Моноаминергические механизмы регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях

Циклофосфан нарушал продукцию колониестимулирующей активности клетками кроветворного микроокружения на протяжении всего периода исследования. В то же время уровень сывороточной КСА возрастал на 1, 3, 7-е сутки наблюдения, однако только на 1-е сутки величина показателя в опыте статистически достоверно превосходила таковую в интактном контроле. Секреция эритропоэтической активности миелокариоцитами увеличивалась к 7-м суткам, тогда как изменения уровня ЭПА в сыворотке крови были незначительными.

Под влиянием фторпиримидинового антиметаболита отмечалось более выраженное, чем при ЦФ, угнетение процессов формирования ГО в костном мозге. Так, статистически достоверное уменьшение содержания клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом и стромальным элементом регистрировалось дважды: на 1-5-е и 8-10-е сутки опыта. На 6, 7-е и 12-е сутки исследования отмечалось увеличение абсолютного числа клеточных ассоциаций. Причем если в указанные сроки количество макрофагположительных комплексов нормализовалось, то интенсивность формирования фибробластоидных ГО существенно превосходила исходный уровень. Динамика содержания эритроидных, гранулоцитарных и эритро-гранулоцитарных гемопоэтических островков в целом повторяла таковую в случае с макрофаг- и фибробластсодержащими ассоциациями. Обращало на себя внимание то обстоятельство, что интенсивность восстановления структурно-функциональной организации гранулоцитарного компартмента кроветворения значительно опережала скорость образования эритроидных ГО.

После назначения 5-фторурацила отмечалось резкое увеличение секреции эритропоэтической активности адгезирующими (1, 3-и сутки) и неадгезирующими (1-е сутки) клетками кроветворного микроокружения. Продукция КСА миелокариоцитами в указанные сроки, напротив, нарушалась. Антиметаболит не влиял на уровень сывороточного ЭПА на протяжении всего периода исследования, но способствовал стимуляции гранулоцитарно-макрофагального колониеобразования гуморальными ростовыми факторами, полученными на 1-е сутки эксперимента.

Совокупность выявленных феноменов позволяет сделать вывод о том, что повреждение структурно-функциональной организации кроветворной ткани, нарушение продукции гемопоэтических факторов роста клеточными элементами ГИМ играют существенную роль в развитии депрессии костномозгового кроветворения, лейкопении и ретикулоцитопении в периферической крови мышей линии CBA/CaLac в условиях введения цитостатиков в 1/3 МПД. Более глубокая и продолжительная ингибиция гемопоэза у животных, получавших 5-фторурацил, обусловлена значительным токсическим действием антиметаболита на формирование ГО и секрецию КСА. Постцитостатическая регенерация эритрона и белой крови связана с восстановлением функций стромальных и макрофагальных элементов ГИМ (образование ГО).

Дальнейшие эксперименты позволили расширить представления о взаимодействии аминов и клеток микроокружения в регуляции прекурсоров гемопоэза. ЦФ in vitro (20 мкг/мл) существенно снижал способность прилипающих клеток кроветворного микроокружения связывать интактные и обработанные эритропоэтином (10^-9 М) эритроидные предшественники. Однако стимуляция в-адренергических и серотонинергических структур соответственно изадрином и серотонином (10^-8 М) на подвергнутых цитостатическому воздействию макрофагах препятствовала ингибиции эритроидного колониеобразования.

Известно, что при цитостатических воздействиях важная роль в регуляции гемопоэза принадлежит компонентам основного вещества соединительной ткани костного мозга (протеогликаны, гликозаминогликаны) [Дыгай А.М. и др., 1992; Гольдберг Е.Д. и др., 2007]. В связи с этим, нам представилось целесообразным изучить возможность восстановления подавленной цитостатиком функциональной активности адгезирующих клеток ГИМ N-ацетилнейраминовой кислотой, которая входит в состав гликозаминогликанов (ГАГ), в комбинации с лигандами моноаминергической природы.

Установлено, что в метилцеллюлозной среде N-ацетилнейраминовая кислота (50 мкг/мл) увеличивала способность подвергнутых прямому воздействию ЦФ (20 мкг/мл) прилипающих клеток ГИМ связывать обработанные изадрином или серотонином (10^-8 М) эритроидные предшественники, что косвенно подтверждает участие сиаловой кислоты в периферических в-адренергических и серотонинергических механизмах индукции пролиферации предшественников эритропоэза.

На основании данных литературы и результатов собственных экспериментальных исследований нами предложена схема участия периферических моноаминов и специфических рецепторов в регуляции кровообразования при цитостатических воздействиях (рис. 1). Периферические моноамины (нейрональной природы) оказывают стимулирующее влияние на резистентные к цитостатикам предшественники кроветворения как путем прямого воздействия на соответствующие плазматические рецепторы, так и опосредованно через клеточные элементы ГИМ. При этом ГАГ потенцируют действие цитокинов. В то же время следует учитывать, что стимулы моноаминергической природы (в основном б-адренергические, серотонинергические) способны инициировать апоптическую гибель прекурсоров гемопоэза, чувствительных к цитостатикам.

Далее нами изучалась роль центральных адренергических, дофаминергических и серотонинергических структур в регуляции кроветворения. На первом этапе исследовалось регуляторное влияние моноаминов ЦНС на систему крови в условиях оптимальной жизнедеятельности мышей линии CBA/CaLac. Введение резерпина, галоперидола либо ципрогептадина вносило некоторые изменения в состояние костномозговой ткани и периферической крови экспериментальных животных. Однако обнаруженные сдвиги в подавляющем большинстве случаев статистически достоверно не отличались от соответствующих значений в интактном контроле.

Приведенные факты в целом подтверждают существующую точку зрения о том, что ЦНС не играет решающей роли в образовании клеток эритрона и белой крови в условиях сбалансированного гемопоэза. В норме преимуществен локальный контроль кроветворения [Гольдберг Е.Д. и др., 1992, 1996, 1999, 2002]. Однако результаты собственных культуральных исследований позволяют внести некоторые коррективы в известное положение. Установлено, что введение резерпина снижало интенсивность роста КОЕ-ГМ и усиливало формирование КОЕ-Э в культуре неадгезирующих миелокариоцитов.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

При этом в случае внесения в тест-систему адреномиметиков выраженность изменений величин показателей была более значительной, чем в опыте с эритропоэтином in vitro. Обращало на себя внимание избирательное угнетение антисеротониновым препаратом периферических серотониновых механизмов контроля активности эритроидных предшественников, а нейролептиком - опосредованный дофаминергическими структурами рост КОЕ-ГМ. Как видно, в рассматриваемой модели кроветворения прослеживается тропность эритроидных клеток к регуляторному влиянию центрального серотонина, а гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров - к дофаминовым структурам мозга.

Изучение зависимости восстановления подавленного цитостатиками костномозгового кроветворения от метаболизма катехоламинов ЦНС позволило выявить, что в условиях введения циклофосфана резерпин препятствовал снижению числа нейтрофильных (3, 5-е сутки) гранулоцитов в костном мозге. При этом препарат не влиял на динамику содержания клеток СМФ на протяжении всего периода исследования и усугублял депрессию эритропоэза на 4-е сутки эксперимента. Следует отметить накопление лимфоцитов на 2, 3-и сутки опыта и падение величины показателя на 6-е сутки. Системное введение симпатолитика препятствовало развитию нейтрофильной лейкопении (2, 4-е сутки) и ретикулоцитопении (2-4-е сутки) в периферической крови. В противоположность этому, лимфопения на 4-е сутки исследования усугублялась.

При последовательном назначении резерпина и 5-фторурацила регистрировалось кратковременное (4-е сутки) увеличение числа нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов в гемопоэтической ткани. Однако в сроки активного восстановления гемопоэза симпатолитик уменьшал количество практически всех исследуемых морфологически распознаваемых миелокариоцитов: незрелых (8, 11-е сутки) и зрелых (11-е сутки) нейтрофилов, лимфоцитов (6, 9, 10-е сутки) и эритрокариоцитов (6, 9-11-е сутки). В периферической крови препарат уменьшал содержание сегментоядерных нейтрофилов (4, 11-е сутки), что приводило к усугублению нейтрофилопении на 4-е сутки эксперимента и отмене нейтрофилеза на 11-е сутки. Действие симпатолитика на периферическое звено лимфоидного ростка и эритрона было неоднозначно. Так, лимфопения на 1-е сутки и ретикулоцитопения на 1, 2, 6-е сутки в опыте были менее выражены, чем в цитостатическом контроле. С другой стороны, препарат усугублял лимфопению на 5, 8-11-е сутки и ретикулоцитопению на 8, 12-е сутки.

Итак, резерпин способствует восстановлению кроветворной ткани (преимущественно гранулоцитопоэза) при назначении циклофосфана и задерживает регенерацию гемопоэза в условиях введения 5-фторурацила (более эритроидного ростка кроветворения).

Учитывая используемую в работе дозу и механизм действия резерпина (преимущественное истощение депо норадреналина, дофамина и незначительно - серотонина в ЦНС), можно предположить, что катехоламины мозга усиливают токсическое действие алкилирующего агента на гемопоэтические клетки (табл. 4). В противоположность этому, при назначении антиметаболита норадреналин и дофамин способствуют стимуляции процессов репарации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения.

Таблица 4. Регуляторное влияние катехоламинов на систему крови мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях (по результатам анализа ИП)

Примечание. Здесь и в таблицах 6, 8 увеличение количества клеток эритроидного и гранулоцитарного ростка кроветворения +, снижение -, изменений нет 0.

Как было продемонстрировано ранее, лиганды моноаминергической природы выступают в качестве элементов системы локальной регуляции гемопоэтических прекурсоров при цитостатических воздействиях. В этой связи, мы рассмотрели возможность действия резерпина на кроветворные клетки через периферические адренергические и дофаминергические структуры, систему КСФ и эритропоэтин.

В условиях назначения циклофосфана симпатолитик значительно снижал темпы деления прекурсоров эритропоэза. По чувствительности к супрессирующему действию резерпина периферические рецепторные механизмы, контролирующие активность процесса, расположились следующим образом: эритропоэтинчувствительные^{3,7-е сутки} > адренергические^{3,7-е сутки} > дофаминовые^{3,5-е сутки}. При введении 5-фторурацила ЭП^{1,5,7-е сутки}, дофамин^{1,3-и сутки} и, в меньшей степени, б-адренергические^{1-е сутки} механизмы участвовали в реализации ингибирующего влияния симпатолитика на деление КОЕ-Э. На обеих моделях цитостатического воздействия резерпин угнетал (ЦФ > 5-ФУ) созревание эритроидных клеток в тест-системе с ЭП и изадрином (регенерация), а при назначении 5-фторурацила - дополнительно и в культуре с мезатоном (ингибиция).

Как это не парадоксально, но при цитостатических воздействиях фармакологическое истощение депо катехоламинов в ЦНС увеличивало интенсивность дифференцировки эритроидных клеток в группах с эритропоэтином, мезатоном и дофамином (преимущественно в период ингибиции), причем стимуляция процесса в случае с алкилирующим агентом превосходила таковую в условиях введения антиметаболита. В опыте с 5-ФУ регистрировался прирост ИП_SКОЕ-Э: в культуре с мезатоном^{5,7-е сутки} и изадрином^{3-и сутки}.

Симпатолитик неоднозначно влиял на периферические механизмы регуляции предшественников грануломоноцитопоэза при цитостатических воздействиях. Так, при назначении циклофосфана препарат оказывал преимущественно стимулирующее действие на пролиферацию (дофамин^{1-7-е сутки}, мезатон^{1-3-и сутки}, Г-КСФ^{1-3-и сутки}) и дифференцировку (мезатон^{1-7-е сутки}, дофамин^{5,7-е сутки}, Г-КСФ^{1-е сутки}) КОЕ-ГМ. В угнетении функциональной активности гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров оказались задействованы в-адренергические структуры и цитокин.

При применении 5-фторурацила резерпин снижал деление и созревание КОЕ-ГМ. В супрессирующем действии симпатолитика на прекурсоры участвовали дофаминергические структуры и Г-КСФ (весь период наблюдения) и адренергические механизмы (регенерация). Между тем, деструкция кроветворной ткани сопровождалась ростом темпов деления и созревания примитивных предшественников, сопряженных с адренергическими структурами.

Исходя из представленных выше данных, можно сделать заключение о том, что при цитостатических воздействиях катехоламины оказывают как ингибирующее, так и стимулирующее влияние (табл. 5). В частности, при развитии миелосупрессии, вызванной назначением фторпиримидинового антиметаболита, в сокращении пула митотически активных КОЕ-Э и КОЕ-ГМ задействованы исключительно адренергические структуры. В условиях введения алкилирующего агента развитие гипоплазии кроветворной ткани во многом связано с ингибицией б-адренергических, дофаминергических и Г-КСФ-опосредованных механизмов регуляции прекурсоров грануломоноцитарного типа.

Таблица 5. Периферические механизмы ингибирующего и стимулирующего влияния катехоламинов на пролиферацию кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях (по данным ИП)

Примечание. Здесь и табл. 7, 9 увеличение темпов пролиферации гемопоэтических прекурсоров +, снижение -, изменений нет 0.

Очевидно, что природа цитостатика во многом определяет характер взаимоотношения дистантных (катехоламины) и локальных (адренергические и дофаминергические структуры, ростовые факторы) механизмов, что, в свою очередь, регламентирует характер сдвигов в отделе прогениторных клеток крови.

Вместе с тем, ряд феноменов, обнаруженных в культуре, достаточно трудно интерпретировать: стимуляцию центральными катехоламинергическими структурами деления гемопоэтических прекурсоров в условиях развития миелосупрессии и задержку входа КОЕ в S-фазу фазу в период регенерации костного мозга. Безусловно, создаваемые in vitro модели кроветворения не в состоянии воссоздать достоверной картины кроветворения в организме. Объяснение выявленным противоречиям, вероятно, находится, в том, что в рассматриваемые сроки клеточные элементы ГИМ (но не нейромедиаторные системы) являются ведущими структурами, определяющими активность прогениторных клеток.

Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение действия резерпина на ГИМ. Показано, что в условиях назначения алкилирующего агента препарат способствовал восстановлению структурно-функциональной организации кроветворной ткани, о чем свидетельствовало увеличение количества макрофагпозитивных (1-5-е сутки), фибробластных (1-4-е сутки), гранулоцитарных (1-4-е сутки), эритроидных (1, 2, 4, 5-е сутки) и смешанных (1-5-е сутки) гемопоэтических островков в костном мозге. Симпатолитик отменял высокий уровень сывороточной КСА (1-е сутки). При этом регистрировалась стимуляция секреции ЭПА адгезирующими клетками костного мозга (5, 7-е сутки).

Истощение депо катехоламинов препятствовало восстановлению структурно-функциональной организации костного мозга при назначении 5-фторурацила, о чем свидетельствовало уменьшение числа ГО с центрально расположенным макрофагом (6-8, 12-е сутки) и стромальным элементом (6, 7, 12-е сутки), а также клеточных ассоциаций гранулоцитарного (6, 7, 12-е сутки), эритроидного (6, 8, 9, 12-е сутки) и эритро-гранулоцитарного (6, 7, 9, 10, 12-е сутки) типа. Резерпин снижал высокий уровень ЭПА в кондиционных средах неадгезирующих клеток ГИМ и КСА в сыворотке крови (1-е сутки). В то же время продукция ЭПА адгезирующими миелокариоцитами и способность сывороточных ростовых факторов стимулировать эритроидное колониеобразование возрастали.

Таким образом, при введении циклофосфана увеличение клеточности гранулоцитарного и эритроидного ростков под влиянием резерпина связано с формированием de novo гемопоэтических островков в костном мозге и продукцией факторов роста КОЕ-Э адгезирующими миелокариоцитами. По-видимому, на этой модели миелосупрессии катехоламины сдерживают активность стромальных элементов кроветворного микроокружения (макрофаги, фибробласты). При применении 5-фторурацила еще большее нарушение симпатолитиком процессов формирования ГО и падение уровня сывороточного КСА и ЭПА в кондиционных средах неадгезирующих клеток на фоне увеличения секреции ЭПА прилипающими миелокариоцитами и уровня ЭПА в крови свидетельствует об избирательной чувствительности элементов ГИМ к регуляторному влиянию центральных аминов. Очевидно, в этих условиях катехоламины оказывают стимулирующее действие на процессы образования ГО и продукцию гемопоэтических факторов роста неприлипающими клетками ГИМ, но угнетают секрецию стимулирующих эритропоэз цитокинов прилипающими миелокариоцитами.

При изучении влияния блокады постсинаптических дофаминовых Д2 рецепторов галоперидолом на подавленный цитостатиками гемопоэз было обнаружено, что в условиях введения циклофосфана препарат препятствовал снижению числа эритрокариоцитов (3, 4, 5-е сутки) и клеток моноцит-макрофагального ряда (3, 5, 6-е сутки) в костном мозге. Действие нейролептика на гранулоцитарный росток было не столь однозначно. Если в ранние сроки наблюдения количество зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов (1, 2, 3-и сутки) снижалось, то на 5, 6-е сутки эксперимента, напротив, регистрировалось увеличение их числа. В периферической крови галоперидол препятствовал развитию нейтрофилеза и ускорял выход ретикулоцитов из кроветворной ткани (6, 7-е сутки). Усугубление лимфопении на 1, 2-е сутки исследования сменялось на существенный прирост лимфоцитов на 7-е сутки.

В случае назначения 5-фторурацила системное введение нейролептика ускоряло восстановление гранулоцитопоэза и лимфопоэза, о чем свидетельствовало накопление в костном мозге нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов на 5-е сутки исследования, а не на 6-е сутки, как в контрольной группе (без галоперидола). К концу исследования (6, 7-е сутки) интенсивность регенерации указанных ростков кроветворения в опыте падала и значительно уступала таковой в цитостатическом контроле. Действие галоперидола на эритроидный росток было ингибирующим, что подтверждалось отменой роста числа эритрокариоцитов на 6-е сутки исследования. В периферической крови блокада постсинаптических Д2 рецепторов в ЦНС препятствовала развитию нейтрофильной лейкопении на 2, 7-е сутки и увеличивала содержание ретикулоцитов на 5-7-е сутки после введения антиметаболита. В противоположность этому, представительство лимфоцитов в опыте снижалось (6, 7-е сутки).

Итак, галоперидол в условиях введения циклофосфана уменьшает клеточность гранулоцитарного ростка кроветворения и увеличивает скорость регенерации эритрона, при назначении 5-фторурацила способствует восстановлению гранулоцитопоэза и усугубляет депрессию эритрона (табл. 6). Исходя из этого, вполне допустимо, что дофаминергические структуры тканей мозга препятствуют развитию ингибиции костномозгового гранулоцитопоэза и еще более снижают активность эритропоэза в условиях введения алкилирующего агента. В случае 5-фторурацила просматривается обратная закономерность.

Таблица 6. Регуляторное влияние дофаминергических структур ЦНС на систему крови мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях (по результатам анализа ИП)

Фармакологическая блокада постсинаптических дофаминергических Д2 рецепторов вызывала существенные изменения активности процессов в отделе кроветворных предшественников мышей линии CBA/CaLac, перенесших цитостатическое воздействие. Так, при введении ЦФ галоперидол снижал функциональную активность эритроидных предшественников в сроки развития миелосупрессии. В период регенерации кроветворной ткани пул митотически активных КОЕ-Э продолжал сокращаться, при этом скорость созревания эритроидных клеток, напротив, возрастала. В условиях введения 5-фторурацила нейролептик угнетал пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки прекурсоров, связанных с системой эритропоэтина, и оказывал модулирующее (нормализующее) влияние на процессы, ассоциированные с периферическими дофаминергическими структурами.

Нейролептик уменьшал темпы деления гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в сроки ингибиции гранулоцитопоэза и увеличивал их в период регенерации. При этом скорость созревания КОЕ-ГМ, сопряженная с системой КСФ, падала, а ассоциированная с дофамином - возрастала. При назначении 5-фторурацила нейролептик в целом задерживал цитокинзависимый рост темпов пролиферации и дифференцировки гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров, в опыте с дофамином стимуляция указанных процессов сменялась на умеренное снижение их активности.

Полученные данные позволяют утверждать, что при цитостатических воздействиях дофамин тканей мозга оказывает ингибирующее влияние на грануломоноцитарные клетки-предшественники (табл. 7). Причем если при назначении 5-фторурацила вход КОЕ-ГМ в S-фазу митотического цикла (миелосупрессия) затрудняет исключительно дофаминергическая стимуляция, то в случае введения циклофосфана в падении пролиферативной активности грануломоноцитарных прекурсоров (регенерация) задействованы структуры к дофамину и Г-КСФ.

Таблица 7. Периферические механизмы ингибирующего и стимулирующего влияния дофаминергической системы на пролиферацию кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях (по данным ИП)

Между тем, результатом взаимодействия дофаминергической системы с ЭП и системой КСФ может выступать увеличение темпов деления гемопоэтических прекурсоров (периферические дофаминергические структуры также не стали исключением). Подобное было обнаружено и при взаимодействии центральных катехоламинергических структур с гемопоэтическими факторами роста (эксперимент с резерпином): в случае назначения антиметаболита со стороны предшественников всех классов, при моделировании миелосупрессии алкилирующим агентом - КОЕ-Э. Во многом совпадают и сроки стимуляции деления катехоламинами в целом (эксперимент с резерпином) и дофамином в частности (эксперимент с галоперидолом). Сопоставление ИП_SКОЕ^{Резерпин} и ИП_SКОЕ^{Галоперидол} выявило, что глубина сдвигов показателя в случае введения симпатолитика и нейролептика различна. В этой связи возникает вопрос о вкладе норадреналина и дофамина тканей мозга в регуляцию гемопоэтинзависимого входа КОЕ в S-фазу митотического цикла. Анализ коэффициентов корреляции, прошедших редукцию данных (факторный анализ), позволил сделать следующие выводы. В условиях введения ЦФ выраженность эритропоэзстимулирующего эффекта дофамина превосходит активность адренергической системы в период развития миелосупрессии, но в сроки регенерации наблюдается обратное. При назначении 5-ФУ чувствительность системы КСФ к стимулирующему действию аминов расположилась следующим образом: дофамин > норадреналин. Со стороны пула эритроидных прекурсоров обнаруживается противоположная картина.

Введение нейролептика неоднозначно влияло на систему локальной регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях. Препарат практически восстанавливал структурно-функциональную организацию гемопоэтической ткани на 1, 2, 4, 6-е сутки после введения ЦФ, о чем свидетельствовал существенный прирост числа гемопоэтических островков всех типов в указанные сроки. Некоторое снижение содержания макрофагпозитивных, гранулоцитарных (3, 5-е сутки), эритроидных (1-е сутки) и смешанных (3-и сутки) клеточных ассоциаций не умаляло стимулирующий эффект препарата. Галоперидол увеличивал продукцию ЭПА прилипающими миелокариоцитами (7-е сутки) и выход КОЕ-Э в культуре интактных клеток костного мозга под влиянием сыворотки крови, полученной на 1, 3, 5-е сутки после введения цитостатика. Вместе с тем, уровни КСА в биологических средах опытных животных не отличались от таковых в цитостатическом контроле.

Блокада постсинаптических Д2 рецепторов вносила определенные изменения со стороны динамики содержания макрофагпозитивных, содержащих стромальную клетку, эритроидных, гранулоцитарных и эритро-гранулоцитарных клеточных ассоциаций в костном мозге при назначении 5-фторурацила: отмечались периоды как увеличения, так и уменьшения величин показателей. Однако в целом нарушения процессов формирования ГО сохранялись (преимущественно комплексов эритроидного и смешанного типа) и регистрировались в те же сроки, что и в цитостатическом контроле (1-6-е сутки). Причем к концу исследования - 7-е сутки, ситуация усугублялась по причине отмены галоперидолом восстановления до уровня интактного контроля числа гемопоэтических островков. В этих условиях высокий уровень ЭПА в супернатантах неадгезирующих миелокариоцитов и КСА в сыворотке крови снижался (1-е сутки). В противоположность этому, продукция факторов роста КОЕ-ГМ адгезирующими миелокариоцитами возрастала (7-е сутки).

Итак, галоперидол способствует восстановлению активности процессов формирования ГО, секреции ЭПА адгезирующими клетками ГИМ и уровня сывороточной эритропоэтической активности при введении циклофосфана. В противоположность этому, при использовании 5-фторурацила нейролептик углубляет нарушение функциональной активности клеточных элементов ГИМ и снижает концентрацию сывороточного КСА. Судя по всему, центральные дофаминергические структуры мозга усугубляют повреждающее действие алкилирующего агента на адгезирующие нуклеары ГИМ, но препятствуют развитию деструктивных изменений в кроветворной ткани мышей, получавших фторпиримидиновый антиметаболит.

Далее нами изучалась роль серотонинергических структур мозга в регуляции кроветворения при цитостатических воздействиях. Нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином не оказывало существенного влияния на динамику содержания гранулоцитов, клеток моноцит-макрофагального ряда и лимфоцитов в костном мозге животных в условиях введения ЦФ на протяжении всего периода исследования. Количество эритрокариоцитов возрастало на 5-е сутки опыта, но на 7-е сутки отмечалось усугубление депрессии эритропоэза. В периферической крови антисеротониновый препарат отменял нейтрофильную лейкопению на 6-е сутки эксперимента, но вызывал еще больший, чем в цитостатическом контроле, дефицит лимфоцитов (2, 4, 6-е сутки). В свою очередь, число ретикулоцитов увеличивалось на 3, 5-е сутки, но к концу наблюдения вновь снижалось (6, 7-е сутки).

При назначении 5-ФУ ципрогептадин ускорял процессы регенерации эритроидного ростка кроветворения, о чем свидетельствовало накопление эритрокариоцитов в костном мозге (4, 6, 7, 12-е сутки) и ретикулоцитов в периферической крови (2, 4, 5, 6, 7, 12-е сутки). В то же время антисеротониновый препарат усугублял депрессию костномозгового гранулоцитопоэза на 3, 5, 7-е сутки опыта, а лимфопоэза - на 5-е сутки. В периферической крови имело место усугубление нейтрофильной лейкопении (2, 4, 5, 7-е сутки) и лимфопении (3-7, 12-е сутки). Следует отметить, что на 4, 6-е сутки эксперимента содержание нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов в кроветворной ткани превосходило таковое в цитостатическом контроле.

Приведенные факты свидетельствуют о том, что при назначении циклофосфана ципрогептадин не оказывает существенного влияния на гранулоцитопоэз, при этом клеточность эритроидного ростка кроветворения в период миелосупрессии возрастает и падает в сроки регенерации. В условиях введения антиметаболита антисеротониновый препарат стимулирует эритропоэз, но снижает содержание нейтрофильных гранулоцитов в системе крови.

Учитывая механизм действия ципрогептадина, можно предположить, что серотонинергические структуры мозга способствуют развитию ингибиции костномозгового эритропоэза и ретикулоцитопении в периферической крови (более при назначении антиметаболита), но, вместе с тем, участвуют в процессах регенерации гранулоцитопоэза (преимущественно при введении 5-фторурацила) (табл. 8).

Таблица 8. Регуляторное влияние серотонинергических структур ЦНС на систему крови мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях (по результатам анализа ИП)

Ципрогептадин подавлял сопряженные с эритропоэтином деление и созревание предшественников эритропоэза при назначении циклофосфана и 5-фторурацила. После введения алкилирующего агента ингибиции подвергались и ассоциированные с серотонинергическими структурами пролиферация и дифференцировка эритроидных клеток.

Антисеротониновый препарат в целом угнетал ассоциированные с Г-КСФ деление и созревание гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников (5-фторурацил > циклофосфан). Изменения активности процессов, сопряженных с периферическим серотонином, отличались от выявленных в тест-системе с цитокином. Если при введении антиметаболита падение индекса созревания КОЕ-ГМ сопровождалось ростом их пролиферативной активности, то в случае назначения алкилирующего агента ингибиция деления (миелосупрессия) сменялась на увеличение функциональной активности прекурсоров грануломоноцитопоэза (регенерация).

Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что регуляторное влияние центральных серотонинергических структур на кроветворные клетки-предшественники осуществляется через эритропоэтин, систему КСФ и периферические серотонинергические структуры (табл. 9). Обращает на себя внимание, что в условиях назначения фторпиримидинового антиметаболита с ростовыми факторами связано преимущественно увеличение темпов деления кроветворных клеток. Причем анализ ИП_SКОЕ^{Резерпин}, ИП_SКОЕ^{Галоперидол} и ИП_SКОЕ^{Ципрогептадин} позволил установить, что гемостимулирующий эффект серотонина превосходит таковой у катехоламинов. В противоположность этому, серотонинергические механизмы участвуют в ингибиции пролиферации КОЕ-ГМ.

Таблица 9. Периферические механизмы ингибирующего и стимулирующего влияния серотониновой системы на пролиферацию кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях (по данным ИП)

Между тем, в условиях введения алкилирующего агента расширению пула митотически активных КОЕ в период миелосупрессии способствуют не только эритропоэтин и Г-КСФ, но и серотонин. По выраженности эритропоэтинзависимой стимуляции роста колоний центральные серотонинергические структуры уступают дофаминергическим, но превосходят адренергические. В последующем регенерация кроветворной ткани, высокие темпы деления эритроидных клеток поддерживаются исключительно серотонинергическими механизмами, в то время как вход КОЕ-ГМ в S-фазу клеточного цикла ингибируется (этому содействует Г-КСФ и серотонин).

Фармакологическая блокада центральных постсинаптических С2 рецепторов существенно изменяла активность клеточных элементов системы локальной регуляции кроветворения при цитостатической болезни. Так, при назначении алкилирующего агента ципрогептадин способствовал восстановлению активности процессов формирования гемопоэтических островков, о чем свидетельствовало увеличение числа макрофагпозитивных (4, 7-е сутки) и содержащих стромальную клетку (4, 5, 7-е сутки) клеточных комплексов в костном мозге. При этом возрастали темпы формирования гранулоцитарных и, в меньшей степени, эритроидных и смешанных ГО (4, 5, 7-е сутки). Одновременно повышался уровень ЭПА (1-е сутки) и КСА (7-е сутки) в сыворотке крови, а также продукция факторов роста КОЕ-Э адгезирующими нуклеарами ГИМ (1-7-е сутки).

В условиях введения 5-фторурацила ципрогептадин препятствовал разрушению структурно-функциональной организации гемопоэтической ткани на 2-4, 6, 7, 12-е сутки исследования. Наиболее существенно увеличивалось содержание макрофагположительных и эритроидных ГО. На 5-е сутки опыта возрастала продукция эритропоэтической активности адгезирующими нуклеарами. Вместе с тем, высокий уровень ЭПА в супернатантах адгезирующих (1, 3-и сутки) и неадгезирующих (1-е сутки) миелокариоцитов и сывороточных ростовых факторов (1-е сутки), наблюдаемый в цитостатическом контроле, отменялся.

Таким образом, нарушение серотониновой медиации в ЦНС ципрогептадином стимулирует восстановление структурно-функциональной организации при цитостатических воздействиях (в случае с 5-фторурацилом преимущественно эритроидных ГО). При этом антисеротониновый препарат снижает активность секреции факторов роста КОЕ-Э клетками ГИМ при назначении антиметаболита, но увеличивает концентрацию ЭПА в супернатантах адгезирующих миелокариоцитов и сыворотке крови в условиях введения алкилирующего агента.

Исходя из результатов собственных экспериментов и данных литературы, следует признать, что развитие цитостатической миелосупрессии связано не только с угнетением и дискоординацией процессов деления и созревания кроветворных клеток-предшественников. Не последнюю роль в этом играют длительно сохраняющиеся деструктивные изменения структурно-функциональной организации кроветворной ткани (нарушения межклеточных взаимодействий и продукции клетками ГИМ гемопоэтических ростовых факторов). В клинической практике препараты рекомбинантного человеческого эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора используют для профилактики и лечения различных видов анемий и нейтропений, восстановления гемопоэза у онкологических больных, подвергающихся цитостатической химиотерапии [Asano S., 1991; Abels R.I., 1992; Schmitz N. et al., 1995; Bennet C.L. et al., 1996; Волкова М.А., 1998; Гершанович М.Л. и др., 1999; Воробьев П.А., 2001; Птушкин В.В., 2002; Переводчикова Н.И., 2005; Littlewood T.J., Collins G.P., 2007]. Между тем, применение ЭП и Г-КСФ во многом ограничено вследствие наличия у них достаточно большого спектра побочных эффектов [Jain K.K., 1994; Vial T., Descotes J., 1995; de Wit R. et al., 1996; Alvarado Ibarra M.L. et al., 1999; Машковский М.Д., 2006; Beutel G., Ganser A., 2007; Tiggue C.C. et al., 2007; Бигильдеев А.Е. и др., 2008]. Обнаруженное нами увеличение темпов восстановления структурно-функциональной организации эритроидного компартмента при введении антисеротонинового препарата и формирование de novo содержащих гранулоциты ГО при назначении симпатолитика дает основание полагать, что восстановление нейрофармакологическими средствами функций адгезирующих клеточных элементов ГИМ будет существенно усиливать гемопоэзстимулирующий эффект Г-КСФ и эритропоэтина.

В связи с вышеизложенным, в следующем разделе представлены результаты изучения возможности стимулирующего действия Г-КСФ на подавленный цитостатиками гранулоцитарный росток кроветворения в условиях истощения депо катехоламинов и эффективность стимуляции эритрона эритропоэтином при снижении активности серотонинергической системы.

Прежде всего, была проведена оценка влияния курсового введения Г-КСФ на гранулоцитопоэз при цитостатических воздействиях. Цитокин ускорял процессы регенерации ростка при назначении циклофосфана, о чем свидетельствовало накопление незрелых (на 2, 3-и сутки) и зрелых (5-е сутки) форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. Существенный прирост сегментоядерных нейтрофилов наблюдался и в периферической крови на 2, 4, 5-е сутки эксперимента (вплоть до развития умеренного нейтрофильного лейкоцитоза на 4, 5-е сутки). Одновременно Г-КСФ увеличивал количество ГО, содержащих стромальную клетку, и гранулоцитарных клеточных комплексов (2, 3, 5-е сутки) (причем число последних уже на 3, 5-е сутки исследования восстанавливалось до уровня интактного контроля). В противоположность этому, содержание клеточных комплексов смешанного типа снижалось (4-7-е сутки).

В условиях введения 5-фторурацила Г-КСФ существенно усугублял депрессию гранулоцитопоэза (1-3, 6-е сутки), но начиная с 8-х суток наблюдалось резкое увеличение числа незрелых (10, 12-е сутки) и зрелых (8-12-е сутки) нейтрофилов в костном мозге. При этом снижалась активность восстановления числа макрофагнегативных (7, 9-е сутки), гранулоцитарных (7-е сутки) и эритро-гранулоцитарных (6, 7, 9-е сутки) ГО. В периферической крови цитокин не только отменял нейтрофильную лейкопению (1, 8, 10-е сутки), но и задерживал выход зрелых гранулоцитов из кроветворной ткани (3, 4-е сутки).

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что при цитостатических воздействиях гранулоцитопоэзстимулирующее действие Г-КСФ обусловлено преимущественно непосредственной активацией пролиферации и созревания предшественников гранулоцитопоэза. Между тем, при назначении циклофосфана цитокин способствует увеличения скорости восстановления гранулоцитарных клеточных ассоциаций.

В условиях назначения алкилирующего агента интенсивность восстановления клеточности гранулоцитарного ростка кроветворения при последовательном истощении депо катехоламинов и введении Г-КСФ значительно превосходила выявленную в группах с Г-КСФ и симпатолитиком. Так, уже на 3-и и 4-е сутки наблюдения содержание соответственно незрелых и зрелых нейтрофилов в костном мозге практически не отличалось от исходных величин, а на 6, 7-е сутки регистрировалась гиперплазия гранулоцитопоэза. Более активный выход сегментоядерных нейтрофилов в периферическую кровь при этом вызывал развитие выраженного лейкоцитоза на 4, 5, 7-е сутки. Последовательное введение симпатолитика и цитокина ускоряло восстановление структурно-функциональной организации гемопоэтической ткани, о чем свидетельствовало значительное увеличение числа макрофагнегативных (1-3, 7-е сутки) и гранулоцитарных (1-3, 5-7-е сутки) клеточных комплексов. При этом клетки гранулоцитарных гемопоэтических островков были представлены преимущественно морфологически распознаваемыми гранулоцитами (сегментоядерными нейтрофилами). В контрольных группах (резерпин, Г-КСФ) количество нуклеаров в клеточных ассоциациях существенно уступало таковому в опыте. Следует отметить, что при последовательном введении резерпина и цитокина формирование дополнительных очагов гранулоцитарного кроветворения предшествовало развитию костномозговой гиперплазии и нейтрофильного лейкоцитоза в периферической крови.

В свою очередь, при назначении антиметаболита последовательное истощение депо катехоламинов и введение Г-КСФ увеличивало содержание нейтрофилов в костном мозге только к 7-м суткам эксперимента, чему предшествовало усугубление миелосупрессии на 1-3-и сутки. Сдвиги в содержании ГО были выявлены на 8, 9-е сутки опыта: в указанные сроки имело место усиление образования клеточных комплексов. В этих условиях характер изменения содержания нейтрофилов в периферической крови полностью совпадал с таковым в группе с цитокином.

Таким образом, резерпин значительно снижает токсическое действие катехоламинов на структурно-функциональную организацию костного мозга (гемопоэтические островки) в условиях введения циклофосфана, что усиливает стимулирующее влияние Г-КСФ на процессы регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения. Вместе с тем, при назначении 5-фторурацила элемент синхронизации формирования ГО и стимуляции кроветворных клеток-предшественников (и как следствие - увеличение скорости репарации костного мозга) под влиянием симпатолитика и цитокина отсутствует, напротив, просматривается усугубление ситуации в период ингибиции ростка, гиперплазия гранулоцитопоэза, наблюдаемая в группе с цитокином в сроки регенерации, отменяется.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности избирательного использования для терапии цитостатических лейкопений наряду с препаратами Г-КСФ фармакологических агентов, снижающих ингибирующее действие катехоламинов.

Прежде чем изучить возможность потенцировать ципрогептадином стимулирующее влияние эритропоэтина был проведен сравнительный анализ эффектов гормона на эритрон в условиях введения цитостатиков с различным механизмом действия.

При назначении фторпиримидинового антиметаболита курсовое введение ЭП вызывало статистически достоверное увеличение числа эритроидных клеток в костном мозге (4, 6, 7, 12-е сутки). В периферической крови существенный прирост ретикулоцитов обнаруживался уже на 2-е сутки и продолжался на протяжении всего периода наблюдений. Примечательно, что на 6, 7, 12-е сутки опыта клеточность эритроидного ростка кроветворения нормализовалась.

Стимулирующий эффект гормона в условиях введения алкилирующего агента регистрировался только в период регенерации эритрона. Безусловно, возрастание числа эритроидных элементов в системе крови связано с активацией функциональной активности предшественников эритропоэза. Тем более, что in vitro высокая реактивность прекурсоров к действию эритропоэтина при цитостатических воздействиях сохраняется (смотри данные культуральных исследований). Веским подтверждением такого заключения служит тот факт, что при курсовом введении препарата эритропоэтина нарушения структурно-функциональной организации гемопоэтической ткани сохранялись на протяжении всего периода наблюдения.

При последовательной блокаде постсинаптических серотониновых С2 рецепторов и введении эритропоэтина в условиях применения 5-ФУ интенсивность восстановления клеточности эритроидного ростка значительно превосходила таковую в группах с эритропоэтином и ципрогептадином (3-12-е сутки). Так, уже на 4-е сутки наблюдения содержание эритроидных клеток в костном мозге практически не отличалось от исходных величин, а на 5-е сутки регистрировалась гиперплазия эритропоэза. При этом увеличение выхода ретикулоцитов в периферическую кровь приводило к развитию выраженного ретикулоцитоза на 6, 7-е сутки исследования.

При изучении локальных механизмов совместного применения ципрогептадина и эритропоэтина было обнаружено активное восстановление структурно-функциональной целостности костного мозга у мышей, получавших антиметаболит. Препараты способствовали накоплению числа макрофагпозитивных (2, 4-7-е сутки), эритроидных (2-7-е сутки) и, в меньшей степени, эритро-гранулоцитарных (2, 4, 6, 7, 12-е сутки) клеточных комплексов. Формирование дополнительных очагов эритроидного кроветворения предшествовало развитию гиперплазии костномозгового эритропоэза и ретикулоцитоза в крови. В дополнение следует отметить, что в опытной группе клетки эритроидных ГО были представлены средними и поздними полихроматофильными нормобластами, оксифильными нормобластами, а также ретикулоцитами. Интересно, что в контрольных группах количество нуклеаров в клеточных комплексах значительно уступало таковому в опыте, причем в группе с ципрогептадином отсутствовали ретикулоциты.

В условиях введения алкилирующего агента применение ципрогептадина и гормона не вызывало столь выраженного увеличения значений показателей, характеризующих костномозговой эритропоэз, как в случае антиметаболита. Исключение составили ретикулоциты периферической крови, восстановление содержания которых в опыте отмечалось гораздо раньше (4-6 сутки), чем в контрольных группах с ЭП (6-е сутки) и антисеротониновым препаратом (7-е сутки).

Таким образом, нарушение серотониновой медиации в ЦНС до моделирования цитостатической миелосупрессии 5-фторурацилом и последующее введение эритропоэтина отменяют депрессию костномозгового эритропоэза и способствуют интенсивному восстановлению содержания ретикулоцитов в периферической крови, вплоть до развития ретикулоцитоза. При этом скорость регенерации подавленного антиметаболитом эритропоэза в опыте (комбинация ципрогептадина с эритропоэтином) превосходит темпы его восстановления в контрольных группах с гормоном и ципрогептадином. При назначении циклофосфана препараты стимулируют только дифференцировку и выход зрелых эритроидных клеток в периферическую кровь.

Судя по полученным данным, в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита серотонин ЦНС оказывает “деструктивное” действие на гемопоэтические островки. В предыдущих исследованиях нами было продемонстрировано супрессирующее влияние серотонина in vitro на митотическую активность эритроидных предшественников животных при назначении 5-ФУ. С этих позиций мы пришли к заключению, что, вероятно, существует «серотониновый» механизм развития анемии при некоторых цитостатических воздействиях (в частности, при использовании антиметаболитов). Его реализация осуществляется на уровне коммитированных кроветворных предшественников и клеток ГИМ (формирование ГО). В этой связи представляется целесообразным использование в терапии цитостатических анемий препаратов, снижающих активность серотонинергической системы.

Результаты последней серии экспериментов дают основание считать, что в реализации эффектов ЭП и Г-КСФ при гипоплазии, вызванной введением цитостатиков, во многом задействованы центральные моноаминергические структуры. Между тем, не исключается возможность модуляции эффектов ростовых факторов на уровне локальной моноаминергической системы. Так, проведенные культуральные исследования позволили выявить, что ряд лигандов моноаминергической природы (мезатон, изадрин, дофамин, серотонин) сдерживали опосредованную эритропоэтином пролиферативную активность КОЕ-Э в культуре неадгезирующих клеток костного мозга мышей при назначении циклофосфана. Внесение моноаминов в 7-суточную культуру вызывало несколько иные сдвиги в активности Г-КСФ: серотонин и дофамин отменяли высокие темпы деления и скорость дифференцировки КОЕ-ГМ, под влиянием адреномиметиков (более изадрина) активность указанных процессов, напротив, возрастала.

При моделировании миелосупрессии введением 5-фторурацила моноаминергические лиганды in vitro отменяли ассоциированное с ростовыми факторами расширение пула митотически активных кроветворных прекурсоров. Исключение составил изадрин, который потенцировал стимулирующий эффект Г-КСФ. Адреномиметики и серотонин препятствовали увеличению величины соотношения КлОЕ/КОЕ, наблюдаемому в контроле с гормоном и цитокином. Аналогичное действие оказывал и дофамин в отношении дифференцировки клеток гранулоцитарного ряда, при этом индекс созревания прекурсоров эритропоэза, напротив, возрастал.

Таким образом, эффекторные аминергические молекулы выступают в качестве модуляторов активности эритропоэтина и Г-КСФ. При этом характер действия моноаминов зависит от типа кроветворных прогениторных клеток и механизма токсического действия цитостатика. Вполне вероятно, что реализация программы линейного коммитирования кроветворных предшественников при цитостатических воздействиях невозможна без взаимодействия системы локальной аминергической регуляции гемопоэтических клеток и ростовых факторов.

Потенцирующее действие адреномиметиков в отношении Г-КСФ, а серотонина - в отношении ЭП продемонстрировано и в культуре неадгезирующих миелокариоцитов интактных животных. По-видимому, в случае алкилирующего агента модулирующая активность моноаминов менее подвержена токсическому действию цитостатика. Усугубление ситуации при назначении антиметаболита (наряду с развитием дефицита активных в отношении гемопоэтических клеток молекул), очевидно, связано с нарушением взаимодействия эритропоэтина и системы КСФ с периферическими моноаминергическими механизмами.

В совокупности собственные результаты экспериментов и данные литературы легли в основу предложенных нами схем регуляторного влияния моноаминов на систему крови при гипопластических состояниях, вызванных введением циклофосфана либо 5-фторурацила (рис. 2).

Развитие миелосупрессии и последующее восстановление кроветворной ткани при цитостатических воздействиях находятся под контролем адренергической, серотонинергической и дофаминергической систем. Регуляторное влияние центральных моноаминергических структур на гемопоэз реализуется прямо через соответствующие рецепторы на коммитированных кроветворных клетках-предшественниках и опосредованно - через изменение функциональной активности клеточных элементов ГИМ (формирование ГО, продукция цитокинов). При цитостатических воздействиях велико значение центральных серотонинергических структур и катехоламинов в реализации гемостимулирующих эффектов ряда гемопоэтических факторов роста: эритропоэтина и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора соответственно. Причем нами не исключается участие системы локальной моноаминергической регуляции в восстановлении нарушенного антинеобластомными средствами оптимального соотношения физиологически активных веществ в межклеточном пространстве кроветворной ткани.

В условиях моделирования гипопластического состояния цитостатиками моноаминергические механизмы регенерации эритрона и белой крови существенно различаются. Так, если активность эритропоэза во многом связана с серотонином (формирование клеточных комплексов эритроидного типа и продукция ЭПА адгезирующими клетками ГИМ, увеличение активности дифференцировки эритроидных предшественников), то с катехоламинами сопряжено восстановление клеточности гранулоцитарного ростка (образова-ние гранулоцитарных ГО и продукция КСА клетками ГИМ, пролиферация и созревание грануломоноцитарных прекурсоров).

Наряду с общими принципами был обнаружен ряд существенных межмодельных различий в моноаминергической регуляции костномозгового гемопоэза. Так, центральные адренергические структуры усиливают токсическое действие алкилирующего агента как на гранулоцитарный (1-7-е сутки), так и на эритроидный ростки кроветворения (ингибиция) (рис. 3).