание шансов развития порто-портального, порто-центрального фиброза.

Впервые установлено, что интерферонотерапия ХГС при достижении вирусологического ответа способствует не только уменьшению гидропической, жировой дистрофии всех зон печеночного ацинуса, числа ступенчатых некрозов, но и вызывает снижение количества фибробластов, плазматических клеток в портальном инфильтрате, количества лимфоцитов при одновременном повышении числа моноцитов внутри долек. Впервые обнаружено, что интерферонотерапия HCV-инфекции (Интрон-А) не влияет на характер и выраженность регенераторных изменений гепатоцитов всех зон.

Впервые определены морфологические предикторы варианта ответа на интерферонотерапию ХГС. Установлено, что отрицательный вирусологический ответ ассоциирован с большей выраженностью мелкокапельной жировой дистрофии, внутриклеточного холестаза, перигепатоцеллюлярного фиброза, пролиферации желчных протоков, экспрессии CK19 эпителием дуктул, экспрессии б-SMA миофибробластоподобными клетками воспалительного инфильтрата.

Впервые установлено, что в эксперименте CCl4-индуцированного токсического гепатита с исходом в цирроз введение липосом, нагруженных церамидом и сфингомиелином, в наибольшей степени препятствует септальной трансформации и способствует снижению альтеративных, некрозовоспалительных изменений во всех зонах печеночного ацинуса.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования уточнили влияние типа вируса, фазы жизненного цикла, сопутствующей алкогольной болезни, опийной наркомании на характер альтеративных, некрозовоспалительных, склеротических изменений при хронической HBV- и HCV-инфекции. Выявленные морфологические предикторы септальной трансформации печеночной паренхимы при ХГС позволяют оценить вероятность цирротической перестройки уже после проведения часто единственной пункционной биопсии печени.

Выявленные морфологические предикторы варианта ответа на интерферонотерапию ХГС позволяют оценить шансы получения отрицательного вирусологического ответа еще до начала противовирусного дорогостоящего лечения.

Установленные показатели системы протеолиза, ассоциированные с порто-портальным и порто-центральным склерозом при HCV-инфекции, расширяют возможности дальнейшего усовершенствования и применения неинвазивных методов диагностики индекса фиброза. Установленная взаимосвязь между гистологическими параметрами морфологической картины и уровнем содержания цитокинов позволила уточнить и расширить знания о характере, роли иммунных реакций при изолированном течении ХГС и в сочетании с алкогольной болезнью, опийной наркоманией.

Выявленное гепатопротективное влияние липосом, нагруженных сфингомиелином и церамидом, на характер альтеративных, некрозовоспалительных, склеротических изменений в модели CCl4 индуцированного токсического гепатита с исходом в цирроз поможет в создании и разработке новых лекарственных форм при лечении гепатитов вирусной этиологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Гистологическая активность ХГВ и ХГС определяется вариантом течения патологического процесса. При всех вариантах изолированной HBV- и HCV-инфекции только фаза цикла вируса влияет на морфологические показатели состояния гепатоцитов всех зон ацинуса, состав портального и зонального воспалительного инфильтрата. Наиболее выраженные альтеративные изменения в печени наблюдаются в репликативную фазу и при сочетании гепатотропной инфекции с алкогольной болезнью. Опийная наркомания при HCV-инфекции с алкогольной болезнью не утяжеляет выраженность альтерации в печени.

2. Стадия хронизации при ХГВ и ХГС определяется не длительностью инфекции, а зависит от дополнительного влияния этанола, опиатов. Злоупотребление алкоголем в наибольшей степени повышает число случаев с умеренным и выраженным фиброзом при HBV- и HCV-инфекции. Септальный фиброз при ХГС сопровождается глубоким дисбалансом протеазно-антипротеазной системы, который наиболее выражен в случаях дополнительного действия этанола. Избыточное коллагенообразование при всех вариантах ХГС ассоциировано с рядом морфологических показателей альтерации, некроза, воспаления, уровнем содержания про- и противовоспалительных цитокинов.

3. При ХГС существует взаимосвязь между характером и выраженностью альтерации, некрозовоспалительной активности, фиброза и встречаемостью клинических, биохимических синдромов, показателями протеазно-антипротеазной системы, уровнем содержания про- и противовоспалительных цитокинов, которая в наибольшей степени определяется фазой жизненного цикла вируса, дополнительным действием этилового алкоголя, опиатов.

4. Терапия интроном-А ХГС приводит к уменьшению альтеративных, склеротических изменений, влияет на характер портального и зонального воспаления в печени. Отрицательный вирусологический ответ при интерферонотерапии ХГС ассоциирован с характером, выраженностью дистрофии гепатоцитов, некроза, воспаления, фиброза, экспрессии клетками воспалительного инфильтрата всех зон печеночного ацинуса ряда ИГХ маркеров.

5. Липосомы, нагруженные сфингомиелином, церамидом, оказывают гепатопротективное и антифибротическое действие в модели CCl4-индуцированного токсического гепатита с исходом в цирроз.

Внедрение в практику. Основные результаты настоящей работы внедрены в лечебно-диагностический процесс НИИ гастроэнтерологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. Основные результаты работы используются в учебном процессе кафедры патологической анатомии, госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

По результатам работы получено 5 патентов на изобретение с внедрением их в практику: «Способ дифференциальной диагностики стадии хронизации хронического вирусного гепатита типа В и типа С» (№ 2193195, 25.07.2001), «Способ оценки реактивности организма при лечении патологии гепатобилиарной системы» (№ 2279084 от 27.06.2006), «Способ оценки состояния печени при лечении описторхоза» (№ 2283493, 10.09.2006), «Способ диагностики цирроза печени» (№ 2291441, 10.01.2007); «Способ диагностики стадии хронизации гепатита» (№ 2291440, 10.01.2007).

Апробация работы. Основные положения работы доложены на 9-й, 10-й, 11-й, 13-й, 14-й Российских гастроэнтерологических неделях (Москва, 2003- 2010); 9-й, 10-й, 11-й, 13-й, 14-й, 15-й Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 2004 - 2010); 6-м Международном Славяно-Балтийском форуме (Санкт-Петербург, 2004); 4-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции «Клинико-эпидемиологические проблемы заболеваний органов пищеварения» (Абакан, 2004); 10-й, 11-й, 12-й, 13-й Российских научно-практических конференциях «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2002 - 2005, 2008 - 2010). Постерный доклад на 15-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2010) - II премия.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 55 работ, из них 15 в журналах, рецензируемых по списку ВАК, изданы 2 монографии и получены 5 патентов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 373 страницах, содержит 68 таблиц, 41 рисунок и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 550 источников, из них 297 отечественных и 253 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

вирусный гепатит болезнь интерферонотерапия

Настоящее исследование выполнялось на базе гастроэнтерологического отделения ОГУЗ ОКБ г. Томска, кафедры терапии ФУВ, кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава в период с 2002 по 2009 г. У всех 520 пациентов было получено информированное согласие на участие в исследовании. Критерии включения и исключения настоящего исследования представлены в табл. 1.

У всех больных было выявлено поражение печени, диагностированное на стадии хронического вирусного гепатита с уточнением этиологического компонента, степени морфологической и биохимической активности, стадии хронизации патологического процесса. Вирусное поражение печени расценивалось как ведущее. Были сформированы группы с HBV- и HCV-инфекцией. В каждой из двух групп выделялись подгруппы изолированного течения ХГВ, ХГС и в сочетании с алкогольной болезнью (АБ), опийной наркоманией (ОН).

Таблица 1. Критерии включения и исключения пациентов настоящего исследования

Таблица 2. Характеристика групп настоящего исследования

Этиологическая структура групп наблюдения, половая принадлежность и средний возраст пациентов вошедших в настоящее исследование представлены в табл. 2. Всего в исследование вошло 520 человек, с существенным преобладанием мужчин (74,6%) над женщинами (25,4%) (табл. 2). Ведущая HBV- инфекция зарегистрирована у 101 (19,4%) человек и HCV у 419 (80,6%) лиц. Случаи изолированного течения ХГВ и ХГС регистрировались в 44,8 % наблюдений, тогда как в 55,2% имелось сочетанное действие гепатотропного вируса с этиловым алкоголем, опиатами. Анализ внутри групп с ведущей гепатотропной инфекцией выявил, что в 31% случаев ХГВ была «чистая» HBV-инфекция, тогда как дополнительное действие этилового алкоголя отмечено в 31%, опиатов в 37% (рисунок).Группы наблюдения с ведущей гепатотропной инфекцией.

Несколько иначе выглядело распределение пациентов в группах с ведущей HCV-инфекцией. Так, установлено, что только РНК-содержащий вирус определялся в 48% наблюдений (см. рисунок). Этиловый алкоголь являлся дополнительным фактором поражения печени при HCV в 18% случаев, опийная наркомания - в 15%, а одномоментное действие этанола с опием при ХГС отмечено в 19% случаев.

Группа наблюдения ХГС до и после интерферонотерапии (Интрон-А) была представлена 45 пациентами, из которых 20 (44,4%) женщин, 25 (55,6%) мужчин со средним возрастом 32,5±3,5 года и 34,5±2,5 года соответственно.

Комплекс исследований, необходимый для решения поставленных в диссертационной работе задач, включал подробный анализ клинико-эпидемиологических, анамнестических данных, определение биохимических показателей, иммуноферментный анализ спектра вирусных антител, определялся генотип HCV, вирусная нагрузка, проведено подробное патоморфологическое изучение биоптатов печени. В настоящем исследовании проведена оценка экспрессии ряда ИГХ-маркеров в печени, анализ уровня цитокинов, продуцируемых периферическими мононуклеарами и показателей протеазно-антипротеазной системы. Охват пациентов перечисленными методами исследования представлен в табл. 3.

Таблица 3. Охват пациентов методами исследования

Характеристика лабораторных методов исследования. Общеклинические методы исследования были представлены проведением общего анализа крови с определением содержания гемоглобина, с подсчетом лейкоцитарной формулы, определением СОЭ; проведением общего анализа мочи с определением содержания белка и форменных элементов крови в осадке мочи, рентгенографией органов грудной клетки; ЭКГ.

Дополнительные уточняющие (по показаниям) инструментальные методы диагностики были представлены ультразвуковым исследованием (УЗИ) органов брюшной полости с использованием аппаратуры фирмы «Aloka»; эзофагогастродуоденоскопией (ЭГДС), с целью выявления варикозно расширенных вен пищевода и эрозивно-язвенных дефектов желудка и двенадцатиперстной кишки с проведением процедуры эндоскопом фирмы «Olympus», компьютерно-резонансной томографией с использованием аппаратуры фирмы «Siemens».

Методы исследования функционального состояния печени. Функциональное состояние печени оценивалось в ходе определения содержания в сыворотке крови наиболее важных биохимических показателей. Исследование белковосинтетической функции печени заключалось в определении общего белка сыворотки крови биуретовым методом и белковых фракций (альбумины, глобулины: бl, б2, в, г) унифицированным методом электрофоретического разделения белковых фракций на пленках из целлюлозы ацетата с окраской синим бромфеноловым [Камышников B.C., 2000].Цитолитический синдром оценивали путем определения активности в сыворотке крови аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ) унифицированным методом по оптимизированному оптическому тесту наборами для кинетических определений фирмы «Лахема» (Чехия). О наличии нарушений пигментного обмена судили по уровню общего билирубина и его фракций в сыворотке крови, определяемых методом Ендрассика-Клеггорна-Грофа [Камышников B.C., 2000]. Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) оценивали с использованием наборов фирмы «Лахема» [Камышников B.C., 2000]. О сохранности синтетической функции судили по значениям протромбинового индекса (ПТИ), определявшимся методом Квика, и общего фибриногена, который определялся унифицированным методом Рутберга [Камышников B.C., 2000]. Для оценки возможного состояния коагулопатии исследовали показатель АЧТВ, длительность кровотечения (ДК), время свертывания крови (ВСК). Для подтверждения мезенхимально-воспалительного синдрома использовали тимоловую пробу. Кроме этого у всех больных определяли уровень глюкозы методом Хагердона-Йенсена [Камышников B.C., 2000].

Серологические и молекулярно-генетические методы диагностики вирусных гепатитов. Серологические маркеры вирусных гепатитов определяли у всех больных методом ИФА [60] тест-наборами «РекомбиБест анти-ВГС» и «ГепаСкрин» (ЗАО «Вектор-Бест», пос. Кольцово, Новосибирская область, РФ). В сыворотке крови у пациентов методом ИФА определяли маркеры вирусных гепатитов А (анти-HAV IgM), В (HBs-Ag, HBe-Ag, анти-HBc-IgM, анти-HBs, анти-НВе), С (анти-HCV суммарные) и D (анти-HDV).

Верификацию репликативной фазы развития вируса проводили методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) [188] с использованием наборов НПФ «Литех» (Москва). Нуклеотидные последовательности продуктов амплификации определяли методом Сэнгера с использованием ДНК-полимеразы. Генотипирование осуществляли путем сравнения последовательностей 5'-UTR и части гена NS5B, выявленных нами изолятов вируса С с данными базы Genbank.

Методы морфологического исследования ткани печени. Биоптаты получали методом слепой чрескожной пункционной биопсии печени под местной инфильтрационной анестезией 6 мл 2% раствора лидокаина. Для получения биоптатов печени использовали одноразовый набор «Hepafix» фирмы «Braun» (ФРГ) с внутренним диаметром от 1,4 до 1,8 мм и длиной иглы 88 мм. Объем биоптатов составлял от 20 до 35 мм3. Забор материала осуществляли после исключения всех абсолютных и относительных противопоказаний после обязательного контроля наиболее важных показателей гемостаза. Взятый для исследования фрагмент ткани печени немедленно помещали в 12% раствор нейтрального формалина. Препараты готовили по стандартной методике, заливали в парафин [Меркулов Г.А., 1969]. Срезы толщиной 5 - 6 мкм исследовали с помощью следующих гистологических методик: окраска гематоксилином и эозином, окраска пикрофуксином по Ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, серебрение, реакция Перлса, проводили ШИК-реакцию. Биоптаты считались информативными при обнаружении четырех и более портальных трактов с полноценными триадами (портальная вена, печеночная артерия, желчный проток).

Индекс гистологической активности (А) гепатита и стадию хронизации (F) рассчитывали по шкале METAVIR [The French METAVIR Cooperative Study Group, 1994]. Изучали качественную и количественную характеристику состояния гепатоцитов как перипортальной, так и интралобулярной зон. Оценивали альтеративные процессы печеночных клеток (липофусциноз, гидропическая, жировая дистрофии, моноцеллюлярный некроз, гепатоциты с «песочными» ядрами), регенераторные и дисрегенераторные (двуядерные гепатоциты, с гиперхромией, гипертрофией, полиморфизом ядра). Проводили подсчет гепатоцитов как минимум в 15 печеночных дольках. Обращали внимание на некрозы гепатоцитов (зональный, ступенчатый, мостовидный, мультилобулярный). Встречаемость некрозов оценивали не менее чем в 15 полях зрения. Качественная оценка выраженности портальной и внутридольковой инфильтрации оценивалась в баллах.

Количественному анализу подвергалась портальная и зональная воспалительная инфильтрация с подсчетом процента каждой клеточной формы инфильтрата на срезах, окрашенных эозином и гематоксилином. Подсчитывалось абсолютное и относительное количество лимфоцитов, моноцитов, плазматических клеток, эозинофилов, нейтрофильных лейкоцитов, фибробластов во всех портальных трактах биоптата и внутри как минимум 15 долек. В пределах всего информативного биоптата оценивался характер фиброза (портальный, перипортальный, порто-портальный, порто-центральный и порто-лобулярный), при этом учитывался перигепатоцеллюлярный фиброз и фиброз центральных вен. Для морфометрического исследования использовали компьютерную систему анализа изображений, включающую световой микроскоп МикМед-2 с цифровой фотокамерой (Pentax W 6.0) и программную обработку полученных изображений. Исследования выполнены на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике [Петров Р.В., 2000]. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам. При исследовании применяли антитела фирм «Dako», «Novocastra» к CK7 (клон OV-TL 12/30, RTU, мышиные), к TGFв (клон TGFв17, рабочее разведение 1:40), к CD117 (клон T595, рабочее разведение 1:80), к Е-кадхерину (клон 36B5, рабочее разведение 1:30), к СK19 (клон b170, рабочее разведение 1:100), к б-SMA (клон бsm1, готовые к применению), к TIMP-2 (клон 46Е5, рабочее разведение 1:20). Выраженность экспрессии вышеобозначенных маркеров оценивали качественно и количественно в баллах как минимум в 15 полях зрения под увеличением х 400, где 0 баллов - отсутствие экспрессии, 1 балл - экспрессия до 30% от числа всех клеточных элементов, 2 балла - экспрессия от 30 до 60% от числа всех клеток, 3 балла - более 60%.

Исследование цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров включало определение уровней IFN-, TNF-, IL-2, IL-4, IL-10 и IL-12 в супернатантах культивированных мононуклеаров проводили с использованием твердофазного иммуноферментного «сэндвичевого» метода. Процедуру выполнения иммуноферментного анализа проводили по инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Procon», Россия; «Cytimmune», США). Учет результатов иммуноферментного анализа производили с помощью фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 (для IFN-, TNF-, IL-2 и IL-4) и 490 нм (для IL-10 и IL-12). Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой. Иммунологические исследования проводили в лаборатории клинической иммунологии НИИ онкологии СО РАМН (Томск).

Методы исследования активности протеолитических ферментов и их ингибиторов в сыворотке крови. В работе изучали биохимические показатели, характеризующие обмен коллагена и эластина в сыворотке крови. В плазме крови измеряли активность коллагеназы, эластазы, б1-протеиназного ингибитора, б2-макроглобулина и содержание фракций гидроксипролина [Нартикова В.Ф., 1979; Оглоблина О.Г., 1984; Шараев П.Н., 1987].

Исследования выполнены на кафедре биохимии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (заведующий кафедрой - доктор медицинских наук, профессор Серебров В.Ю.).

Материалом экспериментального исследования - индукции CCl4-токсического гепатита с исходом в цирроз - были 150 беспородных белых крыс-самцов массой 100 - 150 г. Животных содержали в условиях вивария на стандартном водно-пищевом рационе. Работы с животными проводили в соответствии с нормативными документами. Материалом исследования служила печень. Все манипуляции выполняли в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под легким эфирным наркозом. Характеристика исследуемых групп животных представлена в табл. 4.

Таблица 4. Характеристика серий и групп животных

Метод морфологического исследования печени крыс. Фрагменты ткани печени крыс фиксировали в 12% растворе нейтрального формалина, проводили по стандартной проводке и заливали в парафин [Меркулов Г.А., 1969]. Срезы, толщиной 5 - 6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону. Исследование морфологической картины осуществляли методами световой микроскопии. При описании микропрепаратов использовали «слепой» метод. Выраженность дистрофии, портального и зонального воспаления, встречаемость всех вариантов некрозов и фиброза оценивали в баллах. Забор материала осуществлялся на 7-, 14-, 21-, 30- и 60-е сутки с момента начала ведения CCl4.

Моделирование у крыс токсического гепатита с исходом в цирроз и ход эксперимента. Для моделирования токсического гепатита с исходом в цирроз животным вводили масляный раствор четыреххлористого углерода (CCl4) в дозе 2 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции [Голиков С.Н., 1986]. Все манипуляции с животными осуществляли утром (с 9 до 12 ч) в осеннее-зимний период. Декапитация проводилась под эфирным наркозом. На протяжении исследований смертность животных составила 9%. В ходе эксперимента животным в опытных группах в хвостовую вену вводили по 0,25 мл эмульсии, содержащей липосомы на 100 г массы тела крысы. Использовали липосомы, нагруженные сфингомиелином или церамидом («Sigma Aldrich»), либо не нагруженные («пустые»). При каждой инъекции вводили 33 мкг сфингомиелина или церамида в составе липосом на 100 г массы тела животного. Введение липосом осуществляли с интервалом в один день. В каждой точке исследования было использовано по 6 животных в каждой группе.

Метод приготовления липосом и нагрузка их сфингомиелином или церамидом. Принцип метода основан на образовании замкнутых липосом при механической дезинтеграции тонкой фосфолипидной пленки, полученной выпариванием фосфатидилхолина из хлороформной фазы в вакууме [Корбинский Г.Д., 1998]. В липосомы включалось до 65% церамида или сфингомиелина, о чем судили, применяя метод ТСХ.

Методы статистической обработки полученных данных. Для проведения статистической обработки фактического материала применяли статистический пакет StatSoft 6.0 и SAS 8.0 (SAS Inc., США). При анализе количественных данных проверку на нормальность распределения фактических данных проводили с помощью критерия Шапиро-Вилка. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me, Q1:Q3), среднего и стандартного отклонений (M±SD). При проведении сравнений независимых выборок, при числе групп = 2 в случае нормального распределения и равных дисперсий в группах применяли t-критерий Стьюдента для независимых наблюдений или критерий Аспера-Уолча при неравенстве дисперсий; при отклонении распределения от нормального применяли критерий Манна-Уитни.

При количестве выборок более 2, во избежание эффекта множественных сравнений, в случае нормального распределения применяли дисперсионный анализ или его непараметрический аналог - H-критерий Краскала-Уоллиса и, при достоверных межгрупповых различиях, для попарных сравнений применяли критерий Данна и Z-критерий Краскала-Уоллиса.

Для определения взаимосвязи между переменными вычисляли коэффициенты корреляции: при соответствии нормальному закону распределения - r Пирсона, при несоответствии нормальному закону распределения или бальных оценках - R Спирмена (R(r) < 0,5 - отсутствие взаимосвязи; 0,75 > R(r) ? 0,5 - средняя сила взаимосвязи; R(r) ? 0,75 - сильная взаимосвязь). При анализе качественных данных для определения взаимосвязи между качественными переменными проводили анализ таблиц сопряженности с использованием критерия согласия ч2 (при объеме выборки более 50 и частотах более 5) или (при невыполнении этих требований) точный критерий Фишера. При размерностях таблиц больше чем 2х2, при достоверных различиях эмпирических форм распределения изучаемых признаков при попарных сравнениях применяли точный критерий Фишера с поправкой Бонферрони. Для оценки вклада признаков в вероятность развития события («да», «нет») использована мультиноминальная логистическая регрессия (SPSS 8.0). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимался ? 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клиническая характеристика случаев хронического вирусного гепатита. В 101 наблюдении нашего исследования ведущей являлась ДНК-содержащая вирусная гепатотропная инфекция. 34,6% пациентов этой большой группы были женщины и 65,4% - мужчины. Средний возраст больных с ведущим ХГВ составил 37,3± 10,8 лет. Минимальный возраст пациентов - 16 лет, а максимальный - 62 года. В 32 (32%) наблюдениях нами установлено только изолированное поражение печени HBV. Женщины в этой группе наблюдения составили 65,6% (21 человек), мужчины 34,4% (11 человек). Средний возраст больных составил 40,2±15,8 лет. В наблюдениях с ведущей HBV-инфекцией в 31 (31%) случае поражение печени ДНК-содержащим вирусом сопровождалось неблагоприятным действием алкоголя. В группе HBV-инфекции с алкогольной зависимостью преобладали лица мужского пола (80,6%). Средний возраст пациентов этой группы - 45,2±11,5 лет. В 38 (37%) случаях HBV-инфекция сопровождалась активной наркотизацией. Как и в группе «ХГВ+АБ», среди включенных в исследование преобладали мужчины - 78,9%. Средний возраст наркозависимых, страдавших ХГВ, составил 26,7±5,2 года, что достоверно отличалось от одноименного показателя в других группах (р=0,03 и р=0,01) и свидетельствовало о начале ХГВ и наркотизации в молодом возрасте.

Длительность гепатропной инфекции в случаях «чистого» ХГВ составила 10,5±6,8 лет, в группе «ХГВ+АБ» - 10,2±8,0 лет, а при сочетанном поражении печени ДНК-содержащим вирусом и опиатами - 8,7±4,5 года. Достоверных различий по данному показателю не выявлено (р>0,05).

Наименьший возраст инфицирования при HBV-инфекции отмечен у наркотизирующихся - 18,5±4,5 года. При этом это значение достоверно отлично от полученных значений в группах изолированного течения ХГВ (29,5±16,5 лет) и с алкогольной зависимостью (28,5±15,5 лет) (р=0,0002 и р=0,0001). Столь ранний возраст начала наркотизации, как правило, совпадал с началом течения гепатотропной инфекции, что, наиболее вероятно, связано с путями передачи вируса. При изолированном течении HBV-инфекции инфицирование вирусом наиболее часто происходило во время оперативного лечения и ряда медицинских манипуляций - 43,7%, при ХГВ с алкогольной болезнью - в 48,3% случаев.

При всех случаях HBV-инфекции наиболее часто встречались три синдрома - астеновегетативный, гепатомегалия и болевой. Встречаемость снижения трудоспособности, слабости, утомляемости при всех вариантах течения ХГВ была более 90%. Встречаемость болевого синдрома не зависела от варианта течения ХГВ (р=0,1; р=0,74; р=0,2). Степень встречаемости гепатомегалии была максимальна у больных ХГВ, злоупотребляющих этиловым алкоголем. Показатель в этой группе достоверно отличен от значений групп изолированной HBV-инфекции (р = 0,0043) и у наркоманов, инфицированных ДНК-содержащим гепатотропным вирионом (р= 0,0009). Желудочная диспепсия имела максимальную степень выраженности и встречаемости у больных ХГВ с алкогольной зависимостью в сравнении с другими группами (р=0,0001 и р=0,0006). Кишечная диспепсия не зависела от принадлежности больного к какой-либо группе наблюдения при HBV-инфекции (р=0,54; р=0,73; р=0,8). Синдром желтухи наиболее ярко был представлен в группе ХГВ с алкогольной болезнью и был тяжелее, чем при изолированном вирусном поражении (р= 0,005). В ходе исследования было установлено, что встречаемость и степень выраженности спленомегалии была наибольшей у наркозависимых с ХГВ, в сравнении с изолированным течением гепатотропной инфекции (р=0,03). Тяжесть геморрагического синдрома была одинакова в группах с ведущей HBV-инфекцией (р=0,06; р=0,14; р=0,58).

Наиболее часто встречающимися внепеченочными знаками при ведущей HBV-инфекции являлись энцефалопатия, полинейропатия и признаки ГЭРБ. Минимальное число эрозивно-язвенных изменений в ЖКТ было зарегистрировано у больных с изолированным ХГВ (12,5%). При HBV-инфекции с алкогольной болезнью встречаемость ГЭРБ составила 64,5%, что значительно превосходило показатели в других группах (р=0,0001; р=0,026).

В ходе исследования установлено, что наиболее часто встречающимися биохимическими синдромами при всех вариантах течения HBV-инфекции были цитолитический и гипербилирубинемия. Изолированное поражение ДНК-содержащим гепатотропным вирусом сопровождалось минимальной выраженностью всех выявляемых биохимических синдромов. Алкогольная зависимость способствовала утяжелению холестаза, цитолиза при ХГВ. Частота встречаемости регистрируемого цитолиза составила в группе моно-HBV-инфекции - 18,7%, у больных ХГВ с опийной наркоманией - 21%, а у пациентов с сочетанным поражением печени ДНК-содержащим вирусом и алкоголем - 77,4%. Выраженность цитолитического синдрома в случаях сочетанного поражения печени вирусом и алкоголем максимальна в сравнении с изолированным течением ДНК-содержащей инфекции (р<0,0001) и группой «ХГВ+ОН» (р<0,0001). Минимальный холестаз отмечался в группе моноHBV-инфекции в сравнении с больными ХГВ с алкогольной зависимостью (р=0,01). Опийная наркомания, по нашим данным, достоверно не повышала вероятность более тяжелого развития холестаза (р=0,23, цитолиза (р=0,75) в сравнении с изолированной HBV-инфекцией.

Пациенты с ведущей HCV-инфекцией были самой большой группой в нашем исследовании (419 человек). Женщин было 97 человек, что составило 23,2%, а мужчин 322 - 76,8% от всех наблюдений с HCV-инфекцией. Изолированное течение ХГС диагностировано у 201 (48%) человека. Средний возраст больных с изолированным течением HCV-инфекции составил 39,1±14,6 лет. Из 201 пациента группы с «чистым» ХГС 57 человек (28,3%) были женщины и 144 (71,7%) - мужчины. Положительный алкогольный анамнез и маркеры РНК-содержащего вируса диагностированы у 76 человек из 419 пациентов. Группа «ХГС+АБ» была представлена преимущественно мужчинами (72,3%). Средний возраст достоверно не отличался от пациентов с изолированной HCV-инфекцией и составил 38,4±11,5 лет. У 64 человек, принимавших дериваты опия, нами зарегистрированы маркеры РНК-содержащего вируса с ожидаемым преобладанием лиц мужского пола - 82,8%. Средний возраст данной группы наблюдения составил 24,5±4,2 года.

Факт одновременного приема опиатов со злоупотреблением алкоголем, выявление маркеров РНК-содержащей гепатотропной инфекции послужили поводом для выделения группы «ХГС+АБ+ОН». Как и во всех группах с «участием» лиц, употреблявших наркотики, нами зарегистрирован факт преобладания мужчин молодого возраста среди больных. Так, лица мужского пола составили 89,7%, средний возраст - 25,5±5,1 лет.

Установлено, что группа изолированного течения HCV-инфекции и при сочетании ХГС с алкогольной болезнью характеризовалась инфицированием в более позднем возрасте, нежели наркозависимые пациенты, инфицированные РНК-содержащим вирусом. Так, в группе изолированной HCV-инфекции и у принимающих этанол при ХГС возраст инфицирования составил 31,0±12,0 и 29,5±11,0 лет (p>0,05). Больные РНК-содержащей гепатотропной инфекцией, злоупотреблявшие наркотиками и (или) алкоголем, имели минимальный средний возраст инфицирования 20,5±5,5 и 21,0±6,0 лет соответственно. Почти всегда возраст инфицирования совпадал со временем начала активной наркотизации.

Максимальный показатель длительности заболевания зарегистрирован в группах изолированного течения HCV-инфекции и у употребляющих этиловый алкоголь в гепатотоксичной дозе - 15 лет. В целом же длительность ХГС при изолированном течении составила 8,5±6,5 лет, в группе HCV-инфекции с алкогольной зависимостью - 9,5±5,6 лет, а у наркозависимых - 7,5±4,5 года. У пациентов с регистрацией РНК-содержащего вириона, злоупотреблявших не только алкоголем, но и наркотиками, длительность инфекции составила 6,5±4,6 лет.

При ведущей HCV-инфекции, наиболее часто встречающимися синдромами были астеновегетативный, болевой, гепатомегалия и желудочная диспепсии. Алкогольная зависимость не вызывала утяжеления астеновегетативного синдрома в сравнении с изолированным течением HСV-инфекции (р=0,66). Болевой синдром встречался в 100% случаев ХГС с алкогольной болезнью. Частота болевого синдрома в группе HCV-инфекции с алкогольной зависимостью и у наркозависимых, злоупотреблявших этанолом, достоверно отличалась от значений при изолированном ХГС (p<0,0001) и «чистых» потребителей опиатов (p<0,0001).

Желудочная диспепсия имела минимальную степень выраженности и встречаемости у больных при изолированной HCV-инфекции (49,7%), как и в группе наркозависимых (64,1%) (р=0,05). Максимальная выраженность желудочной диспепсии была в группе ХГС с алкогольной зависимостью (93,2%) При этом показатель встречаемости данного синдрома у злоупотребляющих этанолом достоверно отличен от значения при «чистой» HCV (p<0,0001) и у наркозависимых (р<0,0001). Выраженность желтухи при ХГС с алкогольной болезнью была достоверно больше, чем при изолированном вирусном поражении (р< 0,0001), случаях ХГС с опийной наркоманией (р=0,04), однако при этом не отличалась от значения в группе лиц, принимавших этанол и опиаты одновременно (р=0,9). Выраженность гепатомегалии была максимальной в группах HCV c неблагоприятным действием этанола (100 и 100%). Реже в группах наблюдения с ХГС встречались кишечная диспепсия, желтуха, спленомегалия, геморрагический синдром. В целом нами установлено, что дополнительный прием наркотических препаратов в случаях злоупотребления алкоголем при ХГС сопровождается выраженностью и встречаемостью синдромов, что и у алкоголиков с хронической HCV-инфекцией.

Изолированное течение HCV-инфекции характеризовалось в целом минимальной частотой встречаемости и степенью выраженности внепеченочных проявлений. Алкогольная зависимость определяла более высокую встречаемость ожирения, миокардиодистрофии, полинейропатии, энцефалопатии, проявлений ГЭРБ в сравнении с «чистым» ХГС. Так, избыточная масса тела регистрировалась достоверно чаще только у больных ХГС с алкогольной зависимостью в 15,7% случаев. Сочетанное поражение печени вирусом, этиловым алкоголем в условиях наркотизации характеризуется той же встречаемостью почти всех внепеченочных проявлений, что и группа больных ХГС с алкогольной зависимостью.

Наиболее часто выявляемыми синдромами в группах с ведущей HCV-инфекцией были цитолитический и гипербилирубинемии. Алкогольная зависимость при ХГС способствовала утяжелению цитолиза, иммуно-воспалительного синдрома, гипербилирубинемии, холестаза, в сравнении со всеми другими группами HCV-инфекции. Так, цитолитический синдром наиболее часто встречался у больных страдающих ХГС с алкогольной зависимостью - 77,6%. В то время как группа наркозависимых и злоупотребляющих алкоголем с РНК-содержащей гепатотропной инфекцией имели одинаковую представленность цитолитического синдрома (21,8 и 20,5% соответственно) (р=0,88). У больных ХГС с алкогольной зависимостью частота обнаружения гипербилирубинемии составила 55,6%, у пациентов принимающих опиаты и алкоголь одновременно - 57,6% (р=0,8). Как у наркозависимых с ХГС, так и у наркоманов, злоупотребляющих алкоголем, частота выявления иммуновоспалительного синдрома была одинакова (р=0,65).