Медицинская микробиология

Размещено на http://www.allbest.ru/

Предмет и задачи медицинской микробиологии

Объектом изучения микробиологии являются микроорганизмы (микробы) - мельчайшие невидимые одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают представителям животного или растительного царства.

Особенности микробов:

- малые размеры (обычно их измеряют в микрометрах, 10-6 м, мкм);

- слабая морфологическая дифференцировка (относительно простое строение);

- быстрый рост и размножение (в благоприятных условиях одна особь за сутки может дать потомство в сотни миллионов особей);

- высокая активность обменных процессов (быстрый синтез и разложение веществ,

получение энергии);

- повсеместное распространение (связано с выраженной способностью к адаптации).

Микробиология является комплексом наук. В зависимости от объекта исследования различают: бактериологию, вирусологию, микологию (объект - грибы), протозоологию (объект - простейшие). По целям изучения микробиология делится на общую, медицинскую, санитарную, ветеринарную, промышленную, космическую и др.

Задачи медицинской микробиологии

1. Изучение биологии патогенных (болезнетворных) и нормальных для человека микробов.

2. Изучение роли микробов в возникновении, развитии инфекционных (заразных) болезней и формировании иммунного ответа макроорганизма ("хозяина").

3. Разработка методов микробиологической диагностики (распознавания), специфического лечения и профилактики (предупреждения) инфекционных болезней человека.

Микробиологические исследования проводятся в специальных научных или практических лабораториях, где поддерживается противоэпидемический режим. Соблюдение особых правил работы в лаборатории преследует 2 цели: а) исключить возможность внутри лабораторного заражения и выноса инфекции за пределы лаборатории; б) предотвратить микробное загрязнение воздуха, оборудования и материалов, снижающее качество анализа.

Классификация микроорганизмов

Микробы, как наиболее древняя форма жизни, в системе организмов представлены довольно широко. Они входят (наряду с другими организмами) в надцарство эукариотов, полностью составляют надцарство прокариотов и царство вирусов.

Прокариоты - это, как правило, одноклеточные организмы, бактерии, отличающиеся слабой морфологической дифференцировкой (доядерные); для них характерно:

- отсутствие окруженного мембраной ядра (носителем наследственности является нуклеоид - замкнутая в кольцо нить ДНК, единственная "бактериальная хромосома");

- отсутствие органелл (митохондрий, хлоропластов, комплекса Гольджи и др.);

- размножение бинарным амитотическим делением (надвое);

- особое строение и состав клеточной стенки, малые размеры рибосом, своеобразные ферменты белкового синтеза.

Прокариоты разделены на 35 групп: спирохеты, несколько групп собственно бактерий (например, "грамположительные кокки", "спорообразующие грамположительные палочки и кокки", "грамотрицательные аэробные палочки и кокки" и др.), а также риккетсии и хламидии, микобактерии, микоплазмы. В основе деления прокариот на группы лежат: форма и строение клетки, отношение к окраске методом Грама, тип метаболизма и другие признаки. Внутри группы выделены более мелкие таксоны: порядок, семейство, род, вид (основной таксон). Название вида микроба, как правило, состоит из родового и видового названий. Например, один из возбудителей дизентерии носит название- Shigella sonnei.

Микроскопические эукариоты - это относительно более высоко организованные одноклеточные и многоклеточные организмы, имеющие сходство с клетками животных (простейшие) и растений (грибы). Для эукариот характерны:

- наличие истинного ядра, в котором находится набор линейных хромосом, распределяющихся в ходе митоза в дочерние клетки;

- различные органеллы (митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулум и др.);

- рибосомы большего размера, чем у прокариот;

- способность к эндоцитозу (захвату частиц и растворенных веществ).

Вирусы - это мельчайшие неклеточные организмы, которые можно противопоставить всем другим существам. Основные свойства вирусов:

- отсутствие клеточного строения;

- отсутствие собственных метаболических систем (у вирусных частиц - вирионов нет обмена с внешней средой);

- облигатный внутриклеточный паразитизм;

- наследственный материал (геном) представлен одним типом нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

Методы исследования в микробиологии

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспериментальный, иммунологический.

1.Микроскопический - изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический - (бактериологический, культурный) - посев материала на питательные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура - скопление микробов одною вида, выращенных на питательной среде. Штамм - чистая культура, выделенная из конкретного источника в определенное время, (например, штамм Shigella flexneri №8, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон - генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения I клетки (используется при изучении микробных популяций, в генетических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) - заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

- выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

- изучить болезнетворные свойства микроба;

- получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) - изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами.

В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы - антитела (AT), способные вступать с данным антигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан па выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа (в виде AT или аллергии) свидетельствует о предшествующей встрече с этим микробом: возможно, человек переболел соответствующей инфекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Часто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентификация по антигенной структуре).

Устройство светового микроскопа

Световой микроскоп с иммерсионной системой

Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз. Поэтому используется микроскопы с иммерсионной системой . В состав иммер-сионной системы входит иммерсионный объектив (х90) и иммерсионное масло, которым заполняют разрыв между изучаемый предметом и передней линзой иммерсионного объектива. Поскольку показатели преломления стекла и масла близки, это позволяет избежать потери световых лучей вследствие их отклонения, и, тем самым, создать оптимальную освещённость поля зрения. Необходимость в концентрации светового пучка обусловлена также и чрезвычайно малым диаметром передней линзы иммерсионного объектива. При микроскопировании необходимо помнить, что объективы "сухой системы" не предназначены для погружения в масло, которое может привести их в негодность. Микроскопия с иммерсионной системой позволяет изучать убитые микробы в окрашенном состоянии (их форму, размеры, взаимное расположение, строение бактериальной клетки) и дифференцировать одни микробы от других.

Способность микробов окрашиваться различными методами называют тинкториальными свойствами.

В некоторых случаях (изучение морфологии грибов, простейших, других относительно крупных объектов в живом неокрашенном состоянии) используется световой микроскоп с затемнённым полем зрения (объективы х40 или х8) Для микроскопии готовят препараты "раздавленная капля" или "висячая капля".

Измерение микробов

Изучение морфологических признаков микробов (длина, ширина, форма) нередко проводят для определения их вида. Размеры клеточных микроорганизмов варьируют от долей микрометра (мкм, 10-6м) до нескольких десятков микрометров. Мелкие клетки бактерий имеют размеры 1-2, крупные от 8 до 12 мкм и более. Для измерений используют окуляр-микрометр (встроенную в окуляр прозрачную линейку).

* Темнопольный микроскоп (ультрамикроскоп)

Особенностью этого микроскопа является наличие конденсора темного поля (параболоид-конденсатора), который концентрирует световой пучок и направляет его на исследуемый объект сбоку. Ввиду того, что прямые лучи отсекаются центральной диафрагмой конденсора, а косые лучи, выходящие по периферии диафрагмы, не попадают в объектив, ультрамикроскоп имеет темное поле зрения. При освещении косыми лучами живых и неживых частиц, в т.ч. микробов, часть отраженных лучей попадает в объектив; при этом наблюдается яркое свечение частиц на темном фоне. Темнополъную микроскопию используют для изучения подвижности микробов, наблюдения очень тонких объектов (спирохет) в препарате "раздавленная капля".

* Фазово-контрастный микроскоп

Эта разновидность светового микроскопа позволяет изучать структуру живых неокрашенных микробов (прозрачных объектов). При прохождении света через неокрашенные микробные клетки, в отличие от окрашенных, амплитуда световых волн не меняется, а происходит лишь их изменение по фазе, что не улавливается глазом человека. Сдвиг по фазе происходит при прохождении участков с большей оптической плотностью (рибосомы, нуклеоид). Специальные приспособления: фазовый конденсор и объективы с фазовыми кольцами позволяют преобразовать невидимые фазовые изменения в видимые амплитудные.

* Люминесцентный микроскоп

Принцип работы этого микроскопа основан на явлении люминесценции. Для получения изображения объектов их обрабатывают флюорохромами, которые при возбуждающем облучении коротковолновой частью спектра светятся цветами с большей длиной волны (зеленым, оранжевым и др.). В люминесцентном микроскопе изучают как живые, так и убитые микробы (с "сухой" или иммерсионной системами). Люминесцентная микроскопия позволяет получить контрастное цветное изображение, обнаружить малое количество микробов, изучить их структуру и химический состав, использовать метод иммунофлюоресценции.

* Электронный микроскоп

Этот прибор отличается от световых микроскопов значительно большей разрешающей способностью (около 0,001 мкм) за счет использования вместо света пучка электронов, а вместо стеклянных оптических - электромагнитных линз. В электронном микроскопе изучают вирусы, ультраструктуру убитых макроорганизмов.

5)этапы приготовление микропрепарата для микроскопии.

Окраска по Граму.

1 этап - приготовление мазка.

Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия (ИХН). Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.

2 этап - высушивание.

Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.

3 этап - фиксация.

Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон, смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.

4 этап - окраска.

Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красите-лям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристаллвиолетом (3-5 минут), а сложных - окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.

Дифференцирующий метод Грама

После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+). другие - в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.

Гр + бактерии кокки Гр - бактерии кокки

стафилококки, стрептококки; палочки (споро-образующие): бациллы, клостридии; папочки (неспорообразующие): коринебактерии, микобактерии, актиномицеты нейссерии, вейллонеллы; палочки (неснорообразующие): энтеробактерии, вибрионы; извитые: спириллы, спирохеты, кампилобактерии.

Этапы окраски по Грамму

Этап окраски Цвет

Гр + бактерии Гр - бактерии

Генцианвиолет (2 мин.) фиолетовый фиолетовый

Раствор Люголя (1 мин.) - закрепление окраски фиолетовый фиолетовый

Этанол + йод (30 сек.) - избират. обесцвечивание Гр- бактерий фиолетовый обесцвечивание

Фуксин (1 мин.), докрашивание Гр- бактерий фиолетовый бордовый

Промывание водой

6)Основные формы бактерий. Постоянные структурные элементы.

Шаровидные Палочковидные Извитые

микрококки (одиночные) собственно бактерии спириллы

диплококки (пары) спорообразующие спирохеты

стрептококки (цепочки) (бациллы, клостридии) кампилобактеры

тетракокки (4 клетки) изогнутые палочки (вибрионы)

сарцины (тюки, пакеты)

стафилококки (гроздья)

Обязательными структурными элементами бактерий являются: цитоплазма с нуклеоидом и рибосомами, цитогтазматическая мембрана (ЦПМ), клеточная стенка.

Цитоплазма прокариотов в отличие от эукариотов не содержит митохондрий и хлоропластов, аппарата Гольджи, лизосом, эндоплазматической сети. Нуклеоид выполняет в клетке бактерий функцию ядра, т.е. является носителем генетической информации, однако, в отличие от ядра эукариотической клетки, он не имеет ядерной мембраны, не делится митозом. Нуклеоид состоит из замкнутой в кольцо нити ДНК. В генетическом отношении ДНК нуклеоида является единственной бактериальной хромосомой. В связи с этим бактерии имеют гаплоидный набор генов, контролирующих все их жизненно важные функции. Органеллы цитоплазмы выявляются при электронной микроскопии.

Цитоплазматическая мембрана ограничивает снаружи цитоплазму и состоит из тонкого слоя фосфолипидов и белка. Функции ЦПМ: получение энергии в результате биологического окисления, участие в питании посредством активного транспорта веществ, участие в биосинтезе веществ, делении клетки. В состав ЦПМ входят окислительные ферменты, пермеазы, различные биосинтетические ферменты. ЦПМ выявляют при электронной микроскопии.

Клеточная стенка у Гр+ бактерии, как правило, содержит многослойный пептидогликан, который придает клеточной стенке прочность.

Клеточная стенка определяет форму бактерий, служит для механической защиты, участвует в питании за счет диффузии и осмоса. У Гр- бактерий клеточная стенка представлена тонким слоем пептидогликана, покрытого наружной мембраной, в состав которой входят белки, фосфолипиды и липополисахариды (ЛПС). Наружная мембрана клеточной стенки патогенных микробов во многом определяет специфичность их взаимодействия с организмом хозяина и помогает в распознавании близкородственных микробов. По компонентам и структуре клеточной стенки, биохимическим механизмам ее синтеза бактерии коренным образом отличаются от животных и растений. Клеточную стенку бактерий выявляют при электронной мик-роскопии, специальным окрашиванием или в опыте плазмолиза.

Непостоянные (необязательные) структурные элементы бактериальной клетки

К ним относят; капсулу, спору, включения, жгутики, пили.

Капсула представляет собой поверхностно расположенное слизистое образование, которое по химической природе чаще является полисахаридом. Капсула выполняет защитную функцию, предохраняя клетку во внешней среде от высыхания и других неблагоприятных факторов, а в орга-низме хозяина - от фагоцитоза, бактериолизиса и других реакций, лекарственных препаратов. Бактерии, образующие капсулу в организме и на питательных средах, называют капсульными (например, клебсиеллы пневмонии). Некоторые бактерии образуют макрокапсулу только в организме (золотистый стафилококк, стрептококк пневмонии, палочка сибирской язвы, возбудитель чумы, туляремии и др.). Многие бактерии образуют микрокапсулу: возбудитель коклюша, патогенные энтеробактерии и др. Капсулу выявляют методом Бурри-Гинса: бактерии смешивают с каплей туши, распределяют их по стеклу виде тонкого мазка и фиксируют. После окрашивания разведенным карболовым фуксином в световом микроскопе на серо-коричневом (тушевом) фоне препарата видны красные тела бактерий, окруженные бесцветными зонами капсул.

Споры являются формой существования, предназначенной для сохранения бактерий во внешней среде. В одной бактериальной клетке в течение 12-18 часов формируется 1 спора, которая при благоприятных условиях за 4-6 часов прорастает в I вегетативную клетку. Спорообразующими являются, как правило, Гр+ палочковидные бактерии: те, у которых диаметр споры не превышает поперечный размер клетки, называют бациллами, те, у которых диаметр больше - клостридиями. Устойчивость спор к неблагоприятным физико-химическим воздействиям связана с наличием многослойной оболочки, повышенным содержанием липидов, ионов кальция, магния, вода в связанном состоянии. Жизнеспособность спор при обычных условиях может сохраняться в течение деся-тилетий и столетий. Для уничтожения спор применяют методы стерилизации (пар под давлением, горячий воздух и др.). Споры окрашиваются плохо. Для выявления используют сложные методы окраски (по Циль-Нильсону, Ожешке и др.)

Включения. В клетках прокариотов можно обнаружить включения (скопления полисахаридов, липидов, полифосфатов, серы). У дифтерийной палочки и некоторых других бактерий в цитоплазме обнаруживаются зёрна волютина (полифосфаты), выполняющие функцию запасного вещества (источника фосфора и энергии). Включения и цитоплазма по-разному окрашиваются одними и теми же красителями. Например, при окраске уксусно-кислым генцианвиолетом цитоплазма у дифтерийной палочки окрашивается в бледно-фиолетовый цвет, а расположенные по полюсам зерна волютина - в темно-фиолетовый. Обнаружение зерен волютина имеет диагностическое значение.

Жгутики - являются поверхностными придатками бактериальной клетки, состоят из белка флагеллина и выполняет функцию движения. Наиболее подвижки микробы с 1 жгутиком - монотрихи (холерный вибрион) менее подвижны микробы с пучком жгутиков на одном из полюсов - лофотрихи (синегнойная палочка) или имеющие жгутики на обоих полюсах - амфитрихи; наименее подвижны перитрихи, у которых жгутики расположены по бокам или по, всей поверхности (многие энтеробактерии). В световом микроскопе жгутики не видны. Для их выявления используют прямые методы: электронную микроскопию или специальное окрашивание, позволяющие увеличить размеры жгутиков, например, за счет наслоения солей тяжелых металлов. С целью косвенного выявления жгутиков изучают подвижность микробных клеток. Для этого готовят нативные препараты (раздавленная или висячая капля), которые микроскопируют в затемненном поле зрения, темнопольном или фазовоконтрастном микроскопах.

Пили также являются поверхностными придатками бактериальной клетки и представляют собой тончайшие нити (тоньше и короче жгутиков), состоят из белка пилина. Функцией пилей являются прикрепление к субстрату; они также способствуют контакту клетки - донора с клеткой - реципиентом при конъюгации. Наличие пилей у патогенных микробов во многом определяет их способность вызывать заболевание, т.к. они необходимы для осуществления адгезии (прилипания). Прямое выявление пилей возможно только при электронной микроскопии.

Влияние физических факторов на микроорганизмы

Высушивание губительно действует на микробы, однако разные виды обладают различной чувствительностью. Холерный вибрион гибнет через 48 часов. Возбудитель туберкулёза - через 70 дней. Длительно сохраняются микробы в высохших плёнках из гноя, крови или мокроты (месяцы). Высушивание практически не действует на споры. В процессе высушивания клетка лишается воды, происходит инактивация ферментных систем, наступает гибель микроба. Высушивание применяют в медицине: в сухом виде хранят лекарственное сырьё, многие лекарства. Широко применяется лиофильная сушка - высушивание из замороженного состояния в вакууме. В этом случае вода переходит из кристаллического состояния в парообразное, минуя жидкую фазу, жизнеспособность микробов сохраняется; срок годности живых вакцин и других иммунобиологических препаратов увеличивается до 1 года и более.

Лучистая энергия (ультрафиолет и ионизирующее излучение) непосредственно действует за нуклеиновые кислоты в клетке, вызывая смертельные мутации, или приводит к образованию свободах радикалов, вызывающих инактивацию ферментных систем. Солнечный свет, особенно его коротковолновая часть спектра, оказывает выраженный бактерицидный эффект. УФЛ используют в медицине для обработки операционных, родильных домов и отделений, асептических помещений аптек, в бактериологических лабораториях. Для этих целей устанавливают бактерицидные об-лучатели с длиной волны 260-300 ям. Ионизирующее излучение используют для стерилизации.

Ультразвук вызывает гибель микроорганизмов: в клетке образуются кавитационные полости с резкими перепадами разреженного и избыточного давления, что приводит к разрушению клетки. Этот метод используют для получения компонентов микробной клетки, обеззараживания некоторых жидких препаратов, питьевой воды, молока, соков.

Температура ниже 0°С не оказывает губительного действия, однако микробы прекращают рост и размножение. Некоторые вирусы сохраняются при - 27С°С. В медицине лекарственное сырье, многие лекарственные и биологические препараты хранят при температуре от 0°С до + 10°С (температура бытового холодильника) Высокие температуры более губительны для микробов, однако разные виды могут обладать неодинаковой чувствительностью. Так, менингококки гибнут уже при комнатной температуре, возбудитель сифилиса - при +40°С, возбудитель дизентерии - при +60°С, бруцеллы - при 100°С. Споры бактерий погибают лишь через 2-5 часов кипячения.

Стерилизация

Стерилизация - полное обеспложивание объектов, при котором уничтожаются все формы микроорганизмов (вегетативные и споры). Для стерилизации применяют физические и химические методы. Выбор метода определяется видом стерилизующего материала, который после стерилизации должен сохранять свои основные свойства (форму, эластичность, активность и др.). Физические методы - действие высокой температуры, ионизирующего излучения, фильтрование через коллоидные фильтры.

Методы тепловой стерилизации

Метод стерилизации Аппаратура Режим: температура, время, давление Стерилизуемый материал

однократные методы

прокаливание спиртовка, газовая горелка до красного каления бактериологические петли, мелкий инструментарий

горячим воздухом воздушный стерили-затор 1800С, 60 минут, (160°С, 150 минут) стеклянная посуда, пипетки, вата, тальк, вазелиновое масло, шприцы, хир. инструменты

паром под давлени-ем паровой стерилизатор (автоклав)

1200С, 45 минут, давление 1 атм, (132°С, 20 минут давление 2 атм) простые пит. среды (ПБ, ПА), заразный материал, белье, халаты, хирургический инструментарии, посуда, резиновые перчатки, некоторые лекарства многократные методы

текучим паром паровой стерилизатор с открытым выпускным краном 1000С, 3 дня по 1 часу каждый день ПЖ, молоко, среды и лекарства с углеводородами, некоторые лекарства

тиндализация водяная баня с терморегулятором 56-580С, 5 дней:1 день - 2 часа, остальные дни по 1 часу белковые жидкости (питательные среды, содержащие белок)

Многократные методы - это дробная стерилизация объектов, которые могут быть питательным субстратом для микробов (в промежутках между стерилизацией объект оставляли при комнатной температуре для прорастания спор). Образовавшиеся вегетативные формы микроорганизмов убиваются.

Контроль процесса стерилизации осуществляют несколькими методами:

1) по показаниям приборов (манометров, термометров, таймеров);

2) с использованием физико-химических тестов (вместе со стерилизуемым материалом в аппарат закладывают ампулы с кристаллами веществ или специальные бумажные термохимические индикаторы; при нужной температуре вещества расплавляются, а индикаторы меняют цвет);

3) биологические тесты (в аппарат помещают флакончики с салфетками, пропитанными взвесью термостойкого спорообразующего микроба, и после стерилизации их инкубируют в ПБ, который не должен мутнеть).

Ионизирующее излучение это наиболее перспективный метод, т.к. возможна полная автоматизация всех процессов. Стерилизацию проводят в товарной упаковке, что обеспечивает длительность сохранения материала стерильным. Установка представляет собой бетонную камеру толщиной 2 метра, с надежной защитой от радионуклидов. После обработки материал контролируется наоста точную радиоактивность. Этим способом стерилизуют хирургический инструментарий, изделия из пластмассы, вакцины, лечебные сыворотки, многие лекарства!

Фильтрование. Используют фильтры из коллодия, диаметр пор которых меньше размеров вирусов. Этот метод применяют на химико-фармацевтических заводах при изготовлении вакцин, иммунных сывороток, растворов антибиотиков, бактериофагов. Фильтрование через бактериальные фильтры (из каолина, асбеста, нитроцеллюлозы) не является стерилизацией в полном смысле, т.к. у этих фильтров более крупные поры. Через них могут проходить вирусы и фильтрующиеся формы бактерий.

* Химические методы:

1) 6% раствор перекиси водорода с поверхностно-активными веществами (ПАВ), экспозиция 1-3 часа. Стерилизуют хирургический инструментарий, пластмассы;

2) 1% раствор бета - пропиолактона, экспозиция 1-4 часа. Стерилизуют пластмассы, аппараты искусственного кровообращения, "искусственная почка".

Газовая стерилизация. Используют окись этилена или смесь окиси этилена с бромистым метилом, экспозиция 6-24 часа. Стерилизуют оптику, радиоэлектронное оборудование. В некоторых случаях используют совместное воздействие физических и химических факторов.

Дезинфекция

Дезинфекция - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение в объектах конкретных патогенных микробов. После дезинфекции могут сохраняться непатогенные микробы. В медицине применяют физические и химические методы дезинфекции.

1. Физические методы: 1) механические (вытряхивание, проветривание, влажная уборка, стирка с мылом); 2) действие высокой температуры (прокаливание утюгом, кипячение, пастеризация); 3) УФО (облучение бактерицидными лампами).

2. Химические методы - применяют в различных концентрациях следующие дезинфицирующие вещества: I) хлорсодержащие препараты (хлорная известь, хлорамин Б, гипохлорит кальция, хлоргексидин и др.); 2) окислители (перекись водорода, перманганат калия); 3) фенолы (карболовая кислота, лизол); 4) йод и йодофоры (йод + ПАВ); 5) соли тяжёлых металлов (сулема, диоцид, мертиолят); ПАВ (сульфанол); 7) четвертичные аммонийные соединения (роккал); 8) 70% этанол; 9) формалин; 10) красители (бриллиантовый, зеленый); II) кислоты (салициловая, борная и др.).

Механизм дезинфекции различен: механическое удаление; коагуляция белков при нагревании; хлорсодержащие препараты и формалин взаимодействуют с аминогруппами белков, окислители - с сулъфгидрильными группами; фенолы повреждает клеточную стенку и нарушают процессы дыхания, соли тяжелых металлов образуют альбуминаты белков, ПАВ изменяют заряд клеточных мембран, четвертичные аммонийные соединения нарушают процессы дыхания, красители взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и т.д.

Асептика - система профилактических мероприятий, направленных на предотвращение попадания в рану, лекарственные препараты микроорганизмов. Она включает: I) стерилизацию инструментов, приборов, материалов; 2) специальную обработку рук перед асептичной работой; соблюдение определенных правил и приёмов работы (стерильный халат, маска, перчатки, исключение разговоров и т.п.); 4) осуществление специальных санитарно-противоэпидеческих и гигиенических мероприятии (правильная вентиляция, влажная уборка с применением дезинфицирующих средств, облучение бактерицидными лампами).

Антисептика - комплекс мероприятий , направленных на уничтожение микробов, попавших в рану, лекарственный препарат или другой объект. Применяют антисептику: I) механическую, например, удаление из раны инфицированных или нежизнеспособных тканей при обработке раны; 2) физическую (наложение гигроскопических повязок, применение гипертонических растворов, способствующих оттоку раневого, отделяемого в повязку, сухого тепла, УФС. лазера и т.д. 3) химическую (применяют химические вещества, обладающие бактерицидными или бактериостатическим действием при минимальном органотропном действии, например хлоргексидин; в лекарственные препараты вносят борную кислоту, мертиолят и др.); 4) биологическую (применение антибиотиков, бактериофагов, иммуноглобулинов, средств, стимулирующих защитные силы организма).

Пастеризация - однократное кратковременное прогревание при температуре ниже 80°С, частичное обеспложивание продуктов только от болезнетворных бактерий. Как и кипячение, пастеризация не является методом стерилизации. После пастеризации сохраняются споры и вегетативные формы, поэтому пастеризованный продукт (молоко, соки и т.д.) хранят в холодильнике.

Контроли эффективности дезинфекции.

Контроль текущей и заключительной дезинфекции в очагах кишечных инфекций основан на обнаружении в исследуемом материале кишечной палочки, постоянно находящейся в выделениях больных и по устойчивости близко стоящей к возбудителям кишечных инфекций. После проведения дезинфекции в исследуемом материале кишечная палочка должна отсутствовать.

Для контроля работы дезинфекционных камер используют эталонные культуры, например, стафилококк - при обработке вещей из очагов инфекций, вызванных неспорообразующими микроорганизмами, споры антракоидной палочки - при дезинфекции вещей из очагов инфекций, вызванных спорообразующими микробами.

Типы и механизмы питания бактерий

Для нормального роста и размножения микробам, как и другим существам, нужны органогены (углерод, азот, водород и кислород). Источником водорода и кислорода является вода и некоторые газы (кислород, аммиак, сероводород). По усвоению углерода бактерии делят на аутотрофы и гетеротрофы. Аутотрофы используют углерод неорганических соединений (в том числе углекислоту), гетеротрофы (органотрофы) - углерод органических (углеводы, белки и др., которые часто добавляют в питательные среды для выращивания микробов). Микробы, усваивающие мёртвые остатки органических и неорганических веществ, называют сапрофитами. Тех, которые живут за счет органических соединений животных или растений, относят к паразитам.

По усвоению азота бактерии делят на аминоаутотрофы (используют азот воздуха, азотофиксируюшие) и аминогетеротрофы (используют азот белковых соединений, среди них - все паразиты и многие сапрофиты). Многие микробы нуждаются дополнительно в факторах роста (витаминах, аминокислотах, пуринах и пиримидинах, микроэлементах), которые должны поступать в клетку из питательной среды в готовом виде.

Механизм питания. Поступление в клетку питательных веществ является сложным физико-химическим процессом, который может осуществляться посредством 4-х механизмов:

1) пассивная диффузия - если концентрация снаружи выше, чем внутри клетки (по градиенту концентрации);

2) облегчённая диффузия - с участием пермеаз, когда вещества поступают в неизменном виде (по градиенту концентрации);

3) активный транспорт - с участием пермеаз и в неизменённом виде, но обязательно с затратами энергии (АТФ), т.к. это перенос против градиента концентрации;

4) транслокация радикалов - с участием пермеаз идёт активный перенос химически изменённых молекул, т.к. в целом виде они не способны проходить через мембрану.

По источникам энергии различают фототрофы, которые используют энергию солнечного света, и хемотрофы, получающие энергию за счет химического окисления веществ.

Рост и размножение бактерий являются результатом биосинтеза клеточных компонентов. Рост - это увеличение размеров особи и воспроизведение всех её структур. Размножение бактерий происходит путем бинарного деления. Перед делением в клетке удваивается нить ДНК и обе копии генома равномерно распределяются между двумя дочерними клетками. Время от одного деления до другого (время генерации) составляет у многих микробов 20-30 мин, v некоторых - до 20-30 ч (микробактерии туберкулёза) или более. Особенности роста и размножения микробов, их культуральные свойства, учитывают при идентификации, в производстве вакцин и биопрепаратов из микробов. Культуральными свойствами называют способность микробов расти на определенных средах с образованием характерного роста (скоплений). По мере размножения в жидкой среде одни микробы образуют помутнение, другие - плёнку или осадок, которые могут появиться уже через 8-24 ч после посева. На плотной среде в месте посева (на поверхности или внутри питательного агара) бактерии могут образовывать типичные колонии; макроскопические скопления микробов одного вида - потомство одной микробной клетки. У разных микробов колонии отличаются по раз-меру, форме, рельефу, прозрачности, консистенции и цвету. Окрашенность микробных скоплений связана со способностью некоторых видов на свету продуцировать пигменты. Среда них известны водорастворимые (пиоцианин синегнойной палочки, окрашивает и колонии и среду), растворимые в органических растворителях (продигиозан серрацицй) и нерастворимые пигменты (липохромы стафилококков). Пигменты могут защищать бактерии от действия солнечной энергии, обладать антимикробным действием.

В процессе роста и размножения микробы могут продуцировать токсины, витамины, аминокислоты, ароматические и многие другие вещества в значительных количествах. Это используется при биотехнологическом получении полезных для человека продуктов микробного синтеза. В ходе культивирования на плотных питательных средах может осуществляться выделение чистых культур бактерии, которое должно предшествовать их идентификации. Для этого обычно при посеве механически разобщают (распределяют) микробные клетки по поверхности или в глубине плотной питательной среды. В результате такого посева на месте отдельно лежащих клеток образуются изолированные колонии. Часть такой колонии отсевают на новую питательную среду для накопления выделенной чистой культуры.

Дыхание бактерий, типы дыхания

Дыхание(биологическое окисление) у бактерий тесно связано с питанием и дает энергию для осуществления функций клетки. При этом в ходе биохимических реакций образуется АТФ - универсальный аккумулятор и переносчик химической энергии у живых существ. Различают аэробный и анаэробный типы дыхания. Микробы, окисляющие органические соединения с использованием кислорода воздуха (в качестве акцептора ионов Н+), называют аэробами. В отличие от них, анаэробы получают энергию в ходе окислительно-восстановительных реакций, при которых акцептором Н+ является не кислород, а нитрат или сульфат (в бескислородных условиях). Многие микробы, имея полный набор дыхательных ферментов, могут существовать как в кислородной, так и бескислородной среде - это факультативные (необязательные) анаэробы с нитратным типом дыхания. Облигагные (обязательные) анаэробы существуют лишь в строго анаэробных условиях, т.к. в аэробных условиях образуются токсичные перекиси (Н2О2 и др.), которые не разрушаются из-за отсутствия у облигатных анаэробов фермента каталазы, для них характерен сульфатный тип дыхания. Необходимыми условиями для культивирования микробов являются:

1) наличие подходящей по составу питательной среды;

2) оптимальной (по содержанию О2 и др.) атмосферы над питательной средой;

3) оптимальной температуры.

Микробы, относимые к облигатным паразитам, наиболее требовательны к условиям выращивания. Многие из них (из-за отсутствия или дефекта собственных метаболических систем) могут размножаться только в живых клетках (вирусы, риккетсии, хламидии). Для их культивирования заражают животных, куриные эмбрионы или растущие в искусственной среде клетки эукариотов (культуры ткани). Многие микробы растут на естественных (молоко, картофель и т.д.) или искусственных питательных средах.

Выделение чистой культуры анаэробов занимает 4 дня и отличается тем, что исследование ведут в анаэробных условиях на специальных средах и материал предварительно подращивают сутки в среде для накопления анаэробов. Методы культивирования анаэробов основаны на удалении кислорода из питательной среды и из атмосферы (используют механическое и физическое удаление или замещение, химическое или биологическое связывание О2)

- перед посевом среды регенерируют (кипятят и быстро охлаждают);

- делают посевы в высокие столбики среды в пробирках;

- наслаивают поверх питательной среды вазелиновое масло;

- культивируют в анаэроостате, из которого откачан воздух и замещён инертным газом или бескислородной смесью (азот, водород, углекислый газ);

- культивируют в эксикаторе, на дно которого помещены химические поглотители кислорода (щелочной раствор пирогаллола и др.);

- культивируют в герметично закрытой чашке с плотной средой, на две половины которой отдельно засевают анаэробы и аэробы, которые в ходе размножения поглощают кислород (метод Фортнера).

Питательные среды, их классификация

Питательные среды, предназначенные для культивирования микробов и изучения их свойств должны отвечать следующим требованиям:

1) достаток питательных веществ (источников органогенов, солей и т.д.);

2) стерильность (без этого трудно выделить чистую культуру, изучать ее свойства)

3) оптимальное значение рН и буферность (противодействие сдвигу рН);

4) оптимальный окислительно-восстановительный потенциал (например, для анаэробов - низкий);

5) изотоничность (как у 0,9% раствора хлорида натрия);

6) влажность (для плотных сред);

7) прозрачность (для жидких сред);

8) определенная вязкость для плотных и полужидких сред (зависит от количества добавляемого агар-агара).

Искусственные питательные среды делят на: простые (основные) и сложные. На простых средах (пептонный бульон - ПБ, питательный агар - ПА растут многие микробы, их потребности удовлетворяются простым набором питательных веществ (мясной, рыбный или дрожжевой экстрат и пептон). Пептон является продуктом ферментативного расцепления белка, источником аминокислот. В экстрактах, помимо аминокислот и пептидов, содержатся витамины, соли, микроэлементы.

Сложные среды в зависимости от назначения делят на специальные, элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические; все они, как правило, содержат дополнительные компоненты. Специальные среды имеют добавки, обогащающие среду факторами роста, и предназначены для высокотребовательных микробов. Например, стрептококки не растут на ПА, для них нужны специальные среды - сахарный бульон (ПБ + глюкоза) или кровяной агар (ПА + кровь); менингококки не растут на сахарном бульоне, но хорошо растут на сывороточном агаре (ПА + сыво-ротка крови). Стафилококки, кишечная палочка и другие менее требовательные микробы растут и на простых средах и на многих специальных.

На элективных средах растут микробы преимущественно одного вида. Рост других подавляется под влиянием специальных добавок (антибиотиков, жёлчи; щелочи и др.) или из-за обедненного состава среды. Эти среды используют для выделения чистых культур или накопления микробов определенных видов (сальмонеллы-в желчном бульоне, стафилококки - в солевом бульоне, холерные вибрионы - на щелочной пептонной воде и т.д.).

На дифференциально-диагностических средах один вид микроба можно отличить от другого по характеру роста и биохимическим свойствам. Их также используют при выделении чистых культур из смеси микробов или при идентификации выделенной культуры. Например, в состав среды Эндо кроме питательной основы входит лактоза, и индикатор фуксин (обесцвеченный). Микробы, не ферментирующие лактозу, не изменяют цвет среды, а расщепляющие лактозу окрашивают среду Эндо в красный цвет. Среды Гисса содержат набор углеводов и пептоны, которые предназначены для изучения сахаролитических и протеолитических ферментов в ходе идентификации микробных культур.

Понятие о чистой культуре, штамме, клоне микробов

Чистая культура-скопление микробов одного вида, выращенных на питат.среде.

Штамм- чистая культура, выделенная из конкретного испытания в опр.время.

Клон- генетически однородная чистая культура, полученная в рез-те бесполого размножения 1 клетки.

Выделение чистой культуры бактерий-аэробов занимает 3 дня:

1. день:

а) микроскопия мазка из материала (для ориентировочного суждения о составе микрофлоры);

б) посев материала на ПА в чашке истощающим штрихом (для получения изолированных

колоний);

в) инкубирование в термостате (370С) 18-20 часов

2. день:

а) изучение и выбор изолированных колоний;

б) микроскопия мазков из изолированных колоний для суждения об однотипности микробов в колонии;

в) пересев остатка колонии на скошенный ПА (для получения чистой культуры);

г) инкубирование в термостате (37°С). 18-20 часов

3. день:

а) микроскопия мазков из чистой культуры на скошенном ПА (для контроля чистоты просматривают не менее 40 полей зрения должны быть однотипные по морфологии микроорганизмы);

б) изучение других свойств выделенной чистой культуры.

23)Бактериофаги

БАКТЕРИОФАГИ - вирусы бактерий, которые обладают способностью лизировать бактериальную клетку или изменять ее свойства. Фаги размножаются в клетках чувствительных к ним бактерий.

Строение фага кишечной палочки (Т2)

Средние размеры фагов - 25-110 нм.

По характеру взаимодействия с чувствительной клеткой фаги различают:

а) вирулентные (дают литическую продуктивную инфекцию);

б) умеренные (вызывают лизогенизацию клетки).

По специфичности различают:

а) полифаги (лизируют несколько видов бактерий);

б) монофаги (лизируют только один вид бактерий);

в) типовые фаги (лизируют не все штаммы данного вида, а лишь некоторые, принадлежащие к одому фаговару).

Этапы взаимодействия вирулентного фага с клеткой:

1. Адсорбция фага на специфических рецепторах клеточной стенки (с участием фибрилл и отростка).

2. Проникновение нуклеиновой кислоты фага внутрь бактериальной клетки (лизоцим отростка фага растворяет клеточную стенку бактерии в месте адсорбции, чехол сокращается, стержень проходит сквозь клеточную стенку и нуклеиновая кислота фага поступает внутрь бактериальной клетки, оболочка головки остается снаружи).

3. Синтез в клетке компонентов фага (проникшая нуклеиновая кислота фага вызывает полную перестройку метаболизма клетки; на рибосомах синтезируются белки фага, а в других участках клетки реплицируется его нуклеиновая кислота).

4. Сборка фаговых частиц и лизис клетки (нуклеиновая кислота наполняет белковые головки пристраивается отросток; лизоцим фага растворяет клеточную стенку бактерии, клетка лизируется, и из нее выходят 100-300 новых фагов; они внедряются в соседние клетки и также лизируют их; в результате мутная культура бактерий на жидкой среде просвегляется, а на плотной среде образуется колония фага - "стерильное пятно").

Взаимодействие умеренного фага с клеткой

Адсорбция фага и проникновение нуклеиновой кислоты происходит аналогично. Но проникшая в клетку ДНК фага встраивается в хромосому клетки, где может находиться в неактивном состоянии (под действием белка-репрессора) и наследоваться дочерними клетками после репликации хромосомы. Этот процесс называется лизогенизацией, а клетки, содержащие неактивный геном фага (профаг), называются лизогенными. Чтобы обнаружить в клетке профаг, надо подействовать индуцирующими агентами физическими (УФО, рентгеновскими лучами) или химическими. Они разрушают репрессор, с профага считывается информация, в клетке синтезируются компоненты фага и клетка лизируется. Этот процесс называется индукцией. В процессе лизогенизации может произойти конверсия фагом (изменение свойств бактериальной клетки). Так, если нетоксичную дизентерийную палочку (не продуцирующую экзотоксин) обработать умеренным дифтерийным фагом, некоторые клетки станут лизогенными и приобретут способность продуцировать экзотоксин.

Титрование фагов

Активность препарата фага определяется его титром. Титр фага - наибольшее его разведение, еще вызывающее лизис чувствительной культуры бактерий.

Фаги титруют следующими методами.

/. Титрование фага на жидкой среде

Готовят последовательные десятикратные разведения испытуемого фага в жидкой питательной среде; 10-1, 10-2, 10-3, и т.д. В эти разведения вносят чувствительную культуру бактерий. Пробирки инкубируют в термостате при 37°С 18-20 часов. Затем отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис внесённой культуры (рост бактерий в этой пробирке отсутствует). Это разведение, и является титром фага. Например: "титр фага - 10-6"

2. Титрование фага на плотной среде

Чашку с плотной средой делят на несколько зон. Культуру чувствительных бактерий высевают сплошным газоном на поверхность среды. Затем в соответствующие зоны наносят по капле различных десятикратных разведений фага. После инкубации в термостате при 37°С 18-20 часов отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис (образование "стерильного пятна").

Практическое применение фагов.

I. Вирулентные фаги применяют:

1) для лечения и экстренной профилактики (при угрозе заражения).

Например:

- брюшнотифозный

- дизентерийный

- холерный Эль-Тор,

- коли - протейный,

- стафилококковый,

- гангренозные,

- синегнойный и др.

2) для диагностики (с целью установления вида неизвестного микроба). Например: испытуемый микроб высевают сплошным газоном на чашку с плотной средой, на которую наносят каплю известного видового фага и инкубируют в термостате. Если культура бактерий соответствует данному фагу, образуется "стерильное пятно".

3) для фаготипирования с целью установления источника заражения (применяются типовые фаги). Если штаммы, выделенные от больного и предполагаемого источника лизирутотся одними и теми же типовыми фагами (принадлежат к одному фаговару), это подтверждает общность их про-исхождения.

Применение умеренных фагов:

1) на лизогенных бактериях изучают механизмы функционирования различных генов; с помощью трансдукции устанавливают локализацию генов на бактериальной хромосоме.

2) лизогенные бактерии ипользуются при поисках противоопухолевых веществ: если препарат обладает индуцирующими свойствами, т.е. он взаимодействует с нуклеиновыми кислотами, и его можно испытывать как противоопухолевый препарат.

3) лизогенные штаммы используют при изучении различных мутагенных факторов, например, в космических исследованиях - как индикаторы надежности защиты космических кораблей от жестких космических лучей: если по возвращению из космоса произошла индукция, и культура лизировалась, следовательно в корабль проникли космические лучи, т.е. защита корабля ненадежна.

умеренные фаги широко используются в генной инженерии. Модель "профаг - клетка" лежит в основе вирусогенетической гипотезы происхождения опухолей.

Морфология и физиология грибов

Грибы - это одноклеточные или многоклеточные эукариоты без хлорофилла, но близкие к растениям. Патогенные для человека грибы имеют следующие морфологические формы:

1 - гифы (нити), которые при сплетении образуют мицелий (тело гриба).

Различают:

а) истинный (у плесеней) - трубка, разделённая или неразделённая перегородками (септами), покрытая общей оболочкой;

б) ложный (псевдомицелиий у грибов рода Кандида - Candida) вытянутые, нитевидные клетки, каждая из которых имеет свою оболочку.

2 - круглые и овальные почкующие клетки (у дрожжей и грибов рода Кандида). Размеры вегетативных форм - xl - х100 мкм. Структура их сложная: многослойная клеточная стенка, цитомембрана, дифференцированное ядро, полисомы, митохондрии, включения, пигменты.

3 - споры (по назначению и свойствам они отличаются от спор бактерий: у грибов это форма размножения и распространения; споры гриба менее устойчивы к высокой температуре).

Различают:

а) эндоспоры, покрытые оболочкой. Например, аски у дрожжей, образующиеся в результате полового размножения;

б) экзоспоры; контактируют с воздухом. Например, микроконидии у гриба (Penicillium).

Способы размножения грибов:

1 - поперечное деление;

2 - фрагментация;

3 - почкование;

4 - спорообразование;

5 - половой способ.

По типу дыхания грибы - аэробы и факультативные анаэробы, по типу питания - гетеротрофы. Для выращивания грибов применяют среду Сабуро (дрожжевой экстракт + глюкоза + пептон + агар-агар) рН=6,8

Сроки роста - от 2-3 дней до месяца. Характер колоний различен: беловато-желтые, напоминающие капли сметаны, пушистые, морщинистые, гипсовидно-мучнистые, кожистые, с различными бороздками, пигментами. По отношению к питательной среде различают 3 вида мицелия: воздушный (репродуцирующий), на концах которого располагаются споры, и субстратный, врастающий в питательную среду и мицелий распространения.

Среди патогенных грибов известны диморфные грибы. Это грибы разной морфологии в зависимости от локализации: в организме человека это обычно дрожжевая форма, а на среде Сабуро - мицелиальная. К ним относятся возбудители особо опасных микозов: гистоплазмоза, кокцидиоидного микоза и других заболеваний.

Токсинообразование: большинство грибов образуют эндотоксин, некоторые - экзотоксин. Грибы по строению мицелия подразделяют на две группы.

1. Низшие грибы (мицелий несептированный). Для медицины и фармации важны 2 класса:

- зигомицеты (вызывают болезни лекарственных растений);

- оомицеты (например, мукоровая плесень - вызывает мукоз у людей и животных).

2. Высшие грибы (мицелий септированный). Например грибы рода (Penicillium).

По характеру размножения грибы подразделяют на две группы:

- совершенные грибы (характерен половой способ размножения);

а) - аскомицеты

б) - зигомицеты

- несовершенные грибы - дейтеромицегы (половой способ невыявлен):

а) грибы рода Кандида, вызывающие заболевания у человека

Значение грибов:

1. Патогенные грибы вызывают у человека микозы.