Ранее было показано, что на территории Иркутской области существуют активные очаги КР. С помощью традиционных риккетсиологических методов было установлено, что основными переносчиками и хранителями R. sibirica в природе являются клещи D. nuttalli и D. silvarum.

В настоящее время ежегодно увеличивается число лиц, пострадавших от укусов клещей рода Dermacentor. Так, если в 1996 г. в Центре диагностики и профилактики трансмиссивных инфекций зафиксировано 22 таких обращения, то в 2006 г. - уже 410.

Наблюдается не только рост числа обращений людей, пострадавших от укуса клещей данного рода, но и расширяется ареал этих клещей. Если в 1996-2000 гг. нападения клещей рода Dermacentor отмечались преимущественно на территории УОБАО и вдоль Александровского тракта (автомобильная магистраль, ведущая с территории автономии к г. Иркутску), то в 2006 г. они отмечены на территории Усть-Ордынского, Боханского, Баяндаевского, Эхирит-Булагатского, Ольхонского, Осинского, Усть-Удинского, Ново-Нукутского, Иркутского, Братского, Слюдянского и Нижнеудинского районов Иркутской области.

Отмечено приближение ареала клещей D. silvarum к рекреационной зоне г. Иркутска и увеличение числа случаев нападения клещей непосредственно в черте города. Так, обращения по поводу укуса клещей зафиксированы вблизи всех основных автомобильных магистралей, ведущих к г. Иркутску (Качугском, Александровском, Голоустненском, Байкальском, Московском, Култукском, Московском трактах), а также по ходу железнодорожной магистрали «Иркутск-Слюдянка». Отмечены случаи нападения клещей D. silvarum и на территории микрорайонов города Иркутска: Ново-Ленино, Радищева, Приморского, Зеленого.

В последние годы отмечается выявление новых риккетсий группы КПЛ, связанное с совершенствованием методов их идентификации, но вклад риккетсий данных генотипов в патологию человека до сих пор остается неясным. В связи с этим представляло интерес изучение генетического разнообразия риккетсий группы КПЛ, циркулирующих на территории Иркутской области. Уточнение спектра циркулирующих в регионе риккетсий и их возможных переносчиков имеет огромное значение для совершенствования диагностики КР и дальнейшей разработки средств специфической профилактики этого заболевания.

В исследование были взяты 120 клещей из различных районов Иркутской области, Республики Бурятия и УОБАО. Обнаружение риккетсий проводили в трех видах клещей - I. persulcatus, D. silvarum и D. nuttalli, которые были доставлены в Центр диагностики и профилактики трансмиссивных инфекций в период с 9 мая по 3 сентября 2003 гг. пострадавшими от их укусов людьми. Для детекции риккетсий использовали праймеры на основе консенcуса нуклеотидных последовательностей гена rOmpA риккетсий группы КПЛ. Большинство исследованных клещей (45,8%) были доставлены из Усть-Ордынского, Эхирит-Булагатского, Баяндаевского, Осинского, Ольхонского районов УОБАО. Именно эти районы в основном и обеспечивают заболеваемость КР в Иркутской области. ДНК риккетсий в этих клещах обнаружена в 60,0±6,6% случаев (табл. 11).

Таблица 11. Результаты исследования клещей на наличие ДНК риккетсий группы КПЛ

42,5% исследованных проб составили клещи из Иркутского района. Зараженность их риккетсиями также была высокой (52,9±6,9%). В результате исследования было обнаружено 13 микстинфицированных клещей (10,8%). Восемь из них содержали ДНК риккетсий и антиген вируса КЭ в низкой концентрации, четыре - риккетсии и боррелии, а в одном - обнаружены все три вида возбудителя одновременно.

На следующем этапе был проведен анализ полученных амплифицированных фрагментов. У одного из образцов структура фрагмента гена rOmpA была изучена с помощью секвенирования, по результатам исследования он был отнесен к R. sibirica. Полученные ПЦР-фрагменты остальных образцов затем были обработаны рестриктазами Pvu II и KspII. Данные рестриктазы позволяли отличать R. sibirica от риккетсий, близких к R. montanensis. Ни один из исследованных образцов не содержал сайта рестрикции для Pvu II, т.е. все они отличались от R. sibirica. Один образец не содержал сайта рестрикции для Ksp II, все же остальные образцы разрезались рестриктазой

Ksp II на два фрагмента, как и риккетсии группы R. montanensis. Две пробы давали двойную полосу, что может свидетельствовать о микстинфицированности данных клещей двумя видами риккетсий группы КПЛ. Обе пробы ДНК были получены из клещей

I. persulcatus.

Таким образом, в результате исследований было еще раз подтверждено, что на территории Иркутской области и Бурятии циркулируют риккетсии, относящиеся к двум группам - к группе R. sibirica и группе, близкой к R. montanensis. Большинство из детектируемых риккетсий по первичной структуре гена поверхностного мембранного белка rOmpA отличается от R. sibirica и, следовательно, их патогенность для человека не установлена.

В 2005 г. на наличие ДНК риккетсий было исследовано 65 суспензий клещей, снятых с людей. Клещи D. silvarum в 66,6±5,8% случаев содержали ДНК риккетсий. Зараженность клещей I. persulcatus была еще выше, в 7 из 8 исследованных клещей были обнаружены риккетсии. В ходе исследования были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена rOmpA длиной 337 п.н. у 9 образцов клещей

D. silvarum. По результатам секвенирования 6 из них были отнесены к группе

R. sp. DnS14, два - к группе R. sp. DnS28 и только один образец (77ChapDs) оказался генетически близок R. sibirica (рис. 6).

Этот образец был получен из клеща D. silvarum, снятого с человека, пострадавшего от его укуса на территории Усть-Ордынского района УОБАО. В дальнейшем у данного пациента развилась клиническая картина КР. При изучении с помощью ПЦР в 2005 г. 66 особей таежных клещей I. persulcatus, присутствие ДНК риккетсий было обнаружено в 18 клещах (27,3±5,5%). По предварительным данным, в 3-х образцах установлено наличие ДНК Candidatus R. tarasevichiae, которая относится к группе риккетсий с неустановленной патогенностью для человека.

В 2006 г. при проведении совместных исследований с сотрудниками Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) впервые на территории Иркутской области была установлена циркуляция риккетсий

R. sp. RpA4 (R. raoultii). С помощью двухраундовой ПЦР было проанализировано 20 клещей D. silvarum из Нукутского района и 28 - из Эхирит-Булагатского района Иркутской области. На первом этапе при использовании родоспецифичных праймеров (из области гена цитратсинтазы) ДНК риккетсий выявлена в 45 образцах (93,8%).

При проведении ПЦР с видоспецифичными праймерами (по гену rOmpA) во всех этих пробах обнаружена ДНК R. sp. RpA4. Кроме того, в 7 образцах (14,6%) обнаружено инфицирование двумя видами риккетсий. Помимо ДНК R. sp. RpA4 в них обнаружена ДНК R. sibirica. Фрагменты четырех положительных образцов длиной около 450 н.п. были секвенированы. Результаты исследования показали их принадлежность R. sibirica.

В последнее время появились данные, свидетельствующие об участии риккетсий новых генотипов в патологии человека. Так, Л.В. Кумпан при исследовании образцов сыворотки крови от больных клещевыми инфекциями из Алтайского края и Новосибирской области было отмечено, что часть из них, не реагировавших в РСК с антигеном R. sibirica, вступала в реакцию с антигенами, приготовленными из риккетсий новых генотипов (R. sp. DnS28 и R. sp. RpA4) (Кумпан Л.В., 2006). Таких образцов крови в Новосибирской области было 6,8±1,9%, а в Алтайском крае - 42,8±10,8%.

С целью изучения роли различных генотипов в развитии КР в Иркутской области нами было проведено исследование 45 проб крови больных людей, в 14 из них была обнаружена ДНК риккетсий (31,1%). У двух ампликонов были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена rOmpA длиной 337 п.н. Оба образца оказались генетически близки к риккетсиям группы R. sp. DnS14. Сыворотка №2853 была взята у больного, в анамнезе которого присутствовали жалобы на высокую температуру (до 38,5єС), головную боль, тошноту, появление сыпи по всему телу на 5 сутки с момента присасывания клеща. Результаты анализа крови на клещевой энцефалит и клещевой боррелиоз были отрицательными. Сыворотка №3088 получена от больного, находящегося в реанимации ГКБ №10. У данного больного наблюдались признаки полинейрорадикулопатии. Нападение клеща произошло в Качугском районе Иркутской области. Кроме присутствия ДНК риккетсий R. sp. DnS14, в крови было обнаружено присутствие B. garinii. Таким образом, у больного было установлено наличие микстинфекции КР и ИКБ. Сочетание двух инфекций привело к крайне тяжелому развитию заболевания. Микстинфицирование возбудителями КР и ИКБ обнаружено также в сыворотке крови №1796 (ДНК риккетсий + ДНК B. garinii). В сыворотке крови №2245 были детектированы одновременно РНК вируса КЭ, ДНК риккетсий и боррелий (B. garinii). У всех остальных больных, в сыворотках которых обнаружено наличие ДНК риккетсий, в анамнезе были указания на наличие лихорадки, первичного аффекта, лимфаденита или сыпи на теле.

Таким образом, результаты наших исследований подтверждают полученные ранее данные о широком распространении R. sibirica на территории Иркутской области и Республики Бурятия. Впервые в ходе работы было показано, что на территории

Иркутской области циркулируют риккетсии группы КПЛ новых генотипов с неустановленной патогенностью для человека (R. sp. DnS14, R. sp. DnS28, R. raoultii,

Candidatus R. tarasevichiae (рис. 7).

Высокая степень инфицированности клещей D. nuttalli, D. silvarum и I. persulcatus риккетсиями, расширение их ареала, рост числа обращений людей, пострадавших от укуса клещей на территории очагов КР, а также рост заболеваемости этой инфекцией, делают очевидной необходимость внедрения экстренной профилактики КР на основе результатов экспресс-определения возбудителя в клещах. Наличие смешанных инфекций КР, ИКБ и КЭ требует обязательного проведения дифференциальной экспресс-диагностики этих заболеваний и разработки мер профилактики.

Лабораторную диагностику КР затрудняет значительная генетическая вариабельность риккетсий и все еще остающаяся неясность вклада риккетсий «новых» генотипов в инфекционную патологию. Учитывая возможное присутствие в клещах непатогенных риккетсий, проводить антибиотикопрофилактику необходимо только в тех случаях, когда установлен вид риккетсий. В качестве профилактического лекарственного средства при этом заболевании С.И. Дьяков и М.А. Мисникова рекомендуют использовать рифампицин и его производные пролонгированного действия азориф и рифапентин, а также доксициклин и азитромицин (Дьяков С.И., 2000).

По данным ряда авторов, особенности клинического течения ИКБ и эффективность серо- и генодиагностики зависят от генетической структуры возбудителей. Поэтому очевидно, что для своевременной диагностики и терапии ИКБ необходима достоверная информация о геновидовом разнообразии боррелий, циркулирующих на данной территории и установление вклада боррелий различных геновидов в развитие региональной инфекционной патологии. Прямая микроскопия препаратов, полученных из содержимого кишечника клеща, такую информацию дать не может. К недостаткам данного метода также относится и невозможность проведения исследования в случае высокой степени «напитанности», плохой сохранности переносчика (сухие, раздавленные, фрагменты) или его отсутствии. Кроме того, с помощью микроскопии нельзя получить информацию о патогенности боррелий. По данным А.Н. Алексеева, только 85-90% боррелий, обнаруживаемых в клещах, являются патогенными для человека (Алексеев А.Н., 2004, 2006). Следовательно, от 10 до 15% пациентов, пострадавших от укусов клещей, могут получать антибиотикопрофилактику необоснованно. Возможно, что недостатки применяемых методов лабораторной диагностики смогло бы устранить использование ПЦР с проведением генотипирования возбудителей.

С помощью ПЦР с праймерами на основе фрагмента гена 16S pРНК было проанализировано 108 клещей, собранных с растительности, 25 суспензий и 17 мазков, приготовленных из клещей, доставленных на исследование пациентами. В работу брали только те мазки и суспензии, в которых боррелии были обнаружены ранее с помощью прямой микроскопии. Специфичные фрагменты ДНК удалось получить из 6

(24,0%) суспензий и 6 мазков (35,3%). Низкий процент положительных ответов из образцов, заведомо содержавших боррелии, объясняется, прежде всего, тем, что ДНК в суспензиях, и особенно в мазках, подвергается разрушению в процессе подготовки к исследованиям (фиксация пламенем, окраска мазков, приготовление суспензий) и при последующем хранении. Для генотипирования использовали 2 фрагмента (длина 337 н.о.), полученных из суспензий клещей и 1 фрагмент, полученный из мазка. Один образец из суспензии клещей был полностью гомологичен B. garinii (гомология 100%), а уровень гомологии образца из мазка и B. afzelii НТ61 составил 99%. Еще один образец из суспензии клещей принадлежал к той же группе, в которую входят изоляты B. japonica и B. afzelii. Его установленная нуклеотидная последовательность оказалась сходной с последовательностями японских изолятов B. afzelii НТ61 (98% гомологии) и J1 (97%).

В 2003 г. с целью обнаружения ДНК боррелий в различных видах материала, полученного от пострадавших от укуса клещей людей, нами была применена ПЦР. ПЦР-анализ проводили с коммерческим набором «Хеликс» и собственными наборами реактивов на основе праймеров к генам 16S рРНК и флагеллина. Исследовали различные образцы биологического материала: кровь, мочу, напитавшихся имаго I. persulcatus, суспензии клещей, оставшиеся после постановки ИФА (табл. 12). ДНК боррелий обнаружена в 8,8% клещей I. persulcatus. При изучении 22 проб напитавшихся имаго клещей, ДНК возбудителя ИКБ была обнаружена в восьми из них. Зараженность напитавшихся клещей по данным ПЦР составила 36,4%. Этот результат важен, т.к. именно клещи с продолжительностью питания от 24 часов и больше являются наиболее опасными для человека в плане передачи ему боррелиозной инфекции. Была показана возможность использования ПЦР для детекции боррелий в напитавшихся, сухих клещах и фрагментах клещей, что не удается при использовании прямой микроскопии.

Таблица 12. Результаты исследования материала на наличие ДНК боррелий с помощью ПЦР

Исследовали также возможность параллельного проведения анализа на наличие антигена вируса КЭ и боррелий (ИФА и ПЦР). Нами показано, что в процессе приготовления суспензий клещей для ИФА и их хранении, происходит разрушение ДНК боррелий, поэтому ее выделение нужно проводить сразу после гомогенизации клеща, до исследования в ИФА. В ходе работы также было сделано заключение о том, что для повышения достоверности ПЦР необходимо исследовать сразу несколько клинических образцов материала от одного и того же больного (кровь и моча, СМЖ и кровь, синовиальная жидкость и кровь и т.д.).

С целью определения геновида боррелий, циркулирующих на территории Иркутской области и принимающих участие в развитии ИКБ у людей, в 2004-2005 гг. было проведено типирование 59 образцов сыворотки крови, взятых в разные сроки с момента укуса клеща (табл. 13).

Таблица 13. Результаты исследования в ПЦР сывороток крови людей

Проведенные исследования позволили установить, что в 11 пробах содержится ДНК B. garinii, в 2-х образцах генотипирована B. afzelii. В 7 пробах одновременно присутствовала ДНК B. garinii и B. afzelii.

6 проб крови были получены от пациентов, обратившихся за помощью в ранние сроки с момента укуса (от 3 до 8 дней). Клещи, покусавшие этих пациентов, не были исследованы. Во всех 6 пробах обнаружено присутствие B. garinii. Использование ПЦР в этих случаях позволило провести детекцию боррелий в крови в ранние сроки, назначить данным пациентам доксициклин с профилактической целью и предотвратить развитие заболевания.

Остальные образцы крови были взяты в поздние сроки с момента укуса (от 1 месяца до 2 лет). В 11 случаях с помощью ПЦР удалось провести контроль эффективности антибиотикопрофилактики и лечения ИКБ. ДНК боррелий в этих сыворотках не обнаружена. В других случаях использование ПЦР позволило провести дифференциальную экспресс-диагностику ИКБ и других трансмиссивных клещевых инфекций и исключить роль боррелий как возможных этиологических агентов данных заболеваний. Еще у одного больного было зафиксировано наличие микстинфекции (ИКБ и КР), одновременное заражение двумя возбудителями различных инфекций (B. garinii и риккетсии) вызвало у него крайне тяжелое течение заболевания с необходимостью лечения в отделении интенсивной терапии.

Таким образом, было показано, что ПЦР может широко использоваться для целей экспресс-диагностики ИКБ. Кроме того, ее внедрение в практику позволит устранить ряд недостатков, которыми обладает прямая микроскопия. Использование ПЦР дает возможность исследовать напитавшихся, сухих клещей, фрагменты клещей и обнаруживать боррелии в крови пациентов в ранние сроки с момента укуса. С помощью этого метода можно проводить определение возбудителя до геновида, диагностику микстформ инфекций, выявлять случаи повторных заражений, проводить контроль эффективности профилактики и терапии в отношении разных геновидов боррелий.

Использование ПЦР позволило получить достоверную информацию о генетической вариабельности возбудителей ИКБ, циркулирующих на территории Иркутской области. Результаты этих исследований подтвердили полученные ранее данные об обнаружении на территории Иркутской области двух геновидов боррелий - B. garinii и B. afzelii и получить доказательства участия этих геновидов в развитии ИКБ у больных в Прибайкалье. Учитывая широкое распространение B. garinii и B. afzelii на данной территории, при проведении лабораторной диагностики ИКБ целесообразным было бы использование диагностикумов на основе этих двух геновидов. Хотя для более корректного заключения о роли различных генотипов в развитии ИКБ в Иркутской области исследования в этом направлении должны быть продолжены.