Моноаминергические механизмы регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

14.00.16 - патологическая физиология

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Моноаминергические механизмы регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях

Минакова Мария Юрьевна

Томск - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ Дыгай Александр Михайлович

доктор медицинских наук Скурихин Евгений Германович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ Новицкий Вячеслав Викторович

доктор медицинских наук Алиев Олег Ибрагимович

доктор медицинских наук, профессор Кондакова Ирина Викторовна

Ведущая организация: НИИ физиологии СО РАМН (г. Новосибирск)

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Амосова Е.Н.

1. Общая характеристика работы

кроветворный цитостатический миелосупрессия

Актуальность проблемы. Изучение закономерностей функционирования системы крови в норме и при патологии является актуальной задачей современной экспериментальной гематологии и патофизиологии, решение которой создает предпосылки для разработки адекватных патогенетически обоснованных методов фармакологической профилактики и коррекции гемодепрессивных состояний различной этиологии [Moore M.A.S., Warren D., 1987; Dexter T.M., Heyworth C.M., 1994; Carde P., 1994; Drize N. et al., 1996; Хлусов И.А. и др., 1997; Prow D., Vadhan-Raj S. , 1998; Дыгай А.М. и др., 1999; Жданов В.В. и др., 2000; Воробьев А.И., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2007]. В последние годы получены принципиально новые данные, позволившие во многом расшифровать механизмы локальной регуляции кроветворения в условиях миелоингибирующих воздействий [Дыгай А.М. и др., 1992; Жданов В.В. др., 1998; Гольдберг Е.Д. и др., 2001, 2007; Удут Е.В. и др., 2008], что, в свою очередь, послужило основанием для создания ряда высокоэффективных гемостимуляторов на основе производных гликозаминогликанов и рекомбинантных форм цитокинов [Asano S., 1991; Ruef C., Coleman D.L., 1991; Abels R.I., 1992; Ganser A., Hattori K. et al., 1996; Жданов В.В. и др., 1997; Steward W.P. et al., 1998; Дыгай А.М. и др., 1999; Gabrivole J., 2000; Зак К.П., Грыцюк С.Н., 2001; Птушкин В.В., 2002; Egrie J.C. et al., 2003; Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Beutel G., Ganser A., 2007; Littlewood T.J., Collins G.P., 2007; Xu Y.J. et al., 2007]. Целесообразным подходом к созданию новых гемостимуляторов можно считать и поиск средств, обладающих способностью воздействовать на дистантные механизмы контроля процессов кроветворения. В частности, предложены и апробированы в клинике методы терапии цитостатических миелосупрессий с помощью лекарственных средств, модулирующих активность симпатического отдела вегетативной нервной системы (ВНС) [Гольдберг Е.Д. и др., 1997; Хлусов И.А. и др., 1997].

Между тем, накопленные к настоящему времени данные об участии нейромедиаторных систем в обеспечении гемопоэза указывают на то, что спектр нейрофармакологических средств, способных стимулировать процессы восстановления кроветворной ткани в условиях супрессирующих воздействий (в том числе при введении цитостатиков) гораздо шире [Chatelain C. et al., 1989; Yang M. et al., 1996; Maestroni G.J. et al., 1997; Tsao C.W. et al., 1997; Broome C.S., Miyan J.A., 2000; Devoino L. et al., 2001]. В пользу этого свидетельствует тот факт, что в паренхиме костного мозга помимо симпатических обнаружено наличие чувствительных, пуринергических и холинергических нервных окончаний [Yamazaki K., Alien T.D., 1990; Weihe E. et al., 1991; Tabarowski Z. et al, 1996; Artico M. et al., 2002; Lakshmi C. et al., 2005; Aquila H.L., 2006]. Прослежена секреция ими как адреналина и норадреналина, так и дофамина, тахикининов и ряда других высокоактивных биологических веществ [Maestroni G.L., 2000; Захаров Ю.М., 2004]. Установлено, что кроветворные клетки-предшественники различной степени зрелости, равно как и морфологически распознаваемые гемопоэтические и стромальные клетки, способны нести на плазматической мембране рецепторы к различным лигандам медиаторной природы (ацетилхолин, катехоламины, серотонин, субстанция Р, нейрокинины А и В, опиоиды и др.) [Morley A. et al., 1971; Bosing-Schneider R., Haug M., 1976; Brown J.E., Adamson J.W., 1977; Федоров Н.А., 1979; Van Furth R., 1980; Depelchin A., Letesson J.J., 1981; Hall N.R., 1981; Miles K. et al., 1984; Mladenovic J., Adamson J.W., 1984; Setchenska M.S. et al., 1986; Zahniser N.R. et al., 1989; Харкевич Д.Д., 1989; Broome C.S., Miyan J.A., 2000]. Показано наличие прямого (рецепторного) и опосредованного через клеточные элементы гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) регулирующего влияния нейромедиаторов на процессы пролиферации и дифференцировки коммитирированных прекурсоров гемопоэза [Mladenovic J., Adamson J.W., 1984; Setchenska M.S. et al., 1986; Maestroni G.L., Conti A., 1994; Захаров Ю.М., 2004; Yang M. et al., 2007]. Немаловажным обстоятельством выступает способность кроветворных клеток и клеточных элементов ГИМ не только синтезировать и секретировать нейротрансмиттеры, но и вовлекать их в ауторегуляцию [Marino F. et al., 1997, 1999]. Все эти и многие другие факты предполагают существование моноаминергического локального контроля процессов повреждения и регенерации кроветворной ткани в ответ на миелоингибирующие воздействия. Причем активность адренергических, дофаминергических и серотонергических механизмов в отношении различных клеточных популяций, скорее всего, носит специфический характер.

Согласно современным представлениям, для жизнедеятельности кроветворных клеток важнейшую роль играют гемопоэтические ростовые факторы и ингибиторы [DePace D.M., Weber R.H., 1974; Sieff CA. et al., 1987; Fibbe W.E. et al., 1989; Metcalf D., 1989; Dorshkind K., 1990; Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Carde P., 1994; Grassinger J. et al., 2006; Kertesz Z. et al., 2006]. Известна избирательная чувствительность стволовых мультипотентных клеток и более зрелых предшественников, включая морфологически распознаваемые, к определенным гемопоэтинам [Metcalf D., 1989; Heyworth C.M. et al., 1992; Karger A.G., 1993; Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Carde P., 1994; Cross MA. et al., 1997; Возианов А.Ф. и др., 1998; Чертков И.Л., Дризе Н.И., 1998]. На уровне отдела коммитированных предшественников ярко выражен синергизм действия ростовых факторов и для оптимального ответа крайне важно наличие комбинации «ранних» и «поздних» цитокинов [Sieff C.A., 1987; Ikebuchi K. et al., 1987; Rennick D. et al., 1989; Tanaka R. et al., 1992; Necas E. et al., 1993; Cross M.A. et al., 1997; Воробьев А.И, 2002; Grassinger J. et al., 2006]. Установлено, что в экстремальных условиях (иммобилизация, введение цитостатиков, невротические воздействия и др.) эритроидные и гранулоцитарные прекурсоры приобретают чувствительность к катехоламинам и адренотропным препаратам, на которые они способны отвечать и вне структур кроветворного микроокружения [Maestroni G.L. et al., 1997; Гольдберг Е.Д. и др., 1997, 2004]. В то же время ни в одном из известных нам экспериментов исследователи не рассматривают совместное влияние гемопоэтических факторов роста и лигандов адренергических, дофаминергических и серотонинергических рецепторов на предшественники кроветворения при патологических состояниях.

Другим аспектом рассматриваемой проблемы является вопрос о роли моноаминов центральной нервной системы (ЦНС) в регуляции гемопоэза. Существуют сведения о возможности эффекторного воздействия различных нейромедиаторных систем мозга (адренергическая, дофаминергическая, серотонинергическая, М-холинергическая, ГАМК-ергическая) на клеточность отдельных ростков кроветворения при невротических воздействиях [Гольдберг Е.Д. и др., 2002, 2004]. Активация центральных звеньев дофаминергической системы вызывает иммуностимуляцию, сопровождающуюся накоплением в костном мозге СD4⁺ Т-клеток, увеличением числа антителообразующих и розеткообразующих клеток в селезенке животных, отменой стресс-индуцированного угнетения иммунной реакции, а также усилением пролиферативного ответа Т-лимфоцитов к митогенам [Девойно Л.В., Ильюченок Р.Ю., 1993; Идова Г.В., 1994; Tsao C.W. et al., 1997; Идова Г.В. и др., 2001] . Однако представленные данные литературы не позволяют сформировать четкого представления о регуляторном влиянии моноаминов ЦНС на пул коммитированных клеток-предшественников гемопоэза, а также функции ГИМ в норме и при различных патологических состояниях (включая цитостатические гемодепрессии).

Принимая во внимание вышеизложенное, представляет несомненный интерес изучение роли центральных и периферических моноаминов в развитии миелосупрессии и последующей регенерации кроветворной ткани при цитостатических воздействиях, а также особенностей адренергического, дофаминергического и серотонинергического контроля процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических прекурсоров и функциональной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения. Исследование в данном контексте представляет не только теоретический, но и практический интерес, так как полученные результаты станут основой для разработки новых оригинальных методов коррекции гематологических нарушений при миелосупрессиях, вызванных введением противоопухолевых препаратов.

Цель исследования: изучить механизмы регуляторного влияния адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем на кроветворную ткань при цитостатических миелосупрессиях.

Задачи исследования:

1. Оценить участие адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем в развитии нарушений в системе крови в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила.

2. Исследовать особенности моноаминергической регуляции деления и созревания кроветворных клеток-предшественников при назначении цитостатиков.

3. Вскрыть специфические для адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем механизмы восстановления функциональной активности элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения при моделировании цитостатических миелосупрессий.

4. Оценить вклад моноаминергических систем в реализацию регуляторных эффектов гемопоэтинов (эритропоэтина, Г-КСФ) в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила.

5. Разработать патогенетически обоснованные методы коррекции нарушений в эритроидном и гранулоцитарном ростках кроветворения при цитостатических воздействиях, основанные на модуляции активности центральных и периферических моноаминергических структур.

Положения, выносимые на защиту:

1. При гипопластических состояниях, моделированных введением алкилирующего агента (циклофосфан) или фторпиримидинового антиметаболита (5-фторурацил) в 1/3 МПД, пролиферация и дифференцировка коммитированных кроветворных предшественников и функциональная активность клеточных элементов ГИМ, системы КСФ и эритропоэтина находятся под контролем адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем. При этом серотонинергическая система в большей степени ответственна за изменения со стороны эритрона, а адренергическая и дофаминергическая - в гранулоцитарном ростке кроветворения.

2. Основными причинами различных темпов и характера регенерации костномозговой ткани при назначении алкилирующего агента и фторпиримидинового антиметаболита выступают специфическая активность центральных адренергических, дофаминергических и серотонинергических структур и особенности их взаимодействия с гемопоэтическими прекурсорами и клетками ГИМ, а также избирательная чувствительность эритропоэтина и Г-КСФ к регуляторному влиянию моноаминов.

3. В условиях введения циклофосфана ингибирующее действие адренергической системы на гранулоцитарный и эритроидный ростки кроветворения опосредовано угнетением функциональной активности адгезирующих клеток ГИМ (образование ГО, продукция ЭПА) и снижением скорости деления грануломоноцитарных предшественников (связанное с Г-КСФ и периферическими адренергическими механизмами). Ускорение процессов регенерации кроветворной ткани адренергической системой при назначении 5-фторурацила обусловлено формированием ГО, продукцией ЭПА неадгезирующими клетками ГИМ и увеличением уровня КСА в сыворотке крови. При этом стимуляция пролиферативной активности прекурсоров гемопоэза обусловлена КСФ, эритропоэтином, б- и в-адренергическими структурами.

4. Дофаминергическая система углубляет нарушения структурно-функциональной организации преимущественно эритроидного компартмента кроветворения, вызванные алкилирующим агентом, что приводит к задержке регенерации эритропоэза и более выраженной ретикулоцитопении в периферической крови. При этом имеет место стимуляция Г-КСФ- и дофамин-зависимых механизмов контроля пролиферации грануломоноцитарных предшественников, препятствующая развитию нейтрофильной лейкопении.

5. При назначении 5-фторурацила дофаминергическая система, с одной стороны, увеличивает темпы регенерации эритрона (в силу роста уровня сывороточной ЭПА и эритропоэтин-зависимой активации пролиферации КОЕ-Э), с другой стороны, задерживает восстановление гранулоцитарного ростка кроветворения (за счет снижения продукции КСА адгезирующими клетками ГИМ).

6. При цитостатических воздействиях серотонинергическая система усугубляет развитие депрессии эритропоэза: в условиях введения алкилирующего агента это связано с угнетением формирования эритроидных ГО и функциональной активности эритроидных предшественников (опосредованной системой эритропоэтина) и падением уровня ЭПА в биологически активных средах, при назначении фторпиримидинового антиметаболита - с уменьшением секреции ЭПА клетками адгезирующей фракции ГИМ. Вместе с тем, при использовании 5-фторурацила серотонин ЦНС увеличивает скорость регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения путем усиления образования гранулоцитарных и смешанных ГО и стимуляции опосредованной системой КСФ деления и созревания грануломоноцитарных прекурсоров.

7. В условиях цитостатической миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана, истощение депо катехоламинов резерпином значительно увеличивает гранулоцитопоэзстимулирующую активность Г-КСФ за счет организации в костном мозге de novo гранулоцитарных и смешанных ГО. Нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином оказывает потенцирующее действие на эритропоэзстимулирующие эффекты эритропоэтина во многом благодаря восстановлению нарушенной антиметаболитом структурно-функциональной организации эритроидного компартмента кроветворения.

Научная новизна. В работе в сравнительном аспекте впервые изучена роль адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем в развитии миелосупрессии и регенерации кроветворной ткани на моделях цитостатических воздействий, вызванных алкилирующим агентом и антиметаболитом. Продемонстрировано, что регулирующие эффекты центральных моноаминергических систем осуществляются через адренергические, дофаминергические и серотонинергические структуры на коммитированных кроветворных предшественниках и клеточных элементах ГИМ, а также опосредовано - через системы эритропоэтина и КСФ.

Выявлено, что в условиях цитостатических воздействий чувствительность прекурсоров гемопоэза к прямому действию лигандов моноаминергической природы возрастает, однако в динамике развития гипопластического состояния прослеживается не только стимуляция деления и созревания КОЕ, но и ингибиция данных процессов. В культуре дофамин и серотонин оказывают супрессирующее влияние на опосредованную гемопоэтическими факторами роста пролиферативную активность кроветворных предшественников, в то же время адреномиметики повышают темпы роста КОЕ-ГМ (более при назначении циклофосфана) и угнетают выход КОЕ-Э в присутствии эритропоэтина.

In vitro показано, что N-ацетилнейраминовая кислота увеличивает способность подвергнутых прямому воздействию алкилирующего агента адгезирующих клеток ГИМ связывать обработанные изадрином или серотонином предшественники эритропоэза.

Истощение депо катехоламинов (резерпин) препятствует развитию депрессии костномозгового гранулоцитопоэза и ускоряет восстановление гемопоэтической ткани после назначения циклофосфана, что преимущественно связано с формированием de novo ГО в костном мозге и продукцией ЭПА адгезирующими нуклеарами. При этом возрастают сопряженные с Г-КСФ (период ингибиции) и адреноструктурами (период регенерации) деление и созревание грануломоноцитарных предшественников, а также эритропоэтин (период ингибиции) - и катехоламин (1-7-е сутки) - зависимая дифференцировка эритроидных клеток. Ингибиция симпатолитиком кроветворения в условиях введения антиметаболита вызвана, в первую очередь, нарушениями функций ГИМ (образования ГО и секреции ЭПА неадгезирующими миелокариоцитами) и снижением уровня сывороточного КСА, во вторую очередь, угнетением функциональной активности кроветворных предшественников: опосредованной гемопоэтинами и катехоламинами (период ингибиции) и в-адренергическими структурами, эритропоэтином (период регенерации).

Фармакологическая блокада постсинаптических дофаминовых Д2 рецепторов (галоперидол) усугубляет гипоплазию гранулоцитопоэза в условиях введения алкилирующего агента, что обусловлено разрушением ГО гранулоцитарного и эритро-гранулоцитарного типов и сокращением пула пролиферирующих КОЕ-ГМ. В противоположность этому, галоперидол, повышая функциональную активность адгезирующих клеток, уровень ЭПА в сыворотке крови и интенсивность дифференцировки КОЕ-Э, увеличивает скорость регенерации эритропоэза. При назначении антиметаболита в основе стимуляции галоперидолом гранулоцитопоэза лежит возрастание секреции КСА адгезирующими клетками ГИМ и высокая пролиферативная активность предшественников грануломоноцитопоэза, опосредованная периферическими дофаминергическими механизмами и Г-КСФ, при этом ингибиция эритрона сопряжена с угнетением деления и созревания эритроидных клеток, опосредованных эритропоэтином и дофаминергическими структурами.

Нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином до введения циклофосфана увеличивает уровень ЭПА в сыворотке крови и кондиционных средах адгезирующих миелокариоцитов в период ингибиции и угнетает периферические серотониновые механизмы регуляции эритроидных предшественников в сроки восстановления кроветворной ткани, что соответствующим образом отражается на содержании морфологически распознаваемых эритроидных клеток в системе крови (увеличение их числа в период депрессии эритрона и снижение - в сроки регенерации). При назначении 5-фторурацила основным условием ускорения антисеротониновым препаратом регенерации гемопоэза (преимущественно эритроидного ростка кроветворения) выступают стимуляция формирования de novo эритроидных и гранулоцитарных ГО, а также серотониновых и цитокиновых механизмов контроля пролиферации грануломоноцитарных предшественников.

Впервые продемонстрировано, что в условиях введения циклофосфана уменьшение депо катехоламинов потенцирует гранулоцитопоэзстимулирующий эффект Г-КСФ, а фармакологическая блокада постсинаптических серотониновых С2 рецепторов усиливает эритропоэзстимулирующее действие эритропоэтина при применении 5-фторурацила, что связано с опережающим восстановлением структурно-функциональной организации костного мозга (формирование ГО).

В условиях оптимальной жизнедеятельности организма (интактные животные) in vitro установлена стимуляция дофамином роста колоний преимущественно грануломоноцитарного типа, серотонином - эритроидного типа.

Истощение in vivo депо катехоламинов приводит к уменьшению выхода КОЕ-ГМ под действием Г-КСФ, мезатона и изадрина, но стимулирует in vitro образование КОЕ-Э в культуре с эритропоэтином и адреномиметиками. Нарушение дофаминовой медиации в ЦНС избирательно уменьшает число гранулоцитарно-макрофагальных колоний (in vitro дофамин), фармакологическая блокада постсинаптических серотониновых С2 рецепторов мозга угнетает эритроидное колониеобразование (in vitro серотонин).

Практическое значение работы. Показана важная роль адренергической, дофаминергической и серотонинергической систем в развитии миелосупрессии и регенерации костномозговой ткани в условиях цитостатических воздействий, выявлены основы регуляторного влияния центральных моноаминергических структур на коммитированные кроветворные клетки-предшественники и гемопоэзиндуцирующее микроокружение. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание специфических моноаминергических механизмов контроля эритропоэза и гранулоцитопоэза при моделировании миелосупрессии введением цитостатиков с различным механизмом действия.

Результаты экспериментального исследования дают возможность определить патогенетически обоснованные методы фармакологической коррекции гипопластических состояний кроветворения с помощью лекарственных средств, модулирующих активность центральных и периферических моноаминергических структур.

Материалы по доклиническому исследованию препарата гранулоцитарного колонистимулирующего фактора нейтростима, разработанного НИИ фармакологии СО РАМН совместно с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск), были представлены в Фармакологический комитет МЗ и СР РФ, получено разрешение на его клиническое применение и производство (РУ № ЛСР - 010185/08).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на научных конференциях НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН: «Актуальные проблемы фармакологии и фармакотерапии» (Томск, 1996), конференции фармакологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 15-летию НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 1999), «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2001, 2002), «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004); на V, VI, VIII, VIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 1999, 2001, 2002), на конференции молодых ученых СО РАМН “Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины” (Новосибирск, 2000); на Международной научной конференции “Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности” (Томск, 2000); на XII международной конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2002); на конференции “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии” (Томск, 2002); на 4-ом съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); на XIX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); на конференции «Фармакологическая регуляция стволовой клетки» (Томск, 2005); на 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); на Республиканской научной конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); на конференции «Проблемы онкофармакологии» (Томск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 работ, из них 21 - в журналах, рекомендованных «Перечнем ...» ВАК Минобрнауки России.

Получены патент (RU) № 2317541 «Способ изучения гемопоэза с учетом особенностей высшей нервной деятельности» (опубл. 20.02.2008 г., Бюл. № 5) и решение о выдаче патента «Средство, препятствующее развитию депрессии эритроидного ростка кроветворения при цитостатических миелодепрессиях» (№ 2007137872/15(041423) от 12.09.2008 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 492 страницах машинописного текста, иллюстирована 39 рисунками, 147 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 650 источников, из них 222 отечественных и 428 зарубежных.

2. Материал и методы исследования

Эксперименты проведены на 4835 мышах-самцах линии СВА/CaLac в возрасте 2-2,5 месяцев, массой 18-20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда отдела экспериментальных биологических моделей НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Цитостатическую миелосупрессию моделировали однократным внутрибрюшинным введением алкилирующего агента циклофосфана («Биохимик», Саранск) либо фторпиримидинового антиметаболита 5-фторурацила (химфармобъединение «Дарница», Украина) в 1/3 максимально переносимой дозы (МПД), составившей по результатам пробит-анализа 83,3 и 76 мг/кг соответственно. За 30 минут до цитостатического воздействия животным опытных групп однократно внутрибрюшинно вводили симпатолитик резерпин (“Polfa”, Польша) в дозе 2 мг/кг, нейролептик галоперидол (“Gedeon Richter A.O.”, Венгрия) - 3 мг/кг, антисеротониновый препарат ципрогептадин (“Serwa”, Германия) - 30 мг/кг. На следующий день после введения цитостатиков 1 раз в сутки в течение 5 дней мышам подкожно вводили препарат негликозилированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека нейтростим (разработан НИИ фармакологии СО РАМН совместно с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск) в дозе 100 мкг/кг и препарат эритропоэтина эпоэтин-бета (рекормон, “Hoffman-La Roche Ltd.”, Швейцария) - 10 ЕД на мышь массой 20 г. Конечная концентрация альфа-адреномиметика мезатона (Опытный завод ГНЦЛС, Харьков, Украина), бета-адреномиметика изадрина («Sigma», США); серотонина («Sigma», США) и дофамина («Sigma», США) в полной культуральной среде составляла 10^-8 М; Г-КСФ и рекормона - 10^-8 М, 10^-9 М.

Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем (0,2 мл) физиологического раствора. Фоновые показатели получали при использовании интактных животных. Мышей забивали на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12-е сутки после введения цитостатиков методом дислокации шейных позвонков.

Показатели периферической крови и костномозгового кроветворения определяли общепринятыми методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Содержание коммитированных клеток-предшественников эритропоэза (КОЕ-Э, КлОЕ-Э) и грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ, КлОЕ-ГМ) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования миелокариоцитов в полувязкой культуральной среде. Интенсивность созревания эритроидных и гранулоцито-макрофагальных прекурсоров определяли по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Исследование пролиферативной активности предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза производили с помощью метода “клеточного самоубийства” с использованием гидроксимочевины. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного состава. Эритропоэтическую (ЭПА) и колониестимулирующую (КСА) активности тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. ЭПА и КСА выражали количеством выросших эритроидных и гранулоцито-макрофагальных колоний (на 10⁵ миелокариоцитов) [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараматрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни [Урбах В.Ю., 1975; Гублер Е.В., 1978]. Для оценки степени связи между признаками использовался двумерный корреляционный анализ. Влияние цитостатического воздействия либо препаратов (факторов) на изменения признака исследовали с помощью факторного анализа по критерию Фишера [Лакин Г.Ф., 1990; Мендрина Г.И. и др., 2004] и линейного пошагового дискриминантного анализа Фишера [Seredenin S.B. et al., 1986; Мендрина Г.И. и др., 2004]. В работе использовался также интегральный показатель, характеризующий изменение показателей системы крови в определенный интервал времени [Новицкий В.В. и др., 1990; Гольдберг Е.Д. и др., 1997].

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе исследования изучались регенераторные возможности кроветворной ткани экспериментальных животных при назначении цитостатиков в 1/3 МПД.

Однократное введение циклофосфана вызывало выраженное угнетение гемопоэза. Так, под влиянием алкилирующего агента отмечалось резкое уменьшение общего количества кариоцитов (ОКК) на 1-5-е сутки опыта с последующей нормализацией клеточности костного мозга (6, 7-е сутки). Динамика содержания незрелых и зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов, лимфоидных и эритроидных элементов в целом соответствовала изменениям ОКК. Вместе с тем, интенсивность восстановления числа нейтрофилов в кроветворной ткани значительно опережала таковую лимфоцитов и эритрокариоцитов. Миелосупрессия, вызванная введением алкилирующего агента, сопровождалась соответствующими изменениями в динамике содержания клеточных элементов изучаемых ростков в периферической крови. В частности, уже на 1-е сутки имело место статистически достоверное снижение количества палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов. Рост уровня палочкоядерных нейтрофилов регистрировался на 4-7-е сутки наблюдения, сегментоядерных нейтрофилов - на 6, 7-е сутки, причем на 4,5-е сутки опыта содержание молодых форм нейтрофильных гранулоцитов статистически достоверно превосходило исходные значения. На 1-5-е сутки после введения циклофосфана обнаруживалось развитие выраженной ретикулоцитопении в периферической крови, однако к 6-м суткам выявлялась тенденция к возрастанию числа незрелых эритроидных клеток, а на 7-е сутки их содержание не отличалось от уровня интактного контроля.

Для животных, получавших 5-фторурацил, была характерна более выраженная ингибиция костномозгового кроветворения, чем в случае назначения ЦФ. Так, статистически достоверное снижение числа незрелых и зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов регистрировалось на 1-7-е сутки опыта. При этом наименьшее содержание указанных форм миелокариоцитов было выявлено на 2, 3, 4-е сутки исследования. Вслед за периодом депрессии имело место накопление клеток системы мононуклеарных фагоцитов и нейтрофильных гранулоцитов (8-12-е сутки). Увеличение числа лимфоидных элементов в кроветворной ткани на 8, 9, 10-е сутки опыта сменялось новым снижением их количества на 11, 12-е сутки. В отличие от белой крови, угнетение эритропоэза наблюдалось на протяжении всего периода исследования. Отражением состояния костномозгового кроветворения при введении антиметаболита являлась картина периферической крови. Так, уменьшение содержания палочкоядерных (1-5, 7, 9-10-е сутки) и сегментоядерных (1, 3-8-е сутки) нейтрофилов, лимфоцитов (1-4, 8-10-е сутки) и моноцитов (1-4-е сутки) в периферической крови приводило к развитию выраженной лейкопении (1-5, 6-10-е сутки). Интенсивное увеличение клеточности белой крови отмечалось на 11, 12-е сутки эксперимента. Вслед за ретикулоцитопенией (1-7-е сутки) и восстановлением содержания незрелых эритроидных клеток (8-10-е сутки) имело место падение числа ретикулоцитов (11-е сутки), которое вновь возрастало к окончанию исследования (12-е сутки).

Таким образом, однократное введение цитостатиков в 1/3 МПД вызывает развитие гипоплазии костного мозга, лейкопению и ретикулоцитопению в периферической крови у мышей линии CBA/CaLac. Нарушения в гемопоэтической ткани при инъекции 5-фторурацила более глубокие и продолжительные, чем в случае использования циклофосфана. Обращает на себя внимание различная чувствительность ростков кроветворения к действию цитостатических агентов. В частности, темпы регенерации эритропоэза в значительной степени уступают интенсивности восстановления клеточности гранулоцитарного ростка кроветворения (табл. 1).

Таблица 1. Сроки ингибиции и регенерации костномозгового гемопоэза мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях

При гипопластических состояниях (облучение, гипоксия, введение цитостатиков) глубина поражения и интенсивность процессов регенерации кроветворной ткани во многом определяется функциональной активностью коммитированных прекурсоров гемопоэза [Гольдберг Е.Д. и др., 1991, 2001, 2002, 2006, 2007]. С использованием культуральных методов проведено изучение воздействия in vitro б-адреномиметика мезатона, в-адреномиметика изадрина, дофамина и серотонина на темпы деления и созревания эритроидных и грануломоноцитарных предшественников мышей линии CBA/CaLac в условиях оптимальной жизнедеятельности и введения цитостатических препаратов в сравнении с препаратами эритропоэтина и гранулоцитарного КСФ.

Установлено, что периферические катехоламины и серотонин, наряду с эритропоэтином и гранулоцитарным КСФ, оказывают стимулирующее действие на формирование колоний эритроидного и гранулоцитарно-макрофагального типов в культуре неадгезирующих миелокариоцитов интактных животных. При этом в рассматриваемой модели кроветворения степень индукции роста КОЕ гемопоэтическими факторами роста в концентрации близкой к физиологической (10^-8 М) существенно превосходит таковую в тест-системах с адреномиметиками, дофамином либо серотонином.

В условиях введения циклофосфана эритропоэтин и лиганды, действующие в области моноаминергических рецепторов, неоднозначно влияли на функциональную активность эритроидных предшественников in vitro. Так, добавление в культуру неадгезирующих миелокариоцитов ЭП (10^-9 М) (контрольная группа) вызывало усиление образования КОЕ-Э на протяжении всего периода наблюдения. Рост эритроидных колоний в метилцеллюлозной среде с препаратами аминов регистрировался менее продолжительно (1, 3, 5-е сутки). В экспериментах с оксимочевиной было обнаружено, что при стимуляции в-адренергических структур интенсивность входа КОЕ-Э в S-фазу клеточного цикла в значительной степени превышала таковую в тест-системе с ЭП. В то же время в группах с мезатоном, дофамином и серотонином значение показателя было ниже, чем в контроле с эритропоэтином. Между тем, скорость созревания эритроидных клеток под влиянием лигандов моноаминергической природы в разы превосходила темпы дифференцировки в случае внесения в метилцеллюлозную среду ЭП. При этом изадрин и мезатон оказывали более выраженное стимулирующее воздействие на указанный процесс по сравнению с серотонином и дофамином.

В условиях назначения 5-фторурацила препарат эритропоэтина in vitro статистически достоверно увеличивал митотическую активность прекурсоров эритропоэза (5, 7-е сутки). Существенное эритропоэзстимулирующее действие оказывал и изадрин. Интересно отметить, что на 1-е сутки функциональная активность прекурсоров эритропоэза в группе с в-адреномиметиком превосходила таковую в контроле с ЭП. Дофамин статистически достоверно увеличивал число митотически активных КОЕ-Э на 1-е сутки, но уже к 5-м суткам величина показателя составила 33 % от исходной. В этой группе индекс созревания эритроидных клеток угнетался на протяжении всего периода исследования. Продолжительная ингибиция деления и дифференцировки предшественников эритропоэза была обнаружена в тест-системах с мезатоном и серотонином (3, 5, 7-е сутки).

Несколько иные закономерности были выявлены при изучении прямого действия Г-КСФ и моноаминергических лигандов на пул грануломоноцитарных предшественников в условиях цитостатической миелосупрессии. Так, при введении алкилирующего агента физиологически активные вещества (за исключением дофамина) способствовали усилению формирования КОЕ-ГМ. В группах с цитокином и в-адреномиметиком после ингибиции деления на 1-е сутки отмечалось значительное расширение пула находящихся в S-фазе клеточного цикла грануломоноцитарных предшественников. Серотонин, изадрин и дофамин также увеличивали пролиферативную активность клеток гранулоцитарного ряда, причем величина показателя значительно превосходила таковую в контроле с Г-КСФ. Скорость созревания грануломоноцитарных прекурсоров при внесении в культуру изадрина, дофамина и серотонина также возрастала. В то же время в тест-системе с мезатоном величина соотношения КлОЕ-ГМ/КОЕ-ГМ оказалась ниже исходного уровня на протяжении всего периода наблюдения. В группе с Г-КСФ падение индекса дифференцировки на 1-е сутки опыта сменялось его увеличением на 3, 5, 7-е сутки.

В условиях назначения фторпиримидинового антиметаболита характер сдвигов изучаемых процессов в отделе прекурсоров грануломоноцитопоэза был отличен от обнаруженного при использовании циклофосфана. Так, формирование КОЕ-ГМ под влиянием Г-КСФ, изадрина и серотонина регистрировалось на 7-е сутки, а дофамина - на 5, 7-е сутки наблюдения. В этих условиях темпы деления предшественников грануломоноцитопоэза также возрастали, причем наиболее выражено при стимуляции дофаминовых структур. В контроле с цитокином индекс дифференцировки грануломоноцитарных клеток изменялся волнообразно: увеличение показателя на 3, 7-е сутки и снижение на 5-е сутки эксперимента. Стимуляция in vitro в-адренергических (7-е сутки), дофаминергических (3, 5-е сутки) и серотонинергических (3-и сутки) структур вызывала существенное возрастание индекса созревания. Отдельно в ряду исследуемых физиологически активных веществ стоял мезатон, так как его внесение в тест-систему угнетало функциональную активность гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров на протяжении всего периода исследования.

Таким образом, в культуре неприлипающих клеток костного мозга мышей линии CBA/CaLac, перенесших цитостатическое воздействие, мезатон, изадрин, дофамин и серотонин наряду с гемопоэтическими факторами роста оказывают влияние на интенсивность образования КОЕ, а также темпы деления и скорость созревания прекурсоров гемопоэза. Из этого следует, что периферические моноамины являются неотъемлемой частью системы локальной регуляции коммитированных кроветворных предшественников.

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что в динамике развития цитостатической болезни уровень ответа кроветворных клеток при внесении в тест-систему физиологически активных веществ моноаминергической природы или Г-КСФ и ЭП меняется не только количественно, но и качественно. В этой связи, далее нами был рассмотрен вопрос об избирательной чувствительности процессов деления и созревания прекурсоров гемопоэза к тому или иному стимулу в динамике развития цитостатической болезни. При этом в качестве дополнительных методов обработки результатов использовались интегральный показатель (ИП) и методы многомерной статистики (факторный, дискриминантный и кластерный анализы), что, в конечном итоге, позволило дополнить изучаемые процессы новыми характеристиками.

При цитостатических миелосупрессиях ИП_SКОЕ-ГМ в группах с Г-КСФ, дофамином, изадрином и серотонином существенно превосходил интегральный показатель в соответствующих контрольных группах. Однако детальный анализ результатов культуральных исследований методами многомерной статистики позволил установить, что характер стимуляции пролиферации КОЕ-ГМ лигандами был различен. Так, использование метода К-средних позволило обнаружить, что препараты формировали 3 кластера. В первый вошли цитокин и дофамин, длительно поддерживающие высокий темп деления гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (3-7-е сутки). Второй образовали изадрин и серотонин, способствующие кратковременному усилению роста митотической активности КОЕ-ГМ (3-и сутки). Отдельно в ряду исследуемых физиологически активных веществ стоял мезатон (кластер № 3), так как стимуляция б-адренергических структур in vitro приводила к падению числа КОЕ-ГМ в S-фазе клеточного цикла. Результаты факторного анализа позволили говорить о межмодельных различиях в действии колониестимулирующего фактора и моноаминергических лигандов, так как в случае ЦФ наибольший вклад в структуру первой компоненты вносил дофамин (k=0,901) (дофамин > мезатон > Г-КСФ, при этом не следует забывать об ингибирующем действии б-адреномиметика), а в условиях введения 5-ФУ - изадрин (k=0,955) (изадрин > Г-КСФ > серотонин > дофамин).

Ингибиция гранулоцитопоэза, вызванная ЦФ, сопровождалась избирательным увеличением дифференцировки в группах с Г-КСФ (ИП_ИД-ГМ^{3-и сутки}=350 %) и изадрином (ИП_ИД-ГМ^{3-и сутки}=150 %). В период миелосупрессии, вызванной введением 5-ФУ, отмечалась последовательная смена чувствительности созревания гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров к регуляторному влиянию физиологически активных веществ: при стимуляции серотонинергических структур показатель возрастал на 1-е сутки (ИП_ИД-ГМ=200 %), в тест-системе с дофамином - на 3-5-е сутки (ИП_ИД-ГМ=183 %), под влиянием цитокина - на 5-е сутки (ИП_ИД-ГМ=200 %). В сроки регенерации ростка при назначении алкилирующего агента практически все исследуемые препараты (исключение составил мезатон) увеличивали ИП. Как показал дискриминантный анализ, по выраженности эффекта лиганды расположились в следующем порядке: дофамин > изадрин > Г-КСФ > серотонин. В случае антиметаболита ИП_ИД-ГМ^{7-е сутки} в группе с серотонином составил 200 %, а при стимуляции в-адренергических структур - 266 %. Показательно то обстоятельство, что в обеих моделях миелосупрессии на фоне снижения ИП_ИД-ГМ^{1-7-е сутки} при применении мезатона in vitro значения факторных нагрузок достаточно высоки (2 фактор). Вполне вероятно, что снижение скорости созревания прекурсоров грануломоноцитопоэза имеет ведущее значение в патогенезе нейтрофильной лейкопении (в силу усугубления катехоламинами токсического действия цитостатиков на кроветворные предшественники - б-адренергический механизм).

Как уже подчеркивалось выше, при цитостатических воздействиях изадрин, эритропоэтин и дофамин способны поддерживать высокие темпы деления эритроидных прекурсоров (ИП_{изадрин} > ИП_ЭП > ИП_{дофамин}). Однако по типу действия только препарат эритропоэтина и в-адреномиметик следует отнести к одной группе, так как внесение в тест-систему дофамина в конце исследования угнетало процесс. Различный характер стимуляции лигандами подтверждался методом К-средних: изадрин и ЭП входят в состав одного кластера. Метод главных компонент позволил установить, что в условиях введения алкилирующего агента пролиферация предшественников эритропоэза более изменчива при в-адренергической стимуляции, о чем свидетельствует превосходство факторных нагрузок в опыте с изадрином (2 фактор; k=0,952) над выявленными в контроле с эритропоэтином (2 фактор; k=0,828). Подобная картина была обнаружена при назначении фторпиримидинового антиметаболита. Итак, прямое воздействие на в-адренергические структуры приводит к большей стимуляции деления эритроидных клеток, чем внесение ЭП.

Существенные межмодельные различия проявились в случае прямого действия мезатона и серотонина. Указанные лиганды избирательно угнетали пролиферативную активность эритроидных прекурсоров при назначении 5-фторурацила и не влияли на ИП_SКОЕ-Э при введении циклофосфана.

В условиях гипоплазии, вызванной ЦФ, эритропоэтин и лиганды моноаминергической природы значительно увеличивали индекс созревания эритроидных клеток. По данным линейного пошагового дискриминантного анализа по эффективности действия стимуляторы расположились следующим образом: изадрин > мезатон > серотонин > дофамин > эритропоэтин. Причем адреномиметики и серотонин формируют кластер № 1, ЭП и дофамин вошли в состав кластера № 2. При назначении 5-ФУ стимуляция in vitro специфических б-адренергических, серотонинергических, дофаминергических и эритропоэтинчувствительных структур угнетала дифференцировку прекурсоров эритропоэза. Наиболее выраженная ингибиция наблюдалась при внесении в культуру дофамина и серотонина. При этом если значения факторных нагрузок для серотонина (1 фактор; k=0,984) и дофамина (1 фактор; k=0,929) были существенно высоки, то коэффициенты корреляции в группах с адреномиметиками и ЭП не прошли редукцию данных.

Итак, использование многомерного статистического анализа позволило установить, что реализация токсического действия цитостатиков на гемопоэтические прекурсоры во многом опосредована через периферические б-адренергические механизмы (табл. 2). При этом необходимо отметить способность серотонина и дофамина избирательно угнетать процессы в отделе предшественников эритропоэза (более выражено при введении фторпиримидинового антиметаболита).

Таблица 2. Лиганды, снижающие пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях

По-видимому, сокращение пула митотически активных КОЕ в сроки развития миелосупрессии является следствием усиления катехоламинами (б-адренергические и дофаминергические механизмы) и серотонином проапоптозного действия алкилирующего агента и антиметаболита. Это предположение подтверждается результатами ряда исследований, свидетельствующих об индукции и/или модуляции апоптоза гемопоэтических клеток серотонином [Betten A. et al., 2001; Yang M. et al., 2007] и катехоламинами [Cioca D.P., Watanabe N., Isobe M., 2000; Josefsson E. et al., 2000; Lang P.A. et al., 2005], в том числе дофамином [Sookhai S. et al., 1996; Barzilai A. et al., 2000; Colombo C. et al., 2003; Lakshmi C. et al., 2005]. Можно полагать, что Г-КСФ на 1-е сутки после введения циклофосфана обладает схожим механизмом действия.

В период регенерации “насыщение” гемопоэтической ткани зрелыми кроветворными клетками, вероятно, приводит к запуску аминергических механизмов, сдерживающих деление КОЕ. Следует заметить, что приведенная гипотеза не является абсолютной. Известно, что клетки костного мозга, имеющие фенотип Thy 1,2⁺, играют важную роль в контроле процессов репарации поврежденного цитостатиками (циклофосфан, 5-фторурацил, адриамицин) гемопоэза [Гольдберг Е.Д. и др., 1999, 2002]. Причем стимуляция T-клетками роста кроветворных прекурсоров, как прямая, так и опосредованная взаимодействием с адгезирующими элементами, зависит не столько от количества клеток микроокружения в костном мозге экспериментальных животных, сколько от их функционального состояния. По всей видимости, лиганды б-адренергической, дофаминергической и серотонинергической природы способны модулировать активность лимфоцитов при гипопластических состояниях, которые наряду с кроветворными предшественниками представлены в супернатантах неадгезирующей фракции миелокариоцитов. Исходя из этого, правильнее говорить не только о прямом, но и о непрямом - через ингибирующие факторы лимфоидных клеток, супрессирующем действии мезатона, дофамина и серотонина на гемопоэтические клетки. Веским подтверждением такового заключения служит обнаруженная рядом исследователей чувствительность лимфоцитов к катехоламинам [Bosing-Schneider R., Haug M., 1976; Федоров Н.А., 1979; Depelchin A., Letesson J.J., 1981; Miles K. et al., 1984; Харкевич Д.Д., 1989] и снижение их секреторной активности адреноблокаторами [Гольдберг Е.Д.и др., 1997].

Отдельно следует остановиться на группе лигандов, способных увеличивать темпы деления эритроидных (изадрин, эритропоэтин) и гранулоцитарно-макрофагальных (дофамин, изадрин, серотонин, Г-КСФ) предшественников (табл. 3).

Таблица 3. Лиганды, стимулирующие пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях

Феномен повышения чувствительности кроветворных клеток к физиологически активным веществам in vitro имеет место не только в сроки увеличения содержания морфологически распознаваемых нуклеаров в костном мозге и периферической крови, но и в период миелосупрессии. По-видимому, причину этого противоречия следует искать в нарушении функций клеточных элементов ГИМ, препятствующих реализации пролиферативно-дифференцировочного потенциала прекурсоров гемопоэза в рамках целостного организма. Кроме того, возможная супрессия цитостатиками периферической нейрональной секреции указанных аминов также способна задерживать репарацию кроветворной ткани.

В заключение этого раздела работы мы попытались объяснить разный тип реагирования (угнетение, стимуляция) прекурсоров на внесение в культуру препаратов аминов и ростовых факторов. Учитывая гетерогенность популяции коммитированных кроветворных предшественников [Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Воробьев А.И., 2002], следует говорить о клетках чувствительных и резистентных к цитостатикам. Существование последних дает возможность реализации программы восстановления кроветворной ткани при чрезвычайных воздействиях. Выявленное в ходе исследования преимущество стимулирующих эффектов физиологически активных веществ in vitro в случае назначения алкилирующего агента над таковыми в условиях введения антиметаболита, указывает на то, что токсичность противоопухолевых препаратов во многом регламентирует величину популяций чувствительных и резистентных прекурсоров эритроидного и грануломоноцитарного типа, и, как следствие, скорость регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения.

Следующий раздел работы был посвящен особенностям локальной регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях.

Введение алкилирующего агента снижало общее количество ГО в костном мозге на 1-5, 7-е сутки исследования, что было связано с нарушением процессов формирования клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом (1-7-е сутки) и стромальной клеткой (1-5-е сутки). Анализ цитограмм позволил выявить снижение числа ассоциаций эритроидного типа на протяжении всего периода исследования. Дефицит смешанных ГО в кроветворной ткани сохранялся менее продолжительно: к 7-м суткам их содержание практически нормализовалось. Наиболее быстро восстанавливалось содержание гранулоцитарных клеточных комплексов.