Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

Харківський НАЦІОНАЛЬНИЙ медичний УНІВЕРСИТЕТ

УДК 616.155.1:616-005.1-08:616.155.3:616-092:616.33-002.44

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Еритроцитарна і лейкоцитарна ланки системи гемостазу в нормі та механізми їх порушень при гастральних виразках

14.03.04 - патологічна фізіологія

Кононенко Надія Миколаївна

Харків - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному фармацевтичному університеті МОЗ України (м. Харків).

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки та техніки України Березнякова Алла Іллівна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України (м. Харків), завідувач кафедри патологічної фізіології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Шевченко Олександр Миколайович, Харківський національний медичний університет МОЗ України, професор кафедри патологічної фізіології;

доктор медичних наук, професор Сукманський Олег Іванович, Одеський державний аграрний університет МАП України, професор кафедри нормальної і патологічної анатомії та патофізіології, керівник курсу патологічної фізіології;

доктор медичних наук, професор Кубишкін Анатолій Володимирович, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України (м. Сімферополь), завідувач кафедри патологічної фізіології.

Захист відбудеться 11 червня 2009 р. об 11⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському національному медичному університеті (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського національного медичного університету (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

Автореферат розісланий 30 квітня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат медичних наук, доцент О.Ю. Степаненко.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Система гемостазу - це сукупність функціонально-морфологічних і біохімічних механізмів, які забезпечують зупинку кровотечі при порушенні цілісності судин і разом з тим підтримують кров у рідкому стані всередині судин, тобто нормальну гемоциркуляцію (З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001; А.Н. Сидоркина, В.Г. Сидоркин, М.В. Преснякова, 2005). У життєдіяльності організму феномен тромбоутворення може мати різне значення. З одного боку, завдяки формуванню тромбу при порушенні цілісності кровоносних судин організм захищається від крововтрати, з іншого - тромбоутворення всередині судини призводить до порушення кровотоку і трофіки життєво важливих органів і тканин (М.Р. Гжегоцький, О.С. Заячківська, 2001; С. Бутенас, 2002), що є важливим етапом у патогенезі багатьох захворювань (Н.Н. Грицай, В.П. Мищенко, 2000). До компонентів системи гемостазу належать: система згортання крові з прокоагулянтною (плазмові фактори згортання крові) і антикоагулянтною (фізіологічні антикоагулянти) ланками, фібринолітична система крові з проферментами, ферментами та їх інгібіторами, клітинні фактори згортання крові і фібринолізу формених елементів крові, фактори згортання крові і фібринолізу судинної стінки і тканин. Порядок переліку компонентів системи гемостазу відбиває не стільки їх функціональне значення у фізіології та патології організму, скільки ступінь накопичених до теперішнього часу знань про них (В.П. Мищенко, И.В. Мищенко, 2003; А.И. Гоженко, С.Г. Котюжинская, В.П. Реутов, 2005). Серед клітин крові, які беруть участь у процесах агрегації та адгезії, найкраще вивчені зміни, які відбуваються в тромбоцитах (Д.М. Зубаиров, 2000; В.Б. Воробьев, 2004; Г.И. Козинец, 2006). Між тим є одиничні роботи, в яких відмічається, що важливу роль в утворенні первинного тромбу можуть відігравати й лейкоцити, хоча в цих роботах участь лейкоцитів вивчалася у випадках гіперлейкоцитозу - в основному при лейкемічних лейкозах, або скупчення лейкоцитів у ексудатах і запалених тканинах (А.И. Грицюк, Е.Н. Амосова, И.А. Грицюк, 1994). Не можна також зменшувати роль еритроцитів в утворенні тромбу та порушеннях мікроциркуляції. У зв'язку з великими розмірами агрегатів еритроцити, склеюючись, можуть суттєво порушувати капілярний кровотік. Слід, однак, зазначити, що механізми участі лейкоцитів і особливо еритроцитів в утворенні тромбу вивчені недостатньо (В.А. Макаров, 1998). В силу цього у всіх сучасних монографіях викладення матеріалу про клітинний гемостаз обмежується описом змін, що відбуваються в тромбоцитах, які складають основну масу первинного тромбу (Г.Л. Волков, Т.Н. Платонова, А.Н. Савчук 2005; К.М. Абдулкадыров, 2006; Д.Ф. Шиффман, 2007).

Таким чином, лейкоцитарний та еритроцитарний компоненти гемостазу ще не одержали достатньої і належної не тільки практичної, але й наукової оцінки.

Виразкова хвороба - одне з найбільш поширених серед працездатного населення захворювань, яке становить близько 20-30 % усіх хвороб шлунково-кишкового тракту, які, у свою чергу, займають третє місце за поширеністю у світі після серцево-судинних та онкологічних захворювань (Я.С. Циммерман, 2009). На дану хворобу в економічно розвинутих країнах впродовж життя хворіє від 3 до 20 % усього дорослого населення (А.В. Калинин, 2002). В Україні поширеність виразкової хвороби за останні роки збільшилась з 80 до 140 ‰ (Н.М. Желєзнякова, 2004). Найвищим цей показник був у Вінницькій, Донецькій, Чернігівській та Чернівецькій областях. Часті рецидиви та залучення до патологічного процесу суміжних органів травлення, тяжкість ускладнень, тривала непрацездатність хворих, а також великі економічні витрати зумовлюють актуальність проблеми виразкової хвороби та її медико-соціальне значення (Н.А. Яицкий, В.М. Седов, В.П. Морозов, 2002). Незважаючи на загальновизнану провідну роль інфікування Helicobacter pylori в ульцерогенезі (В.Г. Передерій, С.М. Ткач, 2003), виразкова хвороба шлунка є складним багатофакторним за патогенезом гастроентерологічним захворюванням, а багато патогенетичних ланок ульцерогенезу залишаються дискутабельними й до кінця не вивченими (В.Б. Гриневич, Ю.П. Успенский, Г.Ж. Шабанова, 2002; Г.Д. Фадеенко, 2003).

У теперішній час у патофізіології виразкоутворення прийнято розглядати як результат порушення співвідношення агресивних властивостей шлункового вмісту та захисних можливостей слизової оболонки, що в нормальних умовах врівноважують одні одних, так звані ваги Шея (А.А. Шептулин, В.А. Киприанис, 2006). Виразковий дефект виникає у тих ситуаціях, коли рівновага порушується або внаслідок посилення кислотно-пептичної агресії (А.В. Кубышкин, Л.В. Анисимова, 2007), або через ослаблення захисних механізмів (А.С. Свинцицкий, Г.А. Соловьева, 2000). До останніх відносять слизобікарбонатний бар'єр, достатній кровотік, регенерацію шлункового епітелію, імунний захист, рівень простагландинів. Кровотік безпосередньо впливає на репаративні властивості слизової оболонки шлунка, оскільки епітелій, який швидко ділиться, потребує великої кількості кисню та поживних речовин (А.А. Авраменко, А.И. Гоженко, В.С. Гойдык, 2008). Крім того, було встановлено, що посилений кровотік повністю знімає ушкоджуючі ефекти нестероїдних протизапальних препаратів, жовчних кислот та соляної кислоти, тому що адекватний кровотік забезпечує надходження до слизової оболонки бікарбонатів, значна частина яких не синтезується в клітині, а проходить через неї транзитом або через міжклітинні канали з кровотоку. Причиною слабкого кровопостачання слизової оболонки шлунка є порушення реологічних властивостей крові (Н.И. Белостоцкий, 2002). Однак роль в цьому процесі еритроцитів та лейкоцитів не вивчена.

У зв'язку з цим дослідження механізмів участі еритроцитів і лейкоцитів у згортанні крові в нормі та при виразковій хворобі шлунка є актуальною проблемою сучасної патофізіології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідної теми Національного фармацевтичного університету МОЗ України «Фармакологічні дослідження біологічно активних сполук і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх використання в медичній практиці» (номер держреєстрації 0103U000478). Автор є виконавцем фрагмента даної науково-дослідної теми.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження стало визначення механізмів участі еритроцитів і лейкоцитів у згортанні крові в нормі та патогенезі виразкової хвороби шлунка.

Для досягнення поставленої мети було передбачено вирішення таких завдань:

1. Вивчити механізми участі еритроцитів у системі гемостазу.

2. Визначити механізми участі лейкоцитів у системі гемостазу.

3. Дослідити вплив еритроцитів і лейкоцитів на гемостаз при експериментальній виразці шлунка.

4. Вивчити структурно-функціональні властивості мембран еритроцитів, стан системи перекисного окиснення ліпідів, антиоксидантного захисту еритроцитів, мікроциркуляторного русла і ультраструктуру слизової оболонки шлунка при експериментальній виразці шлунка.

5. Виявити взаємозв'язок між порушеннями структурно-функціональних властивостей мембран еритроцитів, активністю антиоксидантного захисту еритроцитів і зміною гемостатичного потенціалу крові при гастральних виразках.

6. Експериментально обґрунтувати та апробувати в клініці застосування антиоксидантів для лікування хворих на виразкову хворобу шлунка.

Об'єкт дослідження - механізми гемостазу в нормі та при виразковій хворобі.

Предмет дослідження - участь еритроцитів і лейкоцитів у системі гемо-стазу.

Методи дослідження: патофізіологічні, гемокоагуляційні, гематологічні, біохімічні, фармакологічні, мікробіологічні, морфологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено вивчення та доведена здатність цілих еритроцитів активізувати внутрішнє тромбопластиноутворення в умовах дефіциту тромбоцитарного фактора 3, яка зберігається, на відміну від здатності тромбоцитів, і при зниженій активації фактора Хагемана. Встановлено, що активізуючий вплив цілих еритроцитів на внутрішнє тромбопластиноутворення пов'язаний із наявністю в них тромбопластинового фактора еритроцитів (ТФЕ), який є гліколіпопротеїдом з молекулярною масою 17540-22590, зосереджений у стромі еритроцитів у фракції D і має властивості фактора 3 тромбоцитів. Встановлений механізм включення тромбопластинового фактора еритроцитів у процес тромбопластиноутворення, який полягає у збереженні сіалопротеїду зовнішнього шару мембрани клітини, що відіграє роль своєрідного посередника між ТФЕ і активованими факторами згортання плазми. В стромі еритроцитів у фракції А виявлені високомолекулярні стромальні білки (167 900), які прискорюють перетворення фібриногену у фібрин і за біологічною дією нагадують фактор 2 тромбоцитів. Уперше встановлений механізм участі еритроцитів у системі гемостазу, який полягає в активації ендогенної фосфоліпази А₂, дестабілізації ліпідних структур мембран еритроцитів, накопиченні вільних жирних кислот (ВЖК), зміні кількісних співвідношень окремих фракцій у складі фосфоліпідів, втраті клітинними мембранами холестерину. Доведено, що фосфоліпіди внутрішнього шару мембрани еритроцитів: фосфатидилетаноламін (ФЕА) і фосфатидилсерин (ФС) - прискорюють, а фосфоліпіди зовнішньої сторони біошару: сфінгомієлін (СФМ) і фосфатидилхолін (ФХ) - гальмують процес згортання крові. Показано, що лейкоцити беруть активну участь у реакціях клітинної агрегації і входять до складу первинної гемостатичної пробки, здатні активізувати коагуляційний гемостаз за рахунок наявності в них тромбопластичного, антигепаринового і фібринстабілізувального факторів. Уперше вивчено процеси вільнорадикального окиснення ліпідів в еритроцитах, активність антиоксидантних ферментів еритроцитів при експериментальній виразці шлунка за Окабе. Показано, що активація перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) в еритроцитах, зниження активності основних антиоксидантних ферментів еритроцитів, перш за все каталази (КА) та відновленого глутатіону, зумовлює підвищення агрегаційної активності, зниження пероксидної резистентності і здатності еритроцитів до деформування, збільшення в'язкості еритроцитарної суспензії при виразці шлунка. Вперше на моделі хронічної виразки шлунка патогенетично обґрунтовано застосування антиоксиданту - мелаксену - для лікування виразкової хвороби. Встановлений механізм його репаративної дії, обумовлений гальмуванням розвитку некротичних процесів у слизовій оболонці шлунка (СОШ), а при виникненні дефекту - стимулюванням загоєння по типу реституції - з повним відновленням слизової оболонки за рахунок: відновлення кількості білків з молекулярною масою 89, 95 та 99 кДа у загальній фракції клітин, утворення нової фракції білків з молекулярною масою 36 кДа, нормалізації вмісту холестеролу, збільшення рівня триацилгліцеролу та головних фракцій фосфоліпідів - фосфатидилінозитолу і ФЕА - в клітинах СОШ. Патогенетично обґрунтовано додавання до стандартної терапії мелаксену в клініці хворим з виразковою хворобою шлунка, що сприяє більш швидкому рубцюванню виразки та попереджує її рецидивування.

Практична значущість одержаних результатів. Робота належить до фундаментальних досліджень. Одержані дані доводять участь еритроцитів і лейкоцитів у системі гемостазу в нормі та при виразці шлунка і в цілому розширюють уявлення про механізми згортання крові та патогенез виразкової хвороби шлунка. Результати роботи можуть слугувати патогенетичним обґрунтуванням включення антиоксидантів до комплексної схеми лікування виразкової хвороби шлунка. Зокрема, показано, що мелаксен має високу противиразкову активність (17,5) і позитивно впливає на репаративні процеси СОШ за рахунок відновлення кількості білків, нормалізації вмісту холестеролу, зростання рівня триацилгліцеролу та головних фосфоліпідів - фосфатидилінозитолу і ФЕА - в клітинах СОШ.

Одержані результати впроваджені в навчальний процес на кафедрах патологічної фізіології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Запорізького державного медичного університету, Буковинського державного медичного університету, Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, ВДНЗУ «Українська медична стоматологічна академія (м. Полтава), Івано-Франківського національного медичного університету, Національного фармацевтичного університету; на кафедрі загальної та клінічної патофізіології ім. В.В. Підвисоцького Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертація виконана самостійно. Автором особисто був здійснений патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням медичної бази даних «Medlіne» мережі Internet, аналіз актуальності і ступеня вивчення проблеми; визначені напрямки досліджень, сформульовані мета і завдання дослідження, здійснені огляд і аналіз літератури, визначені методологічні підходи, відпрацьовані дослідні моделі, виконані всі експериментальні дослідження, а також проведені аналіз, систематизація і статистична обробка одержаних результатів і оформлення їх у вигляді таблиць і рисунків, обґрунтовані основні положення та наукові висновки роботи, написана і оформлена дисертація.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були викладені і знайшли позитивну оцінку на: V Всеукраїнській науково-практичній конференції «Клінічна фармація в Україні» (Харків, 2004); науковій конференції «ІV читання ім. В.В. Підвисоцького» (Одеса, 2005); ІІ Міжнародній науковій конференції «Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка» (Одеса, 2005); міжнародній науково-практичній конференції «Наукові дослідження - теорія та експеримент 2005» (Полтава, 2005); українській конференції з міжнародним представництвом «Нейроендокринні і імунні механізми регуляції гомеостазу в нормі та патології» (Запоріжжя, 2005); VI Національному з'їзді фармацевтів України «Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України» (Харків, 2005); всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів «Від фундаментальних досліджень до медичної практики» (Харків, 2005); научно-практической конференции с международным участием «Лекарства - человеку: Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств» (Харьков, 2006); ІІІ Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі «Ліки та Життя» (Київ, 2006); науковій конференції молодих вчених з міжнародною участю «Актуальні проблеми геронтології та геріатрії», присвяченій пам'яті академіка В.В. Фроль-кіса (Київ, 2006); всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні проблеми клінічної, експериментальної, профілактичної медицини та стоматології» (Донецьк, 2006); науковій конференції «V читання ім. В.В. Підвисоцького» (Одеса, 2006); І Міжнародній науково-практичній конференції «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів» (Тернопіль, 2006); Х Міжнарод-ному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2006); ІІІ Міжнародній медико-фармацевтичній конференції студентів та молодих вчених, присвяченій 20-річчю Чорнобильської аварії (80-му ювілейному науковому форумі студентів і молодих вчених) (Чернівці, 2006); ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006); науковій конференції «Актуальні питання патофізіологїї» (Ялта, 2006); ІІІ Національному з'їзді фармакологів України «Фармакологія 2006 - Крок у майбутнє» (Одеса, 2006); ІІ Міжнародній науково-практичній конференції «Створення, виробництво, стандартизація, фармако-економічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок» (Харків, 2006); науково-практичній конференції молодих вчених з міжнародною участю «Вчені майбутнього» (Одеса, 2006); науковій конференції «VІ читання ім. В.В. Підвисоцького, присвяченій 150-річчю з дня народження» (Одеса, 2007); ІV Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі «Ліки та Життя» (Київ, 2007); VІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Клінічна фармація в Україні» (Харків, 2007); І Національному конгресі «Человек и Лекарство - Украина» (Київ, 2008); міжнародній науковій конференції студентів та молодих вчених «Молодь - медицині майбутнього» (Одеса, 2008); Науковій конференції «VІІ читання ім. В.В. Підвисоцького» (Одеса, 2008); V з'їзді гематологів та трансфузіологів України з міжнародною участю «Підсумки та перспективи розвитку гематології та трансфузіології в Україні» (Вінниця, 2008); V Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю «Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів» (Запоріжжя, 2008); всеукраїнській науково-практичній конференції «Медична наука - 2008» (Полтава, 2008); науково-практичній конференції «Шпитальні інфекції: сучасний стан проблеми» (Харків, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 52 наукові роботи, з них 22 статті у фахових виданнях, що входять до переліку ВАКа України (17 без співавторів), 2 патенти України, 28 тез у матеріалах конференцій, з'їздів, конгресів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 285 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків і списку літератури, який містить 335 джерел, з яких 226 - вітчизняних та 109 - іноземних авторів. Дисертаційна робота ілюстрована 32 таблицями, 36 рисунками (з яких 12 мікрофотографій та 12 тромбоеластограм), які займають 6 повних сторінок.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 760 нелінійних статевозрілих самцях білих щурів масою 180-200 г. Досліди здійснювали згідно з національними «Загальними етичними принципами дослідів на тваринах» (Україна, 2001), які узгоджуються з положеннями «Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 18.03.86), витяг з протоколу № 12 засідання Комітету з біоетики НФаУ від 10.12.08. Всі маніпуляції, які можуть спричинювати біль, проводили під етамінал-натрієвим (40 мг/кг внутрішньочеревно) або барбаміловим (60 мг/кг підшкірно) наркозом (Л.Н. Сернов, В.В. Гацура, 2000). Евтаназію проводили шляхом передозування ефірного наркозу (О.В. Стефанов зі співавт., 2001). Для виключення впливу сезонних та добових коливань (С.Е. Золотухин, 1991) на показники, які вивчали, основні дослідження були проведені в осінньо-зимовий період у ранкові години.

Вивчення функціонального стану еритроцитів як компонента гемостазу. Визначали агрегаційну активність еритроцитів, індуковану фібриногеном і аденозиндифосфорною кислотою (АДФ) (В.П. Балуда зі співавт., 1980), агрегаційний коефіцієнт еритроцитів за І.І. Міщуком (1994), адгезивну здатність еритроцитів, ступінь ушкодження мембран еритроцитів (А.И. Грицюк, Е.Н. Амосова, И.А. Грицюк, 1994).

Здатність еритроцитів активізувати коагуляційний гемостаз вивчали за показниками тромбоеластограм, які записували на чотирьохканальному тромбоеластографі «Тромб-2» (Росія), в звичайній плазмі і після внесення до неї гемолізованих та інтактних еритроцитів.

При вивченні впливу еритроцитів на систему гемостазу зіставляли результати дослідження показників згортання і фібринолізу в контролі (плазма, бідна на тромбоцити, при додаванні ізотонічного розчину хлориду натрію) та в досліді - плазма, бідна на тромбоцити, при додаванні суспензії еритроцитів (в нульовому розведенні - концентрація клітин становила приблизно 4 млн в мм³), у співвідношенні 1:1 (2 млн клітин в мм³), 1:3 (1 млн в мм³) і 1:9 (0,4 млн в мм³). еритроцит лейкоцит гемостаз гастральний

Тромбопластинову активність еритроцитів оцінювали за їх здатністю активізувати внутрішнє тромбопластиноутворення в плазмі, бідній на тромбоцити, з залученням таких методів: визначення часу рекальцифікації цитратної плазми за Howell (В.А. Макаров, 1997), каолінового часу згортання плазми за P.G. Hattersley у модифікації З.С. Баркагана (2001), силіконового часу плазми за F.K. Beller, H. Graff (В.П. Балуда зі співавт., 1980), індексу діапазону контактної активації плазми за З.С. Баркаганом (2001), активованого часткового тромбопластинового часу (каолін-кефалінового часу плазми) за J. Caen (В.А. Макаров, 1997), індексу звільнення тромбоцитарних активаторів за З.С. Баркаганом (2001), споживання протромбіну за М.А. Котовщиковою та З.Д. Федоровою, генерації тромбіну за методом W.R. Pіtney і J.V. Dacіe (В.П. Балуда зі співавт., 1980).

Вивчення тромбопластинової активності еритроцитів при їх підвищеній агрегації проводили методом визначення споживання протромбіну. Посилення агрегації еритроцитів in vitro досягали додаванням до плазми, бідної на тромбоцити, декстрану (середня молекулярна маса 80000) до кінцевої концентрації 1500 мг/дл. Тромбопластинову активність цілих і зруйнованих еритроцитів (після обробки цілих клітин трипсином) оцінювали за їх здатністю підвищувати тромбопластинову активність плазми, бідної на тромбоцити, у тестах: генерації тромбіну та часу рекальцифікації (В.П. Балуда зі співавт., 1980). Для одержання трипсинізованих еритроцитів відмиті еритроцити обробляли розчином кристалічного ферменту. У першій серії досліду брали 0,1%-вий розчин трипсину з використанням концентрованої суспензії еритроцитів (4-4,5 млн у 1 мм³) й інтактні еритроцити в такій самій концентрації; у другій серії досліду для більш глибокого ферментативного впливу на клітину використовували 0,4%-вий розчин трипсину, завись еритроцитів у більшому розведенні (800-900 тис. у 1 мм³) й інтактні еритроцити у відповідному розведенні.

Дослідження тромбін-акцелераторної здатності еритроцитів проводили за допомогою визначення тромбінового часу за Biggs, Macfarlane, протромбінового часу - за A.J. Quick; фібринстабілізувальної дії еритроцитів - за методом Сигга, вмісту фібриногену - за методом Р.А. Рутберг, часу тромботесту - за М.А. Котовщиковою, етаноловий тест проводили за H. Godal (В.П. Балуда зі співавт., 1980); вміст продуктів деградації фібриногену і фібрину визначали за С.З. Габітовим (1982).

Антигепаринову активність еритроцитів вивчали за тромбіновим часом цитратної і рекальцифікованої депротромбінізованої плазми, за визначенням вільного гепарину в цитратній і рекальцифікованій депротромбінізованій плазмі до і після інкубації з еритроцитами (А.Б. Косырев, А.Б. Добровольский, 1998).

Фібринолітичні властивості еритроцитів вивчали за активністю фібринолізу на стандартних фібринових плівках для визначення в плазмі проактиваторів і активаторів плазміногену - за Аструпом, загальну фібринолітичну активність плазми - за Е. Бідвел, кількісне визначення плазміногену - за методом Брун, антитромбіну ІІІ - за Абільдгаардом (Г.В. Андреенко с соавт., 1981). Загальну фібринолітичну активність еритроцитів визначали за здатністю розчиняти кров'яний згусток за методом М.А. Котовщикової і Б.І. Кузника (В.В. Меньшиков, 1987).

Відокремлення ліпідної фракції еритроцитів для вивчення фосфоліпідного складу мембран проводили за методом Фолча (1957). Для розділення фосфоліпідів на окремі фракції використовували метод тонкошарової хроматографії. Ініціацію окислювальних процесів в еритроцитах здійснювали, використовуючи середовище Фентона (3 мМ перекису водню, 10 мМ сірчанокислого заліза), та інкубували еритроцити в цих умовах впродовж 1, 2 та 24 год.

Білковий спектр строми досліджували за допомогою гель-хроматографії на сефадексі (Г. Детерман, 1970). В кожній фракції визначали вміст білка за методом Lowry, сіалової кислоти - за методом Svennerholm, ліпідного фосфору -за методом Bloor (В.В. Меньшиков, 1987). Молекулярну масу білка розраховували за формулою Г. Детермана (1970).

Дослідження агрегації лейкоцитів проводили на зразках плазми, бідної на тромбоцити, з різним вмістом у ній автологічних лейкоцитів: від 0 до 13 тис. у 1 мкл. Використовували тест АДФ-агрегації і гемолізат-агрегаційний тест (З.С. Баркаган, 2001). Вплив лейкоцитів на коагуляційний гемостаз визначали за часом рекальцифікації цитратної плазми за Howell (В.А. Макаров, 1997), часом тромботесту за М.А. Котовщиковою, споживанням протромбіну за М.А. Котовщиковою та З.Д. Федоровою, тромбіновим часом звичайної і гепаринізованої плазми за Biggs, Macfarlane, активністю фібринстабілізувального фактора за Сиггом, фібринолітичною активністю крові за Е. Бідвел (В.П. Балуда зі співавт., 1980).

В роботі були використані такі експериментальні моделі гастральних виразок: іммобілізаційні виразки з подразненням віддалених від шлунка рефлексогенних зон; виразка, викликана спільним введенням преднізолону та етилового спирту; серотонінова, індометацинова, ацетилсаліцилова моделі виразок шлунка (Л.В. Яковлєва зі співавт., 2001); виразка шлунка за методом Окабе (1971).

Для оцінки системи ПОЛ і активності ферментів антиоксидантного захисту при виразці шлунка використовували метод спектрофотометрії на двопроменевому спектрофотометрі «Specord UV VIS» (Німеччина). У еритроцитах визначали вміст дієнових кон'югат (А.Н Леднев, Э.Е. Рууге, 1985), малонового діальдегіду (A. Patterson, A. Lazarov, 1955), гідроперекисів ліпідів (А.В. Арутюнян, 2000), активність супероксиддисмутази (СОД) (С. Чевари, И. Чаба, 1985), КА (M.R. L'able, P.W. Ficher, 1990), глутатіонпероксидази і вміст глутатіону (Г.Ю. Мальцев, Н.В. Тышко, 2002), активність глутатіонредуктази (Л.Б. Юсупова, 1989).

Оцінку структурно-функціональних властивостей мембран еритроцитів при виразці шлунка проводили шляхом визначення пероксидної резистентності еритроцитів за методом F. Iager, деформування еритроцитів за модифікованим методом C. Tannert і W. Lux, відносної в'язкості еритроцитів за методом А.Ф. Пирогової в модифікації М.А. Котовщикової і З.Д. Федорової (Л.В. Беркало зі співавт., 2003).

Вивчення мікроциркуляції у слизовій оболонці шлунка щурів проводили методом сканувальної електронної мікроскопії корозійних препаратів (Д.С. Саркисов, Ю.Л. Петрова, 1996).

Для вивчення ультраструктури клітин матеріал фіксували у 2,5%-вому розчині глютаральдегіду на фосфатному буфері з дозабарвленням 1%-вою осмієвою кислотою, потім зневоднювали і заливали епоксидною смолою (К.С. Волков, Н.В. Пасечко, 1997). Тканину шлунка фіксували в 10%-вому розчині нейтрального формаліну, проводили через спирти зростаючої концентрації, заливали у парафін (Л.И. Аруин, 2000). Мікротомні зрізи товщиною 5-6 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином. Світлову мікроскопію та фотографування мікропрепаратів здійснювали на мікроскопі «Olympus BX» (Японія).

Для дослідження впливу антиоксидантів на процес репарації тваринам з виразками шлунка перорально вводили мексидол («Мир-Фарм», Росія) в дозі 100 мг/кг, токоферолу ацетат («Словакофарма», Словаччина) в дозі 50 мг/кг і мелаксен («Юніфарм, Інк.», США) в дозі 30 мг/кг. Розраховували виразковий індекс в кожній групі та противиразкову активність препаратів.

Для вивчення ефективності включення антиоксидантів до комплексу традиційної антиульцерогенної терапії хворим з виразковою хворобою шлунка до стандартної терапії (опразол по 20 мг 2 рази на день, амоксицилін по 1000 мг 2 рази на день, клацид по 500 мг 2 рази на день) додавали мелаксен в дозі 6 мг раз на день ввечері. Фіброгастродуоденоскопію проводили за допомогою фіброгастродуоденоскопа «Фуджинон» (Японія), внутрішньошлункову рН-мет-рію - за методом В.М. Чернобрового (1990). Гістологічному дослідженню підлягали біоптати (не менше 3-4 біоптатів), взяті із країв виразки та тіла шлунка до, після та у віддалений термін (до 3 років) за допомогою світлового мікроскопа. Наявність та ступінь обсіменіння СОШ H. pylori визначали двома методами, матеріал для постановки яких брали під час проведення ендоскопії з середньої третини антрального відділу та середньої третини тіла шлунка: мікроскопією забарвлених барвником Романовського-Гімзи мазків-відбитків і за допомогою швидкого уреазного тесту, який являє собою біохімічний метод визначення уреази в біоптаті (А.О. Авраменко, 1998).

Статистичну обробку одержаних результатів проводили методам варіаційного аналізу (ANOVA) з використанням пакета прикладних програм Statistica for Windows ХР 5,1, t-критерію Стьюдента на ПЕОМ Pentium-5, а також за допомогою пакетів прикладних програм для ПЕОМ (S-Plus 2000), Excel (С.Н. Лапач, 2000).

Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом нашої роботи стало з'ясування ролі еритроцитів у первинному гемостазі. Вивчення показників агрегатограми показало, що агрегація, швидкість утворення агрегатів та агрегаційний коефіцієнт інтактних еритроцитів були виражені більшою мірою при дії АДФ, ніж при стимуляції фібриногеном. Гемолізовані еритроцити сильніше, ніж інтактні, чинили вплив на адгезивно-агрегаційну активність також при дії АДФ. Нами виявлена характерна друга хвиля на агрегатограмах гемолізованих еритроцитів, одержаних при стимуляції АДФ. Це є непрямим підтвердженням «реакції вивільнення» з еритроцитів внутрішньоклітинного агрегувального агента - АДФ.

Одержавши дані про те, що еритроцити беруть участь у первинному гемостазі, ми вивчили вплив інтактних еритроцитів на вторинний гемостаз. На першому етапі ми дослідили прямий вплив цілих еритроцитів на першу фазу згортання крові - фазу утворення протромбінази - за внутрішньою (кров'яною) системою. Одержані результати свідчили про те, що інтактні еритроцити вірогідно підвищують загальний коагулювальний потенціал плазми, бідної на тромбоцити. У нульовому розведенні вплив еритроцитів на прискорення часу рекальцифікації плазми в 4,4 раза перевищував такий безтромбоцитарної плазми. Завись еритроцитів у співвідношеннях 1:1; 3:1; 9:1 скорочувала час рекальцифікації в 4,1; 3,9; 3,2 раза відповідно в порівнянні з контрольною плазмою. Каоліновий час згортання вірогідно скорочувався: у нульовому розведенні - у 2,1 раза, у розведеннях 1:1; 3:1; 9:1 - у 1,6; 1,4 і 1,2 раза відповідно. Силіконовий час плазми зменшувався у нульовому розведенні в 3,1 раза, у розведеннях 1:1; 3:1; 9:1 - у 2,0; 1,7 і 1,3 раза відповідно. При вивченні індексу діапазону контактної активації (ІДКА) встановлено, що при використанні всіх концентрацій еритроцитів індекс вірогідно знижувався відносно даного показника плазми. Відомо, що цей тест характеризує початкову фазу згортання крові - внутрішній механізм формування протромбіназної (тромбопластинової) активності, для реалізації якої, крім плазмових факторів згортання, потрібен фактор 3 тромбоцитів. Зменшення ІДКА в наших дослідах у плазмі, бідній на тромбоцити (в умовах відсутності фактора 3 тромбоцитів), свідчило про те, що еритроцити перекривають його дефіцит шляхом виділення в плазму ТФЕ, аналогічного фактору 3 тромбоцитів.

Одержані дані свідчили про активізуючий вплив еритроцитів на процес внутрішнього тромбопластиноутворення. Паралельно ми визначали кефалін-каоліновий час (стандартизований за контактом парціальний тромбопластиновий час) згортання плазми, бідної на тромбоцити. В цьому контрольному тесті до плазми крім каоліну (активація контактного процесу згортання) ми додавали аналог фактора 3 тромбоцитів - кефалін. В умовах подвійної активації гемостазу - кефаліном та тромбопластиновим фактором еритроцитів - згортання плазми значно прискорювалося: в нульовому розведенні - в 3,1 раза, у розведеннях 1:1; 3:1; 9:1 - у 2,5; 1,9 і 1,7 раза відповідно порівняно з контролем. Про безпосередній активізуючий вплив еритроцитів на внутрішнє тромбопластиноутворення свідчило також відмічене нами підвищення споживання протромбіну: в нульовому розведенні - в 4,5 раза, у розведеннях 1:1; 3:1; 9:1 - у 4,2; 2,9 і 2,3 раза відповідно.

Слід зазначити, що значне розведення еритроцитів (9:1) знижувало їхню коагулювальну активність. Незначне розведення, що відповідає фізіологічним коливанням вмісту еритроцитів у крові тварин, не робило помітного впливу на їхній коагулювальний потенціал. Результати досліджень дозволили нам дійти висновку про здатність цілих еритроцитів активізувати внутрішнє тромбопластиноутворення.

Наступним етапом експерименту стало вивчення тромбопластинової активності еритроцитів (за споживанням протромбіну) в умовах достатньої (у скляній пробірці) та зниженої (у силіконованій пробірці) активації фактора Хагемана. Тест споживання протромбіну проводили в плазмі, бідній на тромбоцити; багатій на тромбоцити-І (230-480 тис. у 1 мм³); багатій на тромбоцити-ІІ (60-82 тис. у 1 мм³) при додаванні суспензії еритроцитів. Встановлено, що тромбопластинова активність еритроцитів виявлялася в плазмі, бідній на тромбоцити, почасти - у плазмі, багатій на тромбоцити-ІІ, і зовсім не виявлялася в плазмі, багатій на тромбоцити-І. При зниженій активації фактора Хагемана тромбопластинова активність еритроцитів виявлялася й у плазмі з високим вмістом тромбоцитів. Останнє пов'язано, на нашу думку, з тим, що в умовах зниженого утворення контактного фактора знижується і мобілізація тромбоцитарного фактора 3 (виникає його дефіцит), що створює умови для виявлення активності еритроцитів. Поряд з цим звертає на себе увагу однаковий ступінь підвищення споживання протромбіну під впливом еритроцитів у плазмі, бідній на тромбоцити, у скляній і силіконованій пробірках. Це дозволяє нам вважати, що активізуючий вплив еритроцитів на внутрішнє тромбопластиноутворення, на відміну від тромбоцитів, зберігається і при зниженій активації фактора Хаге-мана.

Далі ми вивчили тромбопластинову активність еритроцитів при їх підвищеній агрегації. Посилення агрегації еритроцитів поєднане з певними змінами фізико-хімічних властивостей поверхні мембрани (В.Б. Воробьев, 2004). У зв'язку з цим виникло питання: якою мірою підвищена агрегація клітин здатна впливати на активність ТФЕ. Нас цікавила також залежність ТФЕ від властивостей поверхні мембрани клітини. Тромбопластинову активність визначали методом споживання протромбіну в звичайній плазмі, в плазмі з декстраном і паралельно в аналогічних пробах після додавання суспензії автологічних еритроцитів. Встановлено, що під впливом декстрану в суспензії еритроцитів закономірно збільшувалась кількість агрегованих клітин з наростанням величини агрегатів. Індекс еритроцитарної активності збільшувався при концентрації декстрану 1000 та 1500 мг/дл, що відповідало подовженню часу споживання протромбіну в плазмовій суспензії еритроцитів у середньому на 26 %, тоді як споживання протромбіну в самій плазмі після додавання декстрану залишалось незмінним. Відмічені нами при впливі декстрану зміни споживання протромбіну в плазмі з еритроцитами, які не залежали від характеру змін споживання протромбіну в самій плазмі, свідчили на користь змін при цьому тромбопластинової активності еритроцитів.

За даними літератури відомо про вплив декстрану тільки на прокоагу-лянтну активність тромбоцитів (Д.М. Зубаиров, 2000). При цьому зниження активності тромбоцитарного фактора 3 спостерігалося тільки після тривалої попередньої інкубації тромбоцитів з декстраном, виявляючи більшу вираженість при збільшенні середньої молекулярної маси декстрану > 250000. Відомо, що тромбопластинова активність цільної крові під впливом декстрану збільшується, тоді як з плазмою подібний ефект не спостерігається (Г.Л. Волков с соавт., 2005). На наш погляд, це свідчило про роль еритроцитів у реалізації даного стимулюючого впливу декстрану на тромбопластиноутворення. Одержані нами дані підтвердили безсумнівне значення властивостей поверхні мембрани еритроцита для прояву активності ТФЕ і лабільність прокоагулянтної активності еритроцитів. Найбільш важливим є той факт, що підвищення тромбопластинової активності еритроцитів можуть супроводжувати такі зміни поверхні мембрани клітин, при яких спостерігається їх підвищена агрегація. Вивчення механізму включення ТФЕ у процес внутрішнього тромбопластиноутворення стало наступним етапом нашої роботи. Відомо, що під впливом ферментативної дії на білкову частину ліпопротеїду, який має певну біологічну активність, остання втрачається чи стає значно менш вираженою (Б.А. Шендеров, 2004). Тому якщо ТФЕ розташовується в мембрані поверхнево, ми передбачали ушкодження його під впливом трипсину і в результаті цього зниження тромбопластинової активності клітини, що зберігається і після її руйнування. Однак ми не виключали можливості посилення прокоагулянтної активності трипсинізованої клітини. Останнє свідчило б на користь глибокої локалізації ТФЕ і одночасно про «бар'єрну» роль сіалопротеїду зовнішнього шару мембрани, що перешкоджає взаємодії клітинного фактора з плазмовими.

Нами було поставлено завдання з'ясувати локалізацію ТФЕ в мембрані еритроцита і його вплив на тромбопластинову активність еритроцитів. У першій серії дослідів ми використовували відносно концентровану клітинну суспензію (4-4,5 млн у 1 мм³) трипсинізованих еритроцитів (0,1%-вий розчин трипсину) і таку ж кількість нормальних еритроцитів. Нами встановлено, що трипсинізовані еритроцити знижують тромбопластинову активність крові, що виявлялося у збільшенні часу рекальцифікації й уповільненні генерації тромбіну. Індекс порівняльної активності еритроцитів для даних показників, відповідно, збільшився (1).

В другій серії дослідів при використанні суспензії еритроцитів у більшому розведенні (800-900 тис. у 1 мм³), оброблених більш концентрованим розчином ферменту (0,4%-вий розчин трипсину), одержані більш виражені зміни тромбопластинової активності еритроцитів. При цьому індекс порівняльної активності еритроцитів перевищив показник в дослідах попередньої серії. Необхідно підкреслити, що вплив гемолізату нормальних і трипсинізованих еритроцитів на генерацію тромбіну в плазмі вірогідно не розрізнявся. Після обробки еритроцитів 0,4%-вим розчином трипсину кількість неагрегованих клітин зменшилась в 4,2 раза, а швидкість осідання еритроцитів збільшилась в 3,8 раза. За даними літератури, відомо, що під впливом трипсину від мембрани еритроцита відщеплюється переважно глікопротеїновий комплекс - сіалопротеїд, який, за сучасними уявленнями, займає украй зовнішнє положення в мембрані еритроцита (Ф.Д. Шиффман, 2007). З відщепленням від клітинної мембрани сіалопротеїду змінюються поверхневі властивості мембрани і зокрема знижується її електронегативність, з чим, на нашу думку, пов'язані відмічені нами посилення агрегації і зниження суспензійної стабільності трипсинізованих еритроцитів. Зниження активності ТФЕ після трипсинізації обумовлено частковим випадінням впливу еритроцитарного фактора, але не пов'язано з набуттям певною частиною еритроцитів гальмувальних властивостей у відношенні власне процесу тромбопластиноутворення. Останнє можна було б пояснити збереженням на поверхні відмитих еритроцитів деякої кількості адсорбованих молекул трипсину. Проти подібного припущення свідчив, однак, той факт, що в малій концентрації трипсин активізує тромбопластиноутворення (А.А. Кушкун, 2007). Можливість набуття трипсинізованими еритроцитами гальмувальних властивостей не підтверджувалася і при аналізі впливу трипсинізованих еритроцитів на процес тромбопластиноутворення в плазмі, багатій на тромбоцити: зниження рівня тромбопластиноутворення при цьому не спостерігалося. Зниження активності ТФЕ, на нашу думку, не пов'язано з безпосереднім ушкодженням фактора протеолітичним ферментом. У випадку прямого впливу трипсину на білкову частину ліпопротеїду з прокоагулянтною активністю зниження прокоагулянтної активності клітини збереглося б і після її руйнування, як це, зокрема, спостерігалося при обробці трипсином гемолізованих еритроцитів.

Можна припустити, що зникнення обговорюваних розходжень після руйнування клітини пов'язане з тим, що надлишкова тромбопластинова активність гемолізату маскує часткове випадіння тромбопластинової активності в цілій клітині. Проти цього, однак, свідчило те, що і при використанні гемолізату з меншою активністю з нормальних і трипсинізованих еритроцитів зниження активності останнього також нами не виявилося. Якщо в цілій клітині трипсин безпосередньо не ушкоджує ліпопротеїд із прокоагулянтною активністю, то це означає, на нашу думку, що ТФЕ розташовується не поверхнево, а знаходиться в більш глибоких шарах цитоплазматичної мембрани. Таким чином, ТФЕ локалізується в глибоких шарах клітинної мембрани еритроцита і для повного прояву своєї активності має потребу в сіалопротеїді зовнішнього шару мембрани клітини, який відіграє роль своєрідного посередника. Оптимальному контакту ТФЕ з плазмовими факторами повинно відповідати наближення еритроцитарного фактора до поверхні мембрани. Це досягається, цілком ймовірно, шляхом перебудови внутрішньої структури клітинної мембрани в результаті взаємодії зовнішньо розташованого сіалопротеїду з активованими факторами згортання плазми.

Після з'ясування локалізації ТФЕ ми звернули увагу на вивчення його природи. Для цього ми дослідили активність ендогенної фосфоліпази, яка призводить до дестабілізації ліпідних структур, та концентрацію холестерину, ВЖК, загальних фосфоліпідів, кількісне співвідношення фракцій фосфоліпідів в еритроцитах цільної крові та крові, яка містить антикоагулянт, при згортанні крові in vitro. Одержані дані свідчили про те, що на початкових стадіях формування згустка крові, тобто через 20-30 хв після її забору, активність ендогенної фосфоліпази А₂ в еритроцитах цільної крові була на 67 % вище фосфоліпазної активності крові, що містить антикоагулянт - цитрат натрію. Ми вважаємо, що підвищення фосфоліпазної активності еритроцитів при згортанні крові в пробірці обумовлено ідентичністю механізмів згортання як іn vіtro, так і в судинному руслі, при якому необхідною умовою внутрішньосудинного тромбоутворення є активація фосфоліпази А₂ формених елементів крові. За даними літератури, відомо, що активація ендогенної фосфоліпази А₂ призводить до дестабілізації ліпідних структур клітинних мембран, яка виявляється у порушенні нормальних кількісних співвідношень окремих фракцій фосфоліпідів, зміні молярного співвідношення холестерин/фосфоліпіди і підвищенні концентрації ВЖК (В.А. Макаров, 1998). У зв'язку з цим наступним етапом нашого експерименту було порівняльне вивчення вмісту загальних фосфоліпідів, ВЖК, холестерину, а також аналіз фосфоліпідного спектра еритроцитів цільної крові і крові, що містить цитрат натрію. Встановлено, що процес згортання крові в пробірці супроводжувався підвищенням на 53 % концентрації ВЖК в еритроцитах цільної крові відносно їх концентрації в еритроцитах цитратної крові. У той же час вірогідної різниці у вмісті загальних фосфоліпідів в еритроцитах цільної крові і крові, що містить антикоагулянт, виявлено не було. Однак в окремих випадках при зіставленні абсолютних значень концентрації фосфоліпідів у паралельних зразках нами було відмічено незначне підвищення цього показника в еритроцитах цільної крові. При вивченні фосфоліпідного спектра еритроцитів були виявлені значні зміни концентрацій різних фракцій фосфоліпідів, що виникають при згортанні крові in vitro (рис. 1). Найбільші зміни при згортанні крові відбувалися з фракцією лізофосфатидилхолінів (ЛФХ) в еритроцитах цільної крові, частка якої у фосфоліпідному спектрі зростала в 3 рази у порівнянні з еритроцитами крові, що містить антикоагулянт. Паралельно відбувалося зниження в еритроцитах цієї ж серії вмісту ФХ, СФМ та підвищення частки ФЕА і ФС. Відомо, що цитоплазматичним мембранам притаманна асиметрія розподілу фосфоліпідів по сторонах біошару (М.Р. Гжегоцький, 2001). Так, СФМ, ФХ розташовуються головним чином у зовнішньому шарі мембрани, а ФЕА і ФС локалізовані на її внутрішній поверхні. У наших експериментах спостерігалося підвищення концентрації ФЕА і ФС в еритроцитах цільної крові в 1,5 і 1,4 раза відповідно та зниження вмісту СФМ і ФХ в 1,4 і 1,6 раза відповідно в порівнянні з даними показників в еритроцитах крові, яка містить антикоагулянт. Отже, фосфоліпіди внутрішнього шару біомембран прискорюють, а фосфоліпіди зовнішньої сторони біошару - гальмують процес згортання крові, і зміни в складі фосфоліпідів еритроцитів спрямовані на посилення процесів коагуляції. Відомо, що ЛФХ є специфічним маркером мембранодеструкції (К.М. Абдулкадыров, 2006), тому значне збільшення в складі фосфоліпідів еритроцитів цільної крові його частки є додатковим доказом активації ендогенної фосфоліпази А₂ в червоних клітинах крові при її згортанні.

Для виявлення зміни мікров'язкості мембран еритроцитів при згортанні крові іn vіtro нами були вивчені вміст загального холестерину і молярне співвідношення холестерин/фосфоліпіди в еритроцитах цільної крові і крові, що містить цитрат натрію. Встановлено, що вміст холестерину в еритроцитах цільної крові був в 1,3 раза менший, ніж в еритроцитах крові, що містить антикоагулянт. Зменшення вмісту холестерину в еритроцитах цільної крові, яке приводило до зниження молярного співвідношення холестерин/фосфоліпіди, дозволило зробити висновок, що початкові процеси згортання крові в пробірці характеризуються збільшенням мікров'язкості мембран еритроцитів. На відміну від фосфоліпідів, які фіксовані у мембранах за допомогою білкових зв'язків, холестерин в еритроциті пов'язаний з фосфоліпідами менш міцно, тому можна припустити, що зміна фосфоліпідного комплексу мембран еритроцитів на початкових етапах згортання крові в пробірці призводить до часткового розриву зв'язків фосфоліпід-холестерин, у результаті чого останній губиться мембраною.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Ліпідний склад мембран еритроцитів з антикоагулянтом (а) і цільної крові (б) при згортанні крові in vitro

Наступним етапом нашої роботи було виявлення білкових фракцій мембрани еритроцитів, які пов'язані білковими зв'язками з фосфоліпідами та впливають на гемостаз. Нами проведено чітке розділення білкових компонентів строми еритроцитів за їх молекулярною масою (таблиця).

Характеристика білкових фракцій строми еритроцитів (n=10)

Вміст білка в окремих фракціях строми еритроцитів був приблизно однаковим, найбільша концентрація ліпідного фосфору (83 %) містилася у фракції D.

Наступним етапом нашого досліду було вивчення впливу білкових фракцій строми еритроцитів на тромбопластинову активність крові (рис. 2). При дослідженні часу рекальцифікації цитратної плазми встановлено, що тільки додавання фракції D, яка містить більшу частину ліпідів еритроцитів, приводить до зменшення даного показника на 40 % у порівнянні з нормальною плазмою. В умовах мінімальної контактної активації згортання плазми (силіконовий час) стає очевидним, що всі білкові фракції, крім фракції В, впливають на початкові етапи гемостазу. Особливо виражену дію виявляють фракції D і Е. Так, після додавання до плазми фракції D силіконовий час зменшився на 39 %, після додавання до плазми фракції Е - на 25 %. При максимальній контактній активації системи згортання крові (додавання каоліну) нами відмічена значна тромбопластинова активність фракцій D і Е: каоліновий час скоротився на 60 і 43 % відповідно. Відомо, що під впливом каоліну в плазмі, багатій на тромбоцити, активується контактна фаза процесу згортання (фактори XII і XI) і звільнюється з тромбоцитів фосфоліпідний фактор 3, в результаті чого утворюється активний комплекс «фактор XII + фактор XI + фосфоліпідний компонент», прискорюється активація інших факторів згортання (IX, VIII і X) (З.С. Баркаган, 2001).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Вплив білкових фракцій строми еритроцитів на згортання плазми, бідної на тромбоцити: * р<0,05 по відношенню до плазми, бідної на тромбоцити

В плазмі, бідній на тромбоцити, фосфоліпідний компонент тромбоцитів у цих реакціях не бере участі, у зв'язку з чим каоліновий час її виявляється більшим, ніж каоліновий час плазми, багатої на тромбоцити. Скорочення в наших дослідах каолінового часу плазми, бідної на тромбоцити, під впливом фракції D строми еритроцитів у 2,5 раза свідчило про те, що ця фракція має властивості фактора 3 тромбоцитів, тобто тромбопластинову активність.