Клинико-иммунологическая эффективность способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении гнойных ран

Рис. 8. Динамика уровня NO в раневой жидкости и сыворотке крови больных с типичным течением гнойных ран.

Рис. 9. Влияние препарата миелопид на продукцию NO МНФ крови здоровых лиц и больных с гнойными ранами.

Известно, что в обеспечении противоинфекционной защиты организма, наряду с NO, важное значение имеет продукция АФК (Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2006; Lucas T., 2010) Результаты проведённых исследований показали, что фагоциты большинства больных (92,4%), по сравнению с клетками здоровых лиц, обладают повышенной продукцией АФК, что, вероятно, является результатом избыточного прайминга МНФ под действием медиаторов в зоне воспаления. У 8% пациентов с затяжным течением раневой инфекции регистрировалось снижение показателей спонтанного и стимулированного НСТ (до 0,1 и 0,18 ед.опт. плотности, соответственно), что свидетельствует о снижении микробицидного потенциала фагоцитов у данной группы больных и согласуется с данными литературы (Ashcroft G.S., 2005; Falanga V., 2006).

Рис. 10. Влияние препарата миелопид на показатели спонтанного и стимулированного НСТ здоровых лиц и больных с гнойными ранами.

Примечание: по левой оси ординат - показатели больных; по правой - здоровых лиц.

При этом установлено, что внесение препарата миелопид в культуру клеток здоровых лиц приводило к усилению спонтанной и стимулированной продукции АФК. Вместе с тем, у больных с гнойными ранами отмечено дозозависимое снижение (до показателей здоровых лиц) АФК. Наиболее выраженный эффект наблюдался при использовании дозы миелопида - 1500 и 3000 мкг/мл (рис. 10).

Учитывая то, что цитокинобразующая функция макрофагов значительно расширяет их эффекторный потенциал и во многом определяет течение и исход репаративного процесса (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 2004-2008; Lucas T., 2010), нами исследован локальный и системный цитокиновый статус у больных с ранами и раневой инфекцией.

Анализ полученных результатов позволил выявить у пациентов три типа реагирования организма на локальный гнойно-воспалительный процесс: первый тип, сопровождающийся увеличением синтеза воспалительных цитокинов и «активным» течением заболевания (при типичном течении раневого процесса), второй - у больных с хронической формой раневой инфекции, сопровождающийся гиперпродукцией воспалительных и противовоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-1Ra, ТФР-в1) цитокинов и третий - со снижением продукции ИЛ-1в, ИЛ-8, ИЛ-6, ФНО-б на фоне затяжного течения патологического процесса в мягких тканях.

Рис. 11. Концентрация цитокинов в раневой жидкости больных с типичным течением раневого процесса (1), с затяжным течением раневой инфекции (2), хроническими ранами (3).

Примечание: приведены показатели цитокинового статуса РЭ, полученного на 7 сутки у больных (1) и (2) течением раневого процесса, на 14 день - (3).

Так, исследования концентраций воспалительных цитокинов в РЭ в острую фазу раневого процесса выявили повышение их уровня по сравнению со стандартными значениями для биологических жидкостей в 87% случаев. При этом повышенная продукция ИЛ-1в, ИЛ-8, ИЛ-6, ФНО-б отмечалась у 42% больных, ИЛ-1в и ИЛ-8 - у 49%, ИЛ-1в - у 9% больных, соответственно.

В фазу образования грануляционной ткани имело место транзиторное повышение на 25-35% от исходного уровня ИЛ-10 и ИЛ-1Ra, а также ТФР-в1 (на 56-147%), который регулирует основные функции фибробластов и эпителизацию ран (Симбирцев А.С., 2008; Baker Е. A., 2006; Zhou L.J., 2008).

Как видно из рис. 11, более высокие концентрации в раневой жидкости отмечены для ИЛ-1в и ИЛ-8 при хроническом течении раневой инфекции. Кроме того, в сыворотках крови 66% данных пациентов определялся повышенный уровень ИЛ-1в, ИЛ-6 и ФНО-б, а у 15% - ИЛ-1в. Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что хронические раны как бы «застревают» в фазе воспаления (Panuncialman J., Falanga V., 2009-2010). Концентрации ИЛ-10, ИЛ-1Ra и ТФР-в1 в раневой жидкости, полученной из длительно незаживающих ран, значительно превышали (на 20-45%) уровни данных противовоспалительных цитокинов в заживающих ранах, что свидетельствует о важности баланса между позитивными и негативными цитокиновыми регуляторами в раневом очаге. Следует отметить, что показатели продукции ИЛ-1в и ФНО-б в очаге воспаления были выше их концентрации в сыворотке крови, тогда как ИЛ-8 ни в одном из случаев (как у больных, так и у здоровых лиц) в ней не определялся.

Третий тип реагирования организма на локальный гнойно-воспалительный процесс, сопровождающийся снижением уровня цитокинов ИЛ-1в (до 16,252,85 пкг/мл), ИЛ-8 (до 28,553,45 пкг/мл), ФНО-б (до 22,155,15 пкг/мл), ИЛ-6 (до 10,155,15 пкг/мл) в очаге воспаления, наблюдался в 13% случаев, что у большинства больных сочеталось с угнетением цитокинпродуцирующей функции МНФ крови. При этом на фоне затяжного течения патологического процесса в мягких тканях снижение концентрации ИЛ-1 в РЭ отмечалось у 72% больных; ИЛ-1в и ИЛ-8 - у 17%; ИЛ-1в и ФНО-б - у 7%; ИЛ-1в , ИЛ-8, ФНО-б. - у 4% пациентов, соответственно.

Таблица 2. Влияние препарата миелопид на спонтанную и ФГА-индуцированную продукцию цитокинов МНФ крови больных гнойными ранами.

Примечание: I - миелопид 600 мкг/мл; II - миелопид 750 мкг/мл; III - миелопид 1500 мкг/мл; IV- миелопид 3000 мкг/мл. К1 - контроль (клетки, необработанные препаратом, без ФГА; К2 - контроль (клетки, необработанные препаратом с внесением ФГА); * p<0,05 ,** - p<0,01 по сравнению с К2; между К1 и К2. Приведены исходно повышенные (n =15) и сниженные показатели (n =15) уровня цитокинов в супернатантах МНФ.

При сравнительном изучении уровня цитокинов в супернатантах клеток после их инкубации с препаратом (табл.2), было установлено иммуномодулирующее действие миелопида на МНФ крови: снижение исходно повышенной продукции и повышение - исходно сниженной, что может иметь важное значение для ускорения процессов миграции, пролиферации и дифференцировки клеток в зоне репарации. При этом более низкие концентрации миелопида (600 и 750 мкг/мл) оказывали преимущественно стимулирующее действие на ФГА-индуцированный синтез цитокинов МНФ крови. Следует отметить, что значимой дозовой зависимости при использовании миелопида в концентрациях 1500 и 3000 мкг/мл установлено не было (табл. 2).

Помимо анализа концентраций цитокинов в биологических жидкостях у больных с исследуемой патологией проводилась оценка частоты выявляемости цитокинов, что, согласно данным литературы, служит дополнительным прогностическим критерием цитокинопосредованности патологии и тяжести её течения (Ковальчук Л.И., Ганковская Л.В., 2008). Надо отметить, что в раневой жидкости при хронических ранах наиболее часто выявлялся ИЛ-1в, ИЛ-8 и ТФР-в₁, а при типичном течении раневого процесса - ИЛ-1в, ИЛ-8, ИЛ-6 и ФНО-б, что, как правило, сочеталось с повышением их концентрации. Кроме того, следует отметить, что изменения продукции ряда цитокинов были взаимосвязаны. Наиболее выраженной была зависимость между уровнями ИЛ-1в и ИЛ-10 (r=0,93; p>95%), ИЛ-8 и ТФР-в₁ ((r=0,92; p>95%).

Обобщая полученные нами данные по исследованию противоинфекционного иммунитета у больных гнойными ранами, можно сказать, что избыточная или недостаточная продукция антимикробных пептидов и белков, метаболитов кислорода и оксида азота, значительное повышение или снижение воспалительных и противовоспалительных цитокинов, нарушение экспрессии TLR2 фагоцитами раневой жидкости более чем в 80% случаев приводит к неблагоприятному течению раневой инфекции, проявляющемуся в затяжном и хроническом течении заболевания, развитии инфекционных осложнений.

При этом наиболее значимыми критериями неблагоприятного затяжного и хронического течения раневого процесса было снижение или повышение (менее 0,5 мкг/мл или более 10 мкг/мл) в раневой жидкости уровня LL-37, повышение (выше 1,5 мкг/мл) содержания б дефенсина, снижение уровня оксида азота (ниже 1 мкмоль/л) и числа TLR2 позитивных фагоцитов (менее 40%).

Таблица 3. Антибактериальная активность препарата миелопид.

Примечание: контроль - физиологический раствор; **p<0,01 по сравнению с контролем

Известно, что в последние годы отмечается рост устойчивости микроорганизмов-возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний к применяемым в клинической практике антибиотикам и антисептикам (Толстых П.М., 2007; Блатун Л.А., 2009; Deepak V., 2006). Изучение свойств препаратов природных антибиотических пептидов человека и животных и разработка на их основе новых подходов к лечению инфекций - один из перспективных путей преодоления резистентности (Heilborn J. D. 2003-2006; Steinstraesser L., 2008). В связи с этим представляло интерес изучить возможное противомикробное действие препарата свиных миелопептидов - миелопида (табл. 3). Проведенные эксперименты показали, что препарат миелопид активен в отношении всех исследуемых микроорганизмов, кроме P. aеruginosa. Как видно из представленных результатов, не было выявлено достоверных различий при использовании миелопида в дозах 750, 1500 и 3000 мкг/мл.

Таким образом, препарат миелопид обладает не только иммунорегуляторным действием, но и противомикробной активностью. Данные литературы и наши наблюдения позволяют предположить, что прямое антимикробное действие миелопида опосредовано входящими в его состав гетерологичными АМП, что позволяет его рассматривать как эндогенный антибиотик животного происхождения и свидетельствует о возможности клинического использования в качестве антимикробного средства (Патент № 2333765).

Как известно, одним из перспективных способов местного лечения гнойных ран является сочетанное использование иммуномодуляторов и физических методов (Луцевич О.Э., Шехтер А.Б., 2008). Исследованиями отечественных авторов показано, что воздушная плазма, обогащенная NO, в отличие от большинства физических факторов, способна оказывать стимулирующее действие на местный иммунный ответ, кровоток и на процесс заживления гнойных ран (Шехтер А.Б., Кабисов Р.К., 2004-2009). Вместе с тем, открытым остается возможность дополнения NO- терапии местным воздействием иммунорегуляторных пептидов для улучшения лечебного эффекта. В доступной литературе также отсутствуют данные о динамике экспериментальной гнойной раны при местном воздействии препарата миелопид. Учитывая это, и полученные in vitro результаты об иммуномодулирующем и антимикробном действии миелопида, представляло интерес провести комплексную оценку динамики течения экспериментальной гнойной раны при различных вариантах локального использования препарата миелопид и NO- терапии. В качестве препарата-контроля из числа традиционных антисептиков был выбран гипохлорит натрия, который, согласно данным литературы, в концентрациях 300-600 мг/л обладает иммунорегуляторным действием (Долженко С.Н., 1999).

Эксперименты выполнены на модели гнойной раны на 140 крысах «Вистар» на основе модели S. Eleck, K. Sommenn. Все животные были распределены на 5 групп: 1 (контрольная) группа - 20 животных, не получавших лечения; 2 группа (30 крыс) - в которой был использован натрия гипохлорит (600 мг/л) и основные группы животных (по 30 крыс), получавшие оптимизированное лечение с использованием раствора миелопида (3000 мкг/мл) - 3 группа, комплекса NО-терапии и натрия гипохлорита (600 мг/л) - 4 группа, сочетания NО-терапии и миелопида (3000 мкг/мл) - 5 группа.

На 1-е сутки лечения экспериментальные гнойные раны во всех группах выглядели одинаково: отёчные, инфильтрированные края с выраженной гиперемией окружающих тканей, дно покрыто налетом фибрина с участками некроза и умеренно выраженным гнойным отделяемым. У всех животных регистрировался дегенеративно-воспалительный тип цитограмм. На 3-и сутки данный тип цитограмм сохранялся лишь у животных 1 (контрольной) группы, тогда как во 2-4 группах была отмечена его смена на воспалительный тип. При этом, несмотря на то, что в цитограммах преобладали нейтрофилы, их количество снизилось с 92,0±1,3% до 89,351,25% при использовании гипохлорита натрия, до 88,2±1,3 - при лечении миелопидом и до 78,42,0% - при сочетании воздействия NaOCl и NО-терапии (92,3±1,5% - в контрольной группе). В 5 группе животных уже на 3-сутки определялся воспалительно-регенераторный тип цитограмм со значительным уменьшением числа нейтрофилов (до 51,72,5%) и деструктивных форм лейкоцитов (до 1,23,3%), повышением количества макрофагов (до 11,81,4%) и фибробластов (до 11,32,3%). Смена воспалительно-регенераторного типа цитограмм на регенераторно-воспалительный регистрировалась на 5 сутки при сочетанном использовании миелопида и оксида азота и на 7-е сутки лечения - у животных 2-4 групп. Соотношение клеточных элементов, соответствующее регенераторному типу, наблюдалось в данных группах на 7 и 10 сутки, соответственно. При этом в контрольной группе животных даже на 14 день сохранялся воспалительный тип цитограмм.

По данным планиметрического исследования, самая высокая скорость заживления отмечена в серии животных, пролеченных комбинацией оксида азота и раствора миелопида - 14,10,28 мм/сут. Во 2-4 группах она составила, соответственно, - 10,10,15; 10,40,52 и 12,60,72 мм/сут., а в группе контроля - 6,40,34 мм/сут. (p<0,05). При сочетанном использовании NО-содержащего газового потока и миелопида на 10-14 сутки сокращалось 82-95% раневого дефекта, тогда как у животных 2 группы - 61-82,5%, 3 группы -59-83%, четвёртой - 67-85%, а у контрольной - лишь 16,5-31%.

Комплексный анализ изучения динамики заживления ран, включая гистологическое исследование раневых биоптатов, выявил, что наиболее эффективным явилось применение комплекса NO-терапии и миелопида (табл. 4). При этом на 14-15 сутки отмечено полное заживление ран вторичным натяжением с формированием нежного рубца (средние сроки заживления составили 14,8±1,5 суток). В контрольной группе животных грануляционная ткань даже к 14 суткам полностью не выполняла раневой дефект, а заживление ран длилось 28,4±3,1 дня. Во 2 - 4 основных группах, где изолированно использовался миелопид или натрия гипохлорит, а также его сочетание с NO динамика течения раневого процесса существенно не отличалась: на 7-10 сутки усиливались пролиферация фибробластов и неоангиогенез, что сопровождалось быстрым развитием и созреванием грануляционной ткани. Средние сроки заживления ран в 3 группе составили 18,7±1,28 суток, во 2-й - 19,7±1,6, в четвёртой - 17,4±1,2 (р<0,05 по сравнению с контрольной группой) дней.

Таблица 4.. Динамика течения раневого процесса у экспериментальных животных

Примечание: * p<0,05; ** p<0,01 по сравнению с показателями контрольной группы.

При посеве отделяемого из ран у животных 5 группы, где использовалась комбинация раствора миелопида и оксида азота, бактериальная флора определялась только на 1-3 сутки, у животных 2, 3 и 4 групп - на 1-5 сутки, в контроле - даже на 14 день. При этом установлено, что NO-терапия усиливала бактерицидное действие натрия гипохлорита при их сочетанном применении: на 5 сутки бактериальная обсеменённость ран снизилась во второй группе до 2,85•10⁴КОЕ/г, в третьей и четвёртой группах - до 2,25•10⁴КОЕ/г и до 2,15•10³ КОЕ/г, соответственно.

Таким образом, анализ данных показал, что эффективность локального действия миелопида при экспериментальных гнойных ранах была аналогична антисептику гипохлориту натрия, бактерицидное действие которого усиливала NO-терапия, а наилучшие результаты были получены при комбинированном использовании миелопида и NO-содержащего газового потока.

Результаты клинических наблюдений.

Для изучения особенностей течения гнойных ран различного генеза нами был проведен клинико-эпидемиологический анализ заболеваемости и лечения пациентов (3475 человек), находившихся в хирургическом отделении МЛПУЗ «Больница скорой медицинской помощи им. Н.А. Семашко», МЛПУЗ «Больница им. С.П. Боткина» г. Орла в 2001-2008 годах, который показал, что наибольший удельный вес в структуре гнойных ран занимают процессы, связанные с лечением острых гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей (61,15%) и посттравматические гнойные раны (15,8%), а также раны после хирургического лечения флегмонозно-некротической рожи (12%). При этом в динамике восьмилетнего мониторинга было установлено, что заболеваемость гнойными ранами не имеет тенденции к снижению и характеризуется «омоложением» контингента больных (61,4% пациентов в возрасте 18-35 лет). Кроме того, за период с 2001 по 2008 гг. зарегистрировано увеличение среди пациентов с гнойными ранами числа больных с сахарным диабетом и гипертонической болезнью (на 4,1-5,8%), сокращение количества больных с обширными ранами и пациентов, которым выполнены повторные радикальные хирургические обработки гнойно-некротических очагов (на 5,2-6,2% и 2,8-3,8%, соответственно). В этиологической структуре раневой инфекции за восьмилетний период наблюдения отмечен рост грамотрицательной флоры и микробных ассоциаций, появление C. аlbicans, сохранение ведущей роли S. аureus.

При этом, как правило, больные поступали в стационар после предшествующего неэффективного амбулаторного лечения. Несвоевременное обращение за медицинской помощью и самолечение имели место в 81,4% и 75,9% случаев, соответственно, 46% больных поступали на лечение в стационар с сомнительным и неблагоприятным прогнозом, 54% - с благоприятным прогнозом течения гнойно-воспалительных заболеваний. Из общего числа пациентов 29,1% имели в анамнезе гнойно-воспалительные заболевания (фурункулы, карбункулы, абсцессы и др.), 62,7% - сопутствующую соматическую патологию (сахарный диабет, гипертоническая болезнь, ИБС, хронические заболевания желудочно-кишечного тракта и гепатобилиарной системы, хронические неспецифические заболевания легких и др.), 34,5% из общего числа больных страдали частыми ОРВИ (до 4-6 раз в год). На основании данных анамнеза, проведённого анализа соматических заболеваний, особенностей течения гнойно-воспалительного процесса в мягких тканях следует, что у 87,3% больных имелись существенные факторы риска для развития иммунной дисфункции. Полученные данные не противоречат результатам эпидемиологических исследований последних лет и подчеркивают актуальность проблемы гнойной инфекции.

Учитывая это, и в соответствии с поставленными задачами исследования проводилось изучение эффективности лечения 198 больных (мужчин - 127; женщин - 71) с гнойными ранами, которые по способу лечения были разделены на 4 группы: I контрольную группу составили 60 пациентов (38 мужчин, 22 женщины; средний возраст 41,5±3,9 лет), получавших традиционное лечение; II группу - 39 пациентов (25 мужчин, 14 женщин; средний возраст 40,5±3,8 лет), которым проводилась локальная иммунокоррекция препаратом миелопид; в III группу были включены 39 пациентов (24 мужчин, 15 женщин; средний возраст 39,5±3,5 лет), получавших местную NO-терапию; в IV группу - 60 больных (40 мужчин, 20 женщин; средний возраст 42,1±4,5 лет), которые получали локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид в сочетании с NO-терапией.

В этиологической структуре гнойных ран доминировали раны после хирургического лечения острых гнойных заболеваний мягких тканей - 108 (54,55%), в т.ч. флегмоны - 86 (43,4%), абсцессы - 22 (11,1%). С флегмонозно-некротической формой рожи было пролечено 30 больных (15,15%), с послеоперационными ранами - 20 (10,1%), с посттравматическими ранами - 40 (20,2%) пациентов. Большинство раневых процессов имели площадь от 31 до 100 см² (60,6%). Общее состояние средней степени тяжести регистрировалось у 122 больных (61,6%), удовлетворительное - у 54 (27,3%), тяжёлое - у 22 пациентов (11,1%).

Эффективность лечения оценивали в 4-х балльной системе по разработанным нами критериям на 1, 3, 6, 9 сутки и при выписке больного. Совокупная оценка выраженности гнойно-воспалительного процесса в 38 и более баллов соответствовала высокой степени активности; 37,5-20,5 - умеренной; ниже 20,0 - незначительной. По степени выраженности гнойно-воспалительного процесса пациенты во всех группах распределились примерно одинаково: незначительная степень активности гнойно-воспалительного процесса отмечался у 20% пациентов группы контроля, у 20,5% больных второй группы и у 17,9% и 20% пациентов третьей и четвертой групп, соответственно; умеренная степень активности - у 50%; 51,2%; 49,4% и 46,7%; высокая - у 30%; 28,3%; 30,7% и 33,3%, соответственно.

При поступлении выраженность клинических симптомов по сумме баллов у больных контрольной группы составляла 37,3,0±0,5 балла, II группы - 36,7±0,8 балла, III и IV групп - 37,8±1,1 и 37,5±0,5 баллов, соответственно. Следует отметить, что локальные объективные признаки гнойно-воспалительного процесса в мягких тканях до лечения определялись у всех пациентов: инфильтрация, отек в области гнойного очага у 98,5%; гиперемия области поражения у 96,5%; нарушение функции пораженной области у 97,4% больных. В 27% случаев выявлялся регионарный лимфаденит, в 16% - лимфангиит, у 8,4% больных - наличие более одного гнойного очага.

Уже на 3 сутки лечения отмечалась существенная разница в течение воспалительного процесса по динамике клинико-лабораторных и инструментальных данных: у больных, получавших локально препарат миелопид, - снижение до 26,9±0,5 баллов; NО - терапию - до 24,5±0,6 баллов; сочетанную локальную иммунокоррекцию миелопидом и NО - до 20,3±0,5 баллов в то время как у пациентов первой группы сумма баллов оставалась на достаточно высоком уровне (28,4±0,7 балла, соответственно). Следует отметить снижение микробной обсеменённости раны и улучшение характера цитологической картины мазков-отпечатков, в основном за счет снижения числа нейтрофилов, увеличения количества макрофагов, появления фибробластов (табл. 5), динамика которых была более значимой на фоне сочетанной локальной иммунокоррекции. При этом на 5-6 сутки у большинства пациентов III и IV групп наблюдалось стихание перифокального воспаления, уменьшение количества раневого отделяемого, и изменение его характера в сторону серозного или серозно-гнойного. Начало появления грануляционной ткани отмечалось лишь у пациентов четвёртой группы. В I контрольной и во II группах динамика показателей была менее выражена, а очищения раневой поверхности зарегистрировано не было.

На девятые сутки у 59% больных второй, 61,5% - третьей и 76,7% - четвертой групп отмечалось типичное течение раневого процесса и почти полное купирование воспалительного процесса в ране (13,3±0,4 баллов; 9,7±0,8 и 7,450,3 баллов, соответственно): очищение от некротических тканей, отсутствие раневого отделяемого, заполнение раневой поверхности грануляционной тканью, уменьшение площади раны, снижение (и отсутствие у больных IV группы) числа микробных колоний в мазках-отпечатках и повышение числа фибробластов (до 44,3±2,3%), свидетельствующих о процессе регенерации тканей (табл. 5). При этом использование миелопида приводило к более быстрому купированию локального воспалительного процесса преимущественно у больных с гнойными ранами размерами до 50см². Следует отметить, что сочетанное использование NО-терапии и миелопида в четвертой группе позволило в 23,3% случаев избежать затяжного течения раневого процесса, а также снизить до 8,3% число больных, получавших повторные курсы антибиотикотерапии.

У больных первой группы положительная динамика клинических проявлений по сумме баллов на 9 сутки была менее выражена (19,1±0,4 баллов), а типичное течение раневого процесса регистрировалось лишь у 45% пациентов. Купирование воспалительного процесса в мягких тканях у пациентов I группы на фоне традиционного лечения происходило только к 13-14 дню (4,80,05 баллов). Общая продолжительность стационарного лечения больных с типичным течением раневого процесса при проведении традиционной терапии составила 14,3±2,2 дней. У больных основных групп лечебная тактика с локальным применением NО- и препарата миелопид приводила не только к более быстрой регрессии клинических симптомов, но и позволила снизить среднюю продолжительность пребывания больных в стационаре до 10,8±1,9 койко-дней у больных четвёртой группы, до 13,2±1,8 и 12,7±2,1 дней - пациентов второй и третьей групп, соответственно.

Рис. 12. Динамика оценки эффективности лечения больных с типичным течением раневого процесса в баллах.

Примечание: I - контрольная группа; II группа - больные, получавшие локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид; III группа - пациенты, получавшие NO-терапию; IV группа - больные, которые получали локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид в сочетании с NO-терапией; р<0,05 между показателями больных до и после лечения; р<0,01 - I и IV групп после лечения.

Анализ результатов лечения показал, что затяжное и хроническое течение гнойных ран регистрировалось у 78 (39,4%) человек из общего числа больных (198 пациентов). Необходимо отметить, что динамика гнойных ран у больных с затяжным течением раневого процесса, главным образом у пациентов с флегмонозно-некротической формой рожи, посттравматическими и послеоперационными ранами, отличалась от таковой при типичном течении: очищение раневой поверхности наблюдалось при традиционном лечении не ранее 12-13 дня (на 8-10 сутки у больных IV группы), появление грануляций - не ранее 14-16 суток (на 10-11 день - в IV группе), а начало эпителизации отмечалось лишь к 16-17 дню (на 11-12 сутки - в IV группе). При этом сроки стационарного лечения больных с затяжным течением гнойных ран составили: 23,2±2,4 дней в первой, 21,2±1,9 - во второй, 21,3±1,4 - в третьей группах, соответственно. В четвёртой группе, у пациентов с затяжным течением раневого процесса, использование предложенного сочетания препарата миелопид и NО-терапии позволило сократить сроки стационарного лечения до 17,3±1,7 суток.

Обширность и глубина поражения мягких тканей у больных гнойными ранами определяла необходимость раннего хирургического закрытия раневой поверхности. Восстановительные операции были произведены у 62% больных. При рассмотрении данных времени подготовки ран к хирургическому закрытию по нозологиям, установлено, что при применении комплекса миелопида и NО-терапии выигрыш во времени составил при типичном течении раневого процесса 2,3-3,2 дня, а в случае затяжного течения и более тяжёлых поражений, таких, как флегмонозно-некротическая рожа, от 5,4 до 6,3 суток.

Учитывая полученные данные, представляло интерес изучить возможные экономические преимущества использования в комплексном лечении гнойных ран (при типичном течении) клинически наиболее эффективного способа локальной иммунокоррекции с применением миелопида и NO-терапии в сравнении с традиционной терапией. Стоимость лечения 1 больного в стационаре по данной схеме была ниже на 24,4%, чем при традиционном лечении.

Таким образом, результаты проведённых исследований показали высокую клиническую эффективность локальной иммунокоррекции у больных с гнойными ранами, приводящую к более быстрому, по сравнению с традиционным лечением, купированию локального воспалительного процесса, а также сокращению сроков и стоимости лечения. Оценка эффективности предложенных способов местного лечения у больных с затяжным и хроническим течением гнойных ран свидетельствует о большей целесообразности сочетанного использования в программах хирургического лечения миелопида и NО-терапии.

Характеристика иммунологических показателей и их оценка в эффективности локальной иммунокоррекции.

Учитывая полученные в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo данные о противовоспалительном и антибактериальном эффектах препа рата миелопид и NО-терапии, нами исследована динамика показателей иммунного статуса больных гнойными ранами на фоне локальной иммунокоррекции.

Как известно, заживление ран является динамичным процессом, в который вовлечены клетки крови, соединительной ткани и эпителия, внеклеточный матрикс, а также различные растворимые медиаторы (Ковальчук Л.В., 2008; Земсков А.М., 2008; Cochrane C., Walker M., 2006). Исследование цитограмм раневой жидкости, взятой интраоперационно, а также в динамике лечения больных с благоприятным (типичным) течением раневого процесса показало, что изменения клеточного состава РЖ имели определенную закономерность (табл.5). Так, в первые часы после вскрытия и дренирования гнойно-воспалительного очага у всех больных в ране преобладал нейтрофильный цитоз со снижением числа жизнеспособных клеток (91,41,5% и 21,151,75% клеток, соответственно). На 3 сутки в цитограммах РЖ больных II-IV групп наблюдалась смена клеточных популяций: снижение числа нейтрофилов, повышение - макрофагов и лимфоцитов, а также количества «живых» клеток. К 6 суткам применения локальной иммунотерапии воспалительно-регенераторный и регенераторный тип цитограмм регистрировался у большинства пациентов. Это сопровождалось значительным снижением количества деструктивных форм нейтрофилов, ростом числа макрофагов и зрелых фибробластов.

При этом использование у больных четвёртой группы комбинированного лечения (миелопид и NО-терапии) позволило получить более выраженный противовоспалительный и прорегенеративный эффекты, чем при изолированном применении обоих способов (табл. 5). После курса локальной терапии с применением миелопида, NО- и их сочетания у всех пациентов отмечались не только статистически достоверные изменения клеточного состава РЖ, но также фенотипа и функциональной активности раневых фагоцитов.

Так, в процессе проведения предложенного лечения, по сравнению с традиционной терапией, наблюдалось улучшение показателей спонтанного и зимозан-индуцированного НСТ-теста (табл. 6), снижение исходно повышенной экспрессии СD95+, СD11b+, СD282+ антигенов и повышение пула HLA-DR+, CD16+ клеток (рис. 13). Кроме того, у пациентов второй и третьей групп по данным цитологического исследования к 8-9 суткам зарегистрировано значительное снижение микрофлоры в ране. У больных четвертой группы на 9 день лечения микрофлора в отпечатках с раневой поверхности не выявлялась.

Таблица 5. Динамика показателей цитограмм на фоне лечения больных с благоприятным (типичным) течением раневого процесса.

Примечание: I группа - контрольная; II группа - локальная иммунокоррекция с миелопидом; III группа - NO-терапия; IVгруппа - миелопид+NO-терапия ; *р<0,05; ** р<0,01 по сравнению с интраоперационными показателями (1 сутки).

В группе контроля раневой процесс по цитологическим данным характеризовался медленным очищением раны от патогенной микрофлоры (на 11-13 сутки), что приводило к сохранению воспалительных явлений и тормозило наступление пролиферативной фазы раневого процесса.

Следует отметить, что при сравнении основных параметров цитограмм больных с затяжным и хроническим течением раневого процесса более неблагоприятные изменения динамики цитологических показателей имели место у больных с флегмонозно-некротической формой рожи. В цитограммах таких пациентов выявлялся высокий процент дистрофических форм нейтрофилов (более 20%) и нежизнеспособных клеток, СD95+клеток (выше 30%), снижение числа СD282+ (менее 40%), отсутствие в очаге воспаления лимфоцитов на 6 сутки лечения, снижение стимулированного НСТ-теста (до 32,73,25%), при сохранении его высокого спонтанного уровня (51,54,5%).

Рис. 13. Динамика показателей раневой жидкости больных с типичным течением гнойных ран на фоне лечения.

Примечание: 1 - показатели в I группе до лечения; 2 - - показатели в I группе после лечения; 3 - показатели во II группе до лечения; 4 - показатели во II группе после лечения; 5 - показатели в III группе до лечения; 6 - показатели в III группе после лечения; 7 - показатели в IV группе до лечения; 8 - показатели в IV группе после лечения; p<0,01 по сравнению с показателями до лечения у больных II, III и IV групп; p<0,05 - в I группе.

Таблица 6. Динамика показателей НСТ-теста раневых фагоцитов на фоне лечения больных с типичным течением раневого процесса.

Примечание: * p<0,05; ** p<0,01 по сравнению с показателями до лечения.

При этом в первые двое суток течения раневого процесса (при благоприятном и неблагоприятном течении) существенной разницы в показателях цитограмм, за исключением числа TOLL-2+ клеток (70-75% и 34-38%, соответственно), не отмечалось. Наиболее выраженные отличия в данных цитограмм регистрировались у большинства пациентов с типичным и неблагоприятным течением гнойных ран на 7-12 сутки, а улучшение указанных показателей на фоне традиционного лечения при хроническом и затяжном характере раневого процесса наблюдалось не ранее 18-20 дня. Позитивная динамика цитограмм у этой категории больных при использовании локальной иммунокоррекции имела место уже на 9-12 сутки и была более выражена при сочетанном применении миелопида и NО-терапии. Особо следует отметить на фоне лечения повышение в интервале 9-12 суток в цитограммах раневого экссудата количества клеток, экспрессирующих TOLL-2 рецепторы (до 43,42,5% - в I группе; до 46,11,5% - во II; до 47,051,5% и 58,31,5% - в III и IV группа, соответственно. При этом более высокий «темп» прироста СD282+ клеток сочетался с более благоприятной клинической динамикой раневого процесса.

Таблица 7. Динамика уровней цитокинов раневых экссудатов на фоне лечения у больных с гнойными ранами при благоприятном течении раневого процесса.

Примечание: * p<0,05; ** p<0,01 по сравнению с показателями до лечения.

Оценивая иммунологическую эффективность предложенных способов локальной иммунокоррекции на цитокиновый статус, следует отметить более выраженную положительную динамику при сочетанном использовании NO-терапии и миелопида (табл. 7), как у больных с благоприятным, так и неблагоприятным течением раневого процесса. Так, на фоне локальной иммунотерапии у всех больных после лечения наблюдалось улучшение показателей исходно нарушенного локального и системного цитокинового статуса с нормализацией последних у 66,7% пациентов II группы (у 43,8% - с затяжным течением гнойных ран), 61,5% и 70,1% - III и IVгрупп (53,3% и 71,4% - с затяжным течением раневого процесса), соответственно.

Вместе с тем, после курса традиционной терапии уровни ИЛ-1в, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-б, ИЛ-1Ra, ИЛ-10 и ТФР-в1 достоверно изменялись (в зависимости от исходного содержания), однако, значений нормы в раневом экссудате и сыворотке крови достигали лишь у 25% и 35% больных, соответственно. Позитивная динамика уровня цитокинов в РЖ при затяжных и хронических гнойных ранах имела место лишь к 14-16 суткам лечения. У 92% больных было установлено сочетание положительной клинической динамики течения раневого процесса и улучшения до нормальных значений показателей локального цитокинового статуса.

Как уже отмечалось, развитие гнойных ран сопровождается значительными нарушениями локальной антимикробной защиты поврежденных тканей. В процессе проведения предложенного комплексного лечения у 94,2% больных с типичным течением гнойных ран к 9-12 суткам отмечалось значительное улучшение показателей продукции антимикробных белков и пептидов в целом более выраженное у пациентов второй и четвертой групп (рис. 14, 15, 17). У больных первой группы положительная динамика регистрировалась только к 14-16 дню в 45% случаев.

При затяжном и хроническом течении гнойных ран более позитивные изменения выявлялись при сочетанном использовании NO-терапии и миелопида. Так, уровень LL-37 в раневой жидкости у больных I, II, III и IV групп после лечения составил, соответственно, 3,45±0,75 мкг/мл, 2,38±0,35 мкг/мл, 2,27±0,25 мкг/мл и 1,45±0,15 мкг/мл. Снижение концентрации дефенсина б в раневой жидкости регистрировалось к окончанию лечения при затяжном течении процесса у пациентов всех групп: до 1,15±0,02 мкг/мл в I группе, до 0,98±0,01 мкг/мл - во второй, до 0,85±0,02 и 0,26±0,01 мкг/мл в третьей и четвертой группах, соответственно. Положительная динамика на фоне лечения была характерна и для продукции лактоферрина: повышение в раневой жидкости его уровня до 22,6±5,5 нг/мл, 34,5±6,45 нг/мл, 36,5±6,5 нг/мл и 48,6±5,5 нг/мл у больных I - IV групп, соответственно.

Рис. 14. Динамика уровня дефенсина б в раневой жидкости и плазме крови больных с типичным течением гнойных ран.

Рис. 15. Динамика уровня LL-37 в раневой жидкости и сыворотке крови больных с типичным течением гнойных ран.

Примечание: 1 - показатели сыворотки крови до лечения; 2 - после лечения; 3 -показатели РЖ до лечения; 4 - показатели РЖ после лечения.

Аналогичная закономерность наблюдалась в отношении уровня миелопероксидазы с повышением его концентрации от исходно сниженной (до 115±25 у.ед.) на 26%, 27,5%, 34% и 54%, в исследуемых группах, соответственно. При этом у больных с типичным течением раневого процесса регистрировалось снижение исходно повышенного уровня миелопероксидазы. Однако, статистически значимых различий, как в её системной, так и в локальной продукции на фоне различных способов лечения установлено не было.

При затяжном течении гнойных ран в сыворотке крови большинства больных (71%) II - IV групп нормализация уровней АМП наблюдалась к 14-16 суткам, при использовании традиционного лечения - лишь к 20-21 суткам у 36,4% пациентов.

Рис. 16. Динамика уровня NО в раневой жидкости и сыворотке крови больных с гнойными ранами.

Примечание: 1 - показатели сыворотки крови до лечения; 2 - после лечения; 3 -показатели РЖ до лечения; 4 - показатели РЖ после лечения; А - пациенты с исходно высокими показателями; В - пациенты с исходно низкими показателями.

Следует отметить, что на фоне лечения происходило «выравнивание» в раневом экссудате и сыворотке крови концентрации метаболитов оксида азота: снижение исходно повышенных показателей и повышение исходно сниженных (рис.16). При этом динамика указанных параметров у больных третьей и четвёртой групп была более выражена при исходно сниженных показателях, что, очевидно, связано с введением экзогенного оксида азота в раневой очаг. Нормализации уровня NО у пациентов, получавших традиционное лечение, зарегистрировано не было.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению матриксных металлопротеиназ как белков тканевого ремоделирования в развитии ряда патологических состояний (Ковальчук Л.В., 2007; Levy М.М., 2005). Однако их роль в регуляции процессов репаративной регенерации тканей изучена недостаточно и остается дискутабельной. Известно, что матрикс металлопротеиназа-3 (ММР-3) катализирует деградацию многих компонентов соединительной ткани, включая протеогликаны, коллаген типов II, IV, IX, XI, Э ламинин и фибронектин, а также оказывает опосредованное действие на деградацию экстрацеллюлярного матрикса через активациию проколлагеназы-1 (Соболева Г.М., Сухих Г.Т., 2007; Antiopi V., Allison J., 2006; Liew F.Y., Brint E.K., 2005).

При анализе показателей ММР-3 до лечения в сыворотке крови и РЖ больных (рис. 18) было выявлено повышение ее концентрации (до 28,4±7,8 нг/мл в РЖ и до 16,7±2,5 нг/мл - в сыворотке крови). Вероятно, данные изменения носят адаптивный характер и направлены на ликвидацию последствий повреждения и стабилизацию репарации. У здоровых лиц уровень ММР-3 составил 0,8±0,5 нг/мл. При этом существенная разница в концентрации ММР-3 в РЖ больных с различными вариантами течения гнойных ран фиксировалось, как правило, между 5-ми и 7-ми сутками, а уровень ММР-3 в раневой жидкости выше 15 нг/мл после 7 дня был характерен лишь для пациентов с затяжным и хроническим течением раневого процесса. Анализ динамики ММР-3 у больных гнойными ранами в процессе лечения показал, что восстановление показателя матрикс металлопротеиназы-3 при неосложнённом течении раневого процесса начинается с 5-7 суток и завершается к 10-13 суткам лишь у 52% больных при традиционном лечении гнойных ран.

Рис. 17. Динамика уровня лактоферрина в раневой жидкости и сыворотке крови больных с типичным течением гнойных ран.

Рис. 18. Динамика уровня ММР-3 в раневой жидкости и сыворотке крови больных с типичным течением гнойных ран.

Примечание: по левой оси ординат - уровень лактоферрина (нг/мл) в сыворотке крови, по правой - в раневой жидкости.

После применения оптимизированного комплексного лечения значимое снижение концентрации ММР-3 отмечалось уже к 8-9 суткам у больных с благоприятным течением раневого процесса и не ранее 12-14 дня - при затяжном и хроническом течении (рис. 18). Так, после традиционного лечения флегмонозно-некротической формы рожи и посттравматических ран концентрация ММР-3 ниже 5 нг/мл в сыворотке крови и менее 10 нг/мл в РЖ регистрировались в среднем на 21,5±2,4 день лишь у 21,2% и 15,2% больных, соответственно. Тогда как в группах сравнения показатели ММР-3 на фоне лечения изменялись статистически более значимо уже на 10-11 сутки, а в концентрациях ниже 5 нг/мл, как в раневой жидкости, так и в сыворотке крови после лечения (на 17- 19 сутки) определялись у 63,3% пациентов II - IV групп.

Полученные результаты позволили нам рассматривать показатель ММР-3 более 15 нг/мл в качестве одного из важных критериев развития затяжного и хронического течения раневого процесса при гнойных ранах. Как показали результаты, комбинация из трёх и более приведенных лабораторных показателей (табл. 8) с высокой долей вероятности (92,6%) свидетельствовала о развитии у больных затяжного и/или хронического течения гнойной раны.

Таблица 8. Показатели прогноза затяжного и/или хронического течения раневой инфекции у больных гнойными ранами различного генеза.

Оценка исходного состояния системного иммунитета показала наличие у 77,8% больных гнойными ранами после вскрытия абсцессов и флегмон мягких тканей признаков иммунной дисфункции. При этом выявлено достоверное снижение числа CD4 (29,91,6%) , CD8 (17,11,2%), CD19(9,11,2%) - позитивных клеток, а также нарушение функциональной активности Т- лимфоцитов в виде снижения экспрессии ранних (CD25 - до 2,60,3%; CD71 - до 24,9±1,1% ) и поздних (HLA-DR - до 20,91,15%) индуцибельных маркеров. При этом у больных, раневой процесс которых характеризовался неблагоприятным течением, было отмечено более выраженное снижение содержания CD4+ и CD25+ субпопуляций на 42% и 38% от вышеприведенных данных. В целом признаки иммунной дисфункции, по экспрессии иммунорегуляторных молекул, у данной категории пациентов регистрировались в 88,5% случаев. Кроме того, иммунные нарушения у 68,3% больных с благоприятным течением раневой инфекции проявлялись повышением фагоцитарной активности (ФА) МНФ крови (до 88,71,7%), гиперэкспрессией CD95 рецепторов, отражающих процесс негативной активации клеток. Снижение ФА (до 30,51,5%) было выявлено у 22% пациентов лишь с неблагоприятным течением раневой инфекции. При этом следует отметить, что разброс данных системного иммунитета при послеоперационных ранах был достаточно широк, поскольку чаще всего они являются следствием какого-либо заболевания, требующего хирургического лечения, в связи с чем наибольшую значимость имело определение показателей локального иммунного статуса.

На фоне лечения у больных всех групп наблюдалось достоверное повышение числа лимфоцитов, экспрессирующих стабильные (CD4+, CD8+) и активационные маркеры (CD25+, CD71+, HLA-DR+). При благоприятном течении раневого процесса регулирующее влияние NО-терапии и её сочетанного использования с миелопидом было более выраженным и имело место у всех больных (более чем у 90% - II и III групп, соответственно). При затяжном и хроническом течении гнойных ран восстановление показателей Т-системы иммунитета регистрировалось к окончанию лечения в 68,8% случаев при использовании миелопида, в 73,3% - NО-терапии и в 85,7% - при сочетанном применении миелопида и экзогенного оксида азота. В контрольной группе изменения показателей Т- звена иммунитета были менее выражены, а полная нормализация числа CD25+, CD71+, CD95+, HLA-DR+ - клеток наблюдалось у 59% больных с типичным течением раневой инфекции и лишь у 45,5% - с затяжными и хроническими гнойными ранами. Аналогичная закономерность отмечалась и в отношении ФА МНФ периферической крови, восстановление которой (снижение показателей до 57,87,8%) регистрировалось к 9-10 суткам у всех больных II-IV групп при благоприятном течении гнойных ран и только у 67% I группы. При осложненном течении раневого процесса нормализация исходно сниженной ФА (повышение до 51,74,2%) имела место лишь при местном применении сочетания миелопида и экзогенного NО.

Кроме того, у больных с типичным течением раневого процесса отмечалось снижение на фоне лечения исходно повышенного числа CD95+ и CD282+ клеток. При неблагоприятном течении гнойных ран восстановление числа CD95+клеток периферической крови наблюдалось у всех больных четвертой группы и у большинства пациентов второй (68,8%) и третьей (80%) групп. Следует отметить, что уменьшение числа МНФ, экспрессирующих TLR2-рецепторы, в среднем с 70,57,4% до 48,33,5% регистрировалось у всех пациентов хроническими гнойными ранами при их исходном повышении, однако достоверных различий по группам установлено не было.

Достоверная положительная динамика после предложенного лечения отмечалась также в отношении В-лимфоцитов (CD19+ клеток) и сочеталась с восстановлением исходно нарушенной продукции IgG, которая регистрировалась на протяжении всего раневого процесса у больных посттравматическими ранами (повышение IgG от +53% до +78%) и при флегмонозно-некротической форме рожи (снижение IgG на 44% - 52%). При этом значительных различий по сравнению с традиционным лечением установлено не было. На фоне лечения происходило восстановление в РЖ концентрации IgG (повышенной до 1,150,33 г/л при типичном течении ран, сниженной до «следовых» значений - при неблагоприятном). Указанная динамика была более значима на фоне комбинированного лечения препаратом миелопид и NО (восстановление уровня IgG в I группе до 0,70,03 г/л; во II - до 0,550,05 г/л; в III и IV группах до 0,50,09 и 0,450,05 г/л, соответственно; p< 0,05).

Полученные данные показали выраженное положительное влияние локального применения препарата миелопид, NО-терапии, а также их комбинации на восстановление иммунологической реактивности больных с гнойными ранами, приводящее к значительному улучшению, а в ряде случаев к нормализации показателей иммунитета. При этом достоверно лучший клинический эффект, подтвержденный лабораторными данными, был получен при сочетанном применении препарата миелопид и NО-терапии: восстановлению показателей локального и системного иммунитета на 9-12 день при типичном течении раневого процесса и на 14-16 сутки - при затяжных и хронических гнойных ранах.