Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша

Размещено на http://www.allbest.ru/

03.00.07 - микробиология

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша

Каратаев Геннадий Иванович

Москва 2008

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук.

Научный консультант член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Смирнов Георгий Борисович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, Миронов Александр Сергеевич профессор

Доктор медицинских наук Мазурова Изабелла Константиновна

Доктор медицинских наук Шагинян Игорь Андроникович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита диссертации состоится 2008 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098 г. Москва ул. Гамалеи д.18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Русакова Е.В.

Общая характеристика работы

генетический изменчивость возбудитель коклюш

Актуальность проблемы

Коклюш - респираторное заболевание людей, вызываемое грам-отрицательными бактериями Bordetella pertussis. Бактерии B.pertussis передаются от человека к человеку воздушно-капельным путем. Профилактика коклюша входит в национальный календарь плановых прививок и обеспечивается программами массовой вакцинации детей. Несмотря на это, циркуляция возбудителя коклюша в популяции не уменьшается. Ежегодно в мире регистрируется до 48,5 миллионов заболеваний, из них до 300 000 случаев заканчиваются летальным исходом (Crowcroft N.S. et al. 2003). Чаще, и в более тяжелой форме, коклюшем болеют дети первого года жизни, но в последнее время отмечается рост числа лабораторно подтвержденных случаев коклюша у подростков и взрослых (Cherry JD, Heininger U, 2004). Эпидемиологические исследования показали, что последние являются основным резервуаром инфекции для заражения наиболее восприимчивых к заболеванию новорожденных (Mattoo S,Cherry JD, 2005). Отмечены случаи бессимптомного носительства B.pertussis (Heininger UW et al., 2004). Активно изучаются механизмы носительства и персистенции возбудителя в организме человека. Установлена связь между переживанием бактерий Bordetella внутри эукариотической клетки и экспрессией некоторых факторов вирулентности возбудителя (Bassinet L, 2000).

Одной из характерных особенностей возбудителя коклюша является высокая степень изменчивости его фенотипических признаков. Бактерии с разной вирулентностью, формой колоний и способностью к гемолизу эритроцитов были выделены на разных стадиях заболевания, при экспериментальном заражении лабораторных животных и при культивировании in vitro (обзор Wardlaw A, Parton R, 1988). Такие бактерии были названы фазовыми вариантами (Lacey B. 1960), а их переход из одной фазы в другую - фазовым переходом.

На протяжении последних 20-и лет проведены многочисленные молекулярно-генетические исследования структуры и экспрессии генов вирулентности. Установлено, что большинство из них регулируется на уровне транскрипции, управляемой двухкомпонентной сенсорной системой BvgAS Bordetellа (Cotter PA, Miller JF, 2001, Cummings CA et al., 2006).

Регуляция экспрессии генов вирулентности Bordetellа изучена главным образом в экспериментах in vitro. Только в одной работе предпринята попытка анализа транскрипции bvgAS-зависимых генов cya, fha, prn и ptx в процессе размножения бактерий в легких мышей после их аэрозольного заражении вирулентным штаммом B.pertussis (Wendy L, Stibitz S, 2005). Отсутствие адекватной модели затрудняет изучение роли отдельных факторов вирулентности и фазовых переходов в формировании и развитии инфекционного процесса в экспериментах на животных. Остается открытым вопрос о механизме формирования носительства (персистенции) возбудителя коклюша в организме человека (Mattoo S, Cherry JD, 2005, Cummings CA et al., 2006).

Установлена структурная организация и последовательности хромосом B.pertussis, B.parapertussis и B.bronchiseptica, что позволило идентифицировать повторяющиеся IS-подобные элементы и геномы профагов в хромосомах микроорганизмов рода Bordetella (McLafferty MA et.al.,1989, McPheat WL et.al., 1989, Parkhill JM et al., 2003). Использование современных методов молекулярного анализа (пульс-электрофореза и IS-типирования и гибридизации) выявило значительные отличия структуры хромосом бактерий B.pertussis, выделенных в разные периоды времени и в различных географических регионах (Mary M et al., 2006). Изменения структуры хромосомы обнаружены и после пассажа бактерий B.pertussis на питательных средах in vitro (Brinig MM et al., 2006). Авторы полагают, что перестройки являются следствием рекомбинаций, индуцированных IS-подобными элементами B.pertussis. События гомологичной и «незаконной рекомбинации», индуцированные IS-элементами, обеспечили редуктивную эволюцию геномов микроорганизмов рода Bordetella (Cummings CA et al., 2004, Mary M et al., 2006). Высказываются предположения о формировании некоторых фазовых вариантов B.pertussis в результате перемещения (исключения) IS-элементов в оперон bvgAS B.pertussis (Stibitz S et al., 1989, Monack DM et al., 1989, McGillivray DM al., 1989). Однако экспериментально эти предположения не были подтверждены.

Актуальность проведенных исследований определяется необходимостью расширения знаний об эпидемиологически значимом возбудителе инфекционного заболевания человека. Идентификация мобильных генетических элементов B.pertussis (IS-элементов, Tn-подобных структур, бактериофагов), определение факторов, влияющих на частоту перемещения МГЭ в клетках B.pertussis, изучение роли МГЭ в регуляции вирулентности возбудителя коклюша, позволит понять механизмы изменчивости и адаптации бактерий возбудителя коклюша к среде обитания.

Используемые в настоящее время бактериологические методы лабораторной диагностики коклюша недостаточно чувствительны, а серологические методы недостаточно специфичны. Идентификация ДНК B.pertussis с помощью методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Xuan Qin et al., 2007) не нашла широкого применения в отечественной практике здравоохранения (И.Н. Лыткина и др., 2004). Необходимость дальнейшего совершенствования лабораторной диагностики возбудителя коклюша, в том числе, методов анализа фазовых вариантов бактерий B.pertussis in vitro и in vivо, определяет актуальность прикладного раздела исследования. Тест-системы для обнаружения ДНК возбудителя коклюша в клиническом материале с помощью ПЦР и методы выявления бактерий B.pertussis, содержащих инсерцию IS-элемента в генах вирулентности, будут использованы для изучения носительства возбудителя коклюша, диагностики атипичных форм заболевания, определения структуры и механизмов формирования резервуаров инфекции.

Цель исследования Выявление генетических основ и молекулярных механизмов изменчивости B.pertussis и роли мобильных генетических элементов (МГЭ) в регуляции экспрессии генов вирулентности возбудителя коклюша.

Задачи исследования:

1. Выделение и характеристика повторяющейся последовательности (RS) и Tn - подобных элементов хромосомы B.pertussis.

2. Разработка экспериментального метода для регистрации событий перемещения RS-элементов в специфические сайты хромосомы B.pertussis. Определение факторов, влияющих на перемещение RS-элементов в оперон bvgAS, регулирующий вирулентность B.pertussis.

3. Выделение мутантов B.pertussis, содержащих инсерцию RS -элемента в опероне bvgAS.

4. Выделение и характеристика новых бактериофагов и лизогенности микроорганизмов рода Bordetella.

5. Конструирование тест-систем для идентификации и характеристики ДНК бактерий B.pertussis в биологическом материале от носителей и больных коклюшем детей и взрослых с помощью полимеразной цепной реакции.

Научная новизна

- клонированы повторяющаяся последовательность и транспозоно-подобная структура хромосомы B.pertussis, сконструированы их генетически маркированные варианты. Показано, что изолированные нами RS и Tn-подобная последовательности являются мобильными генетическими элементами, сходными с МГЭ других бактерий. МГЭ B.pertussis способны к RecA- независимым перемещениям, индуцируют образование дупликаций, делеций, инверсий прилегающего генетического материала и формирование коинтегратов в бактериях E.coli. Установлена зависимость RS- индуцируемых событий рекомбинации от фенотипа бактерии-хозяина. Cконструирован штамм E.coli, продуцирующий функционально-активную транспозазу RSBP B.pertussis;

- идентифицированы события спонтанного перемещения RS- элементов в сctagg сайт оперона bvgAS вирулентных бактерий B.pertussis и выделены инсерционные Bvg- мутанты B.pertussis. Установлено, что частота перемещения RS-элементов зависит от функционирования оперона bvgAS и условий культивирования бактерий B.pertussis. Перемещение RS-элементов не регистрируется в бактериях, содержащих мутацию в опероне bvgAS. Показано, что бактерии B.pertussis могут переходить в авирулентное состояние в результате интеграции RS-элементов в оперон bvgAS, регулирующий экспрессию генов вирулентности бактерий;

- выделены и охарактеризованы новые бактериофаги из бактерий международного штамма B.pertussis Tohamа I (Т) и конвертанта B.parapertussis 17903 (К), установлена лизогенность бактерий и структура геномов описанных ранее бактериофагов B.pertussis и B.bronchiseptica. Показано, что геномы всех изученных бактериофагов Bordetella, за исключением бактериофага К, идентичны. Геном бактериофага К отличается от генома Т и всех охарактеризованных бактериофагов Bordetella. Бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica являются полилизогенами. Геном профага К находится в хромосоме клетки-хозяина, тогда как геном Т присутствует, скорее всего, в состоянии плазмиды и утрачивается в процессе культивирования большей частью бактериальной популяции. По меньшей мере, один из выделенных бактериофагов B.pertussis, родственный Т, способен лизогенизировать бактерии B.parapertussis, интегрируя фрагмент генома в хромосому, и вызывая изменение свойств возбудителя паракоклюша. Свойства охарактеризованных бактериофагов позволяют отнести их к классу мобильных генетических элементов.

Практическая значимость

Показана целесообразность использования разработанных в процессе выполнения работы тест-системы и метода выявления ДНК бактерий B.perussis, находящихся в различных фазовых состояниях, для диагностики заболевания, выявления носителей возбудителя коклюша, определения роли фазовых состояний в патогенезе и персистенции возбудителя.

Использование разработанных тест-систем для лабораторной диагностики коклюша показало их высокую эффективность в сравнении с бактериологическими методами и позволило выявить возбудитель коклюша примерно у 7% «практически здоровых» детей и более чем у 30% больных детей с диагнозом острое респираторное заболевание. Полученные нами и другими авторами результаты указывают на то, что стертая и атипичная формы коклюша является причиной значительного числа заболеваний с симптомами длительного кашля. Длительно кашляющие дети и взрослые, бессимптомные носители бактерий B.perussis, наряду с больными типичной формой коклюша, являются источником инфекции.

Разработанный экспериментальный подход позволяет идентифицировать бактерии, содержащие инсерцию RS-элементов в оперон bvgAS, регулирующий транскрипцию генов вирулентность возбудителя коклюша. Идентификация инсерционных Bvg- мутантов и мутантов по другим генам вирулентности B.perussis на разных стадиях заболевания или в организме носителей позволит определить роль RS-индуцированного мутагенеза при формировании персистирующих форм бактерий Bordetella. Исключение RS-элемента из структуры мутантного гена приводит к восстановлению вирулентного фенотипа, что может вызывать развитие инфекционного процесса в организме хозяина. Определение относительного числа инсерционных мутантов B.perussis у носителей и больных на разных стадиях заболевания может оказаться важным критерием для оценки эпидемиологической значимости носительства Bvg- мутантов и разработки новых подходов к профилактике коклюша.

Подготовлена фармакопейная статья и инструкция по применению «Тест-системы для экспресс-индикации возбудителя коклюша методом полимеразной цепной реакции», одобренные Советом по внедрению научных достижений в практику ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 7 февраля 2008 г., протокол №3.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на конференции National Institute of Allergy and Infection Diseases USA research conference , June 24-30, 2006; 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000; 2-м Всесоюзном симпозиуме теоретических и прикладных аспектов молекулярной биологии, Самарканд 1991; Всесоюзной школе-семинаре «Молекулярная биология и медицина», Ленинград, 1990; FEMS-symposium Pertussis, Berlin, 1988; 13-ой Всесоюзной конференции по электронной микроскопии «Биология и медицина», Москва 1988.

Апробация диссертации состоялась 13 декабря 2007г на совместной научной конференции отделов медицинской микробиологии, генетики и молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 34 работы, из которых 21 в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура работы

Диссертационная работа изложена на 292 страницах, содержит введение, 3 главы («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение») заключение и выводы. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 16 таблицами. Список литературы содержит 490 ссылок, из них 19 в изданиях на русском языке.

Основное содержание работы

1. Материалы и методы

Штаммы и условия культивирования. В работе использованы штаммы E.coli, B.pertussis, B.parаpertussis B.bronchiseptica из коллекции ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Бактерии E.coli культивировали на плотной питательной среде L(Дифко), на минимальной среде с аминокислотами или на жидкой питательной следе L(Дифко) (Миллер ДМ, 1984). Бактерии рода Bordetella культивировали на плотной питательных средах КУА (казеиново-угольный агар), БЖ (Борде-Жангу) с добавлением или без добавления 10% дефибринированной крови барана. Инсерционный мутанты E.coli metY:: pKK3 отбирали и анализировали на минимальной среде, содержащей 1 мкг/мл метионина. В качестве индикаторных сред для характеристики Pts- мутантов использовали среды Мак Конки и среду с тетразолием (Bolshakova TN, 1992), добавляя необходимые углеводы (глюкозу и фруктозу) до 1%.

Для титрования фагов Bordetella использовали полусинтетическую среду типа Cohen- Wheeler с добавлением 0.5% агара (Дифко).

Конструирование изогенных штаммов. Изогенные RecA- и RecBC-- штаммы E.coli конструировали, используя скрещивание с донорами KN502 (TetR) или GA87 (Thy+). Изогенные штаммы бактерий FruS1- и PtsH5- сконструированы в соответствии со стандартной схемой трансдукции селективных маркеров донорных штаммов LBG1605 (Glu-) и LBG1156 (Man+ ). Изогенные штаммы бактерий KmR PtsH- (LBG1623-H7) и СmR PtsI- (LBG1623-I3) сконструированы путем инсерции in vitro последовательности генов kan и cad в структуру генов ptsH и ptsI оперона pts бактерий LBG1623, любезно предоставленных нам Dr. Barry L. Wanner Department of biological sciences, Purdue University, USA. Изогенные варианты, содержащие инсерцию metY::pKK3 и другие мутанты E.coli, конструировали с помощью Р1vir трансдукции c использованием соответствующих доноров. Штаммы бактерий, содержащие рекомбинантные плазмиды pOX38::pKK3, конструировали с помощью коньюгации коинтеграта в бактерии соответствующего реципиентного штамма.

Бактерии, содержащие одну или несколько плазмид, получены с помощью трансформации соответствующих реципиентных штаммов.

Рестрикционный анализ, лигирование, электрофорез ДНК, саузерн- и гибридизацию in situ проводили в соответствии с методическим руководством ( Маниатис Т и др., 1984).

Генетические манипуляции. Трансформацию клеток E.coli плазмидной ДНК или лигированной смесью проводили в соответствии с руководством (Маниатис Т и др., 1984). Процедуры коньюгации и P1vir - трансдукци бактерий E.coli проводили по стандартным методикам (Миллер ДМ, 1984) или использовали модификации, описанные в соответствующих разделах главы «Результаты и обсуждение». Для отбора рекомбинантов (трансдуктантов, трансформантов и трансконьюгантов) использовали селективные среды, содержащие антибиотики, или минимальные питательные среды на основе среды М9 (Миллер ДМ, 1984). Бактерии B.pertussis трансформировали методом электропорации на приборе (Biorad США), согласно инструкции изготовителя.

Выделение ДНК плазмид, хромосомы, бактериофагов и продуктов ПЦР из геля проводили с помощью систем Wizard Plus SV MiniPrepsDNA purification system (Promega США), Wizard Plus MiniPrepsDNA purification system (Promega США) и Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega США).

Клонирование последовательностей ДНК проводили в соответствии с руководством (Маниатис Т и др., 1984). Инвертированные повторяющиеся последовательности ДНК хромосомы B.pertussis 475 клонировали в соответствии с методикой (Ohtsubo H, Ohtsubo E, 1976).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили, в соответствии с рекомендацииями (Mьller FM, 1997) на приборе «Терцик» (Россия) с использованием праймеров, синтезированных АО «Синтол».

Определение нуклеотидной последовательности. Автоматическое секвенирование проводили на прибоер 373А Automatic Sequencer (Applied Biosysthems, USA) с использованием реактивов Dye Deoing Terminator ABI sequencing Kit с Taq-полимеразой FS (Perkin Elmer, USA). Для реакции использовали продукт амплификации ДНК или плазмиды, очищенные в соответствии с приведенной выше методикой.

Синтез и очистка транспозазы RSBP из бактерий E.сoli BL21/pET32 ORF1. Ночную культуру клеток рекомбинантного штамма, выращенную при 37оС в L бульоне с ампициллином, разводили в 100 раз и подращивали 3 часа. Затем добавляли IPTG до концентрации 1mM и культивировали еще 3 часа.

Очистку транспозазы из нерастворимой фракции бактерий E.сoli BL21/ pET32ORF1 проводили с помощью хроматографии на MS-His агарозе (Promega-V8500) в присутствии 6М мочевины в соответствии с инструкцией фирмы производителя. Белок анализировали методом электрофореза в 12% PAAG-геле в денатурирующих условиях по стандартной методике (Laemmli UK, 1970).

Лейкоцитозстимулирующую активность (ЛСА) коклюшного токсина, активность термолабильного токсина (ТЛТ) и видоспецифические агглютиногены бактерий B.pertussis определяли в соответствии с “Инструкцией по проверке биологических свойств вакцинных штаммов B.pertussis”. Для определения видоспецифических агглютиногенов использовали сыворотки диагностические коклюшные и паракоклюшные к агглютиногенам 1.2.3 и 14, адсорбированные, сухие (ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН).

Получение фагов Bordetella в высоком титре и изучение их свойств проводили в соответствии с методами, разработанными Синяшиной ЛН и др., 1982.

Приготовление препаратов ДНК и бактериофага для электронной микроскопии осуществляли по методике (Davis R, 1971).

Исследования клинических образцов. Для исследования использовали смывы с назофарингеальных декроновых тампонов. Взятие материала проводили в соответствии с «Требованиями к взятию и транспортировке материала для лабораторной диагностики коклюша» Комитета Здравоохранения Москвы от 25 ноября 2002 года № 539/№ 230.

Выделение ДНК из клинического материала, проведение ПЦР и учет результатов описаны в ФСП и Инструкции по применению «Тест-системы для экспресс-индикации возбудителя коклюша методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) “МастерК”»

Нерадиоактивное мечение и гибридизацию ДНК-зонда проводили по методике, разработанной (Вейко НН и др., 1989).

Статистическую обработку результатов . Использованы методы математической статистики, принятые в биологии и медицине (Гланц С., 1999).

2. Результаты и обсуждение

Повторяющиеся последовательности и транспозоно-подобные элементы B.pertussis.

Электронно-микроскопический анализ ДНК B.pertussis 475 и Tohama I выявил большое число инвертированных друг к другу повторяющихся последовательностей размером около 1.1 т.п.н., равномерно распределенных по хромосоме. Одна из структур, содержащих два инвертированных повтора, обнаружена нами вблизи оперона bvgAS, контролирующего вирулентность возбудителя коклюша.

Клонирование повторяющейся последовательности и транспозоно-подобного элемента хромосомы B.pertussis 475. Конструирование генетически маркированных RSВР и TnBP- элементов.

Для клонирования повторяющейся последовательности хромосомы B.pertussis 475 использован метод Ohtsubo H. , Ohtsubo E. (1976). Двунитевые фрагменты, сформированные в результате обработки S1-нуклеазой гомодуплекса ДНК B.pertussis 475, содержащей инвертированные повторы, клонированы в векторе рНС79. Структура трех характерных рекомбинантных плазмид pNK1, рМК2 и рМК1, определенная с помощью рестрикционного анализа, Саузерн - гибридизации, электронной микроскопии и частичного секвенирования, представлена на рисунке 1. Последовательность RSВР идентична последовательностям RS1 и RS2 (McLafferty MA et al., 1988, McPheat W et al., 1989).

Рисунок 1. Структура плазмид, полученных в результате клонирования повторяющейся последовательности B.pertussis 475 в плазмиде рНС79.

Cos - фрагмент последовательности вектора рНС79, К10F и K10R - специфические праймеры RSBP.

Транспозоно-подобный элемент (TnBP) обнаружен нами в составе BamHI фрагмента хромосомы B.pertussis 475, содержащего последовательность оперона bvgAS - регулятора транскрипции генов вирулентность бактерий рода Bordetella. Показано, что TnBP стимулирует образование recA - независимых делеций и инверсий в составе рекомбинантной плазмиды, содержащей BamHI фрагмент хромосомы. TnBP состоит из двух инвертированных друг к другу последовательностей, размером 1053 п.н. (RSBP) и 402 н.п. (RSBPi), фланкирующих внутреннюю область хромосомы 731 п.н. (рис. 2). Для дальнейшего изучения свойств RSBP и Tn-подобного элемента были скоструированы их генетически маркированные варианты. Структура рекомбинантной плазмиды рКК3, содержащей маркированный TnBP, представлена на рисунке 2.

Для конструирования маркированной, функционально активной производной RSBP, проведен компьютерный анализ последовательностей 238-и копий RS хромосомы B.pertussis Tohama I, позволивший предположить, что транспозазу RSBP B.pertussis размером 316 а.к. кодирует наибольшая из трех ORF - последовательность ORF1. Для проверки этого предположения сконструированы мутанты, содержащие инсерции гена kan, внутри или вне ORF1 RSBP B.pertussis, клонированные в составе плазмид pMu5 и pMu6, соответственно (рис. 2). Дальнейшие эксперименты показали, что только последовательность RSBP, содержащая интактную ORF1, сохранила способность индуцировать формирование межплазмидных коинтегратов и коинтегратов между плазмидой и хромосомой E.coli (см. ниже).

Рисунок 2. Физическая карта плазмид рКК3, pMu, pMu5 и pMu6, содержащих генетически маркированные элементы TnBP и RSBP.

ORF1 и Д ORF1- интактная и делетированная рамка считывания, кодирующая транспозазу RSBP; Xma*III - сайт рестрикразы, нарушенныу в результате лигирования с BamH1 сайтом последовательности гена kan; K10F и K10R- специфические праймеры для амплификации фрагмента последовательности RSBP

Cвойства RSВР и TnBP-элементов B.pertussis в бактериях E.coli.

Основное свойство мобильных генетических элементов, к числу которых, по нашему предположению, относятся RSВР и TnBP- элементы B.pertussis - их способность перемещаться между геномами и внутри одного генома. Часто, перемещение МГЭ сопровождается изменением структуры прилегающих к нему областей, проявляющееся в виде дупликаций, делеций и инверсий последовательностей ДНК мишени. Перемещение МГЭ может происходить без образования промежуточных продуктов, или сопровождаться формированием коинтегратов между ДНК донора и реципиента МГЭ (Berger B, Haas D, 2001). Для изучения событий транспозиции чаще всего используют перемещение МГЭ из плазмиды в хромосому или между двумя плазмидами.

Транспозиция (интеграция) RSВР и TnBP-элементов B.pertussis в хромосому E.coli.

Перемещение RSВР и TnBP- элементов B.pertussis в хромосому бактерий E.coli регистрировали без элиминации плазмиды-донора или после ее элиминации. Во всех случаях для доказательства хромосомной локализации RSВР, TnBP или плазмиды использовали выделение плазмидной ДНК, Р1vir трансдукцию, Саузерн-гибридизацию, ПЦР и секвенирование продуктов ПЦР.

Первая модель регистрировала события спонтанной транспозиции TnBP из плазмиды рКК3 (рис.2) в хромосому recA мутантов HfrH E.coli KS721. События транспозиции TnBP фиксировали в экспериментах по переносу маркера транспозона TnBP, переместившегося в хромосому E.coli KS721, в процессе скрещивания HfrH E.coliKS721/pKK3 х E.coli478. Изучение структуры хромосомы трансконьюганта 478-5 методами гибридизации и ПЦР показало, что она содержит только последовательность TnBP и не содержит последовательности векторной плазмиды, а структура транспозона в составе хромосомы 478-5 не отличается от структуры TnBP в составе плазмиды - донора. Эксперименты выявили высокую нестабильность транспозантов в бактериях E.coli478. Структура рекомбинантной хромосомы более стабильна в бактериях реципиента E.coli GA87 RecBCsbcB.

Вторая и третья экспериментальные модели представляют собой варианты использования метода «спасения маркера» для идентификации RSВР-индуцированных коинтегратов плазмиды рКК3 с хромосомой E.coli, основанного на применении различных методов элиминации плазмиды-донора.

Первый способ элиминации плазмид основан на подавлении их репликации в результате обработки бактерий коумермицином (Данилевская О, Грагеров А, 1980). В работе использованы RecA+ и RecA- производные штаммов Hfr KS721/pKK3 и F-5097/pKK3. Результаты экспериментов представлены в таблице 1. Частоту N1 определяли как отношение числа KmR бактериальных клонов, выросших на L-агаре с канамицином после обработки бактерий коаумермицином, к числу бактерий, выросших на L-агаре без антибиотика. Частота «спасения маркера» N2 = (n2/ n1)х N1 , где n1 и n2 - число проверенных и бесплазмидных бактериальных клонов, соответственно.

Из таблицы 1 видно, что частота «спасения маркеров» плазмиды рКК3 изменяются незначительно в зависимости от recA генотипа бактерий E.coli. Подавляющее большинство бесплазмидных клонов несли оба маркера устойчивости - маркер KmR TnBP и плазмидный маркер АрR. Среди них были обнаружены ауксотрофные мутанты. Один из бесплазмидных мутантов KmRApR KS721::pKK3, с наиболее часто встречающимся фенотипом, названным нами MetY (см. «Мат. и методы»), выбран для дальнейшего анализа. Для локализации места интеграции плазмиды рКК3 в хромосому E.coli проведён комплементационный анализ мутации MetY в штамме 5097::pKK3 с помощью генов, клонированных в составе бактериофага gt11 коллекции Kochara Y. (коллекция ВНИИ Генетика). Фенотип MetY+ был восстановлен после трансдукции фагом 386, содержащим ген metY+, что позволило картировать инсерцию плазмиды в область структурного гена metY. Показано, что передача хромосомных и плазмидных маркеров в экспериментах Р1vir трансдукции от донора KmRApR MetY KS721:pKK3 проходила совместно с частотой 25-100%, независимо от генотипа реципиента, что указывает на хромосомную локализацию плазмиды рКК3 в гене metY. Структура коинтеграта 5097:pKK3 определена в результате секвенирования продуктов ПЦР с праймеров, представленных на рисунке 3.

Таблица1. Значения частот «спасения маркера» (N2) плазмиды рКК3 в бактериях E.coli.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 3. Структура коинтеграта хромосомы KmRApR E.coli cХ5097 и плазмиды pKK3.

Стрелки с изломом - праймеры FmetY ,RmetY, LRSBP, RRSBP; вертикальные стрелки указывают положение сайтов рестрикции Bgl II, использованных для клонирования интегрированной структуры.

Аналогичные результаты получены нами (см. ниже) при элиминации плазмид рКК3 из клеток мутанта recBC sbcB E.coli в результате их культивирования при 42С0.

При выращивании бактерий MetY- E.coli без антибиотиков наблюдали реверсии к фенотипу MetY+. Минимальные частоты реверсий (10-9 - 3x10-8) регистрировали в бактериях GA87(recA+recBCsbcB), 5099(recA+recBC) и KS721(recArecBC+), а максимальные (2х10-2) в бактериях 5097(recA+recBC+). Этот результат подтверждает стабилизацию рекомбинантных структур, содержащих RSBP, в RecBC SbcB мутантах или (и) указывает на различия в структуре коинтегратов, сформированных в разных штаммах E.coli.

Таким образом, в условиях подавления репликции плазмиды-донора в бактериях E.coli наблюдается, преимущественно интеграция плазмиды с хромосомой хозяина. Коинтеграт содержит плазмиду, фланкированную двумя прямыми копиями RSBР B.pertussis, интегрированную в последовательность гена metY E.coli. Структура metY::рКК3 типична для коинтегратов, сформированных известными МГЭ (Berger B, Haas D, 2001). При выращивании рекомбинантных бактерий без антибиотиков возникают реверсии к дикому фенотипу. Минимальные частоты реверсий к MetY+ наблюдали в RecBCsbcB мутантах E.coli

Как продемонстрировано выше, перемещение TnBP в хромосому E.coli, образование RS-индуцированных коинтегратов между плазмидами (см. ниже) и плазмидой и хромосомой практически не зависит от RecA системы гомологичной рекомбинации E.coli. Однако мутации RecBC SbcB кишечной палочки влияют, по крайней мере, на стабильность RS-индуцированных рекомбинантных структур и, в конечном итоге, на регистрируемые в эксперименте частоты транспозиции и образования коинтегратов в E.coli.

Согласно современным представлениям фосфоенолпируват-зависимая фосфотрансферазная система (ФТС) имеет непосредственное отношение ко многим сторонам функционирования бактериальной клетки. Наряду с другими функциями, она принимает участие в регуляции экспрессии бактериальных генов, в том числе и некоторых генов вирулентности. Паралоги ряда генов ФТС обнаружены в хромосоме B.pertussis и других бактерий (Deutscher J, Saier VJr, 2005), что делает возможным участие ФТС в регуляции процессов «незаконной рекомбинации», обеспечивающих формирование RSBP-индуцируемых коинтегратов. Для изучения зависимости частоты формирования RSBP-индуцированных коинтегратов от ФТС E.coli нами использована упомянутая выше термоэлиминация плазмид с СolE1 репликоном из клеток recBCsbcB E.coli (Basset CL, Kushner SR,1984). Донором TnBP служила плазмида рКК3, в качестве отрицательного контроля - плазмида pUC4K. Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Частоту спасения маркеров определяли также как и в эксперименте по элиминации плазмиды рКК3 с помощью коумермицина. Из таблицы 2 видно, что плазмидные маркеры сохраняются в бактериях GA87-3 с частотой 10-6, но не наследуются клетками E.coli GA87 PtsH5 после их выращивания при 420С (частота « спасения маркера» <10-9). Фенотипическая супрессия мутации ptsH5- выращивание в среде с фруктозой и генетическая супрессия ptsH5 (мутация fruS) - увеличивают частоты «спасения маркера» до значений (10-8 и 5x10-7, соответственно). Во втором случае, частота наследования плазмидных маркеров близка к частоте, наблюдаемой в клетках дикого типа.

Таблица 2. Значения частот «спасения маркеров» плазмиды рКК3 в ptsH+ и ptsH- бактериях E.coli.

* культивирование бактерий на среде с фруктозой

Аналогичные результаты получены при изучении зависимости частоты исключения интегрированной структуры от ФТС E.coli (табл.3). Для этих целей использованы сконструированные нами PtsH+ и PtsH производные штаммов 5097-88, а также PtsH+ и PtsH изогенные штаммы LBG1623 и LBG1605, содержащие мутантный аллель metY::pKK3. События исключения рКК3 из гена metY регистрировали по изменению фенотипа бактерий от MetY KmRApR к MetY+ KmRApR. Как видно из таблицы 3 исключение рКК3 из гена metY происходит только в бактериях с фенотипом РtsH+ или в условиях фенотипической или генетической супрессии мутации рtsH5. В ряде случаев события перемещения сопровождались не только восстановлением MetY+ фенотипа, но и появлением ауксотрофности по различным аминокислотам, что указывает на возможное внутримолекулярное перемещение плазмиды рКК3.

Таблтца 3. Значения частот исключения плазмиды рКК3 в ptsH+ и ptsH- бактериях E.coli.

* культивирование бактерий на среде с фруктозой

Для проверки правильности определения структуры коинтеграта (рис. 3) проведено клонирование фрагмента BglII хромосомы 5097-88 размером около 10 т.п.н., содержащего рлазмиду рКК3 в составе последовательности metY. Бактериальные клоны E.coli, содержащие плазмиду ожидаемой структуры, удалось получить только при использовании для трансформации РtsH мутантов бактерий E.coli. В РtsH+ бактериях плазмида интегрировална в хромосому. Таким образом, мутация РtsH стабилизирует не только структуру хромосомы, но и рекомбинантных плазмид, содержащих RSBP B.pertussis. Это наблюдение указывает на целесообразность использования РtsH мутантов E.coli для клонирования RS-элементов B.pertussis и, возможно, других мобильных генетических элементов. Результаты рестрикционного и гетеродуплексного анализа ДНК плазмиды, содержащей фрагмент BglII хромосомы 5097-88, подтвердили правильность структуры, изображенной на рис. 3.

Представленные экспериментальные результаты позволяют сделать следующие выводы:

- транспозоноподобная структура TnBР может перемещаться из плазмиды в хромосому E.coli;

- в условиях подавления репликции плазмиды-донора в бактериях E.coli наблюдается, преимущественно интеграция плазмиды с хромосомой хозяина;

- структура коинтеграта E.coli (metY::рКК3) типична для коинтегратов, формируемых известными МГЭ;

- плазмида рКК3 способна к точному (почти точному) исключению из хромосомы коинтеграта E.coli (metY::рКК3);

- частоты RSBP-индуцируемых интеграций, исключения плазмиды рКК3, и внутримолекулярного перемещения рКК3 по хромосоме E.coli, зависят от генотипа бактерий;

- частоты RSBP-индуцируемых событий рекомбинации значительно снижены в РtsH мутантах E.coli. Фенотипическая или генетическая супрессия мутации ptsH восстанавливает RSBP- индуцируемую интеграцию и исключение рКК3 из гена metY.

Картирование открытой рамки считывания, ответственной за синтез транспозазы RSВР. Формирование и разрешение RSВР индуцируемых межплазмидных коинтегратов в бактериях E.coli.

Определение последовательности RSBP и потенциальных рамок считывания, ответственных за синтез транспозазы, имеющийся набор инсерционных мутантов RSBP позволили перейти к картированию гена, кодирующего транспозазу RSBP. Для этого, были проведены эксперименты, регистрирующие события формирования коинтегратов между плазмидами pMu, pMu5 и pMu6, содержащими интактную и мутантную последовательности ORF1 RSBP (рис. 2), и коньюгативной плазмидой рОХ38G, содержащей маркер устойчивости к гентамицину, а также хромосомой E.coli. Для регистрации событий RSBP-индуцированной интеграции использован описанный выше метод, термоэлиминации плазмид pMu, pMu5, рКК3 и pMu6 из клеток recBCsbcB E.coli, и метод (Galas DJ,Chandler M, 1982), разработанный для анализа межплазмидных коинтегратов. Формирование RSBP-индуцированных коинтегратов между плазмидами pMu, pMu5, pMu6, рКК3 и плазмидой рОХ38G регистрировали в бактериях PolA E.coli, в которых не возможна репликация плазмид - доноров RSBP(TnBP), содержащих репликон ColE1. Разрешение коинтегратов pMu(pMu5, рКК3)::рОХ38G наблюдали в PolA+ бактериях E.coli.

Результаты экспериментов, представленные в таблице 4 и 5. «Спасение маркера» наблюдается только у плазмид pMu, pMu5, рКК3 содержащих интактную ORF1 RSВР (определении значение N2 см. выше).

Таблица 4. Частоты «спасения маркера» плазмид в бактериях E.coli GA87

Межплазмидные коинтеграты с рОХ38G, формирование которых регистрируются по передаче макеров KmR или ApR (для pMu) в скрещиваниях бактерий RecA-E.сoli 1605pOX38G/pMu5(pMu, pKK3, pMu6, pUC4K) x E.сoli KS164, также образуются только с плазмидами, содержащих интактную ORF1 RSВР. Образование межплазмидных коинтегратов удалось зарегистрировать только в бактериях PtsH+ Е.coli LBG1605 или в PtsH5 мутантах Е.coli в присутствии фруктозы или в результате генетической супрессии мутации рtsH. Все проверенные KmR трансдуктанты (по 50 из каждого скрещивания) содержали маркера ApR.

Таблица 5. Частоты передачи маркеров устойчивости при скрещивании RecA-E.сoli 1605pOX38G/pMu5(pMu6, pMu, pKK3, pUC4K)xE.сoli KS164

* культивирование бактерий на среде с фруктозой; Н.О.- не определяли.

Для плазмиды pMu6, содержащей дефектную ORF1 (рис.2), и плазмиды pUC4K, не содержащей RSBP, «спасения маркеров» и образования коинтегратов с плазмидой pOX38G не зарегистрировано.

Таким образом, результаты экспериментов, представленные в таблицах 4 и 5, показывают, что события RSВР-индуцированного образования межплазмидных коинтегратов и коинтегратов между плазмидой и хромосомой E.coli происходят только при наличии интактной последовательность ORF1 в составе RSВР плазмиды-донора. RSВР-элемент, содержащий исерцию внутри ORF1, утрачивает способность индуцировать образование коинтегратов, что в совокупности с результатами компьютерного анализа аминокислотной последовательности ORF1 (см. ниже), указывает на кодирование транспозазы RSВР B.pertussis последовательностью ORF1. Образование межплазмидных коинтегратов, коинтегратов между плазмидой и хромосомой и перемещение интегрированных структур внутри хромосомы, с максимальной частотой наблюдается в клетках E.coli с интактным ptsH аллелем или в условиях супрессии мутации ptsH.

Согласно классической схеме межмолекулярной транспозиции МГЭ, на первом этапе могут формироваться коинтеграты, состоящие из двух плазмид - донорной, фланкированной двумя прямыми повторами МГЭ, и реципиентной. Продуктами разрешения коинтеграта, обычно, является плазмида донор и плазмида реципиент, содержащая одну копию МГЭ. Разрешение коинтегратов может обеспечиваться резольвазами, кодируемыми МГЭ, ферментами гомологичной рекомбинации клетки-хозяина или теми и другими вместе (Berger B, Haas D, 2001).

Для определения структуры коинтеграта и продуктов его разрешения использованы коинтеграты плазмид рОХ38G и рКК3, полученные в штамме E.coli LC839/pOX38G + рКК3 и переданные в результате коньюгационного скрещивания в PolA мутант E.coli KS164. Плазмидная ДНК из пяти трансконъюгантов (KS164-1, KS164-2, KS164-9, KS164-11, KS164-14) проанализирована с помощью методов электронной микроскопии и Саузерн-гибридизации. Все PolA- трансконъюганты E.coli содержали только одну плазмиду с молекулярным весом большим, чем pOX38G в составе которой, находится только одна копия TnBP. Наличие в коинтеграте только одной копии TnBP указывает на то, что в образовании коинтеграта, в процессе формирования которого обычно происходит дупликация МГЭ, принимает участие не весь транспозон, а только RSBP. Результаты Саузерн-гибридизации фрагментов рестрикции плазмидных ДНК с Р32 меченным RSBP подтвердили этот вывод и выявили интеграцию плазмиды рКК3 в три различных EcoRI фрагмента плазмиды рОХ38. В коинтеграте KS164-1 обнаружена делеция примыкающей к RSBP последовательности гена traN плазмиды рОХ38G.

Таким образом, в ходе описанных экспериментов показано, что слияние репликонов pKK3 и pOX38G обусловлено активностью RSBP, и образование коинтегратов с его участием происходит согласно классическим схемам. Рекомбинантная молекула состоит из реципиентной плазмиды pOX38G, донорной плазмиды рКК3 и двух последовательностей RSBP, прямо ориентированных к другу (аналогично структуре коинтеграта на рис. 3). Выявлено три участка интеграции плазмиды рКК3 в плазмиду pOX38G. Находясь в составе коинтеграта, RSBP сохраняет способность индуцировать образование делеций протяженных сегментов ДНК, прилегающих к сайту интеграции.

Для изучения продуктов разрешения коинтегратов использовали описанные выше коинтеграты pOX38G::pKK3. Разрешение коинтегратов регистрировали по появлению двух плазмид в бактериях RecA- E.coli Х5098 и RecA+ E.coli Х5097 после их скрещивания с донорами Pol- KS164/pOX38G::pKK3 ( KS164-1, KS164-2, KS164-9, KS164-11, KS164-14). В скрещиваниях с участием четырех доноров KS164-2, KS164-9, KS164-11, KS164-14 трансконьганты отбирали с частотами около 10-2/клетку донора. Как и следовало ожидать, трансконъюгантов в скрещиваниях с донором KS164-1, содержащим делецию traN pOX38G, не обнаружено. В клетках всех трансконьюгантов, независимо от генотипа реципиента, присутствовала «тяжелая» и «легкая» плазмиды. «Легкая» плазмида во всех, трансконьгантах, за исключением KS164-2 х Х5097, по размеру и профилю рестрикции совпадала с pKK3, что позволяет говорить о правильном разрешении коинтегратов независимо от функциональной активности системы гомологичной рекомбинации клетки-хозяина. Исходя из традиционных представлений о механизмах разрешения RS-индуцированных коинтегратов, можно ожидать, что плазмида большего размера является вторым продуктом разрешения коинтеграта, и состоит из плазмиды pOX38G и TnBP или RSBP. Для проверки этого предположения проведены скрещивания между различными вариантами доноров Х5097/pOX38G::TnBP и реципиентами E.coli HB 101 и E.coli KS164 с селекцией по маркеру KmRTnBP или GmR плазмиды pOX38G. Полученные результаты, независимо от селективного маркера, выявили стабильное сцепленное наследование маркеров плазмиды pKK3 и pOX38G при скрещивании с обоими реципиентами. ДНК «легкой» плазмиды, выделенной из клеток трансконьгантов E.coli HB101, совпадала по размеру и картине рестрикции с плазмидой pKK3.

Структура «тяжелых» плазмид была установлена при анализе ДНК, выделенной из клеток трансконьгантов PolA-E.coli KS164. «Тяжелые» плазмиды не отличались от коинтегратов pOX38G::рКК3, независимо от использованного для селекции маркера. При разрешении коинтеграта всегда регистрировали плазмиду рКК3 и вторую плазмиду, идентичную исходному коинтеграту.

Таким образом, формирование RSBP-индуцируемых межплазмидных коинтегратов и коинтегратов между плазмидой и хромосомой E.coli происходит только при участии рекомбинантных плазмид, содержащих интактную последовательность ORF1 в составе RSВР. Этот результат подтверждает вывод о кодировании транспозазы RSВР последовательностью ORF1. Структура коинтегратов соответствует структуре, описанной для коинтегратов ряда известных IS-элементов, однако их разрешение в бактериях E.coli происходит иначе. В отличие, например, от IS1-индуцированных коинтегратов, (Хесин РВ, 1984) продуктами разрешения коинтеграта pOX38G::рКК3 является плазмида pKK3 и плазмида, структура которой не отличается от исходного коинтеграта. Процесс разрешения и образования RSВР-индуцированных коинтеграта не зависит от RеcA системы гомологичной рекомбинации клетки-хозяина.

Суперпродукция и функциональная активность транспозазы RSBP B.pertussis в бактериях E.coli.

Транспозазы некоторых IS-элемнтов выделены и охарактеризованы, в других случаях, проведен анализ последовательностей соответствующих генов и предсказаны домены, обеспечивающие ферментативные функции и их связывание с ДНК (см. например, Mahillon J., Chandler M., 1998). Компьютерный анализ открытых рамок считывания RSBP показал, что только последовательность ORF1 может кодировать белок, обладающий характерной для транспозаз структурой. Каталитический D139D217E253 домен транспозазы RSBP B.pertussis предположительно локализован в области 120-290 а.к. С- конца, а ДНК- связывающий домен - в области 25-115 а.к. N - конца белковой молекулы, однако, окончательное определение структуры и положения активных центров возможно только в результате экспериментов, определяющих функциональную активность соответствующих мутантных белков. Подавляющее большинство транспозаз имеют размер более 200 а.к. и высокое значение pI от 9,48 у IS3 до 11.85 у IS30 (Mahnc Braam LA, Reznikoff WS, 1998, Stalder R. et al., 1990). Расчетная молекулярная масса гипотетической транспозазы RSBP B.pertussis составляет 36кДа (316 а.к.), а её изоэлектрическая точка определяется значением pI=11,4, что вполне укладывается в разброс значений соответствующих параметров транспозаз прокариот, определенных экспериментально или теоретически. Значения pI и размеры белков, кодируемых двумя оставшимися рамками считывания (ORF2 и ORF3) RSBP составляют (4,46 и 12,18) и (133 и 127 а.к.), соответственно, и не входят в интервал значений, характерных для транспозаз. Расчетные характеристики, белка кодируемого ORF1, а также приведенные выше результаты функционального анализа мутантов RSBP позволили заключить, что ORF1 кодирует транспозазу RSBP B.pertussis и приступить к конструированию штамма-продуцента.

В качестве вектора экспрессии ORF1 RSBP в клетках E.coli выбрана плазмида pET32 содержащая Т7 промотор, T7-терминатор и последовательность, кодирующую полигистидин, предназначенный для очистки рекомбинантных белков на никель - содержащих колонках. Так как нами установлено, что рекомбинантные структуры, содержащие RSBР, более стабильны в клетках ptsH мутанта E.coli LBG1605, клонирование продукта ПЦР, содержащего ORF1 RSBP, в векторе pGem проведено в бактериях E.coli LBG1605. Фрагмент (NdeI-XhoI), содержащий ORF1 в составе плазмиды pGem4, переклонирован в вектор экспрессии pET32. Рекомбинантная плазмида рЕТ32ORF1 использована для трансформации клеток BL21(DE3) (далее BL21), содержащих ген РНК-полимеразы фага Т7 в составе хромосомы. Транскрипция гена РНК-полимеразы обеспечивается индуцибельным Lac-промотором E.coli.

Рекомбинантные клетки E.coli BL21/рЕТ32ORF1, выращенные в присутствии IPTG, центрифугировали, осадок ресуспендировали и разрушали в дезинтеграторе Fisher Sonic Dismembrator 300. Лизат бактерий центрифугировали при 10000 об/мин, супернатант и осадок использовали для электрофореза. Результаты электрофореза суммарных белков из клеток двух независимых клонов E.coliBL21/рЕТ32ORF1, выращенных в условиях репрессии и индукции Lac-промотора, и препаратов растворимой и нерастворимой фракций индуцированной культуры представлены на рисунке 4 а и б. Как видно из рисунков, в условиях индукции, бактерии синтезируют рекомбинантный белок размером 36 кДа (дале р36) (дор. 2, 4 рис. 4 а). Масса белка, синтезированного в условиях индукции, совпадает с ожидаемым размером продукта экспрессии ORF1. Количество рекомбинантного белка достигает 10%-20% от тотального белка клетки. Практически весь белок находится в нерастворимой фракции, по-видимому, в тельцах включения (дорожка 3 рис. 4 б). При культивировании клеток E.coli BL21/ рЕТ32ORF1 в условиях репрессии Lac-промотора продукции белка не наблюдается.

Рисунок 4. Электрофореграмма белков бактерий штамма BL21-pET32ORF1, (а) выращенных без добавления IPTG (дор. 1, 3) и в присутствии IPTG (дор. 2, 4). (б)- Растворимая (дор. 2) и нерастворимая (3) фракция бактериальных клеток, выращенных в присутствии IPTG. Дор.1- маркер 14,18, 25, 35,45, 66 кДа.

Несмотря на то, что основная масса белка р36 находится в нерастворимой фракции клеток штамма-продуцента, нами были предприняты попытки выделения очищенной транспозазы RSBP для определения её активности в экспериментах in vitro. Для этого, растворимую и нерастворимую фракции индуцированных IPTG бактерий BL21/pET32RS наносили на колонки, содержащие Ni-NTA агарозу, и после двухэтапной эллюции белка буфером с концентрацией имидозола 250мМ рН 5.7 и рН 4,5 анализировали с помощью SDS-электрофореза. Хроматография нерастворимой фракции лизатов бактериальных клеток позволила выделить 1,5 мг белка в концентрации 100 мкг/мл, содержащего менее 10% примесей. Нам не удалось идентифицировать искомый белок при исследовании растворимой фракции концентрата 200 мл бактериальной культуры. Изменение условий культивирования рекомбинантных бактерий E.сoli BL21/pET32ORF1 (температуры, времени инкубации и концентрации IPTG), попытки перевода очищенного белка из денатурированного состояния (раствора в 6М мочевине) в фосфатный буфер (50мМ фосфатного буфера рН7,2 25мМ NaCl, 5мМ -меркаптоэтанола) с помощью ступенчатого диализа раствора белка против буферов того же состава, но содержащих меньшую концентрацию мочевины, использование для диализа различных температурных режимов и концентраций белка, вплоть до 10 мкг/мл, не привели к положительному результату.