Антибиотики. Фармацевтический анализ. Фармакологическая характеристика. Микробиологическая оценка

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Майкопский государственный технологический университет»

Фармацевтический факультет

Кафедра фармации

Курсовая работа

по фармацевтической химии

Тема: ”Антибиотики. Фармацевтический анализ. Фармакологическая характеристика. Микробиологическая оценка”

Выполнила: студентка 4 курса очной формы обучения группы Ф-41

Малеева Валентина Эдуардовна

Майкоп, 2012

Содержание

Введение

1. История открытия антибиотиков

2. Влияние антибиотиков на бактерии

3. Классификация антибиотиков

4. Требования, предъявляемые к антибиотикам

5. Общая характеристика методов качественного и количественного анализа антибиотиков

6. Микробиологическое исследования антибиотиков

7. Устойчивость к антибиотикам

8. Побочные реакции при приеме антибиотиков

9. Особенности получения антибиотиков

9.1 Производство пенициллина

10. Фармакологическая характеристика различных групп антибиотиков

10.1 Фармакологическая характеристика группы пенициллина

10.2 Фармакологическая характеристика группы цефалоспоринов

10.3 Фармакологическая характеристика группы карбапенемов

10.4 Фармакологическая характеристика группы монобактамов

10.5 Фармакологическая характеристика группы макролидов

10.6 Фармакологическая характеристика группы линкосамидов

10.7 Фармакологическая характеристика группы тетрациклинов

10.8 Фармакологическая характеристика группы левомицетина

10.9 Фармакологическая характеристика группы аминогликозидов

11. Фармацевтический анализ некоторых групп антибиотиков

11.1 Фармацевтический анализ группы пенициллинов

11.2 Фармацевтический анализ группы цефалоспоринов

11.3 Фармацевтический анализ группы макролиды и азолиды

11.4 Фармацевтический анализ группы тетрациклинов

11.5 Фармацевтический анализ антибиотиков производных нитрофенилалкиламинов

11.6 Фармацевтический анализ группы стрептомицины

11.7 Фармацевтический анализ группы аминогликозидов

Введение

Антибиотики занимают особое место в современной медицине. Они являются объектом изучения различных биологических и химических дисциплин. Наука об антибиотиках развивается бурно. Если это развитие началось с микробиологии, то теперь проблему изучают не только микробиологи, но и фармакологи, биохимики, химики, радиобиологи, врачи всех специальностей.

Антибиотики представляют собой самую многочисленную группу лекарственных средств. Они используются для предотвращения и лечения воспалительных процессов, вызванных бактериальной микрофлорой. Сфера антибиотиков - это быстро прогрессирующие инфекции или бактериальное заражение жизненно важных органов, с которыми иммунная система не может справиться сама. Антибиотики незаменимы при остром развитии болезни - ангины и пневмонии, а также при инфекционном воспалении, которое локализуется в закрытых полостях (отит, гайморит, остеомиелит, абсцесс, флегмона).

За последние 35 лет открыто около ста антибиотиков с различным спектром действия, однако, в клинике применяется ограниченное число препаратов. Это объясняется главным образом тем, что большинство антибиотиков не удовлетворяют требованиям практической медицины.

Изучение строения антибиотиков позволило подойти к раскрытию механизма их действия, особенно благодаря огромным успехам в области молекулярной биологии. Расширение знаний о структуре и синтезе клеточных оболочек, о роли нуклеиновых кислот, позволило выяснить точки приложения действия антибиотиков в бактериальной клетки.

В настоящее время ведутся активные работы по изысканию антибиотиков нового поколения, эффективных при лечении вирусных и раковых заболеваний.

1. История открытия антибиотиков

Учение об антибиотиках - молодая синтетическая ветвь современного естествознания. Впервые в 1940 году был получен в кристаллическом виде химиотерапевтический препарат микробного происхождения - пенициллин - антибиотик, открывший летоисчисление эры антибиотиков.

Многие учёные мечтали о создании таких препаратов, которые можно было бы использовать при лечении различных заболеваний человека, о препаратах, способных убивать патогенных бактерий, не оказывая вредного действия на организм больного.

Пауль Эрлих (1854-1915) в результате многочисленных опытов синтезировал в 1912 году мышьяковистый препарат - сальварсан, убивающий in vitro возбудителя сифилиса. В 30-х годах прошлого столетия в результате химического синтеза были получены новые органические соединения - сульфамиды, среди которых красный стрептоцид был первым эффективным препаратом, оказавшим терапевтическое действие при тяжёлых стрептококковых инфекциях.

В 1937 году в нашей стране был синтезирован сульфидин - соединение, близкое к пронтозилу. Открытие сульфамидных препаратов и применение их в медицинской практике составило известную эпоху в химиотерапии многих инфекционных заболеваний, в том числе сепсиса, менингита, пневмонии, рожистого воспаления, гонореи и некоторых других.

Луи Пастер и С. Джеберт в 1877 году сообщили, что аэробные бактерии подавляют рост Bacillus anthracis.

В конце XIX века В.А. Манассеин (1841-1901) и А.Г. Полотебнов (1838-1908) показали, что грибы из рода Penicillium способны задерживать в условиях in vivo развитие возбудителей ряда кожных заболеваний человека.

И.И. Мечников (1845 - 1916) ещё в 1894 году обратил внимание на возможность использования некоторых сапрофитных бактерий в борьбе с патогенными микроорганизмами.

В 1896 году Р. Гозио из культурной жидкости Penicillium brevicompactum выделил кристаллическое соединение - микофеноловую кислоту, подавляющее рост бактерий сибирской язвы.

Эммирих и Лоу в 1899 году сообщили об антибиотическом веществе, образуемом Pseudomonas pyocyanea, они назвали его пиоцианазой; препарат использовался в качестве лечебного фактора как местный антисептик.

В 1910-1913 годах O. Black и U. Alsberg выделили из гриба рода Penicillium пеницилловую кислоту, обладающую антимикробными свойствами.

В 1929 году А. Флемингом был открыт новый препарат пенициллин, который только в 1940 году удалось выделить в кристаллическом виде.

С получением пенициллина как препарата (1940 год) возникло новое направление в науке - учение об антибиотиках, которое необычайно быстро развивается в последние десятилетия.

В 70-х годах ежегодно описывалось более 300 новых антибиотиков. В 1937 году Вельш описал первый антибиотик стрептомицетного происхождения актимицетин, в 1939 году Красильниковым и Кореняко был получен мицетин и Дюбо - тиротрицин. Впоследующем число антибиотиков росло очень быстрыми темпами.

2. Влияние антибиотиков на бактерии

Большинство бактерий состоит из одной клетки; каждая имеет защитную оболочку (рис.1.). Их классифицируют и распознают по свойствам их клеточных оболочек. Это обычно проявляется при помощи метода окраски, разработанного Х. Грамом в 1884г. Грамположительные бактерии легко окрашиваются первым красителем, а грамотрицательные - не окрашиваются.

Бактерии также можно классифицировать по их форме. Кокки - круглые, бациллы имеют форму палочек, а спирохеты - спирали. Если кокки выстроены в прямую линию, их называют стрептококками; если они в виде грозди, тогда их называют стафилококками. Диплококки встречаются парами.

По другой классификации бактерии делятся на тех, которым требуется свободный кислород в воздухе - аэробов, и которым он не требуется - анаэробов.

Рис.1. Основные механизмы действия ряда антибиотиков на бактериальную клетку.

У анаэробных и аэробных бактерий во многих инфекциях общая роль. Как анаэробы, так и аэробы могут быть и грамположительными, и грамотрицательными. Анаэробные бактерии особенно часто встречаются в голове и шее, верхних дыхательных путях, нижнем отделе желудочно-кишечного тракта, половых органах и иногда - в коже и мягких тканях. Их роль в инфекциях не всегда признается, частично по причине сложностей с подтверждением диагноза, так как необходимо собрать и перевезти образцы в "безвоздушном" контейнере, чтобы не допустить загрязнения аэробными бактериями. Несколько антибиотиков очень "широкого спектра", введенных в практику в последние годы, весьма малоактивны в отношении анаэробных патогенных микроорганизмов; это важно учитывать, когда такие средства предлагаются в качестве монотерапии при смешанных инфекциях.

Некоторые бактерии, особенно те, которые живут в кишечнике человека, играют существенную роль в его жизни. Например, некоторые из них синтезируют витамины. Неразборчивое использование антибиотиков широкого спектра действия может уничтожить эти полезные бактерии.

При назначении антибактериальных препаратов происходит подавление роста не только патогенных микроорганизмов, но и нормальной микрофлоры кишечника. В результате размножаются сапрофитные микробы, приобретая патогенные свойства и высокую устойчивость к лекарственным препаратам. К ним относятся стафилококки, протей, дрожжевые грибки, энтерококки, синегнойная палочка, клебсиелла.



Рис.2. Основные возбудители заболеваний и антибиотики воздействующие на них.

3. Классификация антибиотиков

Для классификации антибиотиков используют различные принципы.

В зависимости от источников получения антибиотики подразделяют на две группы:

* природны биосинтетические, продуцируемые микроорганизмами и низшими грибами;

* полусинтетические, получаемые в результате модификации структуры природных антибиотиков.

По химическому строению выделяют следующие группы антибиотиков:

* в-лактамные антибиотики: пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, монобактамы;

* макролиды и близкие к ним антибиотики;

* аминогликозиды;

* тетрациклины;

* полимиксины;

* полиены (противогрибковые антибиотики);

* препараты хлорамфеникола левомицетина;

* гликопептидные антибиотики;

* антибиотики разных химических групп.

По характеру действия антибиотиков может быть:

бактерицидным, под которым понимают полное разрушение клетки инфекционного агента, и бактериостатическим, которое проявляется прекращением роста и деления его клеток.

Бактерицидный или бактериостатический характер влияния антибиотиков на микрофлору во многом определяется особенностями механизма их действия. Установлено, что противомикробное действие антибиотиков развивается, в основном, как следствие нарушения:

* синтеза клеточной стенки микроорганизмов;

* проницаемости цитоплазматической мембраны микробной клетки;

* внутриклеточного синтеза белка в микробной клетке;

* синтеза РНК в микроорганизмах.

При сопоставлении характера и механизма действия антибиотиков (табл.3.) видно, что бактерицидный эффект дают преимущественно те антибиотики, которые нарушают синтез клеточной стенки, изменяют проницаемость цитоплазматической мембраны или нарушают синтез РНК в микроорганизмах. Бактериостатическое действие характерно для антибиотиков, нарушающих внутриклеточный синтез белка.

Механизм действия	Антибиотики	Преимущественный характер антимикроб- ного действия
Нарушение синтеза клеточной стенки	в-Лактамные антибиотики	Бактерицидный
	Гликопептидные антибиотики	Бактерицидный
	Циклосерин	Бактерицидный
	Бацитрацин	Бактерицидный
Нарушение проницаемости цитоплазматической мембраны	Полимиксины	Бактерицидный
	Полиеновые антибиотики	Бактерицидный
Нарушение внутриклеточного синтеза белка	Макролиды	Бактериостатический
	Тетрациклины	Бактериостатический
	Линкозамиды	Бактериостатический
	Хлорамфеникол	Бактериостатический
	Аминогликозиды	Бактерицидный
Нарушение синтеза РНК	Рифампицин	Бактерицидный

Табл.3. Механизм и характер антимикробного действия антибиотиков.

По спектру антимикробного действия антибиотики можно условно разделить на

Препараты широкого спектра действующие на грамположительную и грамотрицательную микрофлору: тетрациклины, хлорамфеникол, аминогликозиды, цефалоспорины, полусинтетические пенициллины и препараты сравнительно узкого спектра действия. ЛВ второй группы в свою очередь подразделяют на антибиотики, действующие преимущественно на грамположительную микрофлору биосинтетические пенициллины, макролиды, и антибиотики, влияющие преимущественно на грамотрицательную микрофлору полимиксины. Кроме того, различают противогрибковые и противоопухолевые антибиотики

По клиническому применению выделяют основные антибиотики, с которых начинают лечение до определения чувствительности к ним микроорганизмов, вызвавших заболевание, и резервные, которые применяют при устойчивости микроорганизмов к основным антибиотикам или при непереносимости последних.

антибиотик пенициллин фармацевтический

4. Требование, предъявляемые к антибиотикам

Для того чтобы быть хорошим лечебным средством, каждый антибиотик должен обладать несколькими основными свойствами.

1. Антибиотик должен при низкой концентрации не выше 10-50 мкг/мл убивать болезненные микроорганизмы или, по крайней мере, останавливать их размножение. Иными словами, препарат должен обладать в очень низкой концентрации бактерицидными или хотя бы бактериостатическим действием.

2. Активность антибиотика против болезнетворных микроорганизмов не должна сколько-нибудь существенно снижаться под действием жидкостей тела, как, например, сыворотка крови, лимфа, гной

3. Воздействие на микроорганизмы должно быть быстрым. Болезнетворные микроорганизмы не должны приобретать устойчивость против антибиотика быстрее, чем антибиотик подавит их размножение.

4. Антибиотик не должен ни в коей мере вредить макроорганизму. Он не должен обладать токсичностью ни непосредственно после введения разовой дозы, ни хронически, т.е. после многократного введения в течение нескольких дней. Он не должен также наносить вред тканям макроорганизма при непосредственном контакте с препаратом, например при парентеральном введении.

5. Антибиотик не должен существенно снижать иммунологические реакции, в частности, нарушать образование антигенов, вырабатываемых организмом против болезнетворных микробов. Равным образом препарат не должен нарушать фагоцитоз.

6. Антибиотик не должен препятствовать процессу выздоровления.

Указанными свойствами различные антибиотики обладают лишь до известной степени. Из всех применяемых антибиотиков наиболее полно указанным выше требованиям удовлетворяет пенициллин.

5. Общая характеристика методов качественного и количественного анализа антибиотиков

Качественное определение.

Задача качественно анализа определить неизвестный антибиотик встаёт как при изучении новых антибиотиков, так и в практике, если нужно показать присутствие антибиотика в фармацевтических препаратах. Обе задачи требуют совершенно различных методов. Самым надёжным методом идентификации антибиотика является определение его инфракрасного спектра. Результаты здесь абсолютно однозначны. Только после измерения инфракрасного спектра можно с полной уверенностью судить об отличии или идентичности двух антибиотиков различного происхождения. Поскольку инфракрасным спектрофотометром оснащена не каждая лаборатория, то для идентификации антибиотиков были разработаны системы простых химических реакций, довольно надёжных для идентификации известных антибиотиков.

Для быстрого качественного определения антибиотиков в фармацевтических препаратах очень удобна осциллографическая полярография. При хорошо подготовленной аппаратуре можно за несколько минут идентифицировать большинство применяемых антибиотиков. Практически наиболее важным являются разграничение тетрациклиновых антибиотиков от хлорамфеникола, а также проверка состояния и чистоты пенициллиновых препаратов, причём важно быстро установить, до какой степени препарат разложился.

Другим быстрым физическим методом идентификации антибиотиков является определение показателя преломления твёрдого вещества. В табл. 4. приведены величины показателей преломления для обычно применяемых антибиотиков в твёрдом состоянии.



Антибиотик
Пенициллин-калиевая соль Прокаинпенициллин Стрептомицин-сульфат Стрептомицин-хлоргидрат Хлортетрациклин-хлоргидрат Окситетрациклин-хлоргидрат Бацитрацин Полимиксин В (сульфат) Эритромицин	1,57?1,58 1,57?1,58 1,55 1,56 1,66?1,67 1,55?1,56 1,54?1,55 1,53 1,45?1,47

Табл.4. Индексы преломления некоторых антибиотиков в твёрдом состоянии, определённые методом погружения.

Практическую ценность представляет разница между показателем преломления хлортетрациклина и окситетрациклина, на основе которой можно эти два антибиотика различить. Очень специфическими являются микробиологические методы идентификации антибиотиков. Для этого применяются штаммы, специфически резистентные к данному антибиотику, или же так называемые зависимые штаммы, т.е. такие, рост которых обусловлен присутствием определяемого антибиотика. Этот метод особенно надёжен, однако изыскание или выведение таких штаммов является обычно очень трудоёмким делом.

Многие антибиотики, как, например, пенициллин, стрептомицин, эритромицин, бацитрацин, неомицин, полимиксин и т. д., не являются химически индивидуальными веществами, а представляют собой смесь нескольких структурно сходных веществ. Бумажная хроматография и электрофорез на бумаге позволяют выделить эти составные части и отделить их количественно.

Для изучения антибиотиков можно применять нисходящую, восходящую и горизонтальную хроматографию. Выбор системы растворителей зависит от химической природы антибиотика.

Зоны отдельных антибиотиков выявляются на хроматограммах или электрофотограммах чаще всего биоавтографически, т. е. методом, подобным определению антимикробной активности антибиотиков чашечным методом. Хроматограмму на узкой полоске фильтровальной бумаги после её высушивания кладут на лоток с твёрдой агаровой средой, засеянной суспензией тест-микроба. Лоток помещают на несколько часов в термостат при 37?. В ходе инкубации микроб, посеянный на агар, вырастает, так что агар мутнеет и становится молочно-белым. Он не растёт, однако, вокруг тех мест полосок фильтровальной бумаги, где находятся антибиотически активные вещества. В этих местах остаются чистые прозрачные округлые зоны, которые с первого же взгляда указывают на расположение антибиотически активных составных частей первоначальной смеси. Измеряя диаметр прозрачной зоны, можно установить и количество соответствующей составной части путём сравнения этого диаметра с диаметром зоны стандарта, хроматографируемого одновременно с анализируемыми образцами.

Этот метод применяют для обнаружения антибиотиков и витаминов с той лишь разницей, что витамины выявляются положительно, т. е. микроб растёт лишь в местах, где имеется витамин. Главным достоинством биоавтографии является её чувствительность, которая значительно превосходит чувствительность всех цветных реакций. В этом с нею сравним лишь метод флюоресценции. Это, однако, не говорит о том, что при хроматографировании антибиотиков для их обнаружения не применяют цветные реакции с помощью химических веществ. Этот способ применяют тогда, когда хотят определить составную часть антибиотика, химически подобную ему, но биологически неактивную.

Если же образец, помимо антибиотика, содержит ещё большое количество солей или иных примесей, то бумажная хроматография может и не дать хороших результатов. В этих случаях можно прибегнуть к электрофорезу на бумаге или же сочетать электрофорез с хроматографие.

Бумажная хроматография и электрофорез незаменимы при контроле процесса получения антибиотиков путём ферментации. Их главным достоинством является то, что они одинаково хорошо пригодны как для неочищенных растворов, так и для очищенных веществ. Это обусловлено прежде всего специфичностью биоавтографического метода. Ещё большее значение, нежели для технологии, имеет бумажная хроматография для изыскания и изучения новых антибиотиков.

Количественное определение.

В процессе производства требуется определить содержание антибиотика в культуральной жидкости в ходе ферментации, во всех промежуточных продуктах при выделении и очистке и, наконец, в готовом препарате. Для этого применяют большое количество самых разнообразных биологических и химических методов

Химические методы.

Химические методы используются для анализа антибиотиков очень редко. Практически это будет лишь несколько методов, применяемых для пенициллина. Они основаны на поглощении йода продуктами гидролиза пенициллина. Эти методы в различных модификациях применяются в практике при контроле ферментации и экстракции пенициллина. При более старом способе с применением щелочного гидролиза необходимо было экстрагировать пенициллин из культуральной жидкости амилацетатом при рН=2,0 и температуре 0?, затем из амилацетата экстрагировать его фосфатным буфером при рН=7,8 и только с этим экстрактом производить непосредственное йодометрическое определение. Более новый метод, про котором пенициллин разрушается кислотой, позволяет проводить работу прямо с культуральной жидкостью без экстракций.

Пенициллин можно определять также ацидометрически после его расщепления до пенициллоиновой кислоты, при этом из в-лактамного кольца пенициллина освобождается одна свободная карбоксильная группа, которую можно титровать; в-лактамное кольцо пенициллина можно расщепить либо щёлочью, либо пенициллиназой. Этот метод, однако, нельзя применять для нативного раствора, который содержит множество посторонних веществ, делающих точное ацидометрическое титрование невозможным.

Оптические методы. Колориметрия и спектрофотометрия в видимом свете.

Сюда относятся наиболее часто применяемые методы количественного определения антибиотиков. Основным достоинством колориметрических методов определения являются их простота, скорость и сравнительно высокая точность, недостатком ? их малая специфичность.

Для колориметрического определения антибиотики превращают в окрашенные производные. При этом используют цветные реакции либо с самими антибиотиками, либо с продуктами их расщепления. Например, тетрациклиновые антибиотики образуют окрашенные комплексы с хлорным железом в кислой среде. Стрептомицин расщепляют едким натром до мальтола, который даёт цветную реакцию с хлорным железом или с реактивом Фелинга. Антибиотики группы фенола или ароматических аминов со свободным орто- или пара-положением можно обычно перевести в азокрасителе путём реакции с диазониевыми солями. Так можно определять, например, тетрациклиновые антибиотики.

Некоторые антибиотики можно перевести в соединения с каким-либо красителем, затем выделить эти вещества из реакционной смеси и определить колориметрически. Так можно определять пенициллин с помощью N-(1-нафтил-4-азобензол)-этилендиамина.

Спектрофотометрия в ультрафиолетовом свете

Спектральный анализ имеет большие возможности, нежели колориметрия. Большинству антибиотиков свойствен характерный спектр поглощения в ультрафиолетовой области, и поэтому определять их спектрофотометрически можно непосредственно. Недостатком является то, что присутствие посторонних веществ мешает определению в значительно большей мере, нежели при колориметрии или спектрофотометрии в видимом свете, и поэтому определять антибиотики этим методом можно лишь в отдельно чистых образцах.

Можно повысить специфичность метода и сделать его применимым к менее чистым препаратам путём измерения экстинкции при двух различных длинах волн, из которых одна находится на максимуме, а другая ? при соседнем минимуме кривой экстинкции антибиотика. Этим путём зачастую удаётся установить влияние среды. Важно, чтобы все измерения проводились при строго определённом рН, поскольку спектр поглощения антибиотика в ультрафиолетовом свете очень сильно зависит от рН среды.

Инфракрасная спектроскопия.

Этот метод является специфичным для качественного определения антибиотика. Его можно, однако, очень хорошо использовать и для количественного определения. Обычно достигается точность, равная точности спектрофотометрии в ультрафиолетовом свете, а в некоторых случаях даже ещё более высокая (±1%). Можно производить количественный анализ как растворов, так и твёрдых веществ. При анализе веществ в растворах необходимо выбрать подходящий растворитель, который сам бы не поглощал инфракрасные лучи в данной области. Обычно это бывает сероуглерод или же галоидопроизводные углеводородов. Поэтому антибиотик нужно иметь в такой форме, чтобы его можно было в этих веществах растворить. Если же подходящий растворитель найти не удаётся, можно провести спектрофотометрическое определение вещества в твёрдом состоянии. Твёрдые вещества либо таблетируют с бромистым натрием. Либо суспендируют в масле: измерение поглощения производят в тонких слоях этой суспензии.

Для количественного определения необходимо знать плотность слоёв этой суспензии. Её определяют путём добавления известного количества кристаллического вещества, например б-аланина, к суспензии антибиотика и измерения экстинкции при одном из максимумов поглощения добавленного вещества.

Флюорометрия.

Это один из наиболее чувствительных методов определения антибиотиков, приближающийся по своей чувствительности к биологическим методам. Главной областью его применения являются тетрациклиновые антибиотики, которые сами по себе флюоресцируют жёлтым светом в умеренной щелочной среде; однако обычно измеряется синяя флюоресценция их продуктов разложения в щелочной среде. Хлортетрациклин инактивируют щелочами, например 0,2 М тринатрийфосфатом, оставив смесь стоять в течение 30 минут при комнатной температуре, в то время как тетрациклин кипятят при этом в течение более продолжительного времени.

Антибиотики, которые сами по себе не флюоресцируют и не образуют флюоресцирующих продуктов разложения, можно тем не мене определять флюорометрически путём соединения с подходящим флюоресцирующим веществом и выделения подходящего дополнительного соединения.

Оптическое вращение.

Поляриметрические методы дают очень надёжные результаты применительно к концентратам оптически активных антибиотиков, если только они не слишком сильно окрашены. Вследствие удобства работы они получили очень широкое применение как обычные методы контроля, в особенности при выделении стрептомицина. Для определения антибиотиков в культуральной жидкости они непригодны, поскольку в этих случаях они малочувствительны.

Сконструирован автоматический регистрирующий поляриметр, при помощи которого изучена кинетика разрушения пенициллина кислотами.

Электрохимические методы.

Антибиотики, являющиеся кислота или основаниями, можно титровать потенциометрически. Эти методы применяют сравнительно редко, поскольку с такими антибиотиками редко приходится иметь дело в этих формах. Исключение составляет, например, пенициллин.

Хлоргидраты тетрациклиновых антибиотиков имеют сильно кислотные свойства, напротив, основность этих антибиотиков очень слаба. Поэтому хлоргидраты можно титровать непосредственно алкалиметрически. После подтитровки хлоргидрата достижения степени диссоциации свободной амфотерной формы антибиотика на кривой потенциометрического титрования можно ясно видеть резкое изменение потенциала.

Намного большую точность и значительно более широкие возможности имеет потенциометрическое титрование в неводных растворителях. Так, например, слабоосновные антибиотики, как тетрациклины, а также эритромицин и карбомицин, можно определять с помощью титрованного раствора хлористой кислоты в диоксане. Напротив, антибиотики с кислотными свойствами, пусть даже и очень слабыми, удаётся титровать в среде безводных оснований, например, в триэтаноламине.

Эти методы выгодны тем, что они являются универсальными для целой группы антибиотиков. Конечно, они могут применяться исключительно лишь для чистых веществ и готовых препаратов.

Полярография.

Антибиотики, содержащие в своей молекуле восстанавливающиеся группы например, нитрогруппы, кетогруппы, примыкающие к одной или более двойной связи, альдегидные группы, карбоксильные группы, примыкающие к двойным связям либо имеющие хиноподобную структуру, могут быть восстановлены на ртутном капельном электроде и могут поэтому определяться полярографически. Сюда относятся прежде всего хлорамникол, далее ? все тетрациклиновые антибиотики, стрептомицин, все хиноновые антибиотики, цитринин.

Другие антибиотики, напротив, окисляются на ртутном капельном электроде и могут поэтому давать анодную волну, которая также может служить для их количественного определения. Примером является гентизиловый спирт, производное гидрохинона.

Антибиотики, которые сами по себе полярографически неактивны, можно перевести несколькими способами в полярографически активные вещества. Так, например, пенициллин гидролизуется сначала щёлочью или пенициллиназой и далее в кислой среде ? до диметилцистеина. Эта аминокислота, содержащая группу ? SH, даёт хорошо измеряемую волну в кобальтовом растворе Брдички.

Очень ценна с аналитической точки зрения полярография хлорамникола. Этот антибиотик можно количественно определять полярографическим методом в биологическом материале, как-то: в крови и моче человека, в кутьтуральной жидкости.

Следующей областью применения полярографии являются тетрациклиновые антибиотики. Их можно определять количественно в готовых продуктах и в фармацестических препаратах. При соответствующем выборе среды можно определять количественно соотношение хлортетрациклина и окситетрациклина. Однако количественный анализ смеси хлортетрациклин и окситетрациклина лучше всего удаётся колориметрическим методом. В культуральной жидкости тетрациклиновые антибиотики определить нельзя, поскольку в этом случае определению мешает выделение водорода, катализируемое белками и другими веществами, присутствующими в фильтрате культуральной жидкости.

Амперметрическое (полярометрическое) титрование.

Каждый антибиотик, который осаждается полярографически активными веществами, можно титровать амперметрически. Определение это является более точным, однако значительно менен специфичным, чем обычная непосредственная полярография. Эти методы до настоящего времени применялись очень мало.

Кондуктометрия.

Для прямого определения активности антибиотических препаратов можно использовать кондуктометрическое титрование. Этот метод до сего времени применялся очень мало, хотя несомненно, что на его основе возможно со временем обогатить анализ антибиотиков несколькими точными микроопределениями. Чаще кондуктометрия используется для определения зольности готовых антибиотических препаратов либо для контроля десорбции антибиотиков из ионообменных колонок особенно стрептомицина.

Радиоактивные изотопы в анализе антибиотиков.

В области антибиотиков сфера применении радиоактивных и тяжёлых изотопов необычайно широка. Меченые препараты можно одинаково широко применять как для аналитического контроля производства, так и для решения основных проблем действия антибиотиков на микроорганизм и макроорганизм, для объяснения механизмов всасывания, циркуляции, накопления и выделения антибиотиков в теле. В области фармакологии и биохимии антибиотиков с помощью изотопов были достигнуты ценные результаты.

Приготовление антибиотика, меченного изотопом, производится в процессе биосинтеза путём, в общем сходным с получением обычного антибиотика. Возможность специфической метки (локализации изотопа в одном определённом, заранее известном месте молекулы антибиотика) имеется лишь тогда, когда точно известен предшественник антибиотика и когда этот предшественник можно специфически пометить. Такая возможность имеется у бензилпенициллина, предшественник которого ? фенилуксусная кислота с каким-либо изотопом углерода в карбоксильной группе ? легко доступен. Если теперь при ферментации мы введём в качестве предшественника меченную таким образом фенилуксусную кислоту, то мы получим специфически меченный пенициллин.

Определение антибиотиков при помощи препаратов, меченных изотопами, проводят обычно методом разбавления изотопов. Этот способ применим для анализа образца любой химической природы, если только из него можно получить хотя бы небольшое количество чистого антибиотика. Например, к культуральной жидкости прибавляют заранее известное количество чистого меченого антибиотика с известной удельной радиоактивностью. При этом меченый препарат в определённой степени разбавляют антибиотиком, содержащимся в образце. Затем из жидкости выделяют антибиотик и несколько раз перекристаллизовывают до постоянно удельной радиоактивности. Поскольку изотопы нельзя определить простыми физическими методами, степень разбавления меченого препарата, содержащегося и в выделенном антибиотике, а также его удельная радиоактивность будут обратно пропорциональны содержанию антибиотика в культуральной жидкости.

6. Микробиологическое исследования антибиотиков

Количество антибиотиков выражают в так называемых единицах действия (ЕД). Определение единицы не одинаково для всех антибиотиков. У антибиотиков, которые были выделены в чистом виде, единица определяется как микрограмм чистого вещества. К сожалению, здесь нет единства, так как у некоторых антибиотиков за единицу принимается микрограмм соли например, хлортетрациклин солянокислый, а у других ? микрограмм основания например, у стрептомицина.

Активность антибиотических препаратов в твёрдом состоянии выражается количеством единиц в 1 мг вещества. Содержание антибиотика в культуральной жидкости, в концентратах и растворах выражается числом единиц в 1 мл жидкости.

Количественное определение антибиотиков можно проводить как химическими, так и микробиологическими методами. Главными преимуществами химических методов являются их быстрота и сравнительно высокая точность. Преимуществом же микробиологических методов является их намного большая специфичность: посторонние примеси, содержащиеся в испытуемых образцах, не влияют в такой степени на результаты, как это бывает при химических методах.

Микробиологически можно определить и содержание таких антибиотиков, химические и физико-химические свойства которых ещё подробно неизвестны.

Основным принципом микробиологических методов количественного определения активности антибиотика является определение степени задержки роста микроба, чувствительного к данному антибиотику. Культуры или микробы, используемые для этой цели, называются тест-культурами, или тест-микробами. Задержка роста, вызванная определённым количеством используемого материала с неизвестным содержанием антибиотика например, культуральной жидкости, промежуточного продукта на стадии выделения лекарственно формы препарата и т. п., сравнивается с задержкой роста тест-культуры, вызванной определённым, известным количеством данного антибиотика стандартом.

Микробиологические методы определения активности антибиотиков можно в основном разделить на методы, при которых воздействие на тест-культуру исследуется на жидкой среде, и методы, при которых воздействие антибиотика на тест-культуру оценивается с применением твёрдой питательной среды. К первой группе относятся методы серийных разведений и турбидиметрические методы; ко второй группе ? методы диффузии в агар на чашках и методы диффузии в агар в капиллярах или пробирках. Основными требованиями, которые необходимо предъявлять к микробиологическим методам количественного определения антибиотиков, являются следующие.

1. Точность.

2. Чувствительность.

3. Простота техники эксперимента.

4. Наиболее короткое время инкубации.

Более или менее совершенное выполнение всех этих требований зависит прежде всего от применяемого метода. Для достижения максимальной чувствительности, кроме того, немалую роль играет культура, используемая для определения. Важным критерием метода является также хорошая воспроизводимость результатов в условиях различных лабораторий.

Методы разведений.

Принципом методов разведений является определение количества антибиотика, которое полностью подавляет рост тест-культуры. При этом раствор анализируемого образца с неизвестным содержанием антибиотика и раствор стандарта с известным содержанием антибиотика разводят в геометрической прогрессии питательной средой, предварительно засеянной тест-культурой. По истечении необходимого времени инкубации определяют максимальное разведение образца и стандарта, которое ещё подавляет рост тест-культуры. Путём сравнения этих разведений вычисляют активность исследуемого образца. Вследствие того что оценку проводят по качественному признаку ("растёт"-"не растёт"), этот метод не удовлетворяет первому из перечисленных выше требований. Вместе с тем главным преимуществом методов разведений является их высокая чувствительность, возможность определять очень малые количества антибиотиков, а в некоторых случаях - и короткое время (около 3 часов), необходимое для получения результатов.

При определении содержания антибиотиков в жидкостях тела методом серийных разведений можно использовать индикаторы, реагирующие на изменение рН или окислительно-восстановительного потенциала в процессе роста тест-микроба, например бромкрезоловый красный, метиленовый синий, тимоловый синий, водный синий или феноловый красный и др.

Турбидиметрические методы.

Турбидиметрические методы, как и методы разведений, обычно удовлетворяют требованиям, указанным в пп. 2-4, но при этом их точность по сравнению с методами разведений значительно выше ввиду возможности непрерывного проведения количественных измерений.

Принципом, на котором основаны эти методы, является измерение задержки роста тест-организма, проявляющейся в большем или меньшем помутнении питательной среды. Для измерения помутнения используют фотоэлектрические нефелометры. Путём сравнения интенсивности задержки роста, вызванной действием неизвестного количества антибиотика со стандартной кривой, выражающей степень задержки, вызываемой известными количествами антибиотика, производят вычисление активности анализируемого образца. Турбидиметрические методы по сравнению с методами диффузии обычно являются сравнительно менее точными, так как микроорганизм, растущий на жидких питательных средах, при рабочих условиях проведения анализа более чувствителен к изменчивым факторам внешней среды.

На результат могут повлиять и некоторые сопутствующие вещества, содержащиеся в испытуемом образце; при методах диффузии влияние этих веществ вследствие их меньшего проникновения в агар устраняется. Этими веществами являются, например, жирные кислоты или глюкозодегидрогеназа. Эти методы нельзя применять для определения активности антибиотиков в образцах, которые являются либо окрашенными, либо дают мутный раствор, если только это явление нельзя устранить путём соответствующей обработки стандарта.

Источником ошибок могут быть и конечные, неспецифические изменения окраски культуры или изменения помутнения, которые могут произойти, например вследствие изменения рН при выращивании микроорганизмов. Несмотря на это, однако, турбидиметрические методы применяются весьма широко, главным образом потому, что по сравнению с методами диффузии в агар они требуют значительно меньшего времени инкубации.

Методы диффузии в агар.

При производстве и разработке технологии получения антибиотиков, пожалуй, наиболее часто применяют методы диффузии в агар, которые по сравнению с предыдущими двумя методами обеспечивают большую точность результатов. В некоторых модификациях с помощью этих методов можно определять даже доли микрограмма антибиотика. Их недостаток состоит в том, что они требуют относительно длительного времени инкубации (примерно 18 часов). По сравнению с турбидиметрическими методами методы диффузии являются более выгодными также и потому, что они обычно требуют меньше места для инкубации.

Методы диффузии в агар на чашках основаны на том, что антибиотик диффундирует из испытуемого образца в питательную агаровую среду, засеянную чувствительной к данному антибиотику культурой. Вокруг образца образуется круглая зона, в пределах которой тест-культура не растёт. Начало этому методу положила оксфордская группа исследователей, которая разработала так называемый метод с цилиндриками. По этому раствор антибиотика образца и стандарта заливают в полые цилиндрики, помещённые на поверхность засеянной тест-микробами агаровой среды в чашках Петри. Определение активности производят путём сравнения величин зон задержки роста у образца и стандарта при одном и том же разведении.

При методах диффузии в агар на чашках образующиеся зоны задержки не являются точно круглыми, и, следовательно, измерение их диаметра в разных направлениях даёт непостоянные и тем самым недостаточно точные результаты. От этого недостатка свободны линейные методы диффузии, при которых измеряется задержка роста, получавшаяся вследствие диффузии раствора антибиотика лишь в одном измерении. При этих методах раствор антибиотика либо наливают на засеянную тест-микробами питательную среду в пробирке, либо засеянную питательную среду насасывают в стеклянные капилляры, которые погружают затем в раствор антибиотика. Рост и здесь может быть выявлен вследствие гемолиза или изменения окраски индикатора, добавленного к агаровой питательной среде. Весь процесс может быть в ряде операций механизирован и автоматизирован.

При приготовлении растворов испытуемого образца и стандарта для количественного определения антибиотиков методами диффузии значительно более серьёзной задачей является выбор жидкостей, применяемых для растворения. Обычно для растворения образца и стандарта применяют фосфатные буферные растворы, рН которых выбирают так, чтобы разложение антибиотика было как можно меньшим, а тест-культура была наиболее чувствительной. Для стрептомицина, например, выбирают буфер с рН>7,0, для пенициллина и тетрациклиновых антибиотиков - буфер с рН<7,0.

В соответствии с этим устанавливают и рН используемой для определения агаровой питательной среды. Здесь, однако, нужно иметь в виду, что рН среды влияет на рост тест-организма и что фосфатные анионы оказывают стабилизирующее действие на растворы пенициллина.

Особой проблемой микробиологического определения активности антибиотиков является определение отдельных антибиотиков в смесях методом, отличным от хроматографического. Эта проблема возникла впервые, когда нужно было определять отдельные пенициллины относительно друг друга. Ввиду того что активность отдельных пенициллинов различна при испытании с разными культурами, можно, кроме хроматографического метода, использовать и так называемое дифференциальное титрование, при котором образец, содержащий смесь пенициллинов, титруют либо турбедиметрическим, либо методом диффузии в агар с использованием нескольких различных тест-организмов. Присутствие отдельных пенициллинов в смеси затем рассчитывают на основании соотношения известной активности отдельных пенициллинов против отдельных тест-культур. При определении содержания пенициллина и стрептомицина в лекарственных формах, содержащих смесь этих антибиотиков, можно либо инактивировать пенициллин с помощью пенициллиназы, либо определить пенициллин с микробом, устойчивым к пенициллину. Подобные же методы применяют и при определении других антибиотиков в смесях.

7. Устойчивость к антибиотикам

В процессе применения антибиотиков к ним может развиться устойчивость резистентность микроорганизмов, т.е. способность микроорганизмов размножаться в присутствии терапевтической дозы антибиотика. Резистентность микроорганизмов к антибиотикам может быть природной и приобретенной.

Природная устойчивость связана с отсутствием у микроорганизмов «мишени» для действия антибиотика или недоступностью «мишени» вследствие низкой проницаемости клеточной стенки, а также ферментативной инактивацией антибиотика. При наличии у бактерий природной устойчивости антибиотики клинически неэффективны.

Под приобретенной устойчивостью понимают свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Приобретенная устойчивость связана либо со спонтанными мутациями в генотипе бактериальной клетки, либо с передачей плазмид от естественно-устойчивых бактерий к чувствительным видам.

Известны следующие биохимические механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам:

* ферментативная инактивация препаратов;

* модификация «мишени» действия антибиотиков;

* активное выведение антибактериальных препаратов из микробной клетки;

* снижение проницаемости клеточной стенки бактерий;

* формирование метаболического «шунта».

Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам может иметь групповую специфичность, т.е. резистентность не только к применяемому препарату, но и к другим препаратам из той же химической группы. Такая устойчивость называется перекрестной.

Соблюдение принципов применения химиотерапевтических средств позволяет уменьшить вероятность возникновения устойчивости.

8. Побочные реакции при приеме антибиотиков.

Широкое и активное применение антибиотиков в качестве химиотерапевтических веществ на протяжении более 50 лет способствовало накоплению экспериментального материала о побочных реакциях, вызываемых ими (табл.5.).

И.А. Кассирский и Ю.И. Милевская еще в 1966 г. указали на три основные группы побочных реакций при применении антибиотиков: аллергические, токсические и обусловленные специфическим действием антибиотических веществ (табл. 6.).

Табл.5. Возможные неблагоприятные влияния антибиотиков.

Реакции и механизм их возникновения	Реакции
	опасные для жизни	не опасные для жизни
Аллергические реакции Развиваются как осложнение на аллерген (антибиотик); возникновение не зависит от дозы введенного антибиотика; могут последовать за первым введением антибиотика, сенсибилизация нарастает при повторных курсах лечения	Анафилактический шок, ангиноневротический отек гортани	Кожный зуд, крапивница, сыпь, астматические приступы, ринит, конъюнктивит, эозинофилия
Токсические реакции Возникновение связано с органотропным фармакодинамическим действием антибиотиков Степень выраженности зависит от продолжительности лечения и дозы препарата.	Токсическое действие на кровь. Агранулоцитоз, апластическая анемия	Поражение VIII пары черепно-мозговых нервов, периферических нервов. Нефротоксическое действие: тошнота, рвота, понос
Дисбактериозы и другие явления, связанные с химиотерапевтическим действием антибиотиков	Генерализованный кандидосепсис. Стафилококковые энтероколиты, вторичные пневмонии, вызываемые грамотрицательными микроорганизмами	Местные кандидозы -- молочница и др.

Табл.6.Побочные реакции при терапии антибиотиками(из Навашина и др., 1977, по Кассирскому, Милевской, 1966)

Аллергические реакции

Аллергические реакции - наиболее частое проявление побочного действия антибиотиков. Эти реакции наблюдаются при применении практически всех антибиотиков. Однако чаще всего они возникают при применении антибиотиков пенициллиновой группы, так как в медицинской практике они самые распространенные.

Под аллергией понимают измененную реакцию организма на действие чужеродных веществ, возникающую после предшествующего контакта с ними или вследствие высокой наследственной чувствительности организма.

Аллергические реакции не связаны с фармакологическими свойствами лекарств и возникают только у людей с повышенной чувствительностью (чаще сенсибилизированных).

Антигенные свойства антибиотиков объясняются тем, что они являются так называемыми неполными антигенами -- гаптенами. Гаптены приобретают антигенные свойства только после связи с белком в организме. Это осуществляется при связи с растворимыми протеинами в крови или клеточными мембранами. Установлено, что антитела к пенициллину относятся к классам IgG, IgM, IgE.

Клинические проявления аллергических реакций могут реализоваться немедленно или быть замедленного типа.

Аллергические реакции чаще возникают при повторных введениях определенных веществ, сенсибилизирующих организм, даже при введении ничтожно малых количеств. Состояние сенсибилизации может сохраняться многие месяцы и годы. Сенсибилизация может быть обусловлена и сходными по строению химическими веществами. Примером является перекрестная сенсибилизация сульфаниламидами, стрептомицином и пенициллином. Этим феноменом объясняются случаи возникновения тяжелых аллергических реакций и даже анафилактического шока при первом введении пенициллина. В настоящее время установлено, что в развитии аллергических реакций на медикаменты имеет значение индивидуальное предрасположение, обычно являющееся семейным, -- аллергическая конституция.

Типы аллергических реакций:

а) Анафилактический шок является наиболее грозным осложнением, требующим быстрой диагностики и немедленных лечебных мер. Как правило, он развивается очень быстро. Ему могут предшествовать продромальные явления: зуд, крапивница, ангионевротические отеки.

Основными симптомами анафилактического шока являются: падение кровяного давления вплоть до коллапса с тахикардией или брадикардией, потеря сознания, отек лица и слизистых оболочек, крапивница, редко рвота и понос.

При тяжелых формах наблюдаются кишечные кровотечения, диспноэ, отек мозга, поражения печени, коматозное состояние. Предрасположенность организма к развитию шока более выражена у больных, страдавших прежде различными аллергическими заболеваниями бронхиальная астма, сенная лихорадка и т. д..

Смерть от анафилактического шока может наступить в первые минуты и часы после введения антибиотика. Однако описаны случаи, когда больные умирали через несколько дней или недель после окончания лечения.

б) Синдром сывороточной болезни.

К тяжелым, иногда необратимым или трудно устранимым реакциям генерализованного характера относится так называемая сывороточная болезнь, проявляющаяся различными кожными реакциями, ангионевротическим отеком, болями в суставах, артралгиями, повышением температуры, эозинофилией крови, увеличением селезенки и лимфатических узлов. Наиболее ранним симптомом является набухание лимфатических узлов, иногда в сочетании с воспалительно- некротической реакцией в месте введения-феномен Артюса-Сахарова. В большинстве случаев при прекращении антибиотикотерапии синдром сывороточной болезни исчезает без специального лечения. В затяжных случаях показана десенсибилизирующая терапия, применение антигистаминных и гормональных препаратов.

в) Поражения кожи.

Поражения кожи и слизистых оболочек аллергического характера могут носить различный характер.

Сыпь-макулезная, пятнистые розеолы, пятнисто-папулезная, крупноточечная пятнистая - чаще появляется при введении пенициллина больным с повышенной чувствительностью или ранее сенсибилизированным. Эти реакции легко устранимы и исчезают после отмены антибиотика и назначения дезаллергизирующих средств: димедрол, пипольфен, хлорид кальция. Однако в редких случаях реакции со стороны кожи и слизистых оболочек бывают очень упорными, и требуется длительное лечение с применением активных и сильнодействующих дезаллергизирующих средств. Наиболее эффективно применение кортикостероидных гормонов - преднизона, преднизолона, триамцинолона и других в дозах, диктуемых тяжестью возникшей аллергической реакции.