Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша

Невозможность определения активности рекомбинантного белка в in vitro, потребовала разработки экспериментальной модели для тестирования ее активности in vivo в бактериях E.coli штамма-продуцента бела. Для этого нами сконструирована система «дефектный RSBP - плазмида-помощник». Транспозицию RSBP, «дефектного» по гену транспозазы, должна обеспечить транспозаза, кодируемая “плазмидой-помощник”. Функциональную активность транспозазы определяли в бактериях штамма-продуцента содержащих RSBP, инактивированный инсерцией гена kan, клонированный в составе рекомбинантной плазмиды pVV1 (ApS дериват плазмиды pMu6). Интегранты отбирали после индуцированной коумермицином элиминации плазмидной ДНК из клеток BL21/рЕТ32ORF1+ pVV1 (см. выше). Из 100 KmRApS бесплазмидных клонов BL21/рЕТ32ORF1 + pVV1, 5 клонов проанализированы с помощью P1vir трансдукции. Наличие последовательностей гена kan и RSBP в клетках донора и трансдуктантов подтверждено методом ПЦР, что указывает на интеграцию плазмиды pVV1, содержащей «дефектный» RSBP, или транспозицию «дефектного» RSBP в хромосому BL21.

Таким образом, использованная нами система позволила, идентифицировать события интеграции плазмиды pVV1 (или транспозиции «дефектного» RSBP) в хромосому клеток BL21/рЕТ32ORF1+ pVV1, что указывает на наличие функциональной активности у транспозазы RSBP B.pertussis, синтезированной в клетках E.coli.

Другим проявлением активности транспозазы является выявленное нами снижение выживаемости рекомбинантных штаммов BL21/pET32ORF1 в условиях индукции IPTG. Изучение культуральных свойств бактерий рекомбинантных штаммов BL21/pET32ORF1 показало, что на L- агаре с Ap и 1mM IPTG, титр бактерий в раз меньше чем на L- агаре, а выжившие ApR бактерии не способны продуцировать белок р36. Можно предположить, по крайней мере, две причины гибели клеток: продукция кодируемого ORF1 белка нарушает деление клеток или подавляет репликацию плазмиды pET32ORF1, обеспечивающей синтез в-лактомазы (ApR).

Эксперименты показали, что бактерии BL21/pET32ORF1, выжившие в условиях суперпродукции транспозазы в присутствии антибиотика, сохранили исходную плазмиду pET32ORF1 и приобрели хромосомную мутацию, нарушающую синтез транспозазы. Результаты, демонстрирующие влияние суперпродукции транспозазы Tn5 на выживаемость бактерий E.coli, опубликованы Yigit H, Reznikoff WS, 1998. Ими показано, что в условиях суперпродукции транспозазы, выживают бактерии (с частотой 10-4), содержащие одну из четырех хромосомных мутации stk. Картированные ими мутации снижают активности транспозазы, но не влияют на уровень её продукции. Обнаруженная нами мутация, напротив, приводит к нарушению синтеза транспозазы и, вероятно, затрагивает ген T7-РНК-полимеразы.

Для определения возможной роли транспозазы RSBP в ингибировании репликации плазмиды pET32ORF1 проведена оценка выживаемости бактерий BL21/pET32ORF1+pMu6. Плазмида pMu6 (рис. 2) имеет схожую структуру и механизм репликации с плазмидой pET32ORF1. Эксперименты, проведенные по описанной выше схеме, показали, что выживаемость рекомбинантных бактерий BL21/pET32ORF1+pMu6, выращенных в присутствии ампициллина и IPTG, снижалась в 200 раз (а не в 104, как было определено для клеток BL21/pET32ORF1). Выжившие клетки содержали только плазмиду pMu6. Полученные результаты демонстрируют влияние транспозазы B.pertussis на репликацию СolE1 плазмид pET32ORF1 и pMu6 в клетках E.сoli и демонстрируют специфическую функциональную активность рекомбинантного белка р36, продуцируемого бактериями E.сoli.

Таким образом, в результате работы, направленной на конструирование продуцента транспозазы и изучению её свойств, получены следующие результаты:

- сконструирован штамм E.coli, продуцирующий функционально - активную транспозазу RSBP B.pertussis;

- получены очищенные препараты транспозазы RSBP в растворе 6м мочевины. Основная масса транспозазы, синтезируемой бактериями BL21/рЕТORF1, находится в нерастворимой фракции.

- разработана система «дефектный RSBP - плазмида помощник», выявляющая функциональную активность рекомбинантной траспозазы в клетках штамма-продуцента E.coli;

- культивирование бактерий BL21/рЕТORF1 в условиях синтеза транспозазы в присутствии антибиотика снижает их выживаемость. Выжившие бактерии утрачивают способность синтезировать транспозазу в результате хромосомной мутации.

Неопределенность границ повторяющейся последовательности RSBP хромосомы B.pertussis.

Повторяющиеся последовательности обнаружены в хромосомах всех представителей рода Bordetella. Установлено, что помимо IS481(RSBP) и IS1002 в хромосоме B.pertussis Tohama I, присутствует близкая к ним по размеру IS1663 (Parkhill J et al., 2003). Определение последовательности первых клонированных копий RS В.pertussis, в том числе и RSBP В.pertussis 475, показало, что они состоят из 1053 п.н., включающих в себя почти совершенные концевые инвертированные повторы размером 28 п.н. (McPheat W, McNelly T, 1997). Проведенный нами анализ последовательности хромосомы B.pertussis Tohama I выявил высокую консервативность концевых последовательностей IS481(RSBP). Из 238 копий IS481, 181 - содержит совершенный прямой повтор ctag на обоих концах последовательности, у 44 копий - одна из двух последовательностей ctag содержит одну замену, в 13 копиях - по одной замене обнаружено в обеих фланкирующих последовательностях ctag. Так как высокая консервативность концевых последовательностей, участвующих в связывании с транспозазой, типична для большинства известных IS-элементов, то правильность определения границ последовательности IS481(RSBP) не вызывала сомнений. Не характерным для IS-элементов, являлось отсутствие дупликации последовательностей ДНК-мишени, фланкирующих большинство клонированных разными авторами копий RS-элементов В.pertussis. Отсутствие дупликаций последовательностей ДНК-мишени может быть связано с особенностью IS481(RSBP) или указывать на неточность определения его границ.

Логично предположить, что структура RSBP, в том числе и последовательность концевых нуклеотидов, не зависит от бактерий в которых происходит его перемещение. Нами был проведен анализ последовательностей ДНК мишени в сайтах интеграции RSBP в бактериях E.coli и В.pertussis.

Эксперименты, позволившие зарегистрировать события спонтанной транспозиции RSBP и IS1002 в специфический сайт cctagg оперона bvgAS B.pertussis, описаны в следующем разделе диссертации. Для настоящего обсуждения важно отметить, что перемещение произошло в сайт cctagg, последовательность которого совпадает с нуклеотидами, отнесёнными к IS481(RSBP). Показано, что перемещение RSBP сопровождается дупликацией последовательности cctagg ДНК-мишени.

Аналогичные результаты получил S.Stibitz (1998), при изучении бактерий B.pertussis, выживших в условиях суперпродукции BvgAS. Оказалось, что выжившие бактерии содержат инсерцию IS481 или(и) IS1002 в ctag и gtag сайтах последовательности bvgAS. Так же как, и в наших экспериментах, IS-элементы в сайте интеграции фланкированы прямыми повторами соответствующих последовательностей ДНК-мишени.

Полученные результаты позволили заключить, что RSBP (IS481) состоит из 1043 п.н., включая концевые инвертированные повторы размером 23 п.н., а последовательность NctagN является частью ДНК хромосомы B.pertussis. В таком случае, приведенный выше анализ последовательностей копий RSBP(IS481), и полученные экспериментальные результаты не только заставляют пересмотреть размер повторяющейся последовательности хромосомы B.pertussis, но указывают на высокую специфичность их транспозиции в клетках возбудителя коклюша. Последовательность NctagN, предпочтительная для транспозиции RSBP в бактериях B.pertussis, содержит терминирующий кодон tag, обеспечивающий терминацию трансляции транспозазы RSBP, кодируемой ORF1. Таким образом, если RSBP имеет размер 1043 п.н., то “корректная” терминация синтеза кодируемой им транспозазы в бактериях B.pertussis наступает в том случае, когда RSBP перемещается в специфический NctagN сайт ДНК-мишени. Это наблюдение указывает на возможность регуляции транспозиции RSBP(IS481) на уровне регуляции синтеза его транспозазы. Схожий механизм предполагается для регуляции транспозиции ряда МГЭ. Терминирующий кодон отсутствует в последовательности IS240 (Mahillon J, Chandler M, 1998), IS427 (De Meirsman C, Van Soom C, 1990), ISMk1 (Muriani F et al., 1993), IS870, ISrf1(Fournier P et al., 1993). Некоторые из них перемещаются в последовательности, содержащие или формирующие терминирующий кодон в результате транспозиции.

Подобная схема регуляции может быть реализована и при транспозиции RSBP в бактериях E.coli. То есть, если RSBP размером 1043 п.н. перемещается в бактериях E.coli, сохраняя свои концевые последовательности (tgt ……aca), то его способность к последующим перемещениям зависит от наличия в сайте интеграции терминирующего кодона. Анализ определенных нами последовательностей на границе RSBP в плазмидах pMK2, pNK1, а также хромосомы коинтеграта metY::pKK3 E.coli позволяет сделать следующие выводы:

- на границе 3' конца RSBP (… ttсaca) плазмиды pMK2 расположена последовательность cctaac, содержащая триплет taa, способный обеспечить «корректную» терминацию ORF1 RSBP. Последовательность cctaac близка к консенсусу NctagN и состоит из нуклеотидов ccta неизвестного происхождения и ac, принадлежащих последовательности гена rpoC. Нельзя исключить, что последовательность ccta захвачена, как часть последовательности хромосомы B.pertussis в процессе клонирования RSBP;

- последовательность pNK1, граничащая с ОRF1, не имеет терминирующего кодона. Ближайший терминирующий кодон, расположенный в структуре cos- последовательности, находится на расстоянии 34 аминокислоты от последней аминокислоты, кодируемой ORF1;

- на границе 3' конца RSBP (… ttсaca) в хромосоме metY::pKK3 расположены нуклеотиды ccta, совпадающие с нуклеотидами неизвестного происхождения, обнаруженными на границе RSBP плазмиды pMK2. Аналогично с описанным выше примером, первые нуклеотиды gt последовательности metY, дополняют последовательность ccta до канонической cctagt (NctagtN), содержащей терминирующий TAG кодон для ORF1 RSBP. Однако в отличие от рМК2, последовательность ccta не могла оказаться в составе рекомбинантной плазмиды в результате клонирования повторяющейся последовательности хромосомы. Следовательно, в процессе RSBP индуцированной интеграции плазмиды рКК3 в ген metY E.coli, произошло копирование пограничной последовательности TnBP, присутствующей в плазмиде рКК3, возможно, в результате репарации однонитевых брешей, возникающих при разрезании ДНК рКК3 в процессе ее интеграции в ДНК-мишени;

- дупликаций последовательностей ДНК мишени в плазмидах pMK2, pNK1 и коинтеграте metY::рКК3 не обнаружено;

- делеции, стимулируемые RSBP в бактериях E.coli, могут включать последовательности RSBP и прилегающие участки ДНК-мишени. В формировании делеций могут принимать участие короткие последовательности идентичные концевым нуклеотидам RSBP;

- транспозиция RSBP может регулироваться, по-видимому, на уровне регуляции синтеза его транспозазы.

Таким образом, в отличие от транспозиции RSBP в бактериях B.pertussis, анализ последовательности сайтов интеграции плазмиды рКК3 и участков, примыкающих к концам RSBP, в плазмидах рМК2 и pNK1, сформированных в бактериях E.coli, не позволил отнести нуклеотиды cctagg к последовательности ДНК-мишени и подтвердить, что размер RSBP составляет 1043 п.н.. Особенный интерес вызывают нуклеотиды ccta, обнаруженные в коинтеграте metY::рКК3 и в плазмиде рМК2, которые, с одной стороны, близки к концевым нуклеотидам RSBP размером 1053 п.н., а с другой, являются частью последовательности ДНК-мишени, специфичной для перемещения RSBP размером 1043 п.н. в бактериях B.pertussis.

Приведенные выше рассуждения исходили из предположения, что размер RSBP составляет 1043 п.н., основанного на результатах анализа участков интеграции RSBP в оперон bvgAS. Если исходить из более ранних оценок размера RSBP - 1053 п.н. (McPheat W, 1987), то нуклеотиды ccta следует отнести к концевой последовательности NctagN RSBP. Отсутствие последовательности ctag на другом конце RSBP, в составе обсужденных выше рекомбинантных структур E.coli, объясняется её делетированием в процессе RSBP-индуцированных рекомбинаций. В таком случаи, обнаруженная нами в бактериях B.pertussis, высокая консервативность последовательностей сайтов интеграции RSBP, обусловлена полной или почти полной идентичную его концевых нуклеотидов и сайтов интеграции (NctagN). Такая возможность кажется вполне вероятной, хотя и не описана в известных нам литературных источниках.

Таким образом, имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные не позволяют сделать окончательный выбор в пользу одной из обсужденных выше возможностей и однозначно определить границы RSBP.

IS- индуцируемая фазовая изменчивость Bordetella pertussis.

Одной из характерных особенностей возбудителя коклюша является высокая степень изменчивости его фенотипических признаков in vitro и in vivo. Изучению механизмов фазовой изменчивости B.pertussis посвящены многочисленные исследования последних десятилетий. Были выделены, фазовые варианты лишенные всех факторов вирулентности, в результате мутации сдвига рамки, мелких делеций, инверсий коротких последовательностей и инсерций в опероне bvgAS (Stibitz S, et al., 1989, McGillivray DM et al. 1989, Monack D et al. 1989). Обсуждалась возможность участия IS Bordetella в формировании авирулентных фазовых вариантов B.pertussis и B.bronchiseptica.

Цель настоящего раздела - изучение возможности формирования IS-индуцированных фазовых переходов бактерий B.pertussis. Определение основных направления исследования регуляции и значения фазовых переходов для адаптации бактерий рода Bordetella к условиям обитания.

Разработка метода идентификации транспозиции RSBP в бактериях B.pertussis.

Отсутствие разработанных генетических методов исследования и сложность культивирования бактерий привели к необходимости использования непрямых методов, основанных на идентификации событий перемещения RSBP в специфические участки хромосомы B.pertussis, выявленные в предыдущем разделе работы. Так как одним из наиболее важных для функционирования и вирулентности бактерий рода Bordetella является оперон bvgAS, сайт CctagG в его структуре выбран в качестве объекта для изучения транспозиции IS-элеменов в клетках B.pertussis.

Рис 5 Структура фрагмента хромосомы содержащего инсерцию RSBP (IS1002) в сctagg сайт оперона bvg AS B. pertussis

а) Схема расположения анализируемых последовательностей и праймеров, использованных для анализа структуры.

б) Фрагмент последовательности продукта ПЦР (SF-Bp2) ДНК B.pertussis 5.

в) Фрагмент последовательности продукта ПЦР (SF-AR) ДНК мутанта B.pertussis 5, не обладающего гемолитической активностью.

Последовательности RSBP (б) и IS1002(в) обозначены курсивом; последовательность оперона bvg - обычным шрифтом и подчеркнута; сайт интеграции обозначен большими буквами (СCTAGG).

События перемещения регистрировали с помощью метода ПЦР. Для этого выбраны праймеры SF-АR (рис. 5), фланкирующие CctagG сайт оперона bvgAS, и праймеры, которые могли бы, в сочетаниях с SF и AR, сформировать продукты амплификации при наличии в популяции клеток бактерий, содержащих искомые интеграции RSBP (рис.5).

Некоторые из возможных сочетаний праймеров и расчетные размеры соответствующих фрагментов амплификации представлены в таблице 6. В качестве матриц для амплификации выбрана ДНК хромосом Bvg+ штаммов B.pertussis Tohama I, B.pertussis 5 и 35, а также авирулентных Bvg- штаммов B.pertussis IV и B.pertussis Tohama 347. Результаты амплификации представлены на рисунке 6.

Таблица 6. Размер расчетных продуктов ПЦР (п.н.) ДНК, содержащей RSBP в сctagg- сайте оперона bvgAS.

Рисунок 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК B.pertussis, выделенных из бактерий, выращенных на среде КУА.

Праймеры SF-AR (дор. 1-7), SF-Bp2 (дор. 8-14); 1, 8 - Н2О; 2,9- B. pertussis TohamaI; 3,10 -B. pertussis 5; 4,11-B. pertussis 35; 5,12-B. pertussis IV; 6,13- B. pertussis 347; 7,14 - B. pertussis IVK; 15- Маркер (170, 310, 480, 620, 1570 н.п).

Как видно из рисунка 6, продукты ПЦР (SF- AR) всех использованных матриц имеют размер, соответствующий расчетному размеру- 731 п.н. В ПЦР ДНК хромосом Bvg+ B.pertussis Tohama I, B.pertussis 5, B.pertussis 35 и праймеров SF - Вр2 образуются фрагменты ожидаемого размера 236 п.н. и 926 п.н. (дор. 9,10, 11) и SF - К10R (результаты не представлены). ПЦР ДНК хромосом авирулентных Bvg- штаммов B.pertussis IV и B.pertussis 347 с праймеров SF - Вр2 и SF - К10R продуктов амплификации не выявила (дор. 12 и 13). Продуктов амплификации не обнаружено и в нестед - ПЦР ДНК хромосом авирулентных штаммов (SF-АR - первый этап и SF - Вр2 - второй этап).

Специфичность продукта ПЦР (SF - Вр2) и (SF - К10R) размером 236 п.н. и 926 п.н. установлена с помощью рестрикции и прямого определения их последовательностей (рис. 5 а, б) (результаты анализа фрагмента 926 п.н. не представлены). Последовательность фрагмента 236 п.н. полностью совпадает с расчётной и состоит из двух частей, разделенных cсtagg сайтом. Слева от cсtagg сайта расположена последовательность оперона bvgAS (Х58355), справа - последовательность RSBP (S66929).

Для проверки зависимости частоты перемещения RSBP от состояния оперона bvgAS выполнены эксперименты по идентификации событий перемещения RSBP в бактериях B.pertussis IV фазы, содержащих полноценный оперон bvgAS в транс-положении на плазмиде pRV01. Клетки KmR B.pertussis IV фазы, содержащие нативный оперон bvgAS в транс-положении, отобраны в результате трансформации бактерий B.pertussis IV фазы плазмидой pRV01 (B.pertussis IVК). Определение видоспецифических агглютиногенов и ЛСА коклюшного токсина бактерий B.pertussis IV и B.pertussis IVК указывали на восстановление Bvg+ фенотипа в бактериях B.pertussis IVК. Результаты электрофореза продуктов ПЦР ДНК B.pertussis IVК, представленные на рисунке 6 (дор. 7, 14), показывают, что комплементация мутантного оперона bvgAS в транс-положении восстанавливает способность к перемещению RSBP в клетках B.pertussis.

Таким образом, нами разработана система регистрации событий транспозиции RSBP в сctagg сайт оперона bvgAS B.pertussis. События перемещения RSBP в бактериях B.pertussis наблюдаются только при наличии интактного оперона bvgAS. В возбудителе, хромосома которого содержит мутантный оперон bvgAS, события перемещения RSBP не регистрируются. Способность к перемещению RSBP восстанавливается в результате комплементации мутантного оперона bvgAS в транс-положении.

Перемещение RSBP в оперон bvgAS B.pertussis зависит от присутствия MgSO4 в среде культивирования бактерий.

Представленные в предыдущем разделе экспериментальные результаты позволяют охарактеризовать перемещение RSBP в клетках B.pertussis как bvg -регулируемый процесс. В таком случае, по аналогии с другими bvg- регулируемыми характеристиками бактерий Bordetella, такими как токсичность, гемаглютинирующая активность и т.д. (см. выше), перемещение RSBP может зависеть от модулирующих факторов (MgSO4 и никотиновой кислоты). Для проверки такого предположения нами отобраны отдельные бактериальные колонии B.pertussis Tohama I, выращенные на среде КУА. Каждую их этих колоний трижды пересевали на среде КУА и КУА+ MgSO4. Для анализа использовали также KmR трансформанты B.pertussis IVK, отобранные на среде КУА и КУА+ MgSO4 и расчищенные на соответствующих питательных средах. Результаты ПЦР анализа ДНК выделенных из бактерий B.pertussis Tohama I и B.pertussis IVK, проведенного по описанной выше схеме, выявили инсерцию RSBP в опероне bvgAS в бактериях, выращенных на КУА+ MgSO4, и не обнаружили инсерции в хромосоме бактерий, выращенных на среде КУА без MgSO4. Нестед - ПЦР (праймеры SF-АR и SF-Вр2) ДНК бактерий, выращенных в немодулирующих условиях, идентифицировала искомые продукты, специфичность которых доказана с помощью рестрикции и определения нуклеотидной последовательности. Полученный результат указывает на увеличение частоты транспозиции RSBP при культивировании бактерий в присутствии MgSO4.

Для определения соотношения между количеством копий мутантных (содержащих инсерцию RSBP в ссtagg сайт оперона bvgAS) и не мутантных хромосом в препарате ДНК бактерий B.pertussis Tohama I, выращенных в модулирующих условиях, проведена ПЦР с праймерами SF-AR и SF-Bp2 серии 10-кратных разведений ДНК хромосомы, одного из охарактеризованных выше клонов. Положительный сигнал амплификации ДНК с праймеров SF- AR фиксируется вплоть до 7-го разведения матрицы (К1), тогда как продукт ПЦР с праймеров SF-Bp2 только до 3-4-го разведения (К2). Зная, что специфический фрагмент 731 п.н. (SF-AR), должен формироваться при участии каждой копии хромосомной ДНК, тогда как фрагмент 236 п.н. (SF-Bp2) формируется только на ДНК, содержащих инсерцию RSBP, соотношение К2/К1 = 10-3-10-4 можно использовать в качестве оценки относительного количества молекул ДНК хромосом, содержащих инсерцию RSBP в cctagg последовательность оперона bvgAS, или частоты перемещения RSBP в cctagg сайт оперона bvgAS. Значения, полученные в аналогичных экспериментах для бактерий B.pertussis 5 и 35, составили около 10-2-10-3.

Таким образом, установлено, что в процессе размножения клеток вирулентных бактерий B.pertussis in vitro, наблюдается внутрихромосомное сайтспецифическое перемещение RSBP, сопровождающееся инактивацией оперона bvgAS возбудителя коклюша и переходом бактерий в авирулентное состояние. Авирулентные bvg- мутанты B.pertussis не способны поддерживать внутримолекулярное перемещение RSBP. Присутствие MgSO4 в среде культивирования повышает частоту перемещения RSBP.

Выявленная нами зависимость транспозиции от функционирования генов оперона bvgAS возбудителя коклюша и MgSO4 позволяют провести некоторые аналогии с регуляцией транскрипции гена bipA, экспрессирующегося в промежуточной фазе микроорганизмов рода Bordetella (Williams CI et al., 2005). Можно предположить, что регуляция транспозиции RSBP в бактериях B.pertussis осуществляется на уровне регуляции транскрипции его транспозазы за счет изменения концентрации фосфорелированного регулятора транскрипции BvgА. При больших концентрациях BvgА транскрипция ORF1 подавляется, при малых усиливается. Регуляция транскрипции может происходить в результате взаимодействия фосфорилированного белка BvgА с РНК-полимеразой и специфическими участками RSBP. Полное подавление синтеза белка BvgА в результате мутации в опероне bvgAS нарушает не только репрессию, но и активацию транскрипции транспозазы. Предлагаемая схема регуляции транскрипции транспозазы RS-элементов B.pertussis объясняет существующие экспериментальные результаты и выглядит привлекательной для понимания механизма сдерживания транспозиций множественно повторяющихся IS-элементов в хромосоме B.pertussis. Дополнительным фактором, работающим на понижение уровня активации транскрипции многократно повторенных копий гена транспозазы, может служить отсутствие в структуре RSBP канонических последовательностей для связывания BvgА с зоной и активации транскрипции bvg - регулируемых генов. Последовательность RSBP, расположенная выше стартового кодона ORF1, содержит только одну вырожденную последовательность ATTCAAT, похожую на консенсус T/A)TT(C/T)TA. Вырожденность предполагаемого участка связывания может привести к снижению аффинитета и уменьшению константы связывания BvgА, по крайней мере с участком, необходимым для активации промотора.

Выделение IS индуцируемых фазовых вариантов B.pertussis .

В настоящее время практически отсутствует информация о природе упомянутых выше авирулентных или частично вирулентных мутантов B.pertussis, выделенных от больных детей на разных стадиях заболевания или in vitro. Исключение составляют, упомянутые выше спонтанные авирулентный мутант оперона bvgAS B.pertussis и B.bronchiseptica, отобранные in vitro (Stibitz S, 1989, Monack DM, 1989 и McGillivray DM, 1989).

Изложенные в настоящей работе результаты позволили сформулировать подход к выделению и анализу мутантов B.pertussis, возникших в результате инсерции RSBP в гены, кодирующие факторы вирулентности возбудителя коклюша в процессе культивирования бактерий in vitro.

Для выделения бактерий, содержащих инсерцию RSBP в оперон bvgAS, культуру вирулентного штамма B.pertussis 5, пересевали на среде КУА + MgSO4 и рассевали до отдельных колоний на среду БЖ, содержащую 10% дефибринированной крови барана. Колонии, лишенные зон гемолиза, могут возникать в результате мутаций в опероне bvgAS или в генах гемолизинов. Среди 700 проанализированных колоний выявлено 10, не содержащих зон гемолиза. Бактерий, лишенные гемолитической активности, протестированы на присутствие активности термолабильного токсина на наличие факторспецифических агглютиногенов («Материлы и методы»). Все проверенные мутанты лишены активности ТЛТ и агглютиногенов 1,2,3. Так как экспрессия генов агглютиногенов, гемолизинов и ТЛТ регулируются с помощью оперона bvgAS (см. выше), можно ожидать, что отобранные клоны содержат мутацию в опероне bvgAS. ДНК из 5 проверенных бактериальных колоний проанализирована с помощью ПЦР. Электрофорез и определение нуклеотидной последовательность двух продуктов ПЦР выявили инсерцию IS1002 и дупликацию специфической последовательности CctagG оперона bvgAS (рис 5в). Секвенированная нами последовательность IS1002, идентичная ранее определенной последовательности IS1002 (van der Zee, A. et al. 1996), имеет 60,5% гомологии с последовательностью RSBP(IS481) и содержит открытую рамку считывания ORF1, кодирующую транспозазоподобный белок tnpA размером 214 аминокислот. Первые 130 аминокислот tnpA IS1002 на 58% идентичны соответствующему фрагменту транспозазы RSBP и содержат в себе характерный ДНК-cвязывающий мотив. В структуре tnpA IS1002 нет ярко-выраженного каталитического DDE-домена, характерного для транспозазы RSBP и большинства известных транспозаз бактерий, что само по себе не означает отсутствие необходимой каталитической активности у белка tnpA IS1002. Наличие шести консервативных копий IS1002 в геноме B.pertussis указывает на значимость её последовательности для кодирования белков транспозиции. Возможно, транспозицию IS1002 обеспечивает ДНК-связывающий домен tnpA IS1002 и DDE-домен транспозазы RSBP(IS481) или только транспозаза RSBP. Идентичность концевых нуклеотидов и значительное сходство инвертированных терминальных повторов IS1002 и IS481 (80%), могут свидетельствовать в пользу такого предположения.

Таким образом, нами установлено, что перемещение RSBP(IS481) и IS1002, наблюдаемое в бактериях B.pertussis, содержащих интактный оперон bvgАS, может привести к инактивации оперона bvgAS возбудителя коклюша. Выделены мутантные клоны бактерий B.pertussis 5, хромосома которых содержит инсерцию IS1002 в cctagg сайте оперона bvgAS.

Оперон bvgAS влияет на транспозицию RSBP в Pts мутантах E.coli.

Как следует из материала изложенного в предыдущих главах, оперону bvgAS и IS-элементам принадлежит важная роль в регуляции вирулентности и изменчивости возбудителя коклюша. Регуляция экспрессии bvg-зависимых генов, число которых постоянно возрастает по мере накопления информации о возбудителе, осуществляется на уровне регуляции их транскрипции. Регулятор транскрипции BvgA связывается с операторами промоторной зоны регулируемого гена. Белок BvgS - АТФ-зависимая фосфокиназа, фосфорилирует белок BvgА, сообщая ему возможность специфического связывания с операторной областью гена и РНК полимеразой (Cotter PA, Miller JF., 2001). Нами установлено, что в клетках E.coli и B.pertussis события RS-индуцированной рекомбинации зависят от функционирования ФТС и bvgАS, соответственно. Несмотря на значительные отличия в функционировании и назначении ФТС и двухкомпонентной регуляторной системы BvgАS в клетках E.coli и B.pertussis, они имеют ряд общих характеристик. Ключевым этапом их работы является передача фосфата на белки-мишени, которые в свою очередь, участвуют в обеспечении транспорта углеводов (в E.coli) и регуляции экспрессии большой группы бактериальных генов (E.coli и B.pertussis) (Гершанович ВН 2003, 2004, Cotter PA, Miller JF, 2001). Участие компонентов ФТС в событиях RS-индуцированной рекомбинации в бактериях E.coli и сходство некоторых характеристик ФТС и двухкомпонентной регуляторной системы BvgАS, позволили предположить, что экспрессия оперона bvgАS в Pts- мутантах E.coli может привести к восстановлению транспозиции RS-элементов в мутантных бактериях E.coli.

Для изучения RS-индуцируемой интеграции использованы произодные плазмиды рМТ2, не способные реплицироваться в бактериях E.coli при температуре выше 350С и содержащие маркер устойчивости к Km (Greated A, 2000). Рекомбинантные лазмиды включали в себя сконструированные нами варианты TnВР, маркированные генами устойчивости к Cm (TnBP-Cm) и Тс (TnBP-Тс). Интеграцию плазмид рМТ::TnBP-Cm и рМТ::TnBP-Тс в хромосому E.coli изучали на изогенных бактериях E.coli дикого типа LBG1623, KmR мутанте PtsI LBG1623-I3 и СmR мутанте PtsH LBG1623-H7, содержащих плазмиды рМТ::TnBP-Cm, рМТ::TnBP-Tc и рМТ2. События интеграции регистрировали по появлению СmR или TcR клонов бактерий, после культивирования на селективном L-агаре при температуре 420С (в дальнейшем TR клоны) по схеме, аналогичной использованной нами ранее. Частоту интеграции определяли, как и раньше, по отношению числа TR бесплазмидных клонов к числу взятых в эксперимент живых бактерий. Некоторые TRСmR или TRTcR бесплазмидные клоны проверяли на наличие гена kan плазмиды рМТ2 (ген устойчивости к канамицину в составе хромосомы PtsI LBG1623-I3 отличается от гена kan плазмиды рМТ2) и последовательности RSBP с помощью ПЦР. Все они содержат искомые последовательности, что свидетельствовало об интеграции плазмид рМТ::TnBP-Cm и рМТ::TnBP-Tc в хромосому рекомбинантов. Результаты экспериментов представлены в таблице 7.

Таблица 7. Значение частот «спасения маркеров» в бактериях E.coli

Из таблицы видно, что мутация PtsH7 привела к выраженному снижению частоты интеграции плазмиды рМТ::TnBP-Тс, в сравнении с Pts+ бактериями. Примерно такое же снижение частоты интеграции плазмиды рКК3 наблюдалось в точечном мутанте PtsH5 LBG1605 по сравнению со штаммом дикого типа LBG1623, что вполне ожидаемо, так как обе мутации затрагивают ген ptsH и отличаются только типом мутации. Если хромосома PtsH5 LBG1605 содержит две точечные мутации в гене ptsH (Большакова Т.Н., личное сообщение), то мутация PtsH7 LBG1623 представляет собой делецию части последовательности гена ptsH и инсерцию гена cad (см. «Материалы и методы). Инсерционная мутация в гене ptsI (Datsenko K, личное сообщение), кодирующем фермент I, приводит к менее значительным снижениям частот интеграции. Вероятно, это связано с тем, что мутация PtsH7 нарушает транскрипцию всего оперона pts, тогда как инсерция в ген ptsI, только структуру и экспрессию гена ptsI.

Внесение оперона bvgAS в Рts мутанты бактерий E.coli, в составе плазмиды рDM20 (Karimova G. Pasteur Inst., France), восстанавливает их способность к поддержанию RSBP-индуцированной интеграции рекомбинантных плазмид в хромосому. Частота RSBP-индуцированной интеграция рМТ::TnBP-Cm в мутанте Рts I в присутствии плазмиды рDM20 возросла до значений, определенных для штамма дикого типа, а в мутанте PtsH7/рDM20 частота интеграции даже превзошла соответствующее значение для штамма дикого типа.

Представленные экспериментальные результаты укладываются в сформулированную ранее гипотезу о регуляции транскрипции гена транспозазы с помощью белков ФТС и BvgАS. Можно предположить, что ФТС обеспечивает фосфорилирование некоего регуляторного белка E.coli, участвующего в транскрипции транспозазы. В Pts мутантах E.coli фосфорилирование регулятора нарушается, а транскрипция транспозазы снижается, что проявляется в снижении частот наблюдаемых RS-индуцируемых рекомбинационных событий. В Pts мутантах E.coli, содержащих оперон bvgAS в транс-положении, фосфорилированный белок BvgА обеспечивает транскрипцию гена транспозазы, заменяя, по-видимому, фосфорилированный регулятор транскрипции, функционирующий в бактериях дикого типа, и не активный в Pts мутантах E.coli.

Таким образом, мутации по генам ptsI и ptsH в разной степени снижают частоты RSBP-индуцируемых интеграции плазмид в хромосому E.coli. Способность к интеграции восстанавливается в мутантах, содержащих оперон bvgAS в транс-положении.

Биологическое значение событий инсерционой инактивации оперона bvgAS в бактериях B.pertussis. Новый подход к регистрации фазовой изменчивости возбудителя коклюша in vitro и in vivo.

Коклюш - острое, респираторное инфекционное заболевание, с высокой летальностью у детей первого года жизни. Предполагается, что вспышки коклюша у восприимчивых к возбудителю новорожденных обусловлены носительством (персистенцией) бактерий B.pertussis у детей старшего возраста и взрослых, являющихся источником инфекции. Обследования длительно кашляющих взрослых и подростков выявили от 12% до 52% носителей возбудителя коклюша (Matttoo S, Chery JM, 2005).

Совместно со специалистами «Консультативно - диагностической поликлиники Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации» проведены обследования детей с симптомами коклюша и острых респираторных инфекций (ОРЗ). Выявление возбудителя проводили методом дотт-гибридизации нерадиоактивного зонда, представлявшего собой ДНК RSBP, с ДНК, выделенной из смывов с назофарингеальных мазков от детей разных возрастных групп. Контролем служили традиционные исследования - бактериологический анализ посевов, клинические обследования и серологические исследования крови для выявления антител к возбудителю коклюша аденовирусов, энтеровирусы, вирусы гриппа А и В, парагриппа 1, 2, 3, выполненные в лаборатории Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации в соответствии с действующими инструкциями.

Аналогичные исследования проведены совместно со специалистами ЗАО НПО «Лагис» с использованием метода ПЦР. Обследования проводили в детских садах (№ 213 и 272) и поликлиниках (№ 103, 111, 63, 81 и 97) Юго-Западного округа. Кроме того, методом ПЦР обследовано 89 детей (52 ребенка с длительным кашлем и 37 практически здоровых ребенка), обратившихся за консультативной помощью к сотрудникам группы молекулярной биологии патогенных микроорганизмов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалей РАМН в 1998- 2006гг. Результаты обследования представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты исследования смывов назофарингеальных мазков от детей с помощью метода ДНК гибридизации (ДНК Г, 1-й эксперимент) и ПЦР (2-ой эксперимент).

* объединены все исследования с помощью метода ПЦР.

Из таблицы 8 видно, что в группе детей с клиническим диагнозом коклюш, методом ДНК-гибридизации возбудитель выявлен в 81% случаев, в сравнении с 40% случаев, зарегистрированных с помощью бактериологического метода. Положительная реакция ДНК- гибридизации, обнаружена при обследовании 37% детей с диагнозом ОРЗ, что, скорее всего, указывает на смешанную вирусную и коклюшную инфекцию. 82 длительно кашляющих ребенка и 106 «практически здоровых» детей обследованы с помощью разработанной нами ПЦР тест-системы (см. ниже). ДНК возбудителя коклюша обнаружена в назофарингеальных мазках у 31% и 7,3% длительно кашляющих и здоровых детей, соответственно, что совпадает с результатами зарегистрированным нами с помощью метода ДНК-гибридизации. Heininger U et al., 2004 выявили ДНК B.pertussis у 5,3% пациентов контрольной группы, не имеющих симптомов коклюша в момент обследования. Обнаруженные отличия в цифрах нельзя считать значимыми из-за малого числа выявленных положительных результатов. Присутствие ДНК B.pertussis у практически здоровых людей может указывать на бактерионосительство или быть связано с начальной стадией или атипичной формой коклюша, по крайней мере, у некоторых из обследованных пациентов. Из представленных в таблице результатов следует также, что разработанная нами тест-система для выделения ДНК B.pertussis методом ПЦР обнаружила возбудитель коклюша более чем у 30% длительно кашляющих детей.

Таким образом, коклюш может проявляться в стертой форме и протекать под маской ОРЗ у детей и взрослых с длительным кашлем. (5-7)% практически здоровых и более 30% длительно кашляющих детей являются носителями возбудителя коклюша. Носители могут быть источниками заражения не иммунизированных детей и взрослых, прежде всего иммунодефицитных людей.

Механизмы перехода бактерий в состояние носительства не установлены. Предполагается, что носительство формируется в результате переживания бактерий внутри эукариотических клеток, длительность которого зависит от состояния вирулентности бактерий. Нами показано, что регуляция генов вирулентности B.pertussis может быть нарушена в результате инсерции IS-элементов в оперон bvgAS. Частота перемещения IS-элементов в оперон bvgAS и другие специфические сайты хромосомы B.pertussis in vitro, зависит от условий культивирования возбудителя и функционирования оперона bvgAS. Результаты ряда исследователей, указывают на увеличение времени переживания в эукариотических клетках бактерий B.pertussis, мутантных по генам аденилатциклазы (Gueirard P, 1998). Это позволяет предположить, что инактивация в результате инсерции IS-элементов в оперон bvgAS или других генов вирулентности, может быть пусковым механизмом перехода бактерий в состояние переживания или персистенции. Так как на первом этапе взаимодействия происходит адгезия бактерии к эукариотической клетке, то изменение её фазового состояния, способствующее переживанию, скорее всего, происходит после проникновения бактерии в клетку хозяина. Точное исключение IS-элемента, восстанавливающее экспрессию гена(ов) вирулентности, может привести к апоптозу, гибели эукариотической клетки, освобождению вирулентной бактерии и развитию инфекционного процесса в организме-хозяине или передачи возбудителя новому реципиенту. Альтернативой внутриклеточному переживанию, может быть переживание бактерий в биоплёнках, возможность формирования которых установлена для бактерий B.bronchiseptica, находящихся в промежуточной фазе Bvgi (Mattoo MH, Yuk К, 2004). Механизмы перехода бактерий в промежуточную фазу in vivo не установлены, что не позволяет исключить участие в этом процессе IS-элементов Bordetella. Увеличение частоты транспозиции IS-элементов может быть индуцировано факторами организма-хозяина, попаданием бактерии во внешнюю среду или воздействием других факторов, связанных, например, с применением средств лекарственной терапии заболевания.

Полученные результаты позволяют разработать методы регистрации не только инсерционных Bvg- мутантов B.pertussis, но и бактерий, содержащих инсерцию IS-элемента в гены, кодирующие различные факторы вирулентности возбудителя коклюша (КТ, ФГА, и т.д), и открывают новые возможности для исследования фазовых состояния бактерий B.pertussis в клиническом материале на разных стадиях заболевания. Информация о структуре генов вирулентности in vivo позволит установить значение кодируемых ими продуктов для развития инфекции и перехода бактерий в состояние переживания (персистенции).

Выделение и характеристика новых бактериофагов и определение лизогенности микроорганизмов рода Bordetella.

Результаты, изложенные в предыдущих разделах, подтверждают значимость IS элементов в изменчивости и регуляции вирулентности возбудителя коклюша. К МГЭ относятся и умеренные бактериофаги. Лизогенизация бактерий может привести к изменениям их свойств, в том числе и вирулентности. Изменение вирулентности достигается в результате прямого переноса факторов патогенности, например генов токсинов, или является следствием более сложных событий, изменяющих поверхностные антигены бактериальной клетки (Hendrix RW, 1999).

В настоящее время охарактеризованы бактериофаги микроорганизмов рода Bordetella, выделенные в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи из бактерий коллекции ВОЗ и клинических штаммов, бактериофагами BPP-1, BMP-1 и BIP-1 B.bronchiseptica, проявляющие различный тропизм к бактериям в разных фазовых состояниях (Liu M. et.al., 2004), и два бактериофагами B.avium В1 и В2, способные к генерализованной трансдукции (Shelton C.B., et al., 2000).

В работе описаны новые бактериофаги Т и К, изолированные из международного штамма вирулентных бактерий B.pertussis Tohama I, и бактерий 662-2, полученных в результате конверсии бактерий B.parapertussis 17903 бактериофагом B.pertussis 134. Проведен сравнительный анализ структуры геномов бактериофагов Т и К и ранее изолированных бактериофагов 134 и 41405 - B.pertussis и 214 -B.bronchiseptica. Выявлены особенности лизогении и конверсии бактерий рода Bordetella.

Бактериофаги Т и К морфологически идентичны друг другу и ранее охарактеризованным фагам B.pertussis 134, 41405 и 214 B.bronchiseptica. Диаметр икосаэдрической головки составляет (49,50,5)нм. Бактериофаги имеют хвостовой отросток длиной (1457) н.м., толщиной (8,70,8) н.м. с внутренним каналом (2,0 0,2)нм. Хвостовой отросток представлен, соединенными друг с другом 37-40 сегментами, на которые он легко фрагментируется. Сегменты имеют розеткообразную структуру диаметром (11,01,0)нм. Розетки образованы 6-7 субъединицами и соединены с соседними розетками на расстоянии порядка 15 нм друг от друга.

Результаты электронно-микроскопического анализа ДНК бактериофагов B.pertussis 134, 41405, Т и B. bronchisepticа 214. показали, что их популяции гетерогенны и содержат гомологичные ДНК размером (37 2)т.п.н., отличающиеся друг от друга одной или двумя инсерциями размером около 1 т.п.н. Геном бактериофага К размером (41 3)т.п.н. циркулярно пермутирован, так же как и геномы бактериофагов BPP-1, BMP-1 и BIP-1, и не гомологичен ДНК других фагов. Пермутированность генома К указывает на его способность к генерализованной трансдукции.

Саузерн-гибридизация ДНК бактериофагов Т, 134 с хромосомами бактерий-хозяев и других бактерий рода Bordetella, а также ДНКК с хромосомами разных штаммов B.parapertussis не обнаружила фаговых геномов в структуре хромосом, что указывает на преимущественно внехромосомную локализацию геномов Т, 134, 41405, 214 во всех изученных бактериях Bordetella и К в бактериях B.parapertussis. В пользу такого предположения говорят результаты дотт-гибридизации, обнаружившей 1 на 500-700 отдельных колоний бактерий-хозяев, содержащих ДНК бактериофагов, и анализа последовательности участка ДНК, являющейся сайтом интегрирации генома профага ВPP1 в хромосому B.bronchiseptica RB50. Сопоставление последовательностей (Liu M., Gingery M., Doulatov S.R. et.al., 2004) и B.bronchiseptica RB50 (EMBL BX470250) не выявило профага ВPP1 в хромосоме. Таким образом, два разных коллектива авторов, определяя последовательность ВPP1 в хромосоме B.bronchiseptica RB50, получили принципиально разные результаты в участке интеграции профага. С нашей точки зрения, эти результаты можно объяснить только тем, что авторы имели дело с разными клонами возбудителя, один из которых оказался лизогенным. Можно ожидать, что выделение такого лизогенного клона является достаточно редким событием как для штамма B.bronchiseptica RB50, так и для штаммов B.pertussis 134, Tohama I, B.bronchiseptica 214 и B.parapertussis 17903. Низкая степень лизогенизации бактерий рода Bordetella может быть связана с потерей фагового генома, находящегося, скорее всего, в состоянии линейной плазмиды.

Саузерн-гибридизация Р32 меченной ДНК бактериофага 134 B.pertussis выявила гибридизацию только с одним фрагментом Pst1 рестрикции ДНК хромосом конвертантов B.parapertussis 662-2 (рис.7а). Размер фрагмента (около 7 т.п.н.) указывает на то, что только часть фагового генома интегрирует в хромосому бактерии в процессе лизогенизации. Бактерии конвертантов, резистентные к фагу 134, приобрели специфические агглютиногены, летальную токсичность, способность размножаться в мозговой ткани мышей и так далее, характерные для вирулентных бактерий B.pertussis (Лапаева И.А. и др. 1982). Можно предположить, что в процессе лизогенизации клеток конвертанта принимают участие IS-элементы бактерий Bordetella. Возможно, фрагмент генома фага 134, фланкированный IS-элементами, перемещается в хромосому B.parapertussis, тогда как основная часть генома остается в свободном состоянии и утрачивается популяцией бактериальных клеток. Каким образом, перемещение небольшого фрагмента фаговой ДНК в хромосому B.parapertussis приводит к значительным изменениям свойств возбудителя паракоклюша, предстоит выяснить.

Результаты Саузерн - гибридизации ДНК хромосом B.parapertussis 17903 и 594; двух независимых конвертантов 662-2,; авирулентного мутанта B.pertussis IV и вирулентных бактерий B.pertussis 134, Tohama I, 3865; а также бактерий B.bronchiceptica 8220, W, 3K, выделенных от свиней в хозяйствах СССР, c меченой P32ДНК фага К представлены на рисунке 7б.

Рисунок 7. Саузерн-гибридизация Р32 ДНК бактериофага 134 (а) и Р32 ДНК К1 (б) с хромосомами бактерий рода Bordetella.

а) PstI фрагменты рестрикции B.parapertussis 17903, B.pertussis 134 (дор.1 и 2), B.parapertussis 662-2(1), 662-2(2) и 662-2(2) при двойной дозе фермента (дор.3, 4 и 5). Маркер (дор. 6): 23,7; 9,5; 6,7; 4,3 т.п.н..

б) EcoRI фрагменты рестрикции ДНК бактериофага К1 (дорожка 1) и хромосом B.parapertussis 662-2(1) и 662-2(2) (дор. 2 и 3), B. parapertussis 504 (дор. 4), 17903 (ДНК дор. 5, 11 и 13), B.bronchiceptica 214, W, 3K (дор. 6-8), 8220 (дор. 9 и 10), B.pertussis IV (дор.12), 134(дор.14), Tohama I (дор.15), 3865 (дор. 16).

Сравнение профилей гибридизации фрагментов EcoR1 рестрикции ДНК хромосом различных видов бактерий рода Bordetell с ДНК К, представленных на рисунке 7б (дор. 2-16), позволяет сделать следующие заключения:

- ДНК К гибридизуется с ДНК хромосом всех исследованных возбудителей рода Bordetella кроме B.parapertussis;

- картины гибридизации ДНК хромосом B.bronchice ptica 214, W, 3K (дор. 6-8) близки к картине гибридизации ДНК 662-2 (дор. 2,3), что указывает на одинаковую локализацию генома профага в хромосомах бактерий;

- характер изменения картины гибридизации ДНК хромосом независимых клонов B.bronchiceptica 8220 (дор. 9, 10) по отношению к гибридизации ДНК 662-2 указывает на одинаковую локализацию геномов профагов и на наличие мутаций в структуре профага B.bronchiceptica 8220;.

- картина гибридизации ДНК хромосомы B.pertussis 3865 (дор. 16) указывает на то, что геномы профагов 3865, W, 3K, 214 и 662-2 не идентичны, хотя и имеют протяженные участки гомологии, локализованные, скорее всего, в различных участках хромосомы бактерий;

- характер гибридизации ДНК хромосом B.pertussis 134 и Tohama I (дор. 14 и 15) свидетельствует о значительных отличиях геномов профагов этих штаммов бактерий от профагов B.bronchiceptica 8220, W, 3K, 214, B.pertussis 3865 и конвертанта 662-2;

- выявлено значительное отличие между картинами гибридизации ДНК хромосом B. pertussis IV, 134, Tohama I. Профиль саузерн-гибридизации фрагментов хромосомы авирулентного штамма B. pertussis IV (дор. 12) ближе к гибридизации хромосомы B.bronchiceptica 8220 (дор. 9,10), чем к профилю гибридизации вирулентных штаммов B. pertussis Tohama I или 134 (дор.14, 15).

Результаты, полученные при изучении выделенных нами и охарактеризованных ранее бактериофагов и лизогенности бактерий рода Bordetella, позволяют сделать следующие выводы:

- бактерии, по крайней мере, двух представителей рода Bordetella - B.pertussis и B.bronchiseptica полилизогенны. Геном одного из двух идентифицированных профагов находится в составе хромосомы клеток-хозяев. Второй профаг, скорее всего, находится в автономном состоянии и утрачивается значительной долей популяции бактерий при культивировании in vitro;

- бактериофаг B.pertussis 134 способен осуществлять лизогенизацию бактерий B.parapertussis 17903, сообщая им ряд свойств возбудителя коклюша. В процессе конверсии происходит интеграция части фагового генома 134 в хромосому конвертанта, возможно в результате IS- индуцированной рекомбинации фрагмента фагового генома и хромосомы B. parapertussis 17903;

- бактерии конвертанта B.parapertussis 17903 продуцируют бактериофаг К, последовательность которого отсутствует в хромосоме B.parapertussis 17903. Бактериофаг К идентичен по морфологии с фагами Т, 134 и 214, но имеет совершенно отличный от них геном;

- последовательности, гомологичные ДНК бактериофага К, обнаружены в хромосоме двух независимых конвертантов B.parapertussis 17903 и всех изученных нами штаммах бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica. Локализация сайтов интеграции геномов профагов, гомологичных К, различна у разных видов и штаммов бактерий и может быть связана с вирулентностью бактерий;

- свойства бактериофагов микроорганизмов рода Bordetella указывают на их принадлежность к классу МГЭ.

Конструирование тест-систем для идентификации ДНК возбудителя коклюша и его фазовых вариантов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Сложность лабораторной диагностики коклюша, распространенность возбудителя среди «практически здоровых» и длительно кашляющих людей различных возрастных групп делают актуальным разработку тест-систем, пригодных для идентификации возбудителя коклюша и его фазовых состояний.

Целью настоящего раздела работы является создание тест-системы, содержащей внутренний стандарт (ВС), обеспечивающей высокое качество анализа клинических образцов с помощь ПЦР, и пригодной для транспортировки при комнатной температуре.