Лабораторная диагностика хронического панкреатита

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лабораторная диагностика хронического панкреатита

Лабораторные тесты, применяющиеся для диагностики ХП, относят к следующим группам:

Исследование содержания (активности) ферментов ПЖ в крови, моче.

Зондовые методы изучения экзокринной функции ПЖ:

а) прямые;

б) непрямые.

3. Беззондовые методы выявления внешнесекреторной недостаточности ПЖ:

а) тесты на активность панкреатических ферментов, при которых в моче или выдыхаемом воздухе определяют продукты гидролиза разных субстратов;

б) тесты на недорасщепленные и невсосавшиеся компоненты пищи вкале (копрограмма, содержание жира в кале);

в) оценка содержания панкреатических ферментов (эластазы, липазы,химотрипсина) в кале.

4. Оценка инкреторной функции ПЖ (определение содержания С-пептида в крови, проба Штауба--Трауготта и др.).

5. Оценка трофологической недостаточности

Кроме того, для лабораторной диагностики ХП используют иммунологические, генетические, цитологические, гистологические исследования, определяют в крови уровни панкреатического полипептида, «онкомаркеров» -- СА 19--9, СЕА (карциноэмбриональный антиген) и др.

5.3.1 Исследование содержания (активности) ферментов поджелудочной железы в крови и моче

Первая группа диагностических тестов обычно используется для выявления феномена выхода («уклонения») ферментов в кровь, который развивается при деструкции паренхимы органа и при повышении внутрипротокового давления. Ферменты поступают в интерстициальную жидкость, затем в лимфу и кровь, а позже попадают в мочу. Панкреатические ферменты проникают в кровь также из секреторных ходов и протоков ПЖ. Кроме того, происходит всасывание ферментов в проксимальных отделах тонкой кишки. Далее мы кратко представим основные механизмы феномена «уклонения» ферментов в кровь, поскольку панкреатическая ферментемия имеет и определенное физиологическое значение. На наш взгляд, знание механизмов проникновения ферментов ПЖ в кровь является необходимым для адекватной оценки показателей панкреатических ферментов в крови и упорядочения изложения в монографии материала.

В целом, большое количество научных публикаций, посвященных определению амилазы, липазы, трипсина, эластазы и других панкреатических ферментов в плазме крови при панкреатите, не позволяют нам привести результаты большинства из них, поскольку данный анализ выходит за пределы задач этой главы и монографии в целом.

5.3.1.1 Механизмы проникновения панкреатических ферментов в кровь

Основными продуцентами гидролитических ферментов в кровь являются слюнные, желудочные железы, ПЖ, печень и секреторный аппарат тонкой кишки [40].

В течение длительного времени дискуссионным оставался вопрос о происхождении панкреатических гидролаз в крови. Во многих работах утверждалось, что экзосекретированные панкреатические ферменты попадают в кровь из тонкой кишки (т. е. имеют резорбционное происхождение), вопреки каноническому положению, что белки из просвета тонкой кишки не всасываются. Компромисс между сторонниками и противниками «резорбционной» теории был найден после определения того факта, что белки в незначительном количестве все же могут всасываться в тонкой кишке [11, 38]. Однако всасывание белков в тонкой кишке в большей степени касается всасывания белков-нутриентов и вряд ли может быть отнесено к минорным белкам химуса, в числе которых присутствуют и панкреатические ферменты [40]. В самом деле, доля панкреатических ферментов в составе химуса незначительна, поскольку панкреатический секрет содержит только 3,5% белка, а большая часть панкреатических ферментов разрушается в двенадцатиперстной и тощей кишке [248, 271, 277].

Однако использование рядом авторов ферментов, меченных изотопами, показало, что всасывание их составило, по данным разных исследований, 40% [37J], 60% [36], 50-70% [220]. На экспериментальных моделях с отрезками тонкой кишки у крыс in vitro был отмечен переход р-амилазы из состава перфузата полости тонкой кишки в изотопический раствор натрия хлорида, в котором инкубировался препарат кишки. Этот транспорт увеличивался при повышении гидростатического давления раствора в полости кишки [68]. Аналогичные результаты позже были получены группой авторов под руководством Г.Ф. Коротько [37], причем было определено, что наибольший транспорт ферментов характерен для дистальной части тонкой кишки, а желчные кислоты существенно повышают всасывание панкреатических ферментов.

Признавая реальность тонкокишечного резорбционного механизма происхождения панкреатических ферментов в крови, нельзя считать его единственным [40]. Один из наиболее важных механизмов панкреатической ферментемии -- механизм разрушения ациноцитов (некроз и апоптоз).

Еще одним источником происхождения панкреатических ферментов в крови может являться инкреция ферментов на уровне ПЖ, т. е. ферменты, экзосекреторно покинув клетку-продуцент через ее апикальную мембрану, транспортируются затем из ацинусов и мелких выводных протоков в интерстиций, а оттуда -- в кровь и лимфу [40, 53]. Такая гипотеза имеет не только сторонников, но и оппонентов [23, 65], поскольку полости ацинусов и мелких протоков ПЖ герметизированы межклеточными замыкательными пластинами [40].

Группа гистологов [26, 80] на моделях обструктивного ОП пришла к заключению о возможности транспорта ферментов из железы в интерстиций через межклеточные контакты. В первое время после окклюзии протока ферменты транспортируются из протоковой системы через мелкие протоковые клетки; в дальнейшем к этому пути добавляется и транспорт ферментов через ациноциты. При этом авторами уточняется немаловажная деталь: наблюдается базолатеральный экзоцитоз после апикального эндоцитоза, т. е. фермент предварительно не покидает клетку экзосекреторным путем, а в результате блока экзоцитоза выделяется из клетки через ее базо-латеральную мембрану.

Еще одним механизмом происхождения ферментов пищеварительных желез в крови является истинная инкреция панкреатических энзимов ациноцитами, т. е. транспорт ферментов из ациноцитов через их базолатеральные мембраны в интестиций, а оттуда -- в лимфу и кровь [40]. В 1961 г. А.М. Уголев [76] высказал экскреторную гипотезу эволюционного происхождения внешней и внутренней секреции. В последующих работах эта гипотеза получила авторское развитие, и в 1978 г. была сформулирована концепция о едином происхождении экзо- и эндосекреции, согласно которой секреция возникла в ходе эволюции из неспецифической экскреции клеток. В числе метаболитов из клеток удаляются не только неспецифические, но и специфические синтезированные в ней вещества -- ферменты и гормоны, которые выделяются преимущественно экзо- и эндокринно, что становится доминирующим признаком данной клетки и может быть совмещено с иной специализированной ее функцией. Эта концепция еще на ранних этапах ее развития была поддержана морфологами, отметившими нестрогую полярность транспорта секреторного продукта из ациноцитов, совмещение в одном ациноците экзо- и эндокринных функций путем выделения в качестве экзосекрета ферментов, а эндосекрета -- гормонов. Уже тогда можно было допустить, что практически любой тип клеток может иметь в составе секрета специфические и неспецифические компоненты [40]. Время подтвердило этот принцип [39] и доказало, что многие клетки (лейкоциты, эндотелиоциты, миоциты предсердий и желудочков сердца, адипоциты и др.) синтезируют и выделяют физиологически активные вещества с теле-, пара- и аутогормональными эффектами.

Завершая обзор возможных источников происхождения в крови ферментов ПЖ, следует признать несколько вероятных механизмов, однако качественное соотношение этих путей транспорта может изменяться в зависимости от функционального состояния ПЖ и тонкой кишки, проницаемости их гистогематических барьеров, внутрипротокового давления, уровня кровоснабжения ПЖ и тонкой кишки и, видимо, других причин. Важно еще раз подчеркнуть, что ПЖ не только экзо-, но и эндосекрети-рует синтезированные ею ферменты, а также то, что эндосекреция их может изменяться, как и экзосекреция, в весьма широких пределах, как в норме, так и, особенно, при патологии, и не только органа продуцента -- ПЖ [40].

5.3.1.2 Определение амилазы и ее изоферментов в крови и моче

Как известно, в плазме и сыворотке крови человека содержится а-амилаза двух изоэнзимных типов, продуцируемых соответственно ПЖ и слюнными железами (преимущественно околоушными):

панкреатическая (р-тип);

слюнная (s-тип).

Кроме того, амилолитическая активность выявлена во многих тканях -- в тонкой кишке, печени, почках, мышцах, легких, маточных трубах и жировой ткани [12, 36, 40]. Это, однако, не означает, что все они синтезируют и транспортируют в кровь значительное количество амилазы. Основными поставщиками амилазы в кровь являются ПЖ и слюнные железы [40]. По данным многих авторов, занимающихся этим вопросом, доля амилоли-тической активности панкреатической а-амилазы составляет 30--40% [250], 13--47% [438], 40--50% [8, 40]. Каждая из этих амилаз имеет несколько фенотипов [12]. Имеются указания, что р- и s-амилазы различаются рядом физико-химических свойств, имеют разные почечные клиренсы и разные периоды полураспада в организме (s-амилаза --18 ч, р-амилаза -- 124 ч) [40]. В литературе представлено мнение, что существуют генетически обусловленные соотношения р- и s-амилаз в сыворотке крови у человека [283].

Амилаза в крови находится в свободном (растворенном) и связанном с белками плазмы и форменными элементами состоянии. На первых порах полагали, что амилаза связана с альбуминами, затем было сообщено об амилолитической активности гаммаглобулиновой фракции. Предположили, что в составе альбуминовой фракции присутствует панкреатическая, а глобулиновой -- печеночная амилаза. Однако эти данные не получили строгого подтверждения [40].

По данным Э.А. Веприцкой, амилолитической активностью обладают альбумины и все фракции глобулинов [10]. По мнению Г.Ф. Коротько [40], связь амилаз с белками плазмы является одной из форм депонирования фермента, поддерживающего ферментный гомеостаз организма.

Итак, определение уровня амилазы в крови и моче является наиболее распространенным диагностическим тестом и одним из первых биохимических способов диагностики панкреатита. С 1908 г., когда Вольгемут разработал метод определения активности амилазы в биологических жидкостях, было предложено более 200 методических приемов проведения данного анализа.

Например, при методе М. Ceska и соавт. [138] используется устойчивый крахмальный субстрат; этот тест может быть адаптирован для любых жидкостей организма. Изоферменты амилазы также измеряются во многих обычных лабораториях; они могут определяться в сыворотке, моче или других биологических жидкостях при хроматографии, электрофорезе или изоэлектрическом фокусировании.

С целью удовлетворения требований срочной диагностики был усовершенствован простой колориметрический тест, позволяющий произвести быструю оценку мочевой амилазы; этот метод имеет определенные преимущества. По мнению P.J. Holdsworth и соавт. [226], мочевой тест пригоден для скрининга при клиническом подозрении на ОП, но он не может заменить измерение сывороточной амилазы, являющееся важнейшим методом диагностики этого заболевания. Дальнейшей модификацией амилазного теста является определение клиренсного отношения амилаза -- креатинин [287, 325], однако данный тест требует 24-часового сбора мочи. Результат выражается в процентах клиренсного отношения следующим образом:

Клиренсное отношение = Мочев. Амилаза / Сыв. амилаза х Сыв. х

Креатинин / Мочев. креатинин х 100.

При ОП клиренсное отношение повышено, что объясняется увеличением панкреатического изофермента, имеющего больший клиренс (по сравнению с изоферментом s-типа), и уменьшением канальцевой реабсорбции белков [243]. Ввиду вариабельности почечных изменений при ОП ценность определения отношения клиренсов амилазы и креатинина вызывает серьезные сомнения и широко не используется [5].

Существуют противоречивые сведения о стабильности ос-амилазы: наряду с утверждением о том, что активность фермента стабильна при комнатной температуре в течение недели, имеются данные о снижение этой активности уже через несколько часов [1]. Все это объясняет низкую чувствительность метода. Невысокая чувствительность определения амилазы в крови и моче связана также с кратковременностью гиперамилаземии и гиперамилазурии при панкреатите. Так, уровень амилазы крови начинает повышаться через 2--12 ч от начала обострения заболевания, достигает максимума через 20--30 ч, нормализуются через 2--4 сут. при благоприятном течении заболевания [1, 19, 73, 141]. Содержание амилазы в моче начинает повышаться через 4--6 ч от начала заболевания, а через 8--10 ч уже может нормализоваться [203]. По данным других авторов, активность амилазы в моче, возрастает через 6--10 ч после подъема активности в крови и возвращается к норме через 3 сут. после подъема [73]. В.В. Храпач и соавт. [81] считают, что уровень амилазы в моче имеет две волны повышения в течение 3 сут. с начала периода обострения. В период обострения ХП активность амилазы в крови и в моче может оставаться в пределах нормальных величин, так как у таких больных подъем активности фермента происходит на фоне исходно низкого уровня, связанного с фиброзом паренхимы ПЖ. При тяжелом, прогрессирующем течении ОП или обострении ХП активность амилазы может «истощаться» до нормальных и субнормальных величин [19, 64, 407]. В целом до 20% пациентов с ОП могут иметь нормальные концентрации амилазы сыворотки крови [145]. В исследовании R. Pezzilli и соавт. [346] было определено, что по сывороточным уровням амилазы невозможно определить тяжесть текущего обострения панкреатита и ближайший прогноз.

Чаще в литературе встречается мнение, что определение содержания амилазы в моче более информативно, чем в крови, так как гиперамилазурия более стойка, чем гиперамилаземия [20, 203], хотя некоторые авторы придерживаются противоположенного мнения. Доступность получения мочи позволяет многократно повторять исследование и поэтому выявлять даже небольшой подъем показателя. Кроме того, вследствие отличий в экскреции амилазы почками доля панкреатической изоамилазы в моче значительно больше, чем в крови [19, 73, 103]. Обострение ХП сопровождается специфическим повреждением проксимальной части канальца нефрона, которое приводит к снижению реабсорбции и увеличению почечного клиренса, т. е. гиперамилазурия является результатом и гиперамилаземии, и подавления канальцевой реабсорбции. Как мы уже отмечали ранее, на этом основано определение соотношения клиренсов амилазы и креатинина. Более чувствительным, чем амилазурический тест, является вычисление дебитов уроамилазы, когда исследуется моча, собранная за определенные промежутки времени до и после пищевой нагрузки. Чувствительность этих дебитов при ХП составляет 49--73% [19].

Для повышения чувствительности исследования уровня амилазы в крови и моче А. И. Хазанов советует проводить их изучение в первые сутки пребывания больных ХП в стационаре, затем не менее двух раз после инструментальных исследований, а также в момент усиления болевого абдоминального синдрома. При этом, по его мнению, чувствительность теста повышается с 40 до 75--85% [77].

Интерпретация результатов исследования общей амилазы крови и мочи затруднена также тем, что фермент содержится в слюнных железах, толстой кишке, скелетных мышцах, почках, легких, яичниках, маточных трубах. Амилолитическая активность определяется в молоке, слюне, слезной жидкости, поте. Амилаза не является строгим панкреатоспецифическим ферментом, вследствие чего возможно повышение ее уровня в биологических жидкостях вследствие внепанкреатических причин (табл. 5.11): при перфорации язвы, кишечной инвагинации, перитоните, тромбозе брыжеечных сосудов, холецистите, холангите, паротите, почечной недостаточности, внематочной беременности, остром аппендиците, раке легких, диабетическом ацидозе, феохромоцитозе, после операций по поводу пороков сердца, после резекции печени, употребления препаратов опия, сульфаниламидов, тиазидных диуретиков, пероральных контрацептивов, причем других признаков панкреатита в этих случаях может не выявляться [19, 35, 73].

Недавно опубликованы результаты ретроспективного исследования, в котором был проанализирован уровень сывороточной амилазы у всех больных, госпитализированных в стационар с диагнозом «острый гастроэнтерит», причем пациенты, имевшие другие возможные причины гиперамилаземии, были исключены из исследования. Так, уровень амилазы крови оказался повышенным у 7,4% больных острым гастроэнтеритом, превышая в среднем верхнюю границу нормы на 32%. Авторами было определено, что уровень гиперамилаземии у больных острым гастроэнтеритом никоим образом не влиял на течение гастроэнтерита, тяжесть состояния больных и эффективность проводимой терапии [112]. Таким образом, острый гастроэнтерит может быть ассоциирован с легкой и умеренной гипе-рамилаземией у части больных и должен быть включен в дифференциальный диагноз гиперамилаземии.

Для повышения специфичности гиперамилаземии предлагают считать диагностически значимым повышение уровня фермента в 3--6 раз относительно нормы [204]. Однако патогномоничного для панкреатита уровня амилазы в крови не существует. Вследствие значительного запаса фермента в ацинарных клетках любое нарушение их целостности или малейшее затруднение оттока секрета ПЖ может привести к значительному выходу амилазы в кровь даже при легком течении панкреатита [64]. М. Jaakkola и соавт. выявили повышение в крови уровня общей и панкреатической амилазы после однократного приема большой дозы алкоголя у субъектов без клинических проявлений панкреатита [242]. Напротив, при тяжелой деструкции паренхимы органа гиперамилаземия может не выявляться [308]. Таким образом, прямой связи между тяжестью панкреатита и амилаземией в ряде случаев не наблюдается [19].

Для повышения специфичности исследования амилазы в крови следует определять не суммарное содержание фермента, а панкреатическую изоамилазу. Как мы отмечали ранее, у здоровых людей р-амилаза составляет до 40% общей сывороточной амилазы, остальные 60% представлены слюнной изоамилазой. При ХП это соотношение изменяется: панкреатическая изоамилаза составляет 75--80% общей амилазы крови. Определение активности панкреатической изоамилазы особенно важно при хроническом панкреатите у больных с нормальным содержанием общей амилазы. Повышение показателя указывает на обострение ХП, а снижение -- на экзокринную недостаточность ПЖ при атрофии ацинарной ткани и фиброзе органа у больных, перенесших ряд атак [19]. Так, исследования G. Skude и S. Eriksson [377] показали, что уровень панкреатической изоамилазы в сыворотке крови у больных ХП существенно снижен по сравнению с контролем, хотя содержание общей сывороточной амилазы у таких больных остается в пределах нормы. S.E. Aw и соавт. [100] считают, что изменение именно изоферментов амилазы в моче наиболее целесообразно при диагностике ХП.

В целом специфичность определения панкреатической амилазы при ХП не превышает 88,6% при чувствительности 40--96,9% [2, 78, 424].

5.3.1.3 Сывороточный иммунореактивный трипсин

Большое значение в диагностике панкреатитов придают определению активности трипсина в сыворотке крови, который продуцируется только ацинарными клетками ПЖ, т. е. является панкреатоспецифичным [95, 232].

Содержание иммунореактивного трипсина в сыворотке можно достаточно точно измерить, используя набор для радиоиммунного анализа (Ве-hringwerke, Marburg, GFR). Этот метод подробно описан В.Н. Stagg и Т.Р. Wood [383], но его клиническое применение, по-видимому, ограничено, так как накопленный опыт показал, что изменение сывороточного иммунореактивного трипсина недостаточно показательно для успешного использования его в качестве диагностического теста при ХП [5]. Однако существуют данные, что в ряде случаев при ОП и обострении ХП уровень имунореактивного трипсина в крови может увеличиваться в 20--70 раз [20, 218]. Отчасти низкая достоверность исследований обусловлена связыванием активного трипсина ингибиторами, основными из которых являются а)-антитрипсин и ос₂-макроглобулин. В этом случае антитела, содержащиеся в соответствующих диагностических наборах, плохо «узнают» трипсин в комплексе с ингибиторами [19].

По данным L. Enslev и соавт. [176], при обследовании 80 больных ХП специфичность теста составила более 95%, а чувствительность -- только 40%. В клинической практике частота ложноотрицательных результатов довольно высока, поэтому данный тест рассматривается как неудовлетворительный [5].

Повышение уровня имунореактивного трипсина не является строго специфичным для панкреатитов, встречается при хронической почечной недостаточности, гиперкортицизме, раке ПЖ, калькулезном холецистите. Более специфичными являются низкие показатели имунореактивного трипсина для внешнесекреторной недостаточности ПЖ. Особенно демонстративной при этом является монотонная кривая динамики имунореактивного трипсина после пищевой нагрузки в экспериментальных и клинических исследованиях.

Ряд авторов предлагают определять имунореактивный трипсин в крови в качестве скринингового теста для диагностики экзокринной недостаточности ПЖ у больных, длительно страдающих ХП с исходом в фиброз органа. Однако снижение показателя может регистрироваться и при раке ПЖ. Для уменьшения частоты псевдоотрицательных результатов исследования имунореактивного трипсина в крови при ХП предложено определение его в комплексе с ингибиторами после стимуляции церулеином, панкреозими-ном, пищевой нагрузкой [19].

Определение содержания ингибиторов трипсина в сыворотке крови также используют для диагностики панкреатита, однако их показатели бывают разнонаправлены, не всегда возможна четкая трактовка результатов. Повышение уровня ингибиторов трипсина в крови чаще свидетельствует о мобилизации плазменной ингибиторной системы, что обусловливает псевдонормальные показатели трипсинемии. И напротив, низкое содержание плазменных ингибиторов обычно свидетельствует об их активном потреблении, уменьшение емкости или об истощении защитных механизмов при тяжелой деструкции ПЖ, т. е. является неблагоприятным фактором. Вместе с тем, при любых сывороточных протеазно-ингибиторных соотношениях они, по мнению большинства авторов, не отражают эти соотношения в ткани ПЖ, а следовательно, не могут ориентировать врача в отношении формы, тяжести, а в ряде случаев и диагноза панкреатита [19].

Трипсиноген, циркулирующий в крови, по полярности делят на катионический и анионический с нормальным соотношением этих форм в сыворотке 2:1. При панкреатите происходит более выраженное повышение в крови анионной формы трипсиногена с нарушением указанного выше нормального соотношения [343]. Таким образом, определение катионического и анионического трипсиногена может использоваться в качестве диагностического теста ХП.

В последние годы появились данные о достаточной информативности определения содержания трипсиногена в моче [102, 196, 258]. Точность определения уровня трипсиногена-2 в моче при дифференциальном диагнозе ОП с острой абдоминальной патологией непанкреатического происхождения оценена в исследованиях J. Hedstr6m и соавт. [219] сообщивших о чувствительности данного метода 91% и специфичности 95%.

В дальнейших исследованиях, проведенных этой научной группой [258] у пациентов с острой брюшной болью, отрицательный ответ на трипсиноген-2 в моче исключил ОП с высокой степенью вероятности (чувствительность 95%, отрицательная прогнозирующая ценность -- 99%).

К сожалению, практические врачи чаще пользуются результатами неспецифического изучения суммарной протеолитической активности сыворотки крови, так как набор для радиоиммунного исследования в крови трипсина, катионной и анионной форм трипсиногена и трипсиногена в моче имеют высокую стоимость, и их использование пока возможно только в научных исследованиях.

5.3.1.4 Сывороточная липаза и фосфолипаза

Противоречивы данные и о диагностической ценности при панкреатите определения активности сывороточной липазы. Так, ряд авторов указывают, что метод определения липазы является недостаточно чувствительным и информативным. По другим сведениям, липаза является высокоинформативным показателем, чувствительность и специфичность которого приближаются к 100% [169]. Данные о сроках, при которых сохраняется гиперферментемия, также значительно варьируют. Гиперлипаземия не является строго специфичной для ПЖ, так как наблюдается и при других заболеваниях желудочно-кишечного тракта. G. Melzi, M. Ventrucci и соавт. считают, что повышение активности липазы в крови в два раза специфичнее для ХП, чем гиперамилаземия. Действительно, гиперлипаземия не встречается при аппендиците, внематочной беременности, паротите, раке легкого, но ее регистрируют у 60% больных с заболеваниями гепатобилиарной системы, при кишечной непроходимости, почечной недостаточности, раке предстательной железы и других непанкреатических заболеваниях. Согласно результатам исследования R. Pezzilli и соавт. [346], по сывороточному уровню липазы невозможно определить тяжесть текущего обострения панкреатита и ближайший прогноз. Более специфичным является снижение уровня липазы в крови в отношении фиброза ПЖ как исхода ХП и муковисцидоза.

Методика определения липазы детально описана в работе J. F. Whitaker [430]. При этом используются колориметрическая техника и небольшие количества сыворотки.

В последние годы определенное значение в диагностике панкреатита, в определении прогноза и вероятности развития его осложнений придают исследованию концентрации в крови и моче фосфолипазы А₂ [14].

Это связано с тем, что фосфолипаза А₂ играет существенную роль в патогенезе ХП благодаря тропности к липидам клеточных мембран, и способности вызывать их повреждение [418]. Кроме того фосфолипаза А₂, отщепляя жирные кислоты от лецитина, образует лизолецитин, который при попадании в ГПП через несколько минут вызывает отек, а через несколько часов -- некроз паренхимы ПЖ [19]. Поэтому, повышение содержания в крови фосфолипазы считают идеальным маркером деструктивных процессов [259]. Результаты целого ряда исследований свидетельствуют о высокой чувствительности (до 100%) и специфичности (до 90%) для ХП изучения содержания в крови фосфолипазы А₂ типа I, которая является пан-креатоспецифичным энзимом [115, 330]. Доказано, что повышенный уровень фосфолипазы А₂ типа I определяется в крови раньше и удерживается дольше, чем увеличение активности общей амилазы, панкреатической изо-амилазы, имунореактивного трипсина, липазы, причем гиперфосфолипазе-мия коррелирует с тяжестью обострения ХП [237]. Кроме биохимического, разработаны и более чувствительные иммунофлюорометрический и радиоиммунологический методы изучения активности ферментов. Эти методы позволяют определять не только общую фракцию фосфолипазы А₂, но и уровни профермента и активного энзима. При обострении ХП соотношение между ними резко изменяется в сторону активной фосфолипазы [14, 19].

Нельзя не отметить результаты исследований М. Kashiwagi и соавт. (1998), в которых у больных ХП при изучении экспрессии генов трех изоформ фосфолипазы А₂ (I, II и IV типы) получено увеличение уровней мРНК фосфолипазы А₂ II и IV типов более чем в 5 раз по сравнению с контролем [255]. Иммуногистохимические исследования показали, что у здоровых людей в ацинарных клетках ПЖ присутствует фосфолипаза А₂ типа I, в то время как тип II встречается только в некоторых ацинусах. При ХП содержание фосфолипазы А₂ типа II в ацинусах значительно увеличивается. Кроме того, этой изоформой были насыщены метапластические потоковые клетки, в которых, кстати, определялся и IV тип фосфолипазы А₂. Все ткани ПЖ при ХП с повышенной экспрессией мРНК фосфолипазы А₂ II и IV типов имели высокую степень дегенерации, метаплазии протоков и фиброза. Таким образом, можно предположить, что эти изо-формы фосфолипазы А₂ могут быть ответственны за морфологические изменения, возникающие при ХП.

Учитывая факт важности фосфолипазы А₂ в патогенезе панкреатита, в настоящее время ведется поиск ее ингибиторов, которые можно было бы применять в лечении этого заболевания. Синтез белков, ингибирующих фосфолипазу А₂, запускается в очаге воспаления стероидами. Для обозначения этой группы ингибирующих веществ используется термин «липокортины». Их главная роль заключается в регуляции синтеза простагландинов в воспалительных реакциях [14]. Местные анестетики и нейролептические препараты являются ингибиторами фосфолипазы А₂ и оказывают заметное воздействие на ее активность при экспериментальном ОП [221], однако, несмотря на разработку различных агентов, ингибирующих активность фосфолипазы А₂ посредством различных механизмов, ни один из них пока не признан подходящим для широкого клинического применения [140, 263].

Определение содержания фосфолипазы А₂ типа I в крови является чувствительным тестом и в отношении экзокринной недостаточности ПЖ, поскольку степень снижения активности фермента в крови коррелирует с показателями секретин-панкреозиминового теста [19].

5.3.1.5 Сывороточная эластаза 1

Важное значение в аутолизе ткани ПЖ придают эластазе 1, ферменту ПЖ, относящемуся к эндропептидазам. Эластаза 1 при гидролизе белков разрывает внутренние связи между аминокислотами в середине их цепей, продуцируя, таким образом, пептиды. Эластазы занимают особое место среди других протеаз, благодаря тому, что они способны гидролизировать различные белки, в частности эластин. Таким образом, эластаза может иметь патологическую значимость в развитии сосудистых повреждений, наблюдающихся при ОП [190].

Существует 3 вида эластаз: панкреатические эластазы типов 1 и 2 и эластаза нейтрофилов. Хотя эти ферменты обладают сходными химическими свойствами, иммунологически они значительно различаются, что позволяет определять их раздельно. В настоящее время используется иммуно-ферментный метод исследования человеческой эластазы 1 (ELISA). Таким способом возможно исследование эластазы 1 в любой биологической жидкости, но коммерчески доступные наборы реактивов выпускают для анализа крови (оценка феномена «уклонения» ферментов при остром воспалении ПЖ).

Активность этого фермента в крови, по данным V. Gumaste, повышается при панкреатите раньше, чем уровень других ферментов, и удерживается дольше [203]. Определение активности эластазы 1 считают самым «поздним» чувствительным тестом диагностики обострений ХП, поскольку повышенный уровень эластазы 1 крови сохраняется в течение 8--10 дней после атаки. В этот период активность эластазы 1 в крови повышена у 100% больных, уровень липазы -- у 85%, имунореактивного трипсина -- у 58%, панкреатической изоамилазы -- у 43%, общей а--амилазы -- у 23% больных [73]. Разноречивы сведения о специфичности гиперэластаземии, в частности имеется мнение, что она не соответствует степени деструкции ткани ПЖ и не имеет большого диагностического значения при функциональной недостаточности у больных с многолетним ХП.

Согласно мнению ряда авторов, тяжесть ОП или атаки ХП можно оценивать по уровню эластазы нейтрофилов в плазме крови [129, 167, 197, 231, 417], однако данный метод недоступен в большинстве лечебных учреждений.

5.3.1.6 Редко определяемые ферменты поджелудочной железы

Реже используют определение активности в крови других ферментов: карбоксипептидаз А и В, дегидрогеназ, нуклеаз, глутатионтрансферазы, гиалуронатэндоглюкоаминидазы, глицинамидинотрасферазы, холестеролэстеразы, катепсинов В, D и L и др., однако методы изучения содержания этих ферментов в биологических жидкостях технически сложны, имеют высокую стоимость. Диагностическая информативность этих тестов далеко не всегда оправдывает сложность и стоимость их выполнения [19]. Перспективным, возможно, является изучение содержания в крови и моче панкреатит-ассоциированного белка (см. главу 3).

В табл. 5.12 представлены сводные данные о чувствительности и специфичности определения ряда панкреатических ферментов по результатам исследований наиболее авторитетных центров и авторов.

5.3.2 Оценка экзокринной функции поджелудочной железы

Тесты, позволяющие оценить экзокринную функцию ПЖ, могут потребоваться для обоснования диагноза ХП. Они почти всегда комбинируются с ультразвуковыми, рентгенологическими и другими исследованиями, но могут применяться в диагностических целях и самостоятельно. Их можно разделить на две группы: тесты, требующие введения кишечного зонда, и неинвазивные беззондовые методы. Последние имеют явные преимущества в отношении удобства и минимального риска для пациента, кроме того, они менее дорогостоящие, чем тесты с использованием зондов. К сожалению, не существует беззондового теста, который успешно применялся бы как стандартный метод, все они имеют недостаточную чувствительность и специфичность. Почти все эти методы основываются на определении сниженной секреции панкреатических ферментов, однако ввиду низкой чувствительности они результативны лишь при очень значительном уменьшении ферментативной секреции.

Проведение зондовых и беззондовых методов оценки экзокринной функции ПЖ не является обязательным для каждого гастроэнтерологического отделения; в каждом конкретном случае должен быть сделан необходимый выбор. В настоящее время, вероятно, вполне разумно стремление к осуществлению целого ряда визуальных методов исследования вместе с тестом Лунда (см. ниже) и одним неинвазивным беззондовым методом. В таких случаях визуальные исследования должны проводиться первыми с последующим выполнением функциональных тестов у больных с подозреваемым, но не подтвержденным, ХП [5].

5.3.2.1 Зондовые методы

1. Прямой зондовый метод -- секретин-панкреозиминовый (секретин-холецистокининовый) тест

Секретин, как было показано еще в 1902 г., является активной частью экстрактов дуоденальной слизистой оболочки, которые можно вводить внутривенно для индукции экзокринной панкреатической секреции [111]. Его использование в качестве клинического теста было предложено М. Chiray и соавт. в 1926 г. [143]; позднее методика тестирования усовершенствовалась. A.A. Harper и Н.S. Raper [210] идентифицировали фермент, вырабатываемый поджелудочной железой, и показали, что его продукция не влияет на объем желудочного сока. А.С. Ivi и Е. Oldberg [241] выделили холецистокинин (ХК), гормон, вызывающий сокращение желчного пузыря; в последующем было показано [211], что активность ХК обычно сопровождается панкреатической активностью. P.R. Dunkan и соавт. [172] разработали ХК-тест, позволяющий оценить функцию желчного пузыря; той же группой авторов [131] описан секретин-панкреозиминовый тест, предназначенный для оценки функции ПЖ. При тестировании обычно используются секретин и ХК, хотя нужно помнить, что активность очищенных гормональных препаратов может быть различной, поэтому границы нормы должны устанавливаться каждой лабораторией самостоятельно [5].

Больного обследуют натощак (утром). Сидящему немного наклонившись вперед пациенту через рот вводят двухпросветныи рентгеноконтраст-ный зонд до отметки 60 см. Затем в положении полулежа на правом боку с приподнятыми ногами зонд проводят через привратник до отметки 75 см. Рентгеноскопический контроль позволяет удостовериться, что зонд достиг двенадцатиперстной кишки, а его верхний просвет находится в области желудка. В течение всей процедуры исследуемый лежит на кушетке или в кровати, его голова и плечи приподняты. Осуществляется непрерывная аспирация через зонд при отрицательном давлении 25--40 мм рт. ст. Последовательные образцы дуоденального и желудочного содержимого собирают каждые 10 мин. После внутривенного введения секретина в дозе 4 ед/кг получают два контрольных образца, а затем еще три образца. Примерно через 20 мин после начала инъекций секретина вводят холецистокинин в дозе 1,5 ед/кг и затем собирают 10-минутные образцы в течение 30 мин.

Аспираты анализируют, измеряя скорость секреции, концентрацию бикарбонатов и содержание трипсина. Некоторые авторы определяют также амилазу и липазу, однако существует мнение, что достаточно измерения только одного фермента [5]. Мы полагаем, что возможность комплексной оценки панкреатической секреции (протеолитической, амилолитической, липолитической, определение содержания цинка, лактоферрина и других компонентов панкреатического сока) является одним из преимуществ этого теста, часто используемого в научных исследованиях [49].

Использование гастродуоденального зонда, позволяющего разделять желудочное и дуоденальное содержимое, является необходимым условием выполнения теста ввиду необходимости предотвращения поступления желудочного содержимого в двенадцатиперстную кишку, поскольку, как известно, соляная кислота посредством секретинового механизма является стимулятором гидрокинетической функции ПЖ. С учетом того, что оценка результатов исследования основывается на реакции ПЖ на вводимые экзогенные стимуляторы, а объем собственной соляной кислоты, проникающей в двенадцатиперстную кишку, учесть невозможно, результаты исследования при эндогенной ацидификации двенадцатиперстной кишки искажаются и с трудом поддаются оценке. Кроме того, при низких значениях рН в двенадцатиперстной кишке происходит инактивация большинства панкреатических ферментов [19, 274].

Известны гастродуоденальные зонды Лагерлефа, Огрена--Лагерлефа, Богера, Закржевского, Бартельгеймера, Болдырева, Скуй и др. [6, 19, 24, 70, 82]. Зонды Лагерлефа, Огрена--Лагерлефа и Скуй представляют собой две завулканизированные между собой резиновые трубки. Это снижает их гибкость, усложняет проведение в двенадцатиперстную кишку и делает обременительным для больных проглатывание таких зондов. Кроме того, зонд Огрена--Лагерлефа имеет проводник (металлический шарик), который не всегда помогает проведению зонда в двенадцатиперстную кишку, но может искажать результаты исследования [24]. Трехканальный зонд Бартельгеймера снабжен баллончиками, раздувание которых позволяет изолировать двенадцатиперстную кишку от желудка и нижележащих отделов тонкой кишки. Однако наличие баллончиков, в частности в зонде Бартельгеймера, не только утолщает зонд и затрудняет его проглатывание больным, но и изменяет секрецию ПЖ за счет перерастяжения привратника и стенок двенадцатиперстной кишки [20], поскольку в результате механического воздействия на привратник повышается тонус блуждающего нерва, который стимулирует G-клетки. В результате увеличивается высвобождение гастрина, который способствует увеличению продукции соляной кислоты и панкреатических ферментов [275]. Существуют указания, что данный эффект может иметь место также при использовании зондов, имеющих неравномерный диаметр в одноканальном и двухканальном участках (зонды Богера, Огрена--Лагерлефа, Закржевского и др.), поскольку отрезок зонда, в котором узкая часть переходит в широкую, обтурируя привратник, может также искажать результаты исследования [19].

Все вышеперечисленные зонды полностью или частично изготовлены из резины. Этот материал является нестойким, повреждается при стерилизации, воздействии пищеварительных секретов, изменяет свои свойства при длительном хранении. Недостатком зонда Богера является узкий просвет каналов (по 2 мм) и отверстие малого диаметра (0,7--0,8мм) для поступления в зонд желудочного и дуоденального содержимого, которое в процессе зондирования часто обтурируется слизью.

Данных недостатков лишен зонд для изучения внешнесекреторной функции ПЖ, предложенный Н.Б. Губергриц и соавт. [19], изготовленный из медицинского гранулированного пластиката, безвредного для организма и устойчивого к стерилизации. Кроме того, этот зонд имеет другие преимущества: больший просвет каналов, чем в зонде Богера, при одинаковом общем диаметре зонда; меньше общий диаметр, чем в зондах Лагерлефа, Огрена--Лагерлефа, Скуй, Бартельгеймера, Закржевского; использование инертного, износоустойчивого и гибкого материала для изготовления всех участков зонда (кроме оливы); равномерность диаметра зонда на протяжении от переходника до оливы и больший диаметр отверстий для поступления в зонд исследуемого материала.

Ввиду существования вариаций активности препаратов секретина и хо-лецистокинина, а также различий во времени тестирования и дозах, квотирование предельных значений нормы не имеет смысла. Последние должны быть установлены каждой лабораторией самостоятельно.

Как правило, при нормальной функции ПЖ прирост объема секрета по отношению к стандартному тесту составляет 100%, а прирост концентрации бикарбонатов -- 15%. Прирост объема секреции менее 40% и отсутствие прироста концентрации бикарбонатов свидетельствуют в пользу экзокринной панкреатической недостаточности [59].

Тест с секретином и холецистокинином успешно применяется при оценке недостаточности экзокринной функции ПЖ более 40 лет. Выполнение теста требует особенной тщательности и точности; данные могут быть искажены в результате неполного сбора образцов или вследствие загрязнения дуоденального аспирата желудочным соком. Тест Лунда нередко

бывает предпочтительнее секретин-панкреозиминового теста благодаря своей простоте при аналогичной информативности [5], однако сопоставимость результатов этих методов возможна только при тяжелых степенях внешнесекреторной недостаточности ПЖ [16, 205]. Ложноположительные результаты могут быть при целиакии, сахарном диабете, циррозе печени и гепатите, билиарных расстройствах, после резекции желудка [415].

В целом, при выполнении всех необходимых технических условий, диагностическая точность метода чрезвычайно высока; тест показывает высокую корреляцию с морфологическим «золотым стандартом» (ЭРХПГ) в диагностике ХП. Чувствительность и специфичность метода составляют более 90%. Таким образом, большинством исследователей признается роль секретин-панкреозиминового (секретин-холецистокининового) теста в качестве золотого стандарта определения нарушений экзокринной функции ПЖ [5, 49, 200, 269, 326]. P.G. Lankich и A. Andren-Sandderg считают, что проведение прямого зондового метода является обязательным при диагностике ХП [272]. В то же время существуют мнения, что данный диагностический тест по диагностической значимости при ХП значительно уступает УЗИ, КТ, ЭРХПГ [429]. В большей степени данное мнение обусловлено тем, что с помощью секретин-панкреозиминового теста невозможно проводить дифференциальный диагноз с другими заболеваниями ПЖ [157], поскольку при раке ПЖ, муковисцидозе и другой патологии ПЖ регистрируют адекватные результаты этого теста в 75--90% случаев [31, 341].

Для интерпретации результатов зондового исследования используют предложенное Н.А. Скуя [70] выделение патологических типов секреции ПЖ.

1. Гипосекреторный -- снижение продукции ферментов, бикарбонатов при нормальном объеме секрета. Этот тип характерен для диффузного фиброза ПЖ (поздние стадии ХП), муковисцидоза, реже определяется при раке ПЖ.

2. Гиперсекреторный -- нормальные или повышенные объемы секрета и дебит бикарбонатов, увеличение активности ферментов. Этот тип характерен для начальных воспалительных процессов в ПЖ без признаков атрофии ацинарных клеток и выраженного фиброза. Наблюдается в начальных стадиях ХП, при недлительной и незначительной задержке оттока секрета ПЖ (при язвенной болезни ДПК, кратковременном спазме сфинктера Одди и т. д.).

3. Обтурационный тип делят на 2 подтипа:

нижний блок -- снижение объема секрета при нормальной концентрации бикарбонатов и ферментов, что приводит к снижению их дебита. Характерен для панкреатитов, развившихся вследствие процессов, затрудняющих отток секрета ПЖ (стойкий спазм сфинктера Одди, папиллиты, опухоли фатерова сосочка или головки ПЖ, обтурация ГПП конкрементом);

верхний блок -- снижение объема секрета, повышение концентрации ферментов (но их дебит все же снижен), нормальное содержание бикарбонатов. Такой вариант свидетельствует об отеке ПЖ и характерен для отечного панкреатита (ОП, обострение ХП).

4. Дуктулярный -- снижение объема секрета, нормальная продукция ферментов, резкое повышение концентрации бикарбонатов. Возможно, такие изменения связаны с воспалением протоков и нарушением реабсорбции бикарбонатов.

К недостаткам метода можно отнести необходимость дуоденального зондирования, обременительного для пациента, большой объем работы лаборанта, высокую стоимость и малую доступность стимуляторов ПЖ. Так, стоимость секретин-панкреозиминового теста в США составляет 610 долларов, что сопоставимо по стоимости с КТ и МРТ.

Существует мнение, что при проведении стандартного секретин-панкреозиминового теста вводимые стимуляторы ПЖ (секретин, ХК) могут спровоцировать феномен «уклонения» ферментов, что ограничивает применение теста у больных ОП и обострением ХП [163].

2. Непрямой зондовый метод (тест Лунда)

К непрямым зондовым методам относятся методы, при которых используется эндогенная (непрямая) стимуляция ПЖ.

Тест описан в 1962 г. [300] и назван по имени автора. Тест Лунда основан на сборе тонкокишечного содержимого с помощью интубации после приема стандартной пробной пищи. В последующие годы метод Лунда был несколько модифицирован. В основе приведенной ниже методики лежит оригинальное описание, в которое, однако, внесены некоторые изменения.

Больной обследуется натощак утром. Ему вводят рентгеноконтрастный поливиниловый зонд с внутренним диаметром около 2 мм и с прикрепленным к одному концу стальным шариком или ртутным грузом. Зонд имеет ряд собирающих отверстий, расположенных на его отрезке между 90 и 150 см (расстояние от полости носа). По оригинальной методике интубация проводится за один день до тестирования, но в настоящее время это не считают обязательным. Больному дают перорально 10 мг метоклопрамида или домперидона за 10 мин до интубации, что обычно обеспечивает быстрое прохождение зонда до двенадцатиперстной кишки и, кроме того, уменьшает тошноту. Рентгеноскопический контроль позволяет убедиться, что наконечник зонда находится в двенадцатиперстной кишке. Далее, больному дают стандартную пищевую смесь, состоящую из сухого молока и растительного масла. Добавляется также декстроза, и конечный состав содержит 6% жира, 5% белка и 15% углеводов. Такой состав обеспечивается, например, смесью 18 г растительного масла, 15 г казилана, 40 г глюкозы и 300 мл воды.

G. Lundh предлагал тотальный забор дуоденального сока, но сейчас это не считают необходимым, так как измерение концентрации ферментов более целесообразно, чем определение общей ферментативной продукции за данное время [5]. Не является обязательным и измерение рН дуоденального сока, поскольку было установлено [437], что этот показатель не имеет непосредственного диагностического значения.

После приема смеси дуоденальный аспират собирают (сифонирование или слабый отсос) в течение 2 ч. Образцы (4 последовательные 30-минутные пробы) помещают в контейнеры со льдом. При необходимости образцы могут храниться при --18С до проведения анализа ферментов.

По мнению G. Lundh, наиболее информативным показателем является концентрация трипсина; полученные им кривые концентрации трипсина, химотрипсина, липазы и амилазы ПЖ параллельны друг другу. Большинство авторов согласны с этим, хотя в некоторых случаях дополнительно измеряются амилаза и бикарбонаты.

Существует два доступных метода измерения трипсина в тонкокишечной жидкости. Лучшим является метод, предложенный G.W. Shwert и Y. Takenaka [369], которые применили N-бензоиларгининэтиловый эфир в качестве субстрата. При другом методе, предложенном позже Н. S. Wiggins [433], используется определение величины рН. Наиболее важным аспектом измерения трипсина является то, что универсальных границ нормы не существует и каждая лаборатория должна установить собственные фаницы в соответствии с применяемой методикой [5].

Метод, предложенный G.W. Schwert и Y. Takenaka [369] для измерения тонкокишечного трипсина, был модифицирован G. Lundh [299]; ниже приведена именно эта модификация. Данный вариант требует приготовления бензоиларгинина (БА) и N-бензоиларгининэтилового эфира (БАЭЭ), которые, если необходимо, могут быть синтезированы по методу Schwert и Eisenberg [368]. Используются растворы (0,001 М) БА и БАЭЭ на трис-буфере (рН 8,0) с 0,02 М СаС1₂. Спектрофотометр настраивается таким образом, что он дает поглощение «ноль» при 2 мл БАЭЭ и 1 мл буфера.

Определение проводится при длине волны 253 нм и ширине щели 1,5 мм с помощью стандартного спектрофотометра и 1 см кварцевых ячеек. Сначала определяется разница в поглощении БА и БАЭЭ (2 мл раствора и 1 мл буфера в каждой кювете), которая должна составлять 0,5 -- 0,6 в переходном режиме. Затем заполняются две кюветы: одна -- с 2 мл раствора БА и некоторым количеством пробного раствора для проведения анализа, вторая с 2 мл БАЭЭ и таким же количеством пробного раствора. Объем в обеих кюветах доводится буфером до 3 мл. Для кюветы с БАЭЭ в световом луче время увеличения поглощения определяется в пределах от 0,2 до 0,3 (по шкале). Если пробный раствор является светопоглощающим, то при измерении скорости гидролиза делается соответствующее допущение. Например, если разница между кюветой со стандартом БА и кюветой с пробой БА составляет 0,2 в переходном режиме, время, необходимое для увеличения поглощения в кювете с пробой БАЭЭ, определяется в пределах от 0,4 до 0,5 [5]. Температура окружающего воздуха должна быть (насколько это возможно) одинаковой при всех измерениях. Если приготавливается стандартный раствор трипсина, поглощение измеряется при 280 нм и, соответственно, рассчитываются концентрации для построения стандартной кривой. С помощью этой кривой определяется ферментативная активность, выражаемая в мкг/мл.

Альтернативным и широко используемым методом оценки трипсина в тонкокишечной жидкости является метод Н. S. Wiggins [433]. Он основывается на определении скорости высвобождения ионов водорода из специфического субстрата БАЭЭ.

БАЭЭ (0,5 г) растворяют в 100 мл 1:10 разведенного 1% раствора барбитурата натрия. Процедуры проводятся при 25°С и рН 9 (если необходимо, рН верифицируется непосредственно перед использованием). Тонкокишечную жидкость (1 мл) смешивают с 9 мл 0,05 М ацетатного буфера и нагревают до 25С. Разведенную тонкокишечную жидкость (1 мл) затем смешивают с 5 мл раствора БАЭЭ в реактивном сосуде (приблизительно 8 х 2,5 см) и помещают на магнитную мешалку; электроды рН-метра погружают в этот сосуд.

Начальная величина рН, составляющая около 8,5, постепенно снижается. При ее снижении до 8,0 реакция останавливается и добавляется 0,1 мл 0,04 N. NaOH, что вызывает повышение рН до 8,4; это повторяется, когда рН вновь падает до 8. Определяется время, в течение которого высвобождается 4 мЭкв ионов водорода. Для образцов с нормальной трипсиновой активностью оно составляет менее 4 мин. Если оно превышает 10 мин, процедуру повторяют с разведением тонкокишечной жидкости 1:5. Если время вновь превысит 10 мин, результат регистрируется как значение менее 2 мЭкв/мл в минуту.