Научное обоснование и пути совершенствования экстренной диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций в условиях сочетанности природных очагов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Научное обоснование и пути совершенствования экстренной диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций в условиях сочетанности природных очагов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Общая характеристика работы

энцефалит клещевой боррелиоз лабораторный

Актуальность проблемы. Природно-очаговые трансмиссивные клещевые инфекции имеют широкое распространение в мире и отличаются большим этиологическим разнообразием (вирусы, риккетсии, бактерии, простейшие). Последние 15 лет в России и, особенно, в Сибири характеризуются беспрецедентным ростом заболеваемости населения клещевым энцефалитом (КЭ), иксодовыми клещевыми боррелиозами (ИКБ), а также клещевым риккетсиозом (КР) (Оберт А.С., 2001; Злобин В.И., 2002; Коренберг Э.И., 2002; Борисов В.А., 2002; Жукова Н.Г., 2002; Волкова Л.И., 2003; Зинченко Н.С., 2003; Лашкевич В.А., 2003; Романенко В.В., 2003; Утенкова Е.О., 2003; Воробьева М.С., 2005; Гратц Н.Г., 2005; Ястребов В.К., 2006). Отмечается перманентный рост численности клещей в пригородных лесах и формирование новых антропургических очагов. Количество лиц, прежде всего горожан, пострадавших от укусов клещей, ежегодно возрастает.

Несмотря на то, что исследованиями освещены многие проблемы клещевых трансмиссивных заболеваний, остаются нерешенными принципиальные вопросы, связанные с новой эпидемиологической ситуацией, возникшей в начале ХХI века, требующей на современном этапе пересмотра стратегии и тактики борьбы с этими природно-очаговыми инфекциями.

В последние годы существенно изменились представления о распространении, таксономии и экологии риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ). В различных регионах мира обнаружен ряд новых риккетсий группы КПЛ, некоторые из которых могут обрести статус самостоятельного вида (Рудаков Н.В., 2001; Шпынов С.Н., 2002; Fournier P.E., 2000; Parola P., 2005; Raoult D., 1996). На эндемичных по клещевому риккетсиозу и сопредельных с ними территориях юга Сибири, Северного Казахстана, Дальнего Востока в последние годы выявлен и охарактеризован ряд риккетсий группы КПЛ, существенно отличающихся от возбудителя клещевого риккетсиоза - R. sibirica (Шпынов С.Н., 2003; Иголкина Я.П., 2006; Ливанова Н.Н., 2005; Рудаков Н.В., 2001; Shpynov S, 2001; Brouqui P., 2004; Rydkina E., 1999). У многих риккетсий новых генотипов патогенность для человека не установлена. Эти данные свидетельствуют о высокой актуальности исследований генетического разнообразия риккетсий, циркулирующих на территории Иркутской области и необходимости уточнения вопроса о роли риккетсий новых генотипов в региональной инфекционной патологии.

В последние годы в клещах тех же видов, с которыми связана передача вируса КЭ и боррелий, обнаружены возбудители Ehrlichia muris и Anaplasma phagocytophilum и описаны новые для России заболевания - моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) и гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) (Ohashi N., 2005; Bakken J.S., 1994; Brouqui P., 1999; Stafford III K.C.C., 1996; Inokuma H., 2004; Dumler J.S., 1991; Tylewska-Weirzbanowska S., 2001; Bjoersdorff A., 2002; Stuen S., 2006; Chen S., 1994; Ogden N.H., 1998; Karsson U., Alekseev A.N., 2001; Kim C.M., 2003; Petrovec M., 2002). Громадный ареал таежного клеща позволяет предполагать, что природные очаги МЭЧ и ГАЧ, по всей видимости, широко распространены на территории страны. Циркуляция этих возбудителей обнаружена в Пермской, Ленинградской, Томской, Новосибирской, Тюменской, Челябинской областях и в Алтайском, Приморском, Хабаровском краях (Коренберг Э.И., 1999; Григорян Е.В., 2000; Медянников О.Ю., 2001; Telford III S.R., 2002; Сидельников Ю.Н., 2002; Шпынов С.Н., 2002; Рудакова С.А., 2005; Шутова Н.А., 2006; Рар В.А., 2006). На территории Иркутской области имеются все биоценотические предпосылки для существования очагов МЭЧ и ГАЧ (это наличие соответствующих переносчиков - клещей I. persulcatus, резервуарных хозяев и др.). В пользу предположения о существовании природных очагов этих инфекций в регионе можно отнести и тот факт, что 14,6% случаев сезонных лихорадок у больных, находящихся на лечении в Иркутской городской инфекционной больнице после укуса клещей, остаются нерасшифрованными. Все это свидетельствует о необходимости проведения поисковых исследований на наличие очагов МЭЧ и ГАЧ на территории области.

Таким образом, современная эпидемиологическая ситуация характеризуется, с одной стороны, ростом известных клещевых инфекций, с другой - выявлением новых, ранее не известных на тех или иных территориях. Чрезвычайно важным новым аспектом является то, что очаги разных клещевых инфекций «накладываются друг на друга», т.е. речь идет о сочетанных очагах вирусных, бактериальных и риккетсиозных инфекций.

В условиях существования сочетанных очагов клещевых инфекций и роста числа людей, пострадавших от укусов клещей, ведущее место в борьбе с природно-очаговыми заболеваниями приобретают экстренная лабораторная диагностика и дифференцированная профилактика этих заболеваний. Достижение высокой эффективности этих мероприятий требует научного обоснования, отработки методических и организационных подходов.

Цель исследования: научно обосновать и разработать комплекс мер дифференциальной диагностики и экстренной специфической профилактики клещевого энцефалита и других трансмиссивных клещевых инфекций в условиях сочетанных природных очагов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) провести сравнительный анализ современной эпидемиологической ситуации по клещевому энцефалиту и другим трансмиссивным клещевым инфекциям в Иркутской области и г. Иркутске;

2) обосновать организационные принципы, методическую базу экспресс-диагностики КЭ и ИКБ и разработать схемы исследования материала;

3) оценить уровень зараженности клещей, снятых с людей, возбудителями КЭ и ИКБ и определить риск инфицирования пострадавших лиц;

4) разработать и внедрить в практическую работу тактику экстренной профилактики КЭ и ИКБ, основанную на скрининге лиц, пострадавших от укусов инфицированных данными патогенами переносчиков, дать оценку эффективности такого подхода к профилактике;

5) с помощью современных молекулярно-биологических методов изучить видовое разнообразие боррелий и риккетсий, циркулирующих на территории Прибайкалья;

6) провести рекогносцировочные исследования по оценке эпидемиологической ситуации в отношении МЭЧ и ГАЧ в Прибайкалье;

7) разработать алгоритм комплексной лабораторной экспресс-диагностики и экстренной профилактики инфекций, переносимых иксодовыми клещами в условиях юга Восточной Сибири.

Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика эпидемиологической ситуации в отношении КЭ, ИКБ, КР и оценка эффективности осуществляемых в Иркутской области и г. Иркутске мер профилактики данных инфекций. Проведено сравнительное изучение эпидемиологических особенностей этих инфекций и установлено, что основные закономерности развития эпидемического процесса КЭ и ИКБ на данной территории совпадают. В эпидемиологии клещевых инфекций (КЭ, ИКБ с одной стороны и КР - с другой) имеются как общие черты (тенденция к неуклонному росту заболеваемости, расширение ареала, увеличение числа случаев нападений клещей в городской черте), так и существенные различия (несовпадение основных переносчиков инфекции, территориальная приуроченность, сезонность и структура заболеваемости).

Показано, что для объективной оценки индивидуального риска заражения и развития КЭ и других клещевых инфекций у лиц, пострадавших от присасывания клеща, необходимо экспресс-определение возбудителей в переносчике.

Впервые доказана эпидемиологическая и экономическая эффективность экстренной профилактики клещевых инфекций, основанной на результатах экспресс-исследования снятых с людей переносчиков. Показано, что скрининг лиц, покусанных инфицированными клещами, позволяет отказаться от огульного подхода к экстренной профилактике КЭ и осуществлять адресную профилактику только в отношении пациентов с высокой степенью риска заболевания. Предложенный дифференцированный подход к профилактике позволяет не только значительно снизить социальный и экономический ущерб, наносимый КЭ и ИКБ, но и избежать необоснованного расхода дорогостоящего и дефицитного препарата, каким является специфический противоэнцефалитный иммуноглобулин.

Cущественно дополнены представления о структуре популяций риккетсий в очагах клещевого риккетсиоза Иркутской области. Показано, что наряду с R. sibirica на данной территории циркулируют риккетсии новых генотипов, в том числе, с неустановленной патогенностью для человека (R. sp. DnS14, R. sp. DnS28, R. raoultii, Candidatus R. tarasevichiae).

Впервые на территории Прибайкалья установлено существование природных очагов МЭЧ и ГАЧ с циркуляцией в них E. muris, A. phagocytophilum и Candidatus «Neoehrlichia mikurensis». Доказано участие эрлихий и анаплазм в формировании региональной инфекционной патологии.

Получена достоверная информация о генетической вариабельности возбудителей ИКБ, которая подтверждает роль B. garinii и B. afzelii в развитии ИКБ у больных в Иркутской области.

Впервые дано научное обоснование комплексу методов для диагностики и профилактики вирусных, бактериальных и риккетсиозных трансмиссивных инфекций в сочетанных природных очагах. Показано, что перспективным путем повышения эффективности и качества лабораторной диагностики трансмиссивных клещевых инфекций является использование современных молекулярно-генетических методов, в частности ПЦР.

Теоретическая значимость работы. Научно обоснован и разработан новый комплексный подход к экстренной профилактике трансмиссивных клещевых инфекций в условиях сочетанных природных очагов, основанный на результатах экспресс-определения возбудителей в снятых с пациентов членистоногих и скрининге лиц с высокой степенью вероятности заражения.

Разработаны методические основы оценки индивидуального риска заражения людей возбудителями клещевых инфекций, которые базируются на результатах экспресс-исследования присосавшегося переносчика.

Разработана методология повышения качества лабораторной диагностики трансмиссивных клещевых инфекций за счет внедрения современных молекулярно-генетических тестов и расширения спектра определяемых патогенов.

Практическая значимость работы. Предложен новый подход к экстренной профилактике трансмиссивных клещевых инфекций, основанный на результатах предварительного исследования присосавшегося переносчика, который позволил конкретизировать показания к назначению этиотропных препаратов и повысить на этой основе эпидемиологическую и экономическую эффективность экстренной профилактики данных инфекций. Экономия денежных средств за счет предотвращенного экономического ущерба, наносимого КЭ и ИКБ и введения иммуноглобулина только при наличии показаний за период с 1995 по 2006 гг. в г. Иркутске составила 84 млн. 825 тыс. рублей.

Для улучшения лабораторной диагностики предложено использование современных молекулярно-генетических методов исследования, внедрение которых в практическую работу будет способствовать повышению качества экстренной профилактики клещевых инфекций и, в конечном итоге, реальному снижению заболеваемости трансмиссивными клещевыми инфекциями в регионе.

Разработан алгоритм лабораторных исследований снятых с людей иксодовых клещей для выявления всего спектра возбудителей трансмиссивных клещевых инфекций, циркулирующих в сочетанных природных очагах Прибайкалья и тактика проведения профилактических мероприятий.

Результаты исследований легли в основу информационно-методических документов для органов практического здравоохранения Иркутской области: «Эпидемиология и профилактика болезни Лайма в пригородной зоне г. Иркутска» (1996), «Эпидемиология и профилактика болезни Лайма в пригородной зоне г. Ангарска» (1997), «Эколого-эпидемиологическая характеристика природных очагов трансмиссивных инфекций на территории Иркутской области» (2002), «Методические рекомендации «Иксодовый клещевой боррелиоз: тактика клинико-эпидемиологического, лабораторного обследования и профилактика заболевания» (МР 3.2.002-06, Иркутск, 2006).

В Государственную коллекцию вирусов ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского депонирован штамм вируса КЭ 886-84 с уникальной антигенной и генетической структурой (номер в ГКВ - 977). Полногеномные нуклеотидные последовательности (10 758 н.о.) двух штаммов (178-79 и 886-84) депонированы в международный компьютерный банк данных (GenBank, США) под №EF469661 и №EF469662.

Результаты работы внедрены в работу Центра диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН. Полученные данные используются в учебном процессе Иркутского государственного медицинского университета, на курсах повышения квалификации Иркутского института усовершенствования врачей.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены: на Международной научной конференции «Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами» (Листвянка, Иркутск, 1996), четвертом Российско-японском международном медицинском симпозиуме (Иркутск, 1996), VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997), научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998), Всероссийской научно-практической конференции «Природноочаговые инфекции в России: современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения» (Омск, 1998), Интернациональной конференции «Diversity of the Fauna of North Eurasia» (Новосибирск, 2000), Пятом международном форуме по глобальной вакцинологии (Минск, 2001), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные аспекты природно-очаговых болезней» (Омск, 2001), Научной конференции с международным участием «Инфекции человека в начале XXI века: эволюция, новые проблемы, перспективы контроля», посвященной 90-летию ИЭМ (Иркутск, 2002), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клещевые боррелиозы» (Ижевск, 2002), VIII съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологии и паразитологии (Москва, 2002), Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002), Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфектологии», посвященной 80-летию организации кафедры инфекционных болезней ИГМУ (2003), Расширенном Пленуме проблемной комиссии РАМН «Клещевой и другие вирусные энцефалиты» (Москва, 2003), Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций» (Санкт-Петербург, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке» (Томск, 2006), научно-практической конференции по профилактике вирусного клещевого энцефалита (Пермь, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту:

· Население Иркутской области подвержено высокому риску заражения возбудителями таких клещевых инфекций, как КЭ, ИКБ, КР, МЭЧ и ГАЧ.

· Структура популяций возбудителей клещевых инфекций на территории Прибайкалья неоднородна и представлена: тремя генотипами вируса КЭ (восточный, урало-сибирский, западный); двумя геновидами боррелий (B. afzelii и B. garinii); пятью генотипами риккетсий (R. sibirica, R. sp. DnS14, R. sp. DnS28, R. raoultii, Candidatus R. tarasevichiae); двумя видами эрлихий (E. muris, Candidatus «Neoehrlichia mikurensis») и одним видом анаплазм (A. phagocytophilum).

· В условиях высокой заболеваемости клещевыми инфекциями, слабого охвата населения вакцинацией против КЭ и низкого уровня проведения неспецифической профилактики возрастает значение экстренной специфической профилактики, осуществляемой после укуса человека клещом - переносчиком инфекции.

· Современный подход к экстренной профилактике в совмещенных природных очагах должен носить комплексный характер (т.е. быть направленным против всех известных патогенов, переносимых клещами) и основываться на скрининге лиц, подвергшихся высокой вероятности инфицирования.

· Проведение дифференциальной экспресс-диагностики позволяет конкретизировать показания к назначению этиотропных препаратов и повысить на этой основе эпидемиологическую и экономическую эффективность экстренной профилактики КЭ и других трансмиссивных клещевых инфекций.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 118 научных работ, в том числе: 1 коллективная монография и 24 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций.

Личный вклад автора. Работа выполнена в отделе природно-очаговых инфекций Института эпидемиологии и микробиологии НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН. Материалы диссертации вошли в отчеты по научным и хоздоговорным темам, выполненным при активном участии автора: «Ландшафтно-эпидемиологическое районирование и оценка эпидемической опасности в отношении КЭ и КБ (болезни Лайма) пригородной зоны г. Ангарска» (1996), «Эпидемиология и профилактика болезни Лайма в пригородной зоне г. Иркутска» (1997), «Экологические и эпидемиологические особенности совмещенных очагов КЭ, мало изученных арбовирусных инфекций и Лайм-боррелиоза на территории Восточной Сибири» (1998), «Цикл работ по КЭ и КБ» (2000), «Эколого-эпидемиологический мониторинг совмещенных очагов трансмиссивных инфекций и эколого-генетический анализ природных популяций вирусных, бактериальных и риккетсиозных патогенов в Восточной Сибири» (2002), «Комплексная эколого-эпидемиологическая и молекулярно-генетическая характеристика возбудителей трансмиссивных клещевых инфекций Восточной Сибири» (2005).

Автором сформулирована идея выполнения комплексных научных исследований по проблеме дифференциальной диагностики и экстренной профилактики трансмиссивных клещевых инфекций в условиях сочетанных природных очагов, определены цель и задачи работы, проведена информационная проработка темы исследования, выполнен сбор, анализ и обобщение материалов, сделаны выводы. Доли личного участия автора составляют: в получении и накоплении научной информации - 80%, в обобщении, анализе, интерпретации материалов - 100%.

Автор выражает глубокую признательность научному консультанту работы академику РАМН Злобину Владимиру Игоревичу, всем сотрудникам Центра диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций, лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусов ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН, научным сотрудникам Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск)

В.А. Рар и Я.П. Иголкиной, сотрудникам лаборатории трансмиссивных инфекций ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН к.б.н. М.А. Хаснатинову и С.С. Шулунову, сотрудникам Лимнологического института СО РАН (Иркутск) д.б.н. С.И. Беликову и С.Э. Дигас, работнику ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области» А.М. Антоновой за помощь, оказанную при выполнении данной работы.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 307 страницах, иллюстрирована 37 рисунками и 40 таблицами. Библиографический указатель содержит 392 источника, из которых 253 работы отечественных и 139 - зарубежных авторов.

Содержание работы

Объекты, методы и объем исследований. Для анализа эпидемиологической ситуации по трансмиссивным клещевым инфекциям в Иркутской области и г. Иркутске использованы архивные данные заболеваемости КЭ, ИКБ, КР Управления Роспотрбнадзора по Иркутской области и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области» за период с 1995 по 2004 гг.

С целью определения критериев риска инфицирования лиц, покусанных клещами, обоснования подходов к экстренной профилактике КЭ и ИКБ, определения эффективности профилактических мер, основанных на данных экспресс-исследования, обработаны и проанализированы данные обследования 56 355 человек, обратившихся в Центр диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций за период с 1995 по 2006 гг.

В ходе работы по определению антигена вируса КЭ исследованы 41 404 экземпляров клещей и 11 564 образцов сыворотки крови от пострадавших людей. Определение зараженности возбудителем ИКБ осуществлено у 30 469 переносчиков.

Для изучения генетического разнообразия риккетсий группы КПЛ, циркулирующих на территории Иркутской области и Республики Бурятия, исследовано 311 экземпляров клещей I. persulcatus, 232 - D. silvarum и 14 - D. nuttalli. Для уточнения роли риккетсий в региональной инфекционной патологии проанализировано 45 образцов сыворотки крови от больных людей, госпитализированных в медицинские учреждения в связи с подозрением на КР или наличием у них лихорадки неустановленной этиологии.

На присутствие антител к возбудителям МЭЧ и ГАЧ обследовано 644 образца сыворотки крови больных с острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии, возникшими после присасывания клещей. На наличие ДНК E. muris и A. phagocytophilum исследовано 139 клещей.

Генетическая вариабельность боррелий изучена при исследовании 224 экземпляров клещей I. persulcatus, 68 образцов крови больных ИКБ, взятых в различные сроки от начала заболевания и 9 проб мочи.

Общее количество проведенных лабораторных исследований приведено в табл. 1.

энцефалит клещевой боррелиоз лабораторный

Таблица 1. Общее количество проведенных лабораторных исследований

В ходе данной работы из клещей и крови людей, обратившихся за диагностической и профилактической помощью в Центр диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций, было изолировано 7 штаммов вируса КЭ. Сведения о выделенных штаммах приведены в табл. 2.

Таблица 2. Штаммы, изолированные от клещей и из крови людей, пострадавших от укуса клещей

Для достижения цели и решения поставленных задач был использован комплекс эпидемиологических, серологических, вирусологических, молекулярно-генетических и статистических методов. При анализе эпидемиологической ситуации по трансмиссивным клещевым инфекциям в Иркутской области и г. Иркутске использовали методы описательной и аналитической эпидемиологии (Черкасский Б.Л., 1988). Изучали уровни, возрастную и профессиональную структуру, территориальную приуроченность, сезонность, обстоятельства заражения лиц заболевших КЭ, ИКБ и КР. При проведении ретроспективного анализа заболеваемости основное внимание уделяли ее многолетней и внутригодовой динамике, изучали объем и качество профилактических мероприятий, осуществляемых на территории рекреационных зон г. Иркутска и направленных на борьбу с трансмиссивными клещевыми инфекциями

У пациентов, обратившихся в Центр диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций, собирали и подвергали анализу эпидемиологический анамнез. Изучали состояние клеща и степень его пригодности для лабораторного исследования на наличие двух возбудителей (антигена вируса КЭ и боррелий), уточняли сроки от момента укуса до обращения за медицинской помощью, местность и обстоятельства, при которых произошел укус, пол, возраст, род деятельности пострадавших т.д. С целью оценки эпидемиологической эффективности проводимых диагностических мероприятий, тщательному анализу подвергались результаты лабораторного исследования клещей. Особое внимание обращали на сведения о наличии профилактической вакцинации против КЭ, объем, полноту и качество проведенных экстренных профилактических мероприятий в отношении возбудителей КЭ и ИКБ.

Присосавшихся к людям клещей разделяли на 5 групп (от 0 до IV) пропорционально степени «напитанности» переносчика.

Для обнаружения вируса КЭ в клещах или сыворотках крови людей применяли комплекс методов.

Для экспресс-индикации антигена вируса КЭ в клещах и крови людей использовали ИФА. Исследование проводили согласно инструкции производителя тест-системы (ФГУП НПО «Микроген», Томск). Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре ELx800 (BIO-TEK Instruments, USA) при длине волны 450 нм, «бланк» осуществляли по воздуху. При превышении «пороговой величины» оптической плотности (P/N) от 1,2 до 1,5 раз считали содержание антигена вируса КЭ в клеще низким, от 1,6 до 2,0 - средним, более 2,1 - высоким.

Детекцию РНК вируса КЭ в клещах осуществляли с помощью коммерческой ПЦР-тест-системы «ВектоВКЭ-РНК-ампли-100» согласно инструкции производителя («Вектор-Бест», Новосибирская область).

Изоляцию штаммов вируса КЭ осуществляли путем заражения культуры клеток СПЭВ пробами крови людей, или суспензиями клещей. Выделенные штаммы поддерживали путем 2-3 пассажей на сосунках беспородных белых мышей. Генотипирование штаммов осуществляли с помощью генотипспецифических дезоксиолигонуклеотидных зондов в реакции МГНК или путем секвенирования по методу Сэнгера с помощью автоматического секвенатора ABI 373.

Для обнаружения боррелий в клещах применяли метод светлопольной микроскопии фиксированных препаратов содержимого кишечника клеща (Коренберг Э.И., 1991). Полученные препараты окрашивали по Романовскому-Гимза и докрашивали кристаллическим фиолетовым. Просмотр мазков осуществляли посредством иммерсионной микроскопии с использованием микроскопа МИКМЕД-2. Степень инфицированности клеща считали высокой при обнаружении более 50 боррелий в 100 полях зрения (п.з.), средней - 10-50 боррелий в 100 п.з. и низкой - менее 10 боррелий в 100 п.з.

Также для индикации и идентификации боррелий в исследуемом материале использовали ПЦР. Выделение ДНК проводили по Дойлу-Диксону с незначительными модификациями (Doyle J.J., Dikson E., 1987). Данный раздел работы проводили совместно с к.б.н., с.н.с. лаборатории трансмиссивных инфекций ИЭМ ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН М.А. Хаснатиновым. Для выявления специфической ДНК боррелий использовали следующие праймеры: 1323 (5ґ - TGGCAGTGCGTCTTAAGCATG - 3ґ) и 1499 (5ґ-ATCGAATTAAACCACATGCTCCAC - 3ґ), фланкирующие фрагмент гена 16S pРНК боррелий длиной 922 н.о.); 1284 (TCTGATGATGCTGCTGGTATGGG) и 1285 (GCACCTAAATTTGCTCTTTGATC), позволяющие амплифицировать фрагмент гена флагеллина длиной 683-689 н.п. Для постановки ПЦР использовали амплификаторы «Терцик» (ЗАО «ДНК-технология», Москва) или «GeneAmp 2700» (USA). В качестве положительного контроля использовали ДНК типового штамма B. afzelii Ip21 (НИИЭМ им. Гамалеи, Москва), в качестве отрицательного - ДНК E. coli (штамм Jm109). Размер и чистоту амплифицированного фрагмента оценивали при помощи электрофореза в 4% полиакриламидном геле. Продукты ПЦР окрашивали аммиакатом серебра по J.G. Guillemette. Очистку ампликонов проводили с помощью электрофореза в геле легкоплавкой агарозы. Фрагменты клонировали в плазмидном векторе pGEM 3Zf+ с использованием набора pGEM T-Easy Vector System («Promega», USA) с последующей трансформацией вектором клеток E. coli (штаммы Jm и Novablue). Клонированные фрагменты секвенировали с помощью набора fmol DNA Sequencing System («Promega», USA) по протоколу производителя. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программу Gene Tools 1,0 (Resenchuk, 1991). Для построения филогенетических схем применяли программы из пакета TREECON (Van de Peer Y., 1993). Для составления матрицы генетических дистанций использовали двухпараметрический метод Кимуры (Kimura M., 1980). Для построения филогенетических деревьев применяли метод объединения ближайших соседей - Neighbor-joining. Также для детекции ДНК боррелий использовали коммерческие ПЦР-тест-системы производства «Хеликс» (Санкт-Петербург) и «ВектоЛайм-ДНК-ампли-100» («Вектор-Бест», Новосибирская область) согласно инструкции производителей.

Контроль за эффективностью проведенной антибиотикопрофилактики осуществляли с помощью НРИФ или ИФА. Для постановки НРИФ использовали диагностикумы НИИЭМ им. Гамалеи РАМН (Москва) и НПО «Вирион» (Томск). Учет результатов проводили с помощью люминесцентной микроскопии (Крючечников В.Н., 1985). Определение IgM и IgG-антител в ИФА осуществляли с помощью тест-систем «ЛаймБест» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область) и «Боррелиоз-ИФА-комби», «Боррелиоз-ИФА-скрининг» (ООО «Омникс», Санкт-Петербург) по инструкции производителя.

Для обнаружения риккетсий и изучения их генетического разнообразия использовали молекулярно-генетические методы. Данный раздел исследований проводили совместно с сотрудниками Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) Я.П. Иголкиной, сотрудниками Лимнологического института СО РАН (Иркутск) д.б.н. С.И. Беликовым, С.Э. Дигас, сотрудником лаборатории трансмиссивных инфекций ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН С.С. Шулуновым.

Для оценки зараженности клещей риккетсиями использовали ПЦР и праймеры RICK33 (5`-GCAATACAACAAGGTCTTAAAGCCGC-3`) и RICK532 (5`-TGCAGCATTCGCTCCCCCTAAAG-3`), амплифицирующие фрагмент гена rOmpA длиной 500 п.о. Структуры для синтеза данных праймеров отобраны С.Э. Дигас. Кроме того, детекцию ДНК риккетсий и их типирование осуществляли с помощью метода двухраундовой ПЦР с использованием праймеров, соответствующих фрагментам генов цитратсинтазы (gltA) и поверхностного белка rOmpA (Ливанова Н.Н., 2005). На первом этапе использовали родоспецифичные праймеры (из области гена gltA). Во втором раунде видовую принадлежность и генетические варианты выявленных риккетсий определяли как с помощью праймеров, специфичных участкам гена rOmpA R. sibirica и R. slovaca, так и посредством определения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР по методу Сэнгера. Также, детекцию ДНК риккетсий осуществляли с помощью коммерческой ПЦР-тест-системы «GenePak» («Biokom», Санкт-Петербург) (Rri, Риккетсия Rickettsia rickettsii).

Для изучения гетерогенности популяции риккетсий использовали ПДРФ-анализ. Оптимальный выбор ферментов рестрикции проводили с помощью программы Webcutter 2.0. Рестриктазы PvuII и Ksp22I, были выбраны, как отличающие R. sibirica от риккетсий близких к R. montanensis.

Первичную структуру фрагмента гена поверхностного мембранного белка rOmpA определяли с помощью секвенирования с использованием набора fmol Sequenсing System («Promega», США) по протоколу производителя.

Для обнаружения эрлихий, анаплазм и антител к ним использовали ряд методов. ДНК эрлихий и анаплазм в образцах клещей выявляли с помощью двухраундовой ПЦР. На первом этапе использовали родоспецифичные праймеры из области гена

16S рРНК:

Ehr1 (5'-GAACGAACGCTGGCGGCAAG-3');

Ehr2 (5'AGTA (T/C) CG (A/G) ACCAGATAGCCGC-3');

Ehr3 (5'-ATTACCCAATCCTGACACAGGG-3');

Ehr4 (5'-CTAGGAATTCCGCTATCCTCT-3').

Данные праймеры фланкировали фрагмент гена 16S pРНК эрлихий и анаплазм длиной 524 п.о. Видовую принадлежность и генетические варианты выявленных возбудителей определяли как при проведении ПЦР с использованием праймеров, специфичных для A. phagocytophilum (HGE1 - 5'-CGGATTATTCTTTATAGCTTGC-3'), E. muris (Em1-5'-CGAACGGATAGCTACCCATAGC-3' и Em2-5'-CGCTCCAAAGTTAAGCTTTGGT-3'), так и посредством определения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР (Рар В.А., 2005). Также использовали праймеры Ekh1 (5'-CAGATGCTTCTAGCTATTTATAGC-3') и Ekh2 (5'-AGCTCCAAAGTTAAGCTCTGGT-3'), специфичных для spр. Ehrlichia. Выполнение данного раздела работ осуществляли совместно с сотрудником Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) В.А. Рар. Определение нуклеотидных последовательностей проводили с помощью секвенатора ABI PRISM 3100 («Applied Biosystems», USA) в Центре севенирования ДНК Сибирского отделения РАМН,

г. Новосибирск. Анализ последовательностей проводили с помощью программ BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) и CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html). Филогенетический анализ осуществляли с помощью программы MEGA 3.1.

Кроме того, для обнаружения ДНК эрлихий и анаплазм использовали однораундовую ПЦР с коммерческой тест-системой «GenePak» («Biokom», Россия) (Ehr, Эрлихия общ. Ehrlichia spp.).

Для обнаружения иммуноглобулинов класса M и G к возбудителям МЭЧ и ГАЧ использовали ИФА с диагностическими тест-системами производства НПО «Омникс» (Санкт-Петербург). Исследования выполняли в соответствии с инструкцией производителя. Для каждой сыворотки рассчитывали коэффициент серопозитивности (КС). Положительными считали сыворотки с КС>1,1.

Статистический анализ данных с вычислением общепринятых показателей осуществляли с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA» и системы электронных таблиц Microsoft Excel 2000. Достоверность разницы величин, исследуемых в динамике, определяли с помощью стандартных параметрических и непараметрических критериев статистики (Савилов Е.Д., 1993).

Результаты и обсуждение

Современная эпидемиологическая обстановка и профилактика трансмиссивных клещевых инфекций (на примере Иркутской области и г. Иркутска)

Проблема заболеваний, переносчиками которых являются иксодовые клещи, в последнее десятилетие приобретает все большее значение для многих регионов России, в том числе и для Восточной Сибири. Иркутская область занимает географически центральное место в огромном регионе Восточной Сибири и относится к одной из наиболее экономически развитых и населенных территорий азиатской части страны. Особый интерес анализу эпидемиологической обстановки в данном регионе придает возникновение здесь новой ситуации, когда на протяжении короткого отрезка времени стремительно возросла заболеваемость природно-очаговыми клещевыми инфекциями, превратив Восточную Сибирь (особенно ее наиболее обжитую южную часть), наряду с Уралом и Западной Сибирью, в территорию высокого риска заражения. В настоящее время в Иркутской области официально регистрируются три инфекции, передающиеся через укус клеща: КЭ, ИКБ и КР.

Анализ эпидемиологической ситуации в отношении трансмиссивных клещевых инфекций и организации их профилактики, проведенный нами на примере Иркутской области и г. Иркутска, показал, что основные закономерности развития эпидемического процесса КЭ на данной территории сходны с таковыми в других эндемичных регионах России (Борисов В.А., 2000; Волкова Л.И., 2003; Злобин В.И., 1996; 2004; 2006; Жукова Н.Г, 2002; Леонова Г.Н., 1997; Утенкова Е.О., 2003; Ястребов В.К., 2006).

К наиболее значимым эпидемиологическим особенностям современного КЭ в Иркутской области относятся: 1) высокий уровень и темп роста заболеваемости (показатель заболеваемости КЭ в области ежегодно превышает средне-республиканский в 1,6-4,3 раза; за период с 1977 по 1999 гг. отмечено увеличение заболеваемости КЭ в 136 раз); 2) расширение ареала вируса КЭ - в 1986 г. КЭ был зарегистрирован на 15 административных территориях области, в 2006 г. эндемичными признаны уже 24 территории; 3) неблагоприятное изменение структуры заболеваемости - в последние годы обострение эпидемиологической обстановки на территории Иркутской области происходит за счет неуклонного роста заболеваемости среди городского населения (73,4%), при относительно низкой заболеваемости жителей сельской местности (26,6%); случаи профессиональных заболеваний не превышают 0,6% от общего числа заболевших КЭ; 4) рост количества покусов людей клещами, обусловленный возросшим числом посещений горожанами пригородных лесов (главными причинами контакта населения с клещами и заражения вирусом КЭ являются посещение лесных массивов или других мест отдыха, работа на садоводческих участках, сбор дикоросов); 5) неодинаковая напряженность эпидемического процесса на различных территориях Иркутской области - основные активные антропургические очаги КЭ сформировались вокруг крупных промышленных городов, расположенных в южной части области, на которые приходится свыше 80% заболеваемости; 6) на территории Иркутской области наблюдается значительная генетическая вариабельность штаммов вируса КЭ, а именно, здесь имеет место циркуляция трех генотипов вируса КЭ (дальневосточного, урало-сибирского, западного), из которых урало-сибирский генотип является доминирующим; также на территории области обнаружены штаммы (178-79, 886-84), отличающиеся по молекулярно-генетической структуре от штаммов трех известных генотипов.

Не менее актуальной проблемой для Иркутской области являются иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ). Наличие одного и того же вида переносчика (клещи I. persulcatus) возбудителей КЭ и ИКБ обусловливает существование на территории области сочетанных очагов этих инфекций и сходство многих эпидемиологических проявлений. Для ИКБ в Иркутской области, также как и для КЭ, характерен высокий уровень заболеваемости, которая ежегодно превышает аналогичные показатели в РФ в 1,3-2,4 раза. Ареал данной инфекции шире, чем КЭ и включает 28 районов области.

Наименее благополучная эпидемиологическая обстановка сложилась в Иркутске, где заболеваемость в отдельные годы превышала областные показатели в 2 раза. Структура заболеваемости ИКБ и основные места заражения аналогичны таковым при КЭ.

Анализ эпидситуации при клещевом риккетсиозе (КР) показал, что заболеваемость этой инфекцией на территории Иркутской области, также как КЭ и ИКБ, имеет тенденцию к неуклонному росту, расширению ареала основных переносчиков, увеличению числа случаев нападений клещей в черте г. Иркутска. В результате эпидемиологического анализа был выявлен и ряд различий в эпидемиологии КР и других клещевых инфекций, регистрируемых на территории области. Одним из таких отличий является территориальное распространение заболеваемости КР, которое охватывает только 10 районов Иркутской области. Наиболее высокие показатели заболеваемости отмечаются на территории Усть-Ордынского Бурятского автономного округа (УОБАО), где до настоящего времени сохраняются обширные участки нераспаханных степей - типичных мест обитания клещей рода Dermacentor, являющихся основными переносчиками данной инфекции. Высокая заболеваемость КР на территории округа обусловлена не только особенностями ландшафта, но и особенностями хозяйственной деятельности (преобладает животноводство), и уровнем медицинской помощи (возможна гипердиагностика заболевания). Существенные различия касаются и основных переносчиков возбудителей, для возбудителя КР - это клещи D. silvarum и D. nuttalli, для возбудителей КЭ и ИКБ - клещи I. persulcatus. Отмечены отличия в реализации факторов, способствующих заражению людей КР и проявлениям его сезонности. Наиболее часто заражение людей происходит при сборе дикорастущих лекарственных трав и ягод, а также при выпасе скота и уходе за ним. Отличительной особенностью КР является наличие более раннего начала эпидемического сезона и его большая продолжительность (апрель-октябрь). Возбудителем КР в Иркутской области традиционно считается R. sibirica, однако появление в последнее время сведений о новых видах риккетсий на территории Сибири и Дальнего Востока, свидетельствует о необходимости уточнения вопроса об этиологии этой инфекции в Иркутской области.

В 2003 г. на территории области впервые верифицированы случаи инфекций, вызванные возбудителями МЭЧ и ГАЧ, но официальная регистрация этих заболеваний в области не ведется. Переносчиком этих возбудителей, также как вируса КЭ и боррелий является таежный клещ I. persulcatus. Поэтому высока вероятность того, что в Иркутской области эти риккетсиозные инфекции существуют и их природные очаги территориально совпадают с сочетанными очагами КЭ и ИКБ.

В условиях сочетанных природных очагов, оптимальным является применение тех методов профилактики, которые могли бы одновременно защищать человека от всего комплекса инфекций, передающихся клещами. К ним относятся, прежде всего, методы неспецифической профилактики. Анализ эффективности проведения акарицидных обработок в рекреационных зонах г. Иркутска показал, что ни один из используемых в настоящее время препаратов не обеспечивает защиту населения в течение всего эпидемического сезона; площади, охватываемые обработками, недостаточны. При выборочной проверке обработанных акарицидами объектов в 20-63% случаев обнаружены клещи. Ежегодно на этих территориях регистрируется от 7 до 30 присасываний клещей, отмечен один случай КЭ (табл. 3).

Таблица 3. Результаты проверки эффективности противоклещевых обработок рекреационных зон г. Иркутска за период с 1995 по 2004 гг.

Наиболее надежным и эффективным средством защиты населения от КЭ является вакцинопрофилактика. Однако ежегодно вакцинацию и ревакцинацию в г. Иркутске проходит не более 15 тысяч человек (менее 3% населения), такой уровень «привитости» населения является недостаточным для того, чтобы реально повлиять на ситуацию в отношении КЭ в городе. По-прежнему, основное внимание при проведении вакцинации уделяется контингентам риска в традиционном их понимании (работники «лесных» профессий), тогда как в настоящее время группой высокого риска являются жители городов.

В условиях низкого охвата населения вакцинацией особое значение приобретает экстренная серопрофилактика КЭ, единственным надежным средством которой продолжает оставаться специфический гомологичный донорский иммуноглобулин. Эпидемиологическая оценка эффективности серопрофилактики КЭ, проведенная нами в г. Иркутске, показала, что эффект от экстренного применения противоэнцефалитного иммуноглобулина чрезвычайно высок (99,4% среди детей и 98,5% среди взрослых). Но имеющиеся ресурсы иммуноглобулина расходуются нерационально: большая часть препарата вводится лицам, не нуждающимся в нем, в то время как другие люди, пострадавшие от укусов инфицированных вирусом клещей, не получают серопрофилактики из-за его дефицита.

Таким образом, анализ эффективности различных мер профилактики клещевых инфекций, проводимых в г. Иркутске, показал, что ни один из применяемых в настоящее время методов не обеспечивает надежной защиты населения от заболевания этими инфекциями.

Изложенные выше материалы свидетельствуют о необходимости разработки методических подходов к оценке индивидуального риска заражения людей, пострадавших от укуса клеща, что позволило бы конкретизировать показания к введению специфического иммуноглобулина и усовершенствовать на этой основе тактику экстренной профилактики. В данном аспекте наиболее перспективно определение риска заражения обратившихся по поводу укуса клеща лиц на основании индикации вируса КЭ в переносчиках, снятых после присасывания. Одновременное выявление возбудителей других клещевых инфекций предоставило бы возможность решать вопрос о необходимости проведения экстренной профилактики в отношении ИКБ, КР, МЭЧ, ГАЧ.

Организация дифференциальной экспресс-диагностики клещевого энцефалита и клещевого боррелиоза в г. Иркутске. Тактика профилактических мероприятий в отношении лиц, пострадавших от укуса клещей

С целью оказания диагностической и профилактической помощи населению, пострадавшему от укусов клещей, апробации и внедрения современных методов лабораторной диагностики в 1992 г. в городе Иркутске на базе Института эпидемиологии и микробиологии был создан Центр экстренной диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций. Главным принципом, положенным в основу экстренной профилактики было назначение хорошо зарекомендовавших себя средств (иммуноглобулин против КЭ или антибиотики в случае ИКБ) по результатам дифференциальной экспресс-диагностики, призванной установить факт или высокую степень вероятности инфицирования пациента при укусе клеща вирусом КЭ или боррелиями.

Аргументами в пользу предлагаемого подхода явились: беспрецедентный рост заболеваемости КЭ и ИКБ в регионе Восточной Сибири и Иркутской области, значительное увеличение числа лиц, обращающихся с жалобами на укусы клещей, дефицит и дороговизна иммуноглобулина против КЭ, известные данные о невысоком проценте вирусофорности клещей, необходимость использования различных видов профилактики при заражении вирусом КЭ и боррелиями, разработка эффективных экспресс-методов выявления данных патогенов.

Для практической реализации намеченного подхода необходимо было решить следующие задачи: 1) отобрать методы, адекватные целям экспресс-диагностики КЭ и ИКБ; 2) разработать алгоритм диагностических исследований и тактику профилактических мероприятий в отношении лиц, пострадавших от присасывания клещей.

Наиболее приемлемым методом для оперативного решения вопроса о наличии вируса КЭ в присосавшемся клеще является иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция высоко чувствительна, специфична, экономична и проста в исполнении, экспресс-исследование занимает всего несколько часов. ИФА позволяет не только провести индикацию антигена вируса КЭ в клеще, но и оценить количественно его содержание в исходном материале (Наволокин О.В., 1984). Высокая эффективность ИФА для прямого обнаружения антигена вируса КЭ в клеще показана многими исследователями (Бочкова Н.Г., 1990; Караванов А.С., 1990). Вместе с тем, диагностические возможности и надежность использования ИФА для оценки риска заражения людей по результатам обнаружения антигена вируса КЭ в клещах оставались малоизученными. После разработки в 1989 г. коллективом авторов под руководством Л.Е. Подоплекиной тест-системы для выявления антигена вируса КЭ и апробации ИФА для индикации вируса КЭ в отдельных экземплярах клещей в г. Перми (1986-1990 гг.) стало возможным более широкое использование данного метода экспресс-диагностики. Именно ИФА, начиная с 1992 г., применяется нами для индикации антигена вируса КЭ в переносчиках. За период с 1992 по 2006 гг. исследовано 47 352 экземпляра клещей. Анализ случаев заболевания у людей с отрицательными результатами ИФА на наличие антигена вируса КЭ показал, что в дальнейшем ложноотрицательными признаны только 18 (0,04%). У заболевших КЭ людей отмечались только лихорадочные (72,2%) и менингеальные

(27,8%) формы заболевания. Ложноотрицательные результаты исследования в основном были связаны с плохой сохранностью клеща, доставленного на исследование, и невозможностью точного определения срока укуса.

Для выявления в клещах боррелий наиболее подходящей оказалась прямая микроскопия фиксированных мазков содержимого кишечника членистоногих. Метод был апробирован рядом исследователей и рекомендован для широкого практического использования. С 1995 г. он внедрен в работу «Центра диагностики» г. Иркутска. За двенадцатилетний период наблюдений из 26 980 отрицательных результатов только 16 оказались ложноотрицательными (0,06%). В 40,0% случаев гиподиагностика была связана с исследованием клещей, продолжительность питания которых на человеке составляла более 2-3 суток. В этих случаях, из-за густого мазка и наличия в нем крови, обнаружение спирохеты было затруднено, что снижало эффективность проводимой диагностики.

На территории Иркутской области существуют сочетанные очаги КЭ и ИКБ, что увеличивает риск заражения людей одновременно двумя патогенами и ведет к развитию микстформ, затрудняет диагностику, профилактику и требует комплексного подхода. Поэтому одним из важных аспектов настоящей работы явилась разработка алгоритма исследований, позволяющего проводить надежное выявление в клещах обоих патогенов. Учитывая разную преимущественную локализацию вируса КЭ (слюнные железы) и боррелий (кишечник) в переносчике, мы посчитали возможным объединить метод ИФА с прямой микроскопией и использовать их одновременно, но в виде последовательных стадий. При этом стадия детекции боррелий в кишечнике клеща предшествует стадии определения антигена вируса КЭ в суспензии клеща с помощью ИФА. Десятилетний опыт работы «Центра диагностики» доказал успешность применения данного алгоритма лабораторной диагностики для обнаружения возбудителей КЭ и ИКБ.