Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша

Согласно современным представлениям, таким требованиям удовлетворяет тест-системы, содержащие высушенные в «ПЦР-пробирке» компоненты реакционной смеси, в том числе и ДНК ВС, и обеспечивающие «технологию горячего старта» ПЦР. В разработанной нами тест-системе «горячий старт» достигается в результате временной инактивации Taq - полимеразы за счёт её взаимодействия с моноклональными антителами (МАТ). Тест-система состоит из сухих компонентов, включающих праймеры K10f - K10r, комплекс Taq - полимеразы и МАТ, смеси трифосфатов и ДНК ВС, помещенных в реакционную пробирку объемом 0,6 мл. ПЦР проводится в пробирке после добавления в нее ПЦР-буфера и исследуемой ДНК. Комплекс Taq - полимеразы с МАТ денатурируется в результате прогрева пробирки при 950С в течение 5 минут. Для предотвращения ложноотрицательных результатов, разработан внутренний стандарт ПЦР (ВС). ВС - плазмидная ДНК, состоящую из вектора pGEM и клонированного фрагмента ДНК B.pertussis Tohama I. Клонированный фрагмент включает в себя последовательность хромосомы B.pertussis Tohama I, содержащую вставку ДНК бактериофага размером около 200 п.н., фланкированную праймерами K10f-K10r. Использование ВС позволяет, не только контролировать качество реакции, но и оценить количество ДНК мишени в образце. Для детектирования продуктов реакции может быть использован гельэлектрофорез или один из вариантов методов гибридизации.

Для выделения ДНК из смывов с назофарингеальных тампонов использована обработка клинического материала раствором гуанидинтиоционата с последующей сорбцией ДНК на магнитном сорбенте фирмы Promega США.

Модельные эксперименты по определению чувствительности сконструированной нами тест-системы, выполненные на серии разведений суспензии бактерий B.pertussis Tohama I и очищенной бактериальной ДНК, показали, что она составляет 5-10 бактерий в реакции.

Для определения специфичности тест-системы использованы ДНК в количестве 107-108 геном эквивалентов на реакцию, выделенные их различных микроорганизмов, находящихся в коллекциях НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и контрольного института ГУ НИИГИСК им. Л.А. Тарасевича: HBV, HSV, CMV, Chl.trachomatis, Chl.pneumonia, M.hominis, U.urealyticum, G.vaginalis, T.vaginalis, Streptoccocus B,D,G, F, M.tuberculosis, E.coliK12, B.pertussis, B.pаrаpertussis, B.bronchiseptica, L.pneumophilia, K.pneumoniae, C.diphtheriae, S.typhi, Sh.sonnei, Sh.flexneri, Y.pseudotuberculosis, Enteropathogenic и ДНК человека.

Специфический сигнал амплификации зарегистрирован с помощью электрофореза в агарозном геле только при использовании в качестве матрицы ДНК B.pertussis, B.pаrаpertussis и B.bronchiseptica. Тест-система выявляет ДНК бактерий B.parapertussis и B. bronchiseptica в количестве более чем 1000 молекул в реакции, что более чем в 100 раз хуже, чем чувствительность при выявлении ДНК B.pertussis и соответствует примерно 105 бактерий/мл суспензии. Схожие результаты были получены с помощью использованного нами метода ДНК-гибридизации. Низкая чувствительность метода при выявлении ДНК B.parapertussis и B. bronchiseptica, делает возможным использование разработанной нами тест-системы для видоспецифической диагностики возбудителя коклюша в клинических образцах.

Однако, как показывают приведенные выше результаты, при использовании больших концентраций ДНК, существует возможность идентификации бактерий B.parapertussis и B.bronchiseptica в ПЦР с праймерами K10f - K10r. ПЦР анализ ДНК 40 штаммов B.bronchiseptica, выделенных от животных и находящихся в коллекции НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи, показал, что бактерии 21 штамма содержат, последовательности гомологичные RSBP B.pertussis. Эти результаты указывают, по-видимому, на более широкую распространенность штаммов B.bronchiseptica, содержащих последовательности гомологичные RSBP, чем это было выявлено Diavatopoulos D.A. et al., 2005. Это обстоятельство необходимо учитывать при видоспецифическом типировании культур бактерий рода Bordetella с помощью ПЦР.

Аналогичный принцип, основанный на использовании технологии «горячего старта» и иммобилизованной в ПЦР пробирках реакционной смеси положен в основу тест-системы для идентификации ДНК B.pertussis, содержащей инсерцию RSBP в специфическом сайте оперона bvgAS.

Таким образом, нами разработаны и проверены в лабораторных условиях тест-системы для выявления ДНК возбудителя коклюша и его Bvg- мутантов, содержащих инсерцию RSBP в опероне bvgAS, методом ПЦР. Тест-система для выявления ДНК возбудителя коклюша использована для диагностики атипичных и бессимптомных форм коклюша у детей и взрослых.

Выводы

1. Хромосома B.pertussis содержит большое число повторяющихся нуклеотидных последовательностей (RS-элементов), имеющих различную ориентацию и образующих транспозоно-подобные структуры. Клонированы RS - элемент (RSВР) и Tn-подобная структура (TnBP) хромосомы B.pertussis 475; сконструированы их генетически маркированные варианты.

2. RSВР и TnBP B.pertussis обладают основными свойствами мобильных генетических элементов: перемещаются между плазмидой и хромосомой, индуцируют RecА независимое формирование коинтегратов между плазмидами и между плазмидой и хромосомой бактерий E.coli; индуцируют перестройки прилегающего генетического материала генома хозяина, что позволяет отнести их к классу инсерционных последовательностей (IS-элементов) и транспозонов.

3. Частота формирования RSВР-индуцируемых коинтегратов зависит от генотипа бактерий E.coli, прежде всего, от активности генов фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы. Нарушение функционирования ФТС E.coli, снижает частоты формирования RSВР-индуцируемых коинтегратов и внутрихромосомного перемещения интегрированной структуры.

4. Определена открытая рамка считывания (ORF1), в составе RSВР, кодирующая транспозазу (белок р36). Сконструирован штамм E.coli, продуцирующий функционально активную транспозазу, основная масса которой находится в нерастворимой фракции бактерий штамма-продуцента.

5. Установлено, что перемещение RSBP в специфический сайт оперона bvgAS B.pertussis, регулирующего вирулентность возбудителя коклюша, зависит от функционирования оперона bvgAS: в бактериях B.pertussis, содержащих мутантный оперон bvgAS, перемещения RSBP не регистрируются; способность к перемещению восстанавливается при транс-комплементации мутантного оперона bvgAS. Формирование RSBP- индуцируемых коинтегратов восстанавливается в Pts- мутантах E.coli, содержащих оперон bvgAS в транс-положении.

6. Выделены спонтанные авирулентные Bvg- инсерционные мутанты B.pertussis, сформированные в результате перемещения RSBP в оперон bvgAS. Показано, что популяции бактерий всех изученных Bvg+ штаммов B.pertussis гетерогенны и содержат инсерционные Bvg- мутанты с частотой 10-4 - 10-2. Относительное число Bvg- бактерий в популяции зависит от штамма и условий культивирования. Частота перемещения RSBP увеличивается в присутствии MgSO4.

7. Формирование инсерционных Bvg- мутантов B.pertussis в результате перемещения RSBP в оперон bvgAS; зависимость частоты перемещения RSBP от функционирования оперона bvgAS и условий культивирования бактерий B.pertussi и способность RSBP индуцировать точное исключение интегрированных структур из хромосомы E.coli свидетельствуют об участии IS-элементов в регуляции экспрессии генов вирулентности возбудителя коклюша.

8. Сформулирована гипотеза, устанавливающая связь между образованием фазовых состояний и переживающих (персистирующих) форм возбудителя коклюша, с инактивацией генов вирулентности B.pertussis в результате инсерции IS-элементов. Исключение IS из сайта интеграции восстанавливает вирулентность и может привести к развитию заболевания.

9. Штаммы бактерий B.pertussis и B.bronchisepticа - полилизогенны. Последовательности, гомологичные ДНК бактериофага К, обнаружены в хромосомах всех изученных штаммов бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica. Геном профага, гомологичного Т, локализован вне хромосомы и утрачивается в процессе культивирования большей частью популяции бактерий изученных штаммов бактерий рода Bordetella.

10. Различная локализация геномов одного из профагов в хромосомах разных видов и штаммов бактерий рода Bordetella, и способность второго исследованного бактериофага интегрировать часть генома в хромосому B.parapertussis, вызывая изменение свойств возбудителя паракоклюша, позволяют отнести выделенные бактериофаги к классу мобильных генетических элементов.

11. Разработаны тест-системы, с помощью которых показано, что до 30% детей с диагнозом ОРЗ и 5% - 7% практически здоровых детей инфицированы возбудителем коклюша. Разработаны тест-системы для регистрации событий перемещения RSBP в оперон bvgAS Bordetella.

Список сокращений

МГЭ - мобильный генетический элемент

RS - повторяющаяся последовательность

IS - инсерционный элемент, повторяющаяся последовательность, обладающая свойствами МГЭ.

Tn - транспозон, мобильный генетический элемент

ФТС -фосфоенолпируватзависимая фосфотрансферазная система

т.п.н. - тысяча нуклеотидных пар

п.н. - нуклеотидные пары

н.м. - нанометр

кДа - килодальтон, единица измерения молекулярного веса белка

КУА - казеиново угольный агар, среда культивирования бактерий Bordetella

ЛСА - лейкоцитозстимулирующая активность коклюшного токсина

ТЛТ - термолабильный токсин

МАТ - моноклональные антитела

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ВС - внутренний стандарт

а.к. - аминокислота

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л. Каратаев Г.И., Смирнов Г.Б. Природа последовательностей RSI, фланкирующих ген vct, кодирующий синтез холерного токсина у Vibrio cholerae eltor.// Молек. генетика, микробиология и вирусология. -1986. -№2.-с.11- 17.

2. Покровская М.С., Каратаев Г.И., Смирнов Г.Б. Особенности образования и свойства плазмид pLS, возникающих в результате делеций генома бактериофага лatt80 (Tn9) //Мол. генетика, микробиология и вирусология.-1986.-№1.-с.12-18.

3. Покровская М.С., Каратаев Г.И., Смирнов Г.Б. Делеции генома фага лatt80::Tn9. Характкр внутримолекулярной рекомбинации.//Мол. генетика, микробиология и вирусология. -1986.-№10.-с.33-39.

4. Каратаев Г.И., Рябинина О.П., Лапаева И.А. Множественно повторяющиеся последовательности ДНК хромосомы - видовой признак B.perussis.// Сб. Вопросы физиологии, метаболизма и идентификации микроорганизмов.-Москва. 1987.-с.11-17.

5. Гольцмайер Т.А., Каратаев Г.И., Розинов М.Н., Москвина И.Л., Шумаков Ю.Л., Мотин В.Л., Мебель С.М., Гершанович В.Н., Лапаева И.А. Особенности лизогении и конверсии у микробов рода Bordetella // ЖМЭИ.-1987.-№ 5.-с.9-13.

6. Дорошенко В.Г., Данилевич В.Н., Каратаев Г.И., Лившиц В.А. Структурная и функциональная организация транспозона Tn2555, несущего гены утилизации сахарозы. Молекулярная биология.//-1988.-т.22.-с.645-658

7. Karataev G.I., Lapajeva I.A., Ryabinina O.P., Mebel S. Detection of a new bacteriophage in Bordetella.//FEMS- symposium Pertussis. Berlin, GDR.- 1988.-p.20.

8. Каратаев Г.И., Мотин В.Л., Рябинина О.Г., Лапаева И.А.. Электронно-микроскопическое изучение повторяющихся последовательностей ДНК хромосомы микроорганизмов рода Bordetella. // в Сб. тезисов докладов 13-ой Всесоюзной конференции по электронной микроскопии «Биология и медицина». Москва.-1988.-с.51.

9. Holzmayer T.A., Karataev G.I., Rozinov M.N., Moskvina I.L., Shumakov Y.L.,V.L.Motin, Mebel S.M., Gershanovich V.N., Kapaeva I.A. Bacteriophages of Bordetella sp.: Features of Lysogeny and Conversion.//Zbl. Bakt. Hyg.-1988. -v.269. -p.147-155.

10. Каратаев Г.И., Москвина И.Л., Рябинина О.П., Миллер Г.Г., Мебель С.М., Лапаева И.А. Выделение и характеристика бактериофага из вакцинного штамма Tohama I фазы.//Молек. генетика, микробиология и вирусология. -1988.-№4.-с. 22-25.

11. Каратаев Г.И., Нечаева Е.В., Синяшина Л.Н., Лапаева И.А. Видоспецифический ДНК-зонд для идентификации микроорганизмов рода Bordetella.// Тез. Докладов Республиканской конференции «новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы». Алушта.-1990.-с.79-80.

12. Волгина Т.И., Кириллов М.Ю Нечаева Е.В., Шумаков Ю.Л., Лапаева И.А., Каратаев Г.И Новый мобильный элемент B. pertussis. //Тез. Докладов Всесоюзной школы-семинар «Молекулярная биология и медицина». Москва.-1990.-с.39.

13. Каратаев Г.И., Кириллов М.Ю Нечаева Е.В., Шумаков Ю.Л., Волгина Т.И., Лапаева И.А. Структурные особенности участков ДНК, содержащих “vir” и “tox” гены B. pertussis.//Тез. Докладов Всесоюзной школы-семинар «Молекулярная биология и медицина». Москва.-1990.-с.38.

14. Каратаев. Г.И., Шумаков Ю.Л., Кириллов М.Ю., Волгина Т.И., Лапаева И.А. Структурная организация участка хромосомы, содержащего vir-ген B. pertussis.//Молек.генетика, микробиология и вирусология.-1990.-т.12.-c.27-34.

15. Нечаева Е.В., Волгина Т.И., Кириллов М.Ю., Шумаков Ю.Л., Лапаева И.А., Каратаев Г.И. Мобильный элемент RSBP1 Bordetella pertussiss.//Молек. генетика, микробиология и вирусология.-1990. -т.12.-с.22-27.

16. Каратаев Г.И., Шакирова Р.Г., Карпухин А.В. Высокочувствительный ДНК-зонд для идентификации возбудителя коклюша.// в Сб. материалов 2-го Всесоюзного симпозиума теоретических и прикладных аспектов молекулярной биологии. Самарканд. -1991.-с.84.

17. Шумаков Ю.Л., Кириллов М.Ю., Бутчер С., Нечаева Е.Н., Руниберг-Ньюман К., Каратаев Г.И. Нуклеотидная последовательность и свойства транспозоноподобной структуры, клонированной из хромосомы Bordetella pertussis. // Генетика.-1993.- N7.-c.1061-1069.

18. Шумаков Ю.Л., Кириллов М.Ю., Нечаева Е.В., Синяшина Л.Н., Каратаев Г.И. Нуклеотидная последовательность и свойства транспозоноподобной структуры, клонированной из хромосомы B. pertussis.//Генетика.-1993.-т.29.-c.1061-1069.

19. Кириллов М.Ю., Шумаков Ю.Л., Нечаева Е.В., Синяшина Л.Н, Каратаев Г.И. Нуклеотидная последовательность и свойства инвертированного повторяющегося элемента хромосомы B. рertussis. //Генетика.-1993.-т.29.-c.1267-1276.

20. Kirillov M.Y., Shumakov Y., Nechaeva E.V, Butcher S., Sinjashina L. N., Runeberg K., Romantschuk M., Karataev G. I. Repeated sequences isolated from Bordetella pertussis induce DNA rearrangements and deletions at high frequency //Gene. -1995.-v.166.-p.111-116.

21. Боковой А.Г., Волкова Т.А., Кабишева Е.В., Каратаев Г.И., Кульнева Г.М. Специфическая диагностика коклюша у детей методом ДНК-зондирования. //Клинический вестник.-1996,-№3.-с.15-16 .

22. Лыткина И.Н., Макаров В.Б., Семина С.В., Каратаев Г.И. Выявление возбудителя коклюша в клинических образцах с помощью ПЦР.//Сб.Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. В.2. Москва -1997.-с.144 -148.

23. Синяшина Л.Н. Кириллов М.Ю., Карпухин А.В., Богуш А.И., Боковой А.Г., Каратаев Г.И. Выявление возбудителя коклюша в клинических образцах методом ДНК-ДНК гибридизации.// В сб. Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. Вып.2, Москва, 1997.-с.149-153.

24. Кириллов М.Ю., Нечаева Е.В., Каратаев Г.И. Мобильный генетический элемент хромосомы B.pertussis стимулирует образование коинтегратов в штаммах E.coli// Генетика.-1997.-т.33.-c.1621-1628.

25. Артемьев М.И., Сметанина С.Е., Барановский П.М., Зуева Е.Н., Смирнов В.Д., Каратаев Г.И. Количественная оценка мишени методом ПЦР.// Сб. тезисов докл. 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва.-2000.-с.341-342.

26. Нечаева Е.В., Сивов И.Г. Каратаев Г.И. Транспозиция и наследование Tn -элемента Bordetella в клетках Escherichia Coli K12.// Молек.генетика, микробиология и вирусология.-2000.-т.1.-с.20-23.

27. Сивов И.Г., Белявский О.А., Каратаев Г.И. Интеграция плазмиды в хромосому Escherichia Coli K12, обусловленная транспозоном Bordetella. // Мол. генетика, микробиология и вирусология.-2000.-т.2.-c.33-36.

28. Каратаев Г.И., Синяшина Л.Н., Сивов И.Г. Мигрирующие генетические элемены Bordetella pertussis, как генетические и эпидемиологические маркеры // Вестник РАМН.-2000.-N1.-c.34-38.

29. Сивов И.Г., Большакова Т.Н., Каратаев Г.И. Интеграция и внутримолекулярное перемещение транспозона TnBp3 B.pertussis в клетках E.coli K-12, мутантных по белку Hpr фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы// Генетика.-2001.-т.37.-c.900-907.

30. Воронцов В.В., Сивов И.Г., Умяров А.М., Синяшина Л.Н., Каратаев Г.И. Определение открытой рамки считывания, кодирующей транспозазу RS- элемента Bordetella pertussis// Генетика.-2004.-т.1.-с.16-23.

31. Синяшина Л.Н., Воронцов В.В, Сёмин Е.Г., Честков А.В., Цыганков Ю.Д., Каратаев Г.И. Bvg-негативная регуляция перемещений повторяющихся последовательностей в клетках B. perussis//Генетика.-2005,-№12.-с.1-9.

32. Воронцов В.В., Сивов И.Г., Умяров А.М., Синяшина Л.Н., Каратаев Г.И. Функциональная активность транспозазы IS-элемента B.pertussis в клетках E.coli.// Генетика.-2006.-№1.-c.39-48

33. Синяшина Л.Н., Каратаев Г.И. Молекулярное подтверждение лизогенности микроорганизмов рода Bordetella и характеристика умеренного бактериофага Bordetella parapertussis 662-2.//Генетика.-2006.-№3.-с.1-10.

34. Sinyashina L. N., Medkova A.Yu.,. Semin E. G., Chestkov A.V., Tsygankov Y.D., Karataev G. I. IS481-Induced Variability of Bordetella pertussis//In "National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH: Frontiers in Research" Ed. Vassil St. Georgiev, Humana Press, Totowa, NJ.-2008.-p.227-231.

Размещено на Allbest.ru