Клинико-иммунологическая эффективность способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении гнойных ран

Размещено на http://www.allbest.ru/

Клинико-иммунологическая эффективность способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении гнойных ран

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора медицинских наук

Халилов Максуд Абдуразакович

Курск- 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Орловский Государственный университет»

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Снимщикова Ирина Анатольевна;

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Затолокин Василий Данилович.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Юдина Светлана Михайловна;

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Земсков Андрей Михайлович;

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Винницкий Леонид Ильич.

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава», г. Москва

Защита диссертации состоится «___» ____________2010 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.01. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава

Автореферат разослан «___» ________________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

д.м.н., профессор Калуцкий П.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гнойно-воспалительные заболевания различной локализации до настоящего времени остаются одной из актуальных проблем современной медицины, что обусловлено их распространённостью, тенденцией к хроническому течению, недостаточной эффективностью традиционных методов лечения (Савельев В.С., Гостищев В.К., 2009; Pulgar S., Mechra M., 2008).

В общей структуре хирургических заболеваний хирургическая инфекция наблюдается у 35-45% больных и протекает наиболее часто в виде раневой инфекции, а около 30% летальных исходов после хирургических вмешательств связано с гнойными осложнениями (Федоров В.Д., 2005; Светухин А.М., 2008; Войновский Е.А., 2009; Falanga V., 2007). Эти данные свидетельствуют об актуальности и нерешённости проблемы хирургической инфекции, приобретающей всё большую социально-экономическую значимость.

Результаты лечения гнойных заболеваний мягких тканей и раневой инфекции, несмотря на применение современных методов и достигнутые определенные успехи, не удовлетворяют полностью хирургов (Толстых П.М., 2007; Гостищев В.К., 2009; Coutts P., Sibbald R.G. 2008). Длительное лечение, значительные материальные затраты, частые осложнения, косметические изъяны - это все требует изыскания новых путей, совершенствования уже имеющихся способов терапии данной группы больных. И если тактика хирургического лечения гнойных ран в настоящее время определена, то ряд факторов дополнительного воздействия на раневую поверхность постоянно развивается и совершенствуется.

Сложный патогенез раневого процесса обусловливает необходимость комплексного воздействия на различные его фазы (Земляной А.Б., Сажин А.В., 2009; Rice L.B., Grandmann H., 2006). Так как раневая инфекция является одной из основных причин неудовлетворительных исходов ведения открытых повреждений мягких тканей, актуальность оптимизации местной терапии гнойных ран не вызывает сомнений.

В последние годы все большее внимание клиницистов привлекают перспективы использования при лечении воспалительных процессов оксида азота. В эксперименте и клинике доказан ранозаживляющий эффект при обработке гнойных ран газовым потоком, содержащим оксид азота, что заложило основы нового направления в медицине - NO-терапии ран и раневой инфекции. Важным преимуществом NO-терапии, в отличие от большинства физических и медикаментозных факторов, является воздействие полифункционального NO на все фазы раневого процесса (Шехтер А.Б., 2005, 2008; Шулутко А.М., 2006). Вместе с тем недостаточно изучено влияние экзогенного оксида азота на параметры системного и локального противоинфекционного иммунитета, дисбаланс которых при раневой инфекции ограничивает возможности иммунной системы в своевременном распознавании и уничтожении микробных возбудителей, а также способствует хронизации раневого процесса.

Изучению роли нарушений иммунного ответа при гнойных ранах посвящены многочисленные исследования (Ковальчук Л.В, 2004, 2008; Винницкий Л.И., 2005, 2008; Braff M.H., Bardan, A., 2005; Harder J., 2007).

Однако закономерности дисрегуляции компонентов врождённого иммунитета при раневой инфекции изучены недостаточно и являются дискутабельными, а механизмы формирования иммунодефицита при данной патологии нуждаются в уточнении. До настоящего времени не определены диагностические и прогностические иммунологические критерии неблагоприятного течения гнойных ран, нет единого мнения о значимости показателей локального иммунитета при проведении местного лечения.

Поскольку гнойно-воспалительные заболевания сопровождаются нарушением факторов иммунной защиты (Караулов А.В., Земсков А.М., 2006, 2008; M. Carretero, M. Escamez, 2007), то одним из адекватных способов комплексного лечения представляется иммунотерапия препаратами системного и топического действия. Работами ряда авторов показано, что локальная иммунокоррекция препаратами иммунорегуляторных пептидов при гнойных заболеваниях мягких тканей и раневой инфекции, способствует снижению продолжительности лечения и частоты рецидивов (Симбирцев А.С., Варюшина Е.А., 2008; Fucumoto K., 2005; Jacobsen F., 2007). В литературе встречаются единичные данные о совместном локальном использовании иммуномодуляторов и NO-терапии (Луцевич О.Э., Шехтер А.Б., 2008). Однако, недостаточно сведений о патогенетическом обосновании их дифференцированного назначения в конкретной клинической ситуации, не изучены эффекты их взаимного влияния при сочетанном применении.

В связи с этим приобретает актуальность оптимизация лечения гнойных ран с включением в программы комплексного ведения больных способов локальной иммунокоррекции с использованием препаратов иммунорегуляторных пептидов и NO-терапии, а также необходимость дальнейшего изучения механизмов их противовоспалительной активности, расширения показаний к назначению и разработки оптимальных схем лечения.

Цель работы. Повышение эффективности лечения больных с гнойными ранами путём разработки и применения способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии.

Задачи исследования.

1. Провести комплексное клинико-иммунологическое обследование больных с гнойными ранами различной этиологии и локализации для выявления маркёров высокого риска реализации затяжного и хронического течения раневой инфекции.

2. Изучить in vitro антимикробную активность препарата миелопид и его влияние на продукцию противомикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), воспалительных и противовоспалительных цитокинов, оксида азота и метаболитов кислорода, экспрессию TOLL2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных с гнойными ранами.

3. Сравнить динамику и особенности заживления экспериментальной гнойной раны при различных вариантах использования NO-терапии и миелопида. миелопид иммунный гнойный рана

4. Разработать способы локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении больных с гнойными ранами и оценить их клиническую эффективность в сравнении с традиционным лечением.

5. Исследовать влияние вариантов местного применения препарата миелопид, NO-терапии и их комбинации на динамику показателей локального и системного иммунного статуса больных с гнойными ранами.

Научная новизна. Получены данные об изменении при гнойных ранах продукции антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, б-дефенсина, лактоферрина, миелопероксидазы, гепсидина), экспрессии TOLL2-рецепторов фагоцитарными клетками, которые расширяют представления о роли дисфункции компонентов врождённого иммунитета в патогенезе раневого процесса.

Впервые показана диагностическая и прогностическая значимость комплексной оценки в раневой жидкости при гнойных ранах уровней кателицидина LL-37, б-дефенсина, метаболитов NO, матрикс металлопротеиназы - 3 и числа TOLL2+ клеток.

Впервые выявлена прямая антимикробная активность препарата миелопид в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenеs, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Сandida albicans (Патент № 2333765).

Установлено in vitro иммуномодулирующее влияние препарата миелопид на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), воспалительных и противовоспалительных цитокинов, метаболитов кислорода и оксида азота, экспрессию TOLL2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных гнойными ранами.

Впервые проведена сравнительная оценка изменений патоморфологических показателей и раневой микрофлоры при заживлении экспериментальной гнойной раны в условиях местного использования вариантов NO-терапии и препарата миелопид.

Впервые разработаны и внедрены в клиническую практику способы локальной иммунокоррекции при гнойных ранах с использованием препарата миелопид и NO-терапии в сочетании с миелопидом (Патент № 2326678), проведена оценка их эффективности в сравнении с традиционным лечением и местным применением NO-содержащего газового потока.

Выявлено положительное влияние способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии на динамику показателей системного и локального иммунитета больных с гнойными ранами.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований экспериментально обосновано локальное применение препарата миелопид и NO-терапии в сочетании с миелопидом в комплексном лечении гнойных ран.

Полученные данные об антимикробной активности препарата миелопид обосновывают возможность его местного использования при гнойных ранах и раневой инфекции, вызванных S. аureus, S. рyogenеs, E. coli, P. vulgaris, K. pneumoniae, С. albicans.

Разработаны критерии балльной оценки тяжести течения гнойных ран с учётом клинико-иммунологических показателей и определены маркёры высокого риска реализации затяжного и хронического течения раневой инфекции.

По результатам сравнительной оценки клинической эффективности местного лечения больных с гнойными ранами показано, что сочетанное применение локальной иммунокоррекции с использованием препарата миелопид и NO-терапии позволяет более быстро купировать воспалительный процесс в тканях раны, ускорить заживление и деконтаминацию, сократить время подготовки ран к хирургическому закрытию, сроки и стоимость лечения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Одним из факторов развития иммунной дисфункции у больных с гнойными ранами является дисбаланс компонентов антиинфекционного иммунитета: продукции антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, дефенсина б 1-3, лактоферрина, миелопероксидазы, гепсидина) и экспрессии TOLL2-рецепторов фагоцитарными клетками. Маркёрами неблагоприятного течения гнойных ран являются значительное повышение или снижение в раневой жидкости уровня кателицидина LL-37, повышение концентрации дефенсина б, матрикс металлопротеиназы-3, снижение числа TOLL2+ клеток и уровня метаболитов оксида азота.

2. Препарат миелопид обладает противомикробной активностью и оказывает иммуномодулирующее влияние на продукцию антимикробных пептидов, цитокинов, метаболитов кислорода и оксида азота, экспрессию TOLL2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных с гнойными ранами.

3. Комбинированное использование при экспериментальных гнойных ранах миелопида и NO-терапии сопровождается более быстрой санацией патологического очага и укорочением сроков заживления, по сравнению с изолированным применением миелопида, антисептика гипохлорита натрия и его сочетания с NO-содержащим газовым потоком.

4. Использование в комплексном лечении гнойных ран локальной иммунокоррекции препаратом миелопид и, особенно, NO-терапии в сочетании с миелопидом, ускоряет купирование воспалительного процесса, сроки заживления и деконтаминации, сокращает продолжительность стационарного лечения.

5. Локальное применение препарата миелопид, NO-терапии, а также их сочетания у больных гнойными ранами приводит к восстановлению исходно нарушенных показателей иммунного статуса.

Внедрения в практику. Способы локальной иммунокоррекции препаратом миелопид, NO- терапии в сочетании с миелопидом; способ определения динамики поверхностных раневых процессов внедрены в практику работы ОГУЗ «Орловская областная клиническая больница», МЛПУЗ «Больница скорой медицинской помощи им. Н.А. Семашко» г. Орла, МЛПУЗ «Больница им. С.П. Боткина» г. Орла, ОГУЗ «Белгородская областная клиническая больница», ГУП НИИ Новых медицинских технологий Тульской области, Тульского отделения академии медико-технических наук РФ. Полученные результаты используются в учебном процессе кафедр иммунологии и специализированных клинических дисциплин; общей хирургии; анатомии, оперативной хирургии с курсом факультетской хирургии медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Связь с планом НИР.

Работа проведена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» (номер госрегистрации комплексной темы 14.00.03).

Апробация работы. Основные положения работы представлены, доложены и обсуждены на 2 Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орёл, 2001), Межрегиональной конференции и организационном съезде хирургов «Лечение ран и раневой инфекции (Ярославль, 2003), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы педиатрии и иммунологии» (Санкт-Петербург, 2005), VI Всероссийском научном форуме «Хирургия-2005» (Москва, 2005), Всероссийской конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), VIII и IX Всероссийских научных Форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006, 2007), VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2007), IV Всероссийской конференции общих хирургов с международным участием и Пленуме проблемной комиссии «Инфекция в хирургии» (Ярославль. 2007), I Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орёл, 2008), научно-практической конференции хирургов ЦФО РФ, (Орёл, 2009, Белгород, 2010), Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (Москва, 2010), совместном заседании кафедр иммунологии и специализированных клинических дисциплин, оперативной и факультетской хирургии, внутренних болезней, общей хирургии и анестезиологии, микробиологии и инфекционных болезней МИ ОГУ (Орёл, 2010).

Работа выполнялась при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» по заявке № 551П/41 «Иммунологический мониторинг адаптации человека и его жизнеобеспечения в условиях действия неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов» (2009-2013 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 51 научная работа, в том числе 17 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 монография, 3 пособия для врачей. Получено 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 рисунками, 30 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 493 источника, в том числе 277 отечественных и 216 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование экспериментальных гнойных ран проводилось на 140 крысах «Вистар» обоего пола в равных количествах весом 170 ± 30г по (S. Eleck, K. Sommenn (Даценко Б.М., 1995). Все животные до начала эксперимента прошли карантинный режим вивария, содержались в одинаковых условиях в индивидуальных клетках на типовом пищевом рационе. При проведении экспериментальных работ соблюдены принципы Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (2000), требования приказа №267 МЗ РФ от 19.06.2003 «Правила по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных».

Животные в зависимости от серии исследований и применяемого метода лечения были распределены на 5 групп: животные, не получавшие лечения (1 - контрольная группа); животные 2 группы - сравнения (с применением раствора натрия гипохлорита 600 мг/л) и основные группы животных, получавшие оптимизированное лечение с использованием раствора миелопида (3000 мкг/мл) - 3 группа, комплекса NО-терапии и раствора натрия гипохлорита (600 мг/л) - 4 группа, а также сочетания NО-терапии и миелопида (3000 мкг/мл) - 5 группа. При моделировании гнойной раны, после предварительной обработки кожи, в асептических условиях, под эфирным масочным наркозом, на выбритом от шерсти участке спины в межлопаточной области у животных иссекалась кожа с подкожной клетчаткой в виде квадрата 22 см (400 мм²) по контуру, предварительно нанесенным трафаретом. Края и дно раны раздавливали зажимом Кохера. В рану вносили марлевый тампон весом 0,5 грамм с взвесью суточной культуры золотистого стафилококка (фаготип 3А/3С/55/71) в дозе 1 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического раствора. Рану ушивали наглухо. На 5-е сутки на спине в межлопаточной области у животных формировался абсцесс со всеми характерными признаками гнойного воспаления. Отмечался отек и гиперемия кожи в области нанесения раны, припухлость, у некоторых животных между швами выделялся гной. При пальпации определялась местная гипертермия и флюктуация. После снятия швов и разведения краев раны удалялся марлевый тампон, выделялось большое количество гноя, а сформированная у животных рана имела все основные черты гнойного воспаления, позволяющие считать ее адекватной моделью гнойной раны у человека. Для предупреждения контракции раны за счет эластичности, а также для стандартности условий лечения, к краям раны подшивалась металлическая рамка, соответствующая размерам раны, с «крышкой» для удержания перевязочного материала в ране и предупреждения высыхания раневой поверхности. Лечение начинали с хирургической обработки гнойной раны, включающей эвакуацию гноя, удаление некротической ткани и промыванием ее антисептиком. На раневую поверхность ежедневно во время перевязок при смене марлевых салфеток проводили сеансы NO- терапии, наносили лекарственные средства согласно делению животных на группы до заживления раны.

Для оценки влияния исследуемых факторов на заживление ран проводились клинические, планиметрические, микробиологические, цитологические (по М.Ф. Камаеву) и гистологические методы исследований на 1, 3, 5, 7, 10 и 14 сутки от начала лечения. Скорость уменьшения раневой поверхности определяли по методу Л.Н. Поповой, для оптимизации которого была использована программа анализа динамики ран (Мошкин А.С., 2008).

В клинической части работы была оценена эффективность лечения 198 больных с гнойными ранами. Все больные по способу лечения были разделены на 4 группы: I - контрольную группу составили 60 пациентов, получавших традиционное лечение; во II группу вошли 39 больных, которым на фоне традиционного лечения проводилась локальная иммунокоррекция препаратом миелопид; в третью группу были включены 39 пациентов, получавших местную NO-терапию; IV группу составили 60 больных, которые получали локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид в сочетании с NO-терапией. Больные всех групп были сопоставимы по возрасту, полу и характеру патологического процесса в мягких тканях, распределение в них было случайным. Средний возраст больных составил 41,5±3,9 лет.

Программа диссертационного исследования утверждена на заседании Этического комитета медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет (протокол № 2 от 16. 03.2005г.) в соответствии с требованиями Основ законодательства РФ «Об охране здоровья граждан». Отчет по проделанной работе заслушан на заседании Этического комитета (протокол № 4 от 21 мая 2009 года).

Местное лечение во всех наблюдаемых группах начинали с проведения хирургической обработки гнойного очага с соблюдением общепринятых принципов: рассечение повреждённых тканей с иссечением девитализированных структур, полная ликвидация гнойных затёков, проведение тщательной ревизии и адекватного дренирования гнойного очага, санация её растворами антисептиков. В группе больных, где применялось традиционное лечение, для закрытия раневой поверхности примененялась многокомпонентная мазь на полиэтиленгликолевой основе (левомеколь) в первой фазе и метилурациловая мазь во второй фазе раневого процесса.

Алгоритм лечения больных четвёртой группы (патент на изобретение №2326678 от20.06.2008г.) включал хирургическую обработку раны и санацию её растворами антисептиков; воздействие на раневую поверхность воздушно-плазменным потоком, содержащим оксид азота, генерируемым с помощью аппарата «Плазон» (длительность воздействия на одну зону размером 1х1см составляла 8-9 секунд с расстояния 20-25 см от выхода плазмотрона, общее время соответствовало площади раны); локальное применение раствора миелопида (3000 мкг/мл), которым обрабатывали раневую поверхность 1 раз в сутки как в первой, так и во второй фазах раневого процесса. Соответственно местное лечение пациентов второй и третьей групп включало использование раствора миелопида или оксида азота по выше приведённой схеме.

Критериями исключения пациентов из проводимого исследования служили: возраст пациентов меньше 18 и старше 65 лет, сопутствующие соматические заболевания в стадии обострения или декомпенсации, беременность, тяжелый сепсис, иммуносупрессия вследствие новообразований или ВИЧ-инфекции, активный вирусный гепатит, индивидуальная непереносимость или аллергическая реакция больного на препараты, используемые для терапии.

Эффективность лечения оценивали в баллах по разработанным нами критериям. При этом учитывали: характер и количество раневого отделяемого, наличие инфильтрации и отёка в области гнойного очага, нарушение функции поражённой анатомической зоны, сроки появления грануляций и выполнения ими раны, время начала краевой эпителизации, степень перифокальной гиперемии, клеточный состав мазков-отпечатков с поверхности раны, степень микробной обсеменённости, скорость сокращения площади раны (мм² в сутки), показатели локального иммунного статуса (табл. 1), которые оценивали на 1, 3, 6, 9 сутки и при выписке больного.

Таблица 1 Лабораторные показатели оценки выраженности локального воспалительного процесса при раневой инфекции.

Для определения исходного состояния иммунного статуса, сравнительной динамики течения раневого процесса у больных с различными причинами возникновения гнойных ран и для выявления маркёров высокого риска реализации затяжного и хронического течения раневой инфекции были дополнительно обследованы 145 больных (средний возраст 42,7±3,5 лет), получавших традиционное лечение: 65 - с ранами после вскрытия абсцессов и флегмон мягких тканей; 20 - с послеоперационными ранами, 30 - с посттравматическими ранами; 30 - с флегмонозно-некротической формой рожи.

Мононуклеары периферической крови (МНК) здоровых лиц и больных с раневой инфекцией выделяли с использованием метода дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Фримель Г., 1980). Разделение суммарной фракции мононуклеаров на моноциты и лимфоциты осуществляли посредством избирательной адгезии моноцитов к пластику (Тотолян А.А., 2000).

С целью определения способности клеток к продукции антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), цитокинов метаболитов оксида азота или кислорода взвесь мононуклеарных фагоцитов (МНФ) в концентрации 2 млн./мл инкубировали в течение 1,5 часов в сывороточной среде RPMI-1640 при 37°С с препаратом миелопид (композит свиных миелопептидов; НПЦ Медицинская иммунология, Россия) в атмосфере 5% СО₂. В качестве индуктора синтеза цитокинов использовали ФГА (фитогемагглютинин, «Difco», США) в концентрации 10 мкг/мл. По окончании инкубации клетки в планшетах трижды отмывали средой 199, ресуспендировали в полной среде RPMI-1640 в объеме 100 мкл и культивировали в стандартных условиях в течение 18 часов (22 часа при определения NO). Для исследования брали супернатанты клеток, полученные путем 10-минутного центрифугирования культуральной смеси при 1500 об./мин, которые переносили в лунки 96-луночного планшета.

Интенсивность кислородного метаболизма МНФ крови определяли по восстановлению нитросинего тетразолия в формазан. При оценке индуцированного НСТ-теста в лунки вносили зимозан в концентрации 0,2 мг/мл и инкубировали при 37?С в течение 1 часа. Реакцию учитывали на планшетном фотометре для ИФА при длине волны 540 нм (Тотолян А.А., 2000).

Продукцию миелопероксидазы оценивали по методике Азнабаевой Л.Ф. с соавт. (2002 г.) с расчетом показателя пероксидазной активности исследуемой биологической жидкости (ПОА). Определение концентрации кателицидина LL-37 и лактоферрина в супернатантах клеток, сыворотке крови и раневом экссудате проводилось методом твердофазного ИФА с помощью набора реагентов Hbt (Нидерланды), ЗАО “Вектор-Бест” (Россия).

Содержание NO в пробах оценивали спектрофотометрически при длине волны 540 нм с помощью реактива Грисса. Результат рассчитывали по кривой с использованием стандартных растворов нитрита натрия (Голиков П.П., 2004). Уровень цитокинов определяли методом ИФА с помощью набора реагентов ООО “Протеиновый Контур”, ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) и DRG (Germany).

Для определения влияния препарата миелопид на экспрессию TOLL-2 рецепторов мононуклеарными фагоцитами крови, МНФ в концентрации 2 млн./мл инкубировали 90 минут в сывороточной среде RPMI-1640 с миелопидом (600, 750, 1500, 3000 мкг/мл) в лунках 96-луночных планшетов при 37°С в атмосфере 5% СО₂. По окончании инкубации клетки в планшетах трижды отмывали от препарата средой 199, ресуспендировали в полной среде RPMI-1640 в объеме 100 мкл и культивировали в стандартных условиях в течение 22 часов, после чего планшет центрифугировали при 2000 об./мин. 3 минуты, удаляли супернатанты и трижды отмывали клетки средой 199. Оценка экспрессии TOLL-2 рецепторов производилась путем подсчёта CD282+ клеток с помощью моноклональных антител Hbt (Нидерланды) непрямым иммунопероксидазным методом.

Оценку уровня дефенсина б и гепсидина в сыворотке крови и раневом экссудате (РЭ) проводили методом ИФА с использованием тест-систем Hbt (Нидерланды) и IBL (Германия).

Для получения РЭ использовали стерильные марлевые тампоны, которые помещали в рану с экспозицией на 20-30 секунд. После аппликации пропитанный тампон вносили в пробирку с 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида на 30 минут с последующим его удалением после центрифугирования в течение 5 минут при 1500 об./мин.

С целью оценки показателей системного иммунитета больных осуществлялся забор периферической крови до лечения, в процессе и после лечения, при этом изучали уровень иммуноглобулинов A, M, G, антимикробных пептидов и цитокинов ИЛ-1в, ИЛ-1Ra, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-, ТФР-в₁ в сыворотке крови, функциональную активность МНФ.

Фенотип клеток определяли непрямым иммунопероксидазным методом с использованием моноклональных антител (ТОО «Сорбент», г. Москва; Hbt, Нидерланды), согласно прилагаемым инструкциям и рекомендациям. Концентрацию иммуноглобулинов оценивали методом радиальной иммунодиффузии с помощью стандартных планшетов «Реафарм» (Москва). Фагоцитарную активность МНФ определяли с помощью реагентов фирмы «Диа^эМ» (г. Москва).

Для определения иммунологических показателей, принимаемых за физиологическую норму, были обследованы 20 здоровых лиц (средний возраст 45,1±0,5 лет) для выявления у них фоновых показателей иммунного статуса и их сравнения с данными иммунограмм у больных с раневой инфекцией.

Антибактериальное действие миелопида определяли методом диффузии в агар по степени задержки роста микроорганизмов в зоне нанесения препарата. В качестве тест-культур были использованы штаммы микроорганизмов из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также клинические изоляты бактерий (E. coli, P. vulgaris, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus, S. pyogenes, C. albicans).

Иммунологические исследования выполнялись на кафедре иммунологии и специализированных клинических дисциплин медицинского института ОГУ. Бактериологические исследования выполнены на кафедре микробиологии и инфекционных болезней медицинского института ОГУ, в бактериологической лаборатории МУЗ «Городская СЭС» и МЛПУЗ «Городская больница им. С.П. Боткина» г. Орла в соответствии с методическими рекомендациями МЗ СССР (1985 г.).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программного комплекса Microsoft Excel XP на компьютере «Pentium IV». Исследование корреляционной взаимосвязи между показателями выполнялись по Пирсону.

Результаты исследований и их обсуждение

Результаты экспериментальных исследований.

По современным представлениям одним из ключевых звеньев патогенеза гнойных ран является развитие иммунной дисфункции, что приводит к нарушению нормального заживления тканей на одной и более стадиях развития раневого процесса и замедляет репарацию (Долгушин И.И., 2009; Galkowska, H., 2005; Steinstraesser L., 2008). Вместе с тем, исследования механизмов формирования иммунной недостаточности у больных гнойными ранами достаточно фрагментарны и посвящены преимущественно изучению состояния Т-, В- звеньев иммунитета и фагоцитарной системы (Смирнов В.С., 2004; Сарвин А.Г., 2005; Варганов М.В., 2006). При этом закономерности дисрегуляции системных и локальных компонентов противоинфекционного иммунитета у больных гнойными ранами являются дискутабельными и нуждаются в уточнении для разработки адекватных способов местной иммунокоррекции.

В настоящее время особый интерес вызывает возможность применения для лечения заживления ран препаратов иммунорегуляторных пептидов (цитокинов, факторов роста и др.), которые благодаря широкому спектру биологической активности регулируют все этапы воспалительного процесса (Симбирцев А.С., Ковальчук Л.В., 2008; Юдина С.М., Снимщикова И.А., 2010; Heilborn J. D., 2005; Jacobsen F., 2007). Однако одной из основных проблем, связанных с патогенетическим обоснованием локального применения иммунорегуляторных пептидов, является необходимость изучения их плейотропного действия на различные клетки-мишени и те факторы, которые определяют развитие иммунной дисфункции при гнойных ранах и раневой инфекции.

Учитывая вышеизложенное, представляло интерес изучить у больных с гнойными ранами особенности факторов, обеспечивающих противомикробную защиту при остром, затяжном и хроническом течении раневого процесса и возможности регуляции их продукции препаратом миелопид. Для решения задач исследования нами были обследованы 145 пациентов с гнойными ранами различной этиологии и локализации. При этом на системном и локальном уровне проводилась оценка продукции антимикробных пептидов и белков (АМП), активных метаболитов кислорода и азота, цитокинового статуса, экспрессии TLR2 - рецепторов фагоцитами.

Как известно, особое место среди продуктов активированных фагоцитов занимают АМП, являющиеся, с одной стороны, естественными эндогенными антибиотиками, а с другой - сигнальными молекулами, вовлечёнными в процессы активации клеток иммунной системы и репарации тканей. В настоящее время охарактеризованы сотни эндогенных АМП различных групп, одни из которых имеют большую молекулярную массу и представлены литическими ферментами, белками, содержащими сайты против специфических макромолекул и др., большинство других - являются катионными, гранулы-ассоциированными полипептидами (Кокряков В.Н., 2006; Ковальчук Л.В., 2007; Bowdish D.J., 2005; Braff M.H., 2004-2006; Hancock R.E., 2006-2008; Harder J., 2007-2009). Предположив, что нарушение синтеза АМП может быть одной из причин иммунной дисфункции при гнойных ранах, были изучены особенности их системной и локальной продукции, а также возможности её регуляции in vitro препаратом имунорегуляторных пептидов миелопид.

На сегодняшний день белок LL37 (hCAP18) является единственным идентифицированным человеческим кателицидином, проявляющим иммунорегуляторное действие и антимикробную активность против грам-отрицательных и грам-положительных бактерий, а также грибов и вирусов (Ковальчук Л.В., 2007; Barlow P. G., 2006; Zanetti M., 2007; Steinstraesser L., 2008). Как показали результаты исследований, в острую стадию раневого процесса было выявлено повышение содержания LL37 в РЖ (рис.1), по сравнению со стандартными значениями для биологических жидкостей, с пиком продукции на 5-6 сутки, что, по-видимому, имеет срочный компенсаторный характер. Позитивная динамика течения локального патологического процесса сопровождалась последующим снижением уровня LL37 (hCAP18) в раневой жидкости до 1,2-2,5 мкг/мл к 11-14 суткам лечения. Данная иммунологическая картина имела место преимущественно у пациентов с раневыми процессами после вскрытия абсцессов и флегмон мягких тканей (52 пациента - 35,9% из общего числа обследованных больных и 80% из данной категории пациентов). У больных с посттравматическими и послеоперационными ранами аналогичные показатели регистрировались в 4,1% (у 6 больных из 30) и в 7,6% (у 11 пациентов из 20) случаев из общего числа пациентов, соответственно.

Иная динамика местной продукции LL37 была характерна для пациентов с неблагоприятным течением и исходом раневой инфекции. Так, затяжной раневой процесс протекал на фоне стабильно высоких концентраций кателицидина. Начиная с первых дней лечения, в гнойной ране таких больных наблюдалось повышение уровня LL37 более 10 мкг/мл. Данная динамика выявлялась преимущественно у пациентов с послеоперационными и посттравматическими ранами - 6,2% (у 9 больных из 20) и 4,8% (у 7 больных из 30), соответственно. Кроме того, установлено, что резкое кратковременное повышение исследуемого показателя, как правило, на 7-8 сутки на фоне благоприятного течения раневого процесса сочеталось с развитием инфекционных осложнений и регистрировалось в 7,6% случаев у пациентов с гнойными ранами после вскрытия абсцессов и флегмон мягких тканей. При этом пик содержания LL37 в РЖ опережал лихорадочную реакцию на 1-2 дня. Следует отметить, что в раневом экссудате при хронических ранах выявлялось значительное снижение концентрации LL37, который у большинства пациентов определялся в минимальных и «следовых» количествах. Показано, что снижение кателицидина ниже 1,1 - 0,5 мкг/мл в раневой жидкости регистрировалось на всех стадиях раневого процесса у всех больных с флегмонозно-некротической формой рожи и у 17 из 30 пациентов (56,7%) с посттравматическими ранами.

При изучении содержания hCAP18 в сыворотке крови больных была установлена широкая вариабельность значений LL37: от «нулевых» до 5-10 кратного повышения (1,3±0,2 мкг/мл у здоровых лиц). Как правило, динамика этих изменений была аналогична тем, что выявлялись у больных с различным течением гнойной раны в раневой жидкости. Однако пиков продукции исследуемого АМП в течение гнойной раны выявлено не было. Средние концентрации LL37 в сыворотке крови у больных с типичным течением раневого процесса до лечения колебались от 1,7 до 4,7 мкг/мл, составив в среднем 4,1±0,8 мкг/мл. К 11-12 суткам регистрировалось снижение показателя до 3,1±0,7 мкг/мл. Как правило, обширные и хронические раны протекали на фоне более низких концентраций LL37 (в среднем 1,1±0,4 мкг/мл), которые при этом практически не отличались от показателей здоровых лиц, что может свидетельствовать об угнетении эндогенной продукции АМП и снижении резервных возможностей клеток-продуцентов в ответ на бактериальную стимуляцию.

Рис. 1. Концентрация LL37 в раневой жидкости больных с типичным (I) и затяжным (II) течением гнойных ран.

Рис. 2. Концентрация дефенсина б (HNP 1-3) в раневой жидкости больных с типичным (I) и затяжным (II) течением гнойных ран.

Примечание: на рис. 1 и рис. 2, 3, 8 - p<0,05 между показателями в группах на 1, 5; 1 и 7 сутки.

Как известно, наряду с кателицидином LL37 к катионным АМП относятся дефенсины б и в (Ковальчук Л.В., 2007; Будихина А.С., Пинегин Б.В., 2008; Bowdish D.J., 2006; Wang G., 2008). В этой связи заслуживают внимания данные об изменении продукции дефенсина б (HNP 1-3) (рис. 2), который являясь уникальным маркёром нейтрофилов (в меньшей концентрации обнаруживаются в Т-, В-лимфоцитах, моноцитах/макрофагах), проявляет микробицидное, хемотаксическое действие, а также иммуномодулирующую и цитотоксическую активность (Braff M.H., 2007; Buck C.B., 2007; Steinstraesser L., 2008). Установлено, что в острую фазу раневого процесса у всех больных гнойными ранами повышено количество HNP 1-3 в раневой жидкости (до 1,8±0,1 мкг/мл) и плазме крови (до 0,95±0,1 мкг/мл). В плазме крови здоровых лиц уровень HNP 1-3 варьировал от 48 до 105 нг/мл. Снижение числа раневых нейтрофилов в РЖ коррелировало с уменьшением уровня дефенсина б (r=0,95; p>95%). Так, при благоприятном течении раневого процесса снижение HNP 1-3 в раневой жидкости отмечалось, как правило, с 5 дня и достигало в среднем уровня 0,625±0,125 мкг/мл к 9-10 суткам. На фоне затяжного, хронического течения раневого процесса и дефицита эпителизации отмечалось сохранение повышенного уровня HNP 1-3 в раневом очаге (более 1,5±0,25 мкг/мл).

Рис. 3. Концентрация лактоферрина в раневой жидкости больных с типичным (I) и затяжным (II) течением гнойных ран.

В последние годы в патогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний различной локализации активно обсуждается роль гепсидина, который выполняя роль АМП, подобно белкам острой фазы, синтезируется в печени, а также участвует в регуляции транспорта железа в различных компартментах организма, включая клетки эпителия, макрофаги и др. (Nemeth E., 2003; Dallalio G., 2003; Meldrum D.R., 2007). Установлено, что в РЖ гепсидин определялся лишь в 6,2% случаев и только у больных с обширными (более 100 см²) гнойными ранами. Повышение концентрации гепсидина в сыворотке крови (до 215,3±38,2 нг/мл, по сравнению с показателями здоровых лиц - 87,4±16,8 нг/мл) регистрировалось у 18%, преимущественно у больных с осложненным течением заболевания на фоне сопутствующей патологии (сахарный диабет, патология желудочно-кишечного тракта).

Исследование в раневом экссудате уровня железосвязывающего катионного пептида - лактоферрина, обладающего антибактериальной, противовирусной и антиоксидантной активностью, а также участвующего в регуляции роста и дифференцировки клеток фагоцитарного ряда (Тотолян А.А., 2003; Orsi N., 2005; Baker H.M., 2006), выявило повышение его содержания (до 148±12 нг/мл) в РЖ у большинства больных (55,9%) в острую фазу раневого процесса. Последующая динамика лактоферрина зависела как от обширности поражения, так и сопутствующей патологии больных. Так, благоприятное, т.е. типичное течение гнойной раны, протекало на фоне постепенного снижения концентрации лактоферрина (с формированием практически полного «плато» на 3-5 сутки) до уровня 100-110 нг/мл к 7 дню. Затяжное и хроническое течение раневой инфекции сопровождалось более низкой концентрацией лактоферрина (рис. 3). Определение содержания лактоферрина в раневом экссудате больных хроническими ранами выявило максимальное его снижение (до 4,5±1,2 нг/мл) на 18 день лечения. Уровень лактоферрина в сыворотке крови здоровых лиц и больных составил 448±51,4 нг/мл и 936±62,2 нг/мл, соответственно.

Учитывая возможный синергический эффект действия лактоферрина и миелопероксидазы в фагосомной вакуоли в процессе фагоцитоза, а также внеклеточно в очаге воспаления (Кокряков В.Н., 2008; Klebanoff S.J., 2005; Soehnlein O. A., 2008), представляло интерес оценить продукцию миелопероксидазы на местном и системном уровне.

Рис. 4. Влияние препарата миелопид на продукцию LL37 МНФ крови здоровых лиц и больных с гнойными ранами.

Рис. 5. Влияние препарата миелопид на продукцию лактоферрина МНФ крови здоровых лиц и больных с гнойными ранами

Примечание: на рис.4-7, 9, 10 - К - контроль (внесены клетки, необработанные препаратом). I - больные с типичным течением раневого процесса; II - больные с хроническими ранами; 1 - миелопид 600 мкг/мл; 2 - миелопид 750 мкг/мл; 3 - миелопид 1500 мкг/мл; 4 - миелопид 3000 мкг/мл; p<0,01 по сравнению с контролем.

Анализ результатов показал, что у пациентов в острую фазу заболевания, как при типичном течении раневого процесса, так и при хронической раневой инфекции, уровень миелопероксидазы в раневом экссудате и в сыворотке крови (680±115 у.ед. и 1550±195 у.ед., соответственно) был значительно выше, чем у здоровых лиц (665±105 у.ед. в сыворотке крови), что свидетельствует о компенсаторном характере повышения данного гликопротеина и согласуется с данными литературы (Ashcroft G.S., 2005; Baker E.A., 2006).

На наш взгляд, заслуживают внимания данные о прогрессивном снижении концентрации миелопероксидазы (до 115±25 у.ед.) в РЖ больных с обширными и хроническими гнойными ранами, которое регистрировалось в период с 5 по 15-е сутки. При этом темп снижения уровня миелопероксидазы в раневом экссудате при благоприятном течении раневого процесса был значительно ниже (максимальное снижение до 378±105 у.ед.), что можно трактовать как реакцию адаптации, направленную на оптимизацию репаративных процессов в зоне повреждения.

Исследование концентраций изучаемых антимикробных пептидов в супернатантах МНФ больных, по сравнению со здоровыми лицами, выявило снижение продукции кателицидина LL37, лактоферрина и миелопероксидазы у 51,7%, 47% и 35% пациентов, соответственно. При этом «нулевые» значения уровня LL37 выявлялись в 13,96% случаев, снижение концентрации LL37 и лактоферрина было отмечено у 15,1% пациентов, LL37, лактоферрина и миелопероксидазы регистрировались в 11,63% образцов.

Вероятно, дисбаланс АМП выявляемый, как правило, при хронических ранах или затяжном течении раневой инфекции, свидетельствует, с одной стороны, о повышенной востребованности этих медиаторов для завершения локального воспалительного процесса, а с другой - об истощении их локальной продукции и снижении резервных возможностей фагоцитарных продуцентов АМП. Кроме того, высокий уровень этих медиаторов на ранних стадиях раневого процесса, по всей видимости, необходим для обеспечения определенного уровня защиты от инфекционных агентов в очаге воспаления.

Рис. 6. Влияние препарата миелопид на продукцию миелопероксидазы МНФ крови здоровых лиц и больных с гнойными ранами.

Рис. 7. Влияние препарата миелопид на экспрессию CD282+ МНФ крови здоровых лиц и больных с гнойными ранами.

Таким образом, нарушение продукции АМП может рассматриваться как один из механизмов развития иммунной дисфункции у больных гнойными ранами, что является основанием для разработки адекватных способов лечения.

Учитывая вышеизложенное, было изучено влияние миелопида на продукцию АМП мононуклеарными фагоцитами крови здоровых лиц и больных с гнойными ранами. В результате проведенных исследований установлено, что внесение препарата в культуру МНФ крови здоровых лиц сопровождалось усилением продукции изучаемых эндогенных пептидов. Как видно из рис. 4-6, эффект препарата был более выражен при использовании миелопида в дозах 1500 мкг/мл и 3000 мкг/мл (750 и 3000 мкг/мл - для лактоферрина). При сравнительном изучении уровня АМП в супернатантах клеток больных после их инкубации с препаратами (рис.4-6), было установлено иммуномодулирующее действие миелопида на мононуклеарные фагоциты крови: повышение исходно сниженной продукции и снижение - исходно повышенной, что может иметь важное значение для купирования локального инфекционно-воспалительного процесса при ранах и раневой инфекции. Полученные in vitro данные указывают на возможность направленного изменения синтеза эндогенных противомикробных пептидов под действием миелопида у больных с гнойными ранами.

В последние годы установлено, что секреция АМП инициируется после связывания патогенов с рецепторами, распознающими «патоген-ассоциированные молекулярные образы» (PRR - pattern-recognition receptors), которые выполняют интегрирующую функцию между врождённой и адаптивной иммунной системой (Хаитов Р.М., 2009; Liew F. Y., 2005; Trinchieri G., 2007). Среди PRR Toll-подобные рецепторы рассматриваются как ключевые рецепторы, опосредующие реализацию врождённого иммунитета на микробные патогены. Наиболее широким спектром специфичности среди всех идентифицированных TLR обладает TLR2, связывающий липопротеины грамположительных и грамотрицательных бактерий, пептидогликан и липотейхоевую кислоту грамположительных бактерий, грибковый зимозан (Bellocchio S., 2004, Gantner B. N., 2005; Roeder A., 2005; Takeda K., 2007). В связи с этим представляло интерес изучить уровень экспрессии TLR2 клетками раневого экссудата и МНФ крови здоровых лиц и больных.

Результаты проведенных исследований показали, что у 76% больных с гнойными ранами в течение первых 6 суток, определялся более высокий уровень экспрессии TLR2 клетками раневого экссудата (повышение числа CD282+ клеток до 74,51,5%), по сравнению с МНФ крови здоровых лиц и больных (42,52,5% и 61,44,5%, соответственно), что, вероятно, связано с повышенной концентрацией микробных патогенов в зоне инфекционно-воспалительного процесса. Вероятно, такой высокий уровень экспрессии TLR2 индуцирует выработку антимикробных пептидов, что согласуется с ранее полученными данными. При неосложнённом течении раневого процесса уровень экспрессии TLR2 клеточных рецепторов, как правило, снижался к 9 суткам. Вместе с тем, у 24% пациентов регистрировался низкое (ниже 40%) содержание в РЖ CD282+ клеток, экспрессирующих TLR2, что может быть связано, с одной стороны, со «сбрасыванием» этих иммунорегуляторных молекул гиперактивированными клетками очага воспаления, а с другой - с генетическими дефектами экспрессии TLR2 фагоцитами. Данная динамика была характерна лишь для больных с обширными и хроническими гнойными ранами. Как правило, из гнойных ран у этих пациентов высевался золотистый стафилококк (52% случаев) или его ассоциации (41%). При этом наличие у данной категории больных высоких показателей уровня дефенсина б в раневой жидкости может быть обусловлено другими сигнальными путями активации его продукции (в т.ч. через рецепторы IL-1Rs).

У большинства больных с затяжной и хронической раневой инфекцией (64,5%) число CD282+МНФ периферической крови соответствовало показателям здоровых лиц, т.е. было снижено по сравнению с количеством CD282+ клеток при благоприятном течении раневого процесса, что, по-видимому, свидетельствует о неполноценности механизмов противомикробной защиты и снижении адаптационных возможностей у данной категории пациентов. При этом повышение числа TLR2+клеток периферической крови регистрировалось у 39,5% пациентов с затяжными и хроническими гнойными ранами. Следует отметить, что у здоровых лиц в 10% случаев отмечалось исходное повышение экспрессии CD282+ мононуклеарами крови, по-видимому, связанное с физиологической гетерогенностью в данной группе.

Значительный интерес в этой связи представляют полученные нами данные о влиянии миелопида на экспрессию TLR2 МНФ крови. Так, внесение изучаемого препарата в культуру клеток здоровых лиц и больных с «нормальными» показателями приводило к повышению числа CD282+ МНФ и к снижению - исходно повышенной экспрессии TLR2. Как видно из рис. 7, наиболее выраженный эффект наблюдался при использовании препарата в дозах 1500 и 3000 мкг/мл.

Известно, что при активации TLR2 запускается сигнальный каскад, приводящий к выработке воспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО-б), хемокинов и др. регуляторных молекул (Ковальчук Л.В., 2008; Baker H.M., 2006; Barton G. M., 2009). Одной из адапторных молекул, продуцируемых клетками в ответ на активацию TLR2 агонистами, является оксид азота, оказывающий мультимодальное действие на различные клетки-мишени (Ганковская Л.В., 2007; Trinchieri G., 2008). Анализ результатов показал (рис. 8), что при типичном течении раневого процесса пик суммарной продукции нитритов и нитратов в биологических жидкостях приходится на 1-2 сутки со снижением к 5-7 дню.

При проведении клинико-иммунологических параллелей между изменением продукции NO при типичном, затяжном и хроническом течении раневого процесса было показано, что у всех пациентов с вялотекущей и хронической раневой инфекцией оксид азота в экссудате из раны регистрировался в более низких концентрациях (1,1±0,05 мкмоль/л и 0,3±0,03 мкмоль/л, соответственно), что может иметь важное значение в развитии осложнений. Более низкий уровень метаболитов NO был выявлен также при хронических гнойных ранах в сыворотке крови и супернатантах МНФ крови. Следует отметить, что резкое нарастание концентрации NO (более 6,5 мкмоль/л) в РЖ, как правило, на 7-8 сутки на фоне благоприятного течения раневого процесса сопровождалось последующим развитием инфекционных осложнений.

Обработка клеток in vitro препаратом миелопид оказывала дозозависимое действие на продукцию метаболитов NO в культуральной среде, повышая сниженные и снижая повышенные показатели. Как видно из рис. 9, максимальный эффект проявлялся при использовании миелопида в дозе 3000 мкг/мл.