Антибиотики. Фармацевтический анализ. Фармакологическая характеристика. Микробиологическая оценка

Дерматиты: эритематозная, уртикарная или буллезная сыпь эксфолиативные дерматиты, иногда генерализованные.Контактные дерматиты чаще всего встречаются у рабочих антибиотических производств и медицинского персонала, имеющих постоянный контакт с антибиотиком особенно пенициллином, стрептомицином, тетрациклином, левомицетином, а также с другими антибиотиками. Контактные дерматиты могут возникать и при нанесении на кожу мазей или растворов, содержащих антибиотики, введении их внутрикожно или подкожно для определения сенсибилизации к препаратам.

Крапивница может наблюдаться как после местного, так и после системного парентерального, внутрь введения антибиотиков и является одним из самых частых среди аллергических осложнений антибиотикотерапии чаще всего при пенициллинотерапии. Крапивница возникает в ранние сроки минуты, часы, а иногда через много дней и недель после введения антибиотика.

Ангионевротический отек носит локализованный характер отек губ, век, лица или распространяется на ряд областей гортань, трахея, легкие. Ангионевротический отек может иметь самостоятельное значение или являться составной частью общей аллергической реакции на введение антибиотиков.

Фотодерматозы - поражение кожи, вызываемое некоторыми антибактериальными препаратами и проявляющееся после воздействия солнечного света.

Токсическое действие антибиотиков

Токсические реакции характерны для многих групп антибиотиков, и могут возникать практически во всех органах и системах.

а) Нейротоксические явления возникают после применения антибиотиков ряда групп и проявляются:

1) поражением на слуховые ветви VIII пары черепных нервов мономицин, канамицин, неомицин, стрептомицин, флоримицин, ристомицин;

2) действием на вестибулярный аппарат стрептомицин, флоримицин, канамицин, неомицин, гентамицин.

Токсическое действие стрептомицина и других аминогликозидов на VIII пару черепных нервов выражается в потере слуха и вестибулярных расстройствах. В характере поражений органа слуха имеется разница между стрептомицином и неомицином. При лечении стрептомицином эти реакции бывают большей частью временными в отдельных случаях может выявиться стойкое и прогрессирующее поражение VIII пары черепномозговых нервов. Многие больные туберкулезом способны переносить без осложнений инъекции стрептомицина в течение нескольких месяцев. Неомицин вызывает осложнения значительно чаще, в более выраженной и устойчивой степени. Они могут возникнуть уже после 7-10-дневною применения этого препарата. Учитывая данный факт, неомицин можно применять только местно и внутрь;

3) поражением зрительного нерва стрептомицин, левомицетин, циклосерин, полимиксин;

4) развитием полиневрита стрептомицин, полимиксин, амфотерицин В, циклосерин;

5) возникновением парестезии, головных болей, головокружений, атаксии полимиксин, стрептомицин, циклосерин, амфотерицин В;

6) развитием различных поражений центральной нервной системы циклосерин, полимиксин, гризеофульвин, амфотерицин В, пенициллин, стрептомицин;

7) возникновением нервно-мышечной блокады аминогликозиды, полимиксин;

8) прямым токсическим действием при интралюмбальном введении, проявляющимся в виде галлюцинаций, эпилептиформных припадков, судорог отдельных групп мышц и общей гипертензии мускулатуры пенициллин, стрептомицин, тетрациклин, левомицетин и ряд других антибиотиков.

Нейротоксические реакции могут наблюдаться при назначении больших доз бензилпенициллина внутривенно более 40 000 000 ЕД в сутки.

б) Нефротоксические реакции могут сопровождать лечение полимиксином, амфотерицином В, неомицином, мономицином, канамицином, гентамицином, сизомицином, тобрамицином, стрептомицином, цефалоридином, гризеофульвином, ристомицином, сульфонамидами.

Больные с нарушением выделительной функции почек особенно подвержены нефротоксическому действию лекарств, что связано с их кумуляцией и созданием высоких концентраций в крови вследствие нарушения выведения. При нарушении выделительной функции почек нефротоксичность многих препаратов усиливается с одновременным распространением токсического действия на печень. В этих случаях надо назначать препараты с менее выраженным нефротоксическим действием и в первую очередь пенициллины и цефалоспорины.

Пенициллины - природные и их полусинтетические производные - даже в больших дозах относительно малотоксичны.

Цефалоспорины. Нефротоксические реакции наиболее часто наблюдаются при применении «старых» цефалоспоринов: цефалотина и цефалоридина. При применении цефалоридина в больших дозах описаны тяжелые поражения почечных канальцев. Частота возникновения и тяжесть проявления нефротоксичности возрастает при комбинации цефалоспоринов с аминогликозидами. Для цефалоспоринов II и III поколений цефазодин, цефамандол, цефокситин, цефуроксим и др. эти реакции менее характерны.

Аминогликозиды. Нефротоксичность относится к одному из проявлений побочного действия данной группы антибиотиков. Среди аминогликозидов, наиболее часто применяемых парентерально, эффективными препаратами являются канамицин и гентамицин и другие новые аминогликозиды (тобрамицин, сизомицин, амикацин).

При длительном лечении этими препаратами и в дозах, превышающих обычную суточную, могут наблюдаться поражения проксимальных отделов канальцев, что клинически выражается в снижении клубочковой фильтрации, появлении альбуминурии, микрогематурии, энзимурии. Применение этих антибиотиков при почечной недостаточности требует большой осторожности. При назначении аминогликозидов необходимо постоянно следить за функцией почек и выбирать оптимальную суточную дозу антибиотиков по критерию как эффективности, так и безвредности.

Полимиксины обладают нефротоксическим действием, однако при нормальной функции почек и соблюдении осторожности в выборе доз эти явления могут быть сведены к минимуму.

Ристомицин, виомицин относятся к потенциально нефротоксическим веществам. Эти препараты следует применять только в тех случаях, когда другие менее токсичные антибиотики не дают терапевтического эффекта.

Тетрациклины не обладают прямым нефротоксическим действием, однако, у больных при почечной недостаточности может повышаться уровень мочевины в крови. При выраженной почечной недостаточности тетрациклины могут вызывать азотемию, ацидоз, рвоту. При применении препаратов тетрациклинов с истекшим сроком годности, в которых содержатся продукты деградации-ангидротетрациклин и эпиангидротетрациклин, возможно развитие синдрома Фанкони: тошнота, рвота» альбуминурия, ацидоз, глюкозурия, аминоацидурия. При этом наблюдаются дегенеративные изменения в дистальных отделах почечных канальцев; клубочки остаются интактными. Явления обычно носят обратимый характер.

в) Гепатотоксические явления. Многие антибиотики накапливаются в больших концентрациях в желчи тетрациклины, эритромицин, рифампицин и могут вызывать поражения печени.

Описаны гепатиты, связанные с прямым токсическим или токсико-аллергическим действием сульфонамидов. Так как печень несет детоксицирующую функцию, а почки - выделительную, часто оба эти органа могут являться одновременным объектом побочного действия препаратов. При любых нарушениях функции этих систем надо иметь в виду возможность развития токсических побочных явлений.

В соответствии с этим врач должен внимательно следить за развитием данных симптомов и выбирать менее токсичное средство, снижать дозу или избегать назначения препаратов с возможным побочным действием на печень и почки. При применении амфотерицина В могут возникать гепатиты, при назначении нитрофуранов, линкомицина - явления желтушности; при лечении некоторыми солями эритромицина - холестатические гепатиты.

Тяжелые поражения печени в виде жировой инфильтрации печеночных клеток могут наблюдаться при использовании больших доз тетрациклинов, особенно вводимых парентерально. Хотя эти явления носят, как правило, обратимый характер, при наличии в анамнезе больного органических поражений печени или при обнаружении гепатотоксических явлений в процессе применения тетрациклинов антибиотик следует отменять. Для предупреждения возможности возникновения поражений печени не рекомендуется вводить внутривенно тетрациклин в суточной дозе более 1 г.

Описаны поражения печени и поджелудочной железы при лечении тетрациклинами женщин, страдающих пиелонефритом, в период беременности.

Гепатоцеллюлярная форма лекарственной желтухи свойственна гризеофульвину, стрептомицину, тетрациклинам, амфотерицину В, флоримицину и другим препаратам. Побочные явления прекращаются после отмены препарата.

г) Токсическое действие на желудочно-кишечный тракт ряда антибиотиков тетрациклин, эритромицин, гризеофульвин, амфотерицин В, фузидин и др., связанное с их раздражающим воздействием на слизистые оболочки, проявляется в виде тошноты, рвоты, анорексий, болей в области живота, поноса и др.

Обычно эти явления носят не столь выраженный характер, чтобы отменять антибиотики. Однако при часто присоединяющемся дисбактериозе под влиянием антибиотиков широкого спектра действия, а также линкомицина и клиндамицина могут возникать серьезные осложнения вплоть до псевдомембранозного энтероколита.

д) Влияние на кроветворную систему. Угнетение кроветворения в виде гипопластической анемии наблюдается в редких случаях при применении левомицетина и амфотерицина В, гемолитические анемии--при применении левомицетина, стрептомицина, апластические анемии -- при использовании левомицетина. Лейкопения с агранулоцитозом описана при лечении левомицетином, ристомицином, гризеофульвином, тромбоцитопения -- при применении ристомицина, левомицетина, рифампицина. Как правило, кроветворение восстанавливается после прекращения лечения. Тяжелые поражения костного мозга наблюдаются при лечении левомицетином, особенно при его длительном применении.

В развитии агранулоцитоза и гипоплазии кроветворения нельзя исключить роль аутоиммунных механизмов или снижения устойчивости клеток крови к лекарственным веществам вследствие дефицита ферментов по типу развития некоторых гемолитических анемий, например, лeкapcтвeннaя гемоглобинурия. Учитывая большую редкость гипоплазии кроветворения при лечении антибиотиками, некоторые авторы ставят вопрос о том, что это осложнение возникает у лиц, уже имеющих генетический дефект костномозгового кроветворения. Антибиотики при этом могут играть роль толчка в реализации процесса.

С наибольшей частотой тяжелые поражения кроветворения апластическая анемия возникают под влиянием левомицетина. Анемия может носить гипопластический или апластический характер с тромбоцитопенией и агранулоцитозом, приводящим к летальным исходам. Исходя из возможности таких тяжелых явлений, показания к применению левомицетина следует строго ограничить и препарат применять лишь под контролем врача, в стационаре, в случаях, когда нельзя назначать другие, менее токсичные вещества.

е) Эмбриотоксическое действие антибиотиков - побочное действие препаратов на плод, связанное с их проникновением через плацентарный барьер. Описаны случаи поражения слуха у новорожденных при лечении беременных стрептомицином, слуха и почек - при лечении неомицином и канамицином. Под действием тетрациклина при назначении его беременным могут возникать пигментация зубов и повреждение зубной эмали» повышенная склонность к кариесу у детей. Описано влияние на рост костей плода замедление скелетообразования при введении беременным больших доз тетрациклинов. В связи с возможностью токсического действия на плод за 3-6 нед. до родов противопоказано применение левомицетина, тетрациклина, стрептомицина, канамицина и других препаратов.

Побочные явления, связанные с биологическим действием антибиотиков.

Осложнения, связанные со специфическим антимикробным действием антибиотиков, происходят в результате нарушения равновесных экосистем организма человека. От этого зависят возникновение дисбактериозов и нарушение витаминного баланса организма, вторичные инфекции, вызываемые резистентными к антибиотикам формами возбудителей. Такие осложнения могут проявляться как у взрослых людей, так и у детей.

Так, тетрациклиновые антибиотики могут накапливаться в костях и нарушать их рост. Это особенно заметно проявляется у детей, длительное время принимавших указанные антибиотики. Хлорамфеникол и стрептомицин могут вызывать поражение костного мозга и нарушать процесс кроветворения гипопластическая анемия.

Противоопухолевые антибиотики из группы антрациклинов, в том числе адриамицин, вызывают нарушение генетического аппарата не пораженных опухолью клеток организма.

Антибиотики, подавляющие синтез нуклеиновых кислот или нарушающие энергетический метаболизм, обладают, как правило, широким набором побочных реакций.

Суперинфекции могут носить как эндогенный, так и экзогенный характер. В процессе антибиотикотерапии, обеспечивающей излечение основного процесса, одновременно подавляется чувствительная к назначаемым препаратам нормальная микрофлора. Многие патогенные либо условно-патогенные микроорганизмы начинают усиленно размножаться, и могут стать источником нового заболевания эндогенная суперинфекция.

Эндогенные суперинфекции могут быть вызваны различными микроорганизмами - стафилококками, синегнойной палочкой, протеем, энтеробактером, серрациями, кишечной палочкой, анаэробами, патогенными грибами и др., природно-нечувствительными к данному антибиотику или приобретшими устойчивость в процессе антибиотикотерапии.

Форма течения суперинфекций и их локализация могут быть различными: менингиты, абсцессы мозга, поражения мочевых путей, желудочно-кишечного тракта, желчных путей, дыхательных путей, слизистых оболочек и кожных покровов, глаз и т. д.

Экзогенная суперинфекция в результате вторичного инфицирования может быть обусловлена тем же видом микроорганизма, который вызывает основной патологический процесс, но с иной степенью чувствительности к антибиотикам, а также новым видом возбудителя. Это явление наблюдается при лечении дифтерии, пневмонии, туберкулеза, скарлатины и может служить источником новых осложнений у данного больного.

Экзогенная инфекция передается воздушным путем или путем непосредственного контакта. Источником инфекции служат носоглотка больных и персонала, воздух помещений, медицинские инструменты и т. д.

Кандидозы. К этой группе суперинфекций относятся заболевания, вызванные дрожжеподобными грибами рода Candida. Антибиотикотерапи нарушает обычные соотношения между различными представителями нормальной микрофлоры подавление роста бактерий и усиленное размножение дрожжеподобных грибов и способствует активации Candida и их распространению у ослабленных больных.

Кандидозам чаще всего подвержены новорожденные, не обладающие достаточно развитыми защитными реакциями, а также резко ослабленные больные с глубокими нарушениями обмена веществ.

Необходимо отметить, что высев Candida со слизистых оболочек, из мокроты, кала, мочи наблюдается и в норме, без связи с применением антибиотиков. В терминальных стадиях заболевания у резко ослабленных основной болезнью лиц может произойти генерализованная инвазия Candida с поражением внутренних органов и без вмешательства антибиотиков. Вероятность кандидасепсиса при лечении антибиотиками в процентном отношении невелика. Однако преувеличенный страх перед возможными кандидозами приводит в некоторых лечебных учреждениях к отказу от антибиотической терапии даже в тех случаях, когда имеются обязательные или жизненные показания к массивному применению антибиотиков.

Местные кандидозы, поверхностные поражения слизистых оболочек не представляют опасности и обычно не должны являться сигналом для прекращения антибиотического лечения. Между тем в ряде случаев при явном терапевтическом эффекте от примененного антибиотика необоснованно отменяют его при появлении на слизистой оболочке полости рта у больного молочницы или отдельных кандидозных элементов.

Отмена антибиотиков широкого спектра действия и замена их другими, с более узкой направленностью действия, в соответствии с этнологией заболевания, введение нистатина или леворина в комплексе с витаминами полностью излечивают больных от местных кандидозов.

Вместе с тем необходимо соблюдать разумную осторожность как в клиническом, так и в лабораторном плане. Необходимо всемерно устранять факторы, способствующие развитию кандидозов, улучшать питание и витаминный баланс больных, активизировать защитные механизмы. При необходимости следует принимать такие меры, как терапия стероидами и гемотрансфузии, энергично лечить основное заболевание, тщательно наблюдать за состоянием слизистых оболочек. Быстрое распространение поражений слизистых оболочек и кожи, нарастающее количество Candida в посевах соскобов со слизистых, мочи, мокроты и кала являются сигналами возможности развития тяжелых кандидозных поражений. В таких случаях при решении вопроса о дальнейшем продолжении антибиотикотерапии следует подходить к больному строго индивидуально, оценивая состояние основного процесса. При первых признаках генерализации грибковой инфекции: обнаружение мицелия при микроскопии нативных препаратов мочи, мокроты экссудатов полостей и др., нарастание мицелиальных и клеточных элементов при повторных обследованиях; появление клинических симптомов кандидозного сепсиса или поражения висцеральных органов введение антибактериальных антибиотиков немедленно прекращают и проводят лечение противогрибковыми препаратами

Лечение кандидозов является сложной задачей, хотя обычно они подвергаются обратному развитию после отмены антибиотиков

Реакция бактериолиза реакция Яриша-Герксгеймера.

При антибиотикотерапии некоторых инфекций возможны своеобразные осложнения, связанные с быстрым разрушением микробов и освобождением большого количества эндотоксинов. Эти явления наблюдаются обычно в начале антибиотикотерапии при введении больших доз бактерицидных и бактериостатических антибиотиков.

Они развиваются быстро, начинаются с потрясающего озноба, лихорадки, тахикардии, проливного пота; возможна диарея. В тяжелых случаях отмечаются понижение температуры, коллапс, потеря сознания, олигурия, анурия, при отсутствии лечения может наступить летальный исход. Симптомы реакции бактериолиза напоминают явления, наблюдаемые при эндотоксическом, а также гемотрансфузионном шоке.

Проявления реакции бактериолиза различной интенсивности описаны при антибиотикотерапии брюшного тифа, коклюша, сифилиса, бруцеллеза, лептоспироза и др. Обычно симптомы интоксикации появляются вскоре после введения антибиотика, а их возникновение свидетельствует о высокой чувствительности возбудителя к данному этиотропному средству.

Предотвратить развитие тяжелых реакций бактериолиза в большинстве случаев можно при соблюдении режима антибиотикотерапии, сочетанием применении антибиотиков с антигистаминными препаратами.

9. Особенности получения антибиотиков

Процесс получения антибиотика включает в себя следующие основные стадии:

1. получение соответствующего штамма -- продуцента антибиотика, пригодного для промышленного производства (рис. 7.);

2. биосинтез антибиотика;

3. выделение и очистка антибиотика;

4. концентрирование, стабилизация антибиотика и получение готового продукта.

Первая задача при поиске продуцентов антибиотиков - выделение их из природных источников. Биосинтез антибиотиков - наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый вид способен образовывать один или несколько вполне определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ.

Выявление потенциальной возможности образовывать в процессе жизнедеятельности антибиотики связано с условиями культивирования организмов. В одних условиях организм образует антибиотик, в других условиях тот же организм при хорошем росте не будет обладать способностью синтезировать антибиотическое вещество. Образование антибиотиков будет происходить только при развитии организма в специфической среде и при наличии особых внешних условий. Путем изменения условий культивирования можно получить больший или меньший выход антибиотика, или создать условия, при которых антибиотик вообще не будет образовываться. Можно также путем изменения условий культивирования продуцента добиться преимущественного биосинтеза одного из антибиотиков, при условии образования изучаемым организмом нескольких антибиотических веществ, или же получить новые формы антибиотиков, но только в пределах тех соединений, которые способны синтезироваться этим организмом.

К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на проявление антибиотических свойств микроорганизмов, относятся состав среды, ее активная кислотность, окислительно-восстановительные условия, температура культивирования, методы совместного выращивания двух или большего числа микроорганизмов и другие факторы.

Среды для культивирования микроорганизмов.

Натуральные среды, состоящие из природных соединений и имеющие неопределенный химический состав,части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва и т. д., содержат все компоненты, необходимые для роста и развития микроорганизмов большинства видов. Используются следующие среды:

- мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входят хлорид натрия, фосфат калия, иногда глюкоза или сахароза; используется обычно в лабораторной практике.

- картофельные среды с глюкозой и пептоном, часто используемые в лаборатории для культивирования многих видов актиномицетов и бактерий;

- среды с кукурузным экстрактом, соевой мукой, бардой и другими веществами, в состав которых входят сульфат аммония, карбонат кальция, фосфаты, глюкоза, сахароза, лактоза или иные углеводы и ряд других соединений; среды успешно применяются в промышленности, т. к. являются дешевыми и обеспечивают хорошее развитие микроорганизмов с высоким выходом антибиотиков.



Рис.7. - Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза.

Поскольку натуральные среды не позволяют получать строгие количественные данные для изучения физиологических и биохимических особенностей организма, применяют синтетические среды, которые подбирают для отдельных продуцентов индивидуально.

Источниками углерода могут быть органические кислоты, спирты, углеводы, сочетания различных углеродсодержащих соединений. При промышленном получении ряда антибиотиков в качестве источников углерода нередко применяют картофельный крахмал, кукурузную муку или другие растительные материалы.

Источники азота оказывают большое влияние на образование микроорганизмами антибиотических веществ. Обычно в средах для культивирования микроорганизмов источником азота служат соли азотной, реже азотистой кислоты, аммонийные соли органических и неорганических кислот, аминокислоты, белки и продукты их гидролиза.

Обычно наиболее благоприятным для микроорганизмов является соотношение C/N = 20. Однако для образования антибиотика такое соотношение не всегда оптимально. Поэтому для каждого продуцента необходимо подбирать соответствующее соотношение углерода и азота.

Источниками минерального питания служат фосфор, сера и другие макро- и микроэлементы.

Продуценты антибиотиков по отношению к концентрации фосфора в среде можно разделить на три группы:

- высокочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора в среде составляет менее 0,01 % продуценты нистатина, тетрациклинов, флоримицина, ванкомицина;

- продуценты средней чувствительности, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,010-0,015 % продуценты стрептомицина, эритромицина, циклосерина, неомицина;

- малочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,018-0,020 % продуценты новобиоцина, грамицидина, олеандомицина.

Сера входит в состав некоторых антибиотиков, образуемых грибами пенициллин, цефалоспорин, глиотоксин и др., бактериями бацитрацины, субтилины, низины и актиномицетами эхиномицины, группа тиострептона. Обычно источником серы в среде служат сульфаты. Однако при биосинтезе пенициллина лучшим источником серы для продуцента служит тиосульфат натрия.

Кроме того, для биосинтеза антибиотиков необходимы и отдельные микроэлементы. Так, продуцент альбомицина S. subtropicus образует антибиотик при значительной концентрации железа в среде. Железо необходимо для образования хлорамфеникола и других антибиотиков.

Биосинтезу ряда антибиотических веществ хлорамфеникола, стрептомицина, пенициллина и др. способствуют ионы цинка.

Стимулирующее влияние на биосинтез гентамицина, курамицина А, фософономицина оказывают ионы кобальта.

Ионы галогенов входят в состав некоторых тетрациклиновых антибиотиков и хлорамфеникола.

Влияние рН среды.

Многие бактериальные организмы, синтезирующие антибиотики, лучше развиваются при рН около 7,0, хотя некоторые, например молочнокислые стрептококки, продуцирующие низин, лучше развиваются в среде при рН = 5,5-6,0.

Большинство актиномицетов хорошо развиваются при начальных значениях рН среды в пределах от 6,7 до 7,8; в большинстве случаев жизнеспособность актиномицетов при рН ниже 4,0-4,5 подавлена.

Влияние температуры.

Для большинства бактериальных организмов температурный оптимум развития лежит в диапазоне 30-37 °С. Для продуцента грамицидина С оптимальная температура для развития и биосинтеза равна 40 °С.

Актиномицеты, как правило, культивируются при температуре 26-30°С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут развиваться как при пониженных от 0 до 18 °С, так и при повышенных 55-60 °С температурах.

Для большинства мицелиальных грибов оптимальная температура составляет 25-28 °С.

Влияние аэрации.

Большинство изученных продуцентов антибиотиков являются аэробами. Для биосинтеза многих антибиотиков пенициллин, стрептомицин и др. максимальное их накопление происходит при степени аэрации, равной единице, при которой через определенный объем среды за 1 мин продувается такой же объем воздуха.

В процессе развития продуцента антибиотика в промышленных условиях потребность организма в кислороде меняется в зависимости от стадии развития, вязкости культуральной жидкости и других факторов. На определенных стадиях могут возникнуть ситуации, связанные с кислородным голоданием продуцента. В этих условиях следует принимать дополнительные меры, например, повышение концентрации окислителя добавлением пероксида водорода.

Наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов - продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования с использованием периодических процессов. В условиях глубинной культуры процесс развития организма и синтеза антибиотика проходит в две фазы.

В первой фазе развития культуры или, как ее иногда называют, тропофазе фаза сбалансированного роста микроорганизма, наблюдается интенсивное накопление биомассы продуцента, связанное с быстрым потреблением основных компонентов среды и с высоким уровнем поглощения кислорода.

Во второй фазе развития, фаза несбалансированного роста микроорганизма, накопление биомассы замедлено или даже уменьшено. В этот период продукты метаболизма микроорганизма лишь частично используются на построение клеточного материала, они в основном направляются на биосинтез антибиотика. Обычно максимум продукции антибиотика в среде наступает после максимума накопления биомассы.

9.1 Производство пенициллина

Способность образовывать пенициллин широко распространена среди многих плесневых грибов, относящихся к родам Penicillium и Aspergillus. Однако это свойство более характерно для группы Penicillium notatum-chrysogenum. Первые выделенные из естественных субстратов штаммы как наиболее активные продуценты пенициллина образовывали не более 20 единиц 12 мкг антибиотика на 1 мл культуральной жидкости. В результате широкой научной работы по селекции новых активных штаммов продуцентов пенициллина получены различные штаммы Penicillium chrysogenum, которые, в отличие от исходных штаммов, обладают высокой продуктивностью и используются в промышленности. В настоящее время в промышленных условиях получают культуральные жидкости с содержанием пенициллина более 15000 ед/мл, а отдельные штаммы способны синтезировать антибиотик в количестве до 25000 ед/мл.

Под названием «пенициллин» объединена обширная группа веществ, которые являются N-ацильными производными гетероциклической аминокислоты. Из природных пенициллинов применяются бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин.

Рис.8. Технологическая схема производства пенициллина.

Изложение технологического процесса.

Подготовка инокулята

Подготовка посевного материала включает следующие стадии:

1) выращивание посевного мицелия 1-й генерации в аппаратах малой емкости в инокуляторах;

2) выращивание посевного мицелия 2-й генерации в аппаратах большой емкости.

Споровая культура, используемая для засева инокулятора, выращивается на пшене в стеклянных флаконах, высушивается и в таком виде хранится при комнатной температуре. Засев производят сухими спорами из 2-3 флаконов.

Основной задачей при культивировании продуцента пенициллина в посевных аппаратах на стадии подготовки инокулята является быстрое получение большой массы мицелия, способного обеспечить при пересеве в ферментер интенсивный рост и высокий выход антибиотика. Для осуществления этой задачи продуцент необходимо выращивать на средах, богатых легкоусвояемыми питательными веществами, в условиях хорошей аэрации, при оптимальной для роста микроорганизма температуре.

В качестве легкоусвояемого углерода выступает глюкоза, сахароза и т.д. В качестве второго источника углерода применяют в небольших количествах лактозу, присутствие которой в среде для выращивания посевного мицелия желательно по следующей причине: ее потребление начинается не сразу, а после некоторого периода адаптации, в течение которого происходит образование фермента, расщепляющего лактозу. Посевной мицелий, выращенный на среде, содержащей лактозу, обладает более высокой ферментативной активностью по отношению к трудноусвояемой лактозе и быстрее потребляет ее, что положительно сказывается на ходе ферментации.

Потребность гриба в азоте легко удовлетворяется минеральным азотом - аммонийным или нитратным. Помимо неорганического азота, в состав посевных сред, применяемых в промышленности, входит богатое органическим азотом растительное сырье типа кукурузного экстракта. Растительное сырье характеризуется не только наличием органического азота, оно содержит дополнительный углерод, входящий в состав аминокислот, полипептидов и белков, а также минеральные элементы, витамины и ростовые вещества.

Кроме углерода и азота, для роста микроорганизма необходимы фосфор, сера, магний, калий и микроэлементы - марганец, цинк, железо, медь. Большинство известных посевных сред содержит почти все вышеуказанные элементы, но в различных соотношениях. В табл.9. приведен пример среды, применяемой для выращивания посевного материала.

Вещество	%
Кукурузный экстракт	2 (на сухой вес)
Глюкоза	2
Лактоза	0,5
Азотнокислый аммоний	0,125
Однозамещенный фосфорнокислый калий	0,2
Сернокислый магний	0,025
Сернокислый натрий	0,05
Мел	0,5

Табл.9. Состав одной из сред для выращивания посевного материала.

Существенное влияние на рост мицелия оказывает рН среды. Наиболее благоприятное значение рН для роста мицелия лежит между 6,0-6,5. При более кислом или более щелочном рН рост и развитие микроорганизма замедляются.

Выращивание посевного мицелия продолжается 36-50 часов до получения биомассы средней густоты. Мицелий, выращенный в инокуляторах, передается в количестве 10% по объему в посевные аппараты, где культивируется в течение 12-18 часов, а затем передается в большие ферментеры в количестве 15-20%. Процесс выращивания посевного мицелия 1-й и 2-й генерации осуществляется при температуре 24-26°.

Пенициллы - продуценты пенициллина являются типичными аэробами и требуют для своего роста и развития наличия кислорода. Для получения высокопродуктивного посевного мицелия наряду с оптимальной питательной средой необходимо обеспечить и достаточное снабжение гриба. В процессе производства пенициллина выращивание посевного мицелия осуществляют при непрерывном перемешивании и бесперебойной подаче воздуха в аппараты в количестве 1,2-1,5 объема воздуха на 1 объем среды в минуту.

Процесс ферментации

Ферментация является основной стадией в производстве пенициллина, на которой формируется целевой продукт. В промышленности применяется метод глубинной ферментации, при котором культура микроорганизма выращивается в питательной среде, заполняя весь ее объем. У различных штаммов потребность в источниках питания неодинакова. В связи с этим состав сред не является постоянным и универсальным для всех продуцентов, образующих пенициллин, и меняется с появлением новых штаммов.

Ферментационная среда должна быть составлена таким образом, чтобы развивающаяся культура, потребляя питательные вещества и выделяя продукты обмена, сама создавала необходимые условия и осуществляла переход от фазы роста мицелия к фазе пенициллинообразования. Желательно, чтобы вторая фаза была более продолжительной и чтобы процесс ферментации прекращался до наступления автолиза.

Для этого, как и при выращивании посевного материала необходимо одновременное присутствие в среде как легко-, так и трудноусвояемого углевода. Легкоусвояемый углевод обеспечивает быстрый рост и образование обильной биомассы; трудноусвояемый углевод создает условия, благоприятные для биосинтеза антибиотика.

При промышленном биосинтезе пенициллина наибольшее распространение в качестве легкоусвояемого углевода получила глюкоза или гидрол. Трудноусвояемым углеводом является лактоза. Лактоза является единственным углеводом, обеспечивающим полноценное протекание фазы пенициллинообразования. Высокий выход антитибиотика получают только при наличии в среде лактозыв качестве основного источника углевода. Лактоза находится в культуральной жидкости на протяжении всего процесса ферментации, благодаря чему мицелий обеспечен сахаром, биомасса в течение пенициллинообразования медленно растет, и накопление антибиотика достигает максимального уровня.

В состав ферментационных сред входит органический и минеральный азот. Отличным источником органического азота считается кукурузный экстракт, но он может быть с успехом заменен пшеничным экстрактом, различными жмыхами, соевой мукой, глютеном и другим растительным сырьем, богатым азотом.

Источником минерального азота обычно служат нитрат аммония, сернокислый аммоний и некоторые другие соли. При ассимиляции грибом аммонийного азота этих солей освобождаются анионы кислот, которые способствуют некоторому закислению среды.

Исключительно важную роль в обмене веществ клетки играет фосфор, который необходим не только для нормального роста и развития гриба, но и для осуществления самого процесса биосинтеза пенициллина. Для образования пенициллина требуется значительно более высокая концентрация фосфора в среде, чем для роста гриба.

Обязательным компонентом ферментационной среды является сера, входящая в состав важнейших аминокислот и ферментов. Сера необходима еще и потому, что она входит в состав молекулы пенициллина. В питательные среды сера вносится в виде солей серной кислоты и гипосульфита.

Из других элементов, необходимых для нормальной жизнедеятельности гриба и образования антибиотика, следует отметить калий, магний, цинк, железо, марганец, медь.

Также необходимо присутствие предшественников в среде. Предшественниками называются вещества, непосредственно включающиеся в молекулу получаемого продукта. Предшественником бензилпенициллина является фенилуксусная кислота или ее производные - фенилацетамид, фенилэтиламин, фенилацетилглицин и другие вещества. Предшественником феноксиметилпенициллина является феноксиуксусная кислота. Оптимальная концентрация предшественника в среде устанавливается в зависимости от эффективности его использования для биосинтеза пенициллина данным штаммом.

Для биосинтеза пенициллина наиболее благоприятно нейтральное значение рН. Для поддержания в культуральной жидкости определенного уровня рН рекомендуется регулировать его с помощью автоматического добавления кислоты или щелочи либо путем установления правильного соотношения компонентов среды. В синтетических средах в качестве регуляторов рН чаще всего применяют органические кислоты, в комплексных средах - мел. Своеобразным регулятором рН при промышленном получении пенициллина является кашалотовый жир, который добавляется в среду в процессе ферментации как пеногаситель.

Для получения максимального выхода пенициллина основные компоненты среды должны входить в ее состав в строго определенных соотношениях и концентрациях. Состав некоторых сред, применяемых в производстве пенициллина представлен в табл.10.

Компоненты	Среда
	кукурузная	жмыховая	жировая
Кукурузный экстракт	2,0 - 3,0	-	2,0 - 3,0
Жмыхи (арахисовый, подсолнечный, соевый и др.)	-	2,0 - 4,0	-
Лактоза	5,0	5,0	1,0
Глюкоза или гидрол	1,5	1,5	1,5
Кашалотовый жир или растительные масла	0,5 - 0,1	0,5 - 0,1	2,5 - 3,5
Азотнокислый аммоний	0,4	0,4	0,4
Сернокислый натрий	0,05	0,05	0,05
Фосфорнокислый калий однозамещенный	0,4	0,4	0,4
Сернокислый магний	0,025	0,025	0,025
Серноватистокислыый натрий (гипосульфит)	0,2	0,2	0,2
Мел	0,5 - 1,0	0,5 - 1,0	0,5 - 1,0
Предшественник	0,3 - 0,4	0,3 - 0,4	0,3 - 0,4

Табл.10. Состав сред, применяемых для получения пенициллина.

Основными показателями, свидетельствующими об окончании ферментации, являются полное исчезновение углеводов в культуральной жидкости и прекращение биосинтеза антибиотика. Процесс ферментации в производственных условиях осуществляется при температуре 26±1⁰С и продолжается обычно 120-125 часов.

Интенсивность биосинтеза пенициллина зависит от количества мицелия, образуемого в процессе ферментации. Большая биомасса образует больше пенициллина, поэтому содержание углеводов, азота, фосфора и серы в среде должно быть достаточно высоким, чтобы обеспечить максимальное образование мицелия. Однако большая биомасса еще не гарантирует высокого выхода антибиотика. Гриб необходимо обеспечить не только достаточным количеством питательных веществ, но и необходимым количеством кислорода. Питание гриба и аэрация являются двумя сторонами одного процесса - чем больше питательных веществ в среде, тем больше требуется кислорода для их окисления. С другой стороны, повышение концентрации питательных веществ в среде ведет к увеличению биомассы, для дыхания которой требуется пропорционально большее количество кислорода. Состав питательной среды и аэрация взаимообусловлены. Максимальное количество пенициллина может быть получено только на средах с высокой концентрацией компонентов в условиях достаточного снабжения культуры растворенным кислородом.

Важным условием успешного проведения процесса биосинтеза пенициллина является строгое соблюдение условий асептики, так как попадание посторонних микроорганизмов может резко снизить выход антибиотика. Многие распространенные микроорганизмы способны образовывать фермент пенициллиназу, расщепляющий пенициллины. Попадание даже небольшого числа бактерий, способных вырабатывать пенициллиназу, приводит к полной инактивации пенициллина, в связи чем следует уделять особое внимание стерильности питательных сред, воздуха и вспомогательных материалов.

Необходимость обеспечения условий стерильности процессов при технологических связях агрегатов между собой коллекторными системами загрузки питательных сред, передачи посевного материала из инокуляторов в ферментаторы накладывает более высокие требования к уровню автоматизации этих процессов.

Фильтрация

Обычно для отделения мицелия от культуральной жидкости применяют вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Фильтрацию начинают до начала автолиза мицелия, поскольку при фильтрации автолизированной культуры мицелий не образует плотной пленки на фильтрующей поверхности барабана, а налипает в виде отдельных тонких комков, которые сами не отходят в зоне «отдувки» фильтра, и их приходится удалять вручную. При этом продолжительность фильтрации увеличивается в 2 - 3 раза, выход фильтрата резко падает, а сам фильтрат получается очень мутным.

Необходимо тщательно соблюдать условия, препятствующие разрушению пенициллина во время фильтрации, - охлаждение нативного раствора до 4-6°С и систематическая после каждой загрузки обработка фильтра, коммуникаций и сборников антисептиками, например хлорамином. Фильтр также должен систематически стерилизоваться острым паром.

Предварительная обработка нативного раствора

Нативный раствор, фильтрат культуральной жидкости представляет собой более или менее мутную, окрашенную в желто-коричневый или зеленовато-коричневый цвет жидкость. Величина рН среды в зависимости от штамма продуцента, состава среды и продолжительности процесса ферментации обычно колеблется от 6,2 до 8,2.

Очень важной характеристикой нативного раствора является содержание в нем белковых веществ, определяемых осаждением трихлоруксусной кислотой или другим соответствующим методом.

Применяется несколько способов предварительной обработки нативного раствора с целью освобождения от белковых примесей: осаждение солями многовалентных металлов например, А1³⁺ Fе³⁺ или Zn²⁺, коагуляция танином, термическая коагуляция при температуре 60-75°С и рН 5,5 - 6,0, осаждение примесей катионными детергентами типа четвертичных аммониевых оснований например, цетилпиридиний-бромидом или додецилтриметиламмонийхлоридом. Применение этих методов приводит к потерям антибиотика. Обычно в результате коагуляции и последующей фильтрации или сепарирования теряется от 5 до 15% пенициллина. При этом коагуляция солями металлов позволяет удалять не более 50% общего количества белковых веществ.

Экстракция и очистка пенициллина

Нативный раствор содержит 3-6% сухих веществ. На минеральные вещества приходится 30-40% сухого остатка, от 15 до 30% приходится на пенициллин, а остальное представляет сложную смесь органических веществ, включая белки, полипептиды, низкомолекулярные азотистые соединения, углеводы, различные органические кислоты и, в зависимости от штамма продуцента, то или иное количество пигмента. Для выделения пенициллина из этой сложной смеси можно пользоваться методами, основанными на адсорбции, экстракции или осаждении.

В промышленности извлечение активного вещества из нативного раствора основано на экстракции не смешивающимся с водой растворителем при подавленной диссоциации карбоксильной группы пенициллина. В растворитель, кроме пенициллина, переходит большая часть органических кислот. Минеральные загрязнения, большая часть азотистых соединений и других органических веществ остаются в водной фазе, так что в результате экстракции чистота продукта увеличивается в 4-6 раз.

К растворителям, применяемым для экстракции пенициллина, предъявляются следующие основные требования:

1) малая растворимость в воде;

2) отсутствие взаимодействия с пенициллином;

3) низкая упругость пара при температуре 5--30°С;

4) возможность регенерации при температуре не выше 120 -- 140°;

5) низкая стоимость.

С учетом этих и ряда других показателей основными растворителями-экстрагентами были приняты бутилацетат и амилацетат.

При кислых значениях рН пенициллин нестабилен, поэтому при экстракции пенициллина в органический растворитель необходимо строго контролировать рН, поддерживая его в пределах 1,9-2,0, проводить экстракцию в возможно короткое время, охлаждать жидкости.

При экстракции пенициллина из нативного раствора образуются весьма стойкие, трудноразделяемые эмульсин, что обусловлено наличием в нативном растворе поверхностно-активных веществ. Это требует применения специальных дезэмульгаторов. Обычно для этой цели применяют анионные детергенты, например сульфированные жирные или нафтеновые кислоты. Обычно выбор детергента определяется его доступностью и экономическими соображениями. Для разделения эмульсии в экстракторах-сепараторах, как правило, достаточно добавлять к нативному раствору 0,05--0,1% детергента.

На стадии экстракции пенициллина из нативного раствора используются либо многоступенчатые экстракторы-сепараторы типа «Лувеста» и «Россия», либо двухступенчатая схема экстрагирования контактирование подкисленного нативного раствора с бутилацетатом в специальных смесителях и разделение эмульсии на центробежных сепараторах типа САЖ-3.Применение эффективных центробежных экстракторов-сепараторов с производительностью 4000--5000 л/час, обеспечивающих по крайней мере две ступени экстракции в одной машине и хорошее разделение фаз, сводит до минимума время пребывания пенициллина в кислой водной среде и, следовательно, повышает выход антибиотика. Применение двухступенчатой схемы при экстракции пенициллина из нативного раствора, безусловно, нежелательно не только вследствие более длительного времени пребывания пенициллина в неблагоприятных условиях в этом случае, но и вследствие того, что применение сепараторов САЖ-3 не всегда обеспечивает достаточно полное разделение фаз. Это влечет за собой ухудшение качества бутилацетатного экстракта загрязнение нативным раствором и увеличение потерь бутилацетата с отработанным нативным раствором. Соотношение фаз при проведении бутилацетатной экстракции пенициллина из нативного раствора составляет 1,0:0,3--0,45, температура 4--3°С.

После проведения бутилацетатной экстракции пенициллина из нативного раствора производят извлечение пенициллина из бутилацетатного экстракта водным раствором бикарбоната натрия или буферным раствором при рН 6,6--7,2.На этой стадии также применяют многоступенчатые экстракционные машины или используют двухступенчатую противоточную экстракцию с разделением эмульсии на сепараторах с отношением растворительно-водная фаза 1.0:0,35. Выход по бутилацетатной и буферной экстракциям составляет около 90-92%.

Для дальнейшей очистки пенициллин повторно извлекают из буферного экстракта органическим растворителем чаще всего бутилацетатом или хлороформом при рН 2,0. Процесс ведется аналогично бутилацетатной экстракции из нативного раствора. Эта стадия технологически оформляется также с применением многоступенчатых экстракционных машин или осуществляется в виде двухступенчатой противоточной экстракции с разделением фаз на сепараторах. Выход составляет около 86% от количества пенициллина, содержащегося в нативном растворе.

Весь экстракционный процесс извлечения и химической очистки пенициллина проводится по непрерывной схеме.

Выделение кристаллических солей пенициллина.

Наиболее надежным методом, обеспечивающим получение кристаллического пенициллина хорошего качества, является выделение бензилпенициллина из бутилацетатного экстракта в виде концентрированного водного раствора калиевой соли с последующим упариванием воды с бутанолом под вакуумом, что приводит к кристаллизации калиевой соли из бутилового спирта.

Этот процесс имеет следующую технологическую последовательность:

1. Обезвоживание бутилацетатного экстракта путем охлаждения до - 16-18°С с последующей фильтрацией от льда.Удаление пигментных загрязнений обработкой активированным углем и фильтрацией на охлажденном друк-фильтре.

2. Получение концентрата калиевой соли бензилпенициллина экстракцией 0,56-0,6 н раствором едкого кали.

3. Стерилизующая фильтрация концентрата калиевой соли и упаривание под вакуумом с бутиловым спиртом при температуре 16-26° и остаточном давлении 5-10 мм рт. ст.Объем кубового остатка должен составлять не более 60-80% объема загруженного концентрата.Добавление бутанола к концентрату при упаривании под вакуумом связано с тем, что бутанол с водой образует смесь, кипящую при более низкой температуре по сравнению с температурой кипения воды.Отгонка воды проводится сравнительно в мягких условиях, вследствие чего возможность инактивации пенициллина уменьшается.После удаления воды и большей части бутилового спирта калиевая соль бензилпенициллина кристаллизуется,

4. Фильтрация осадка калиевой соли бензилпенициллина на фильтрующей центрифуге и промывка осадка безводным бутиловым спиртом.

5. Гранулирование полученной пасты и сушка калиевой соли в вакуум-сушильных шкафах при температуре 75-80° и остаточном давлении 10-20 мм рт. ст. При этом получается калиевая соль бензилпенициллина в виде белого мелкокристаллического порошка с активностью содержанием бензилпенициллина порядка 95% и выходом 70% от количества антибиотика в нативном растворе.

Важнейшим требованием, предъявляемым к получаемому сухому порошку пенициллина, является его полная стерильность. Термическая обработка препарата недостаточна. Стерильность может быть обеспечена лишь при проведении заключительных стадий процесса в строго асептических условиях, исключающих возможность заражения продукта микроорганизмами и их спорами. Поэтому, начиная со стерилизующей фильтрации концентрата и бутанола, все операции проводятся в изолированных стерильных помещениях и в стерильной аппаратуре. Для обеспечения условий асептики осуществляется весь комплекс необходимых санитарных и технологических мероприятий.

Перед регенерацией бутилацетат и бутанол, применяемые в процессе выделения и химической очистке пенициллина, промывают раствором щелочей для удаления примесей кислот продуктов инактивации пенициллина, фенилуксусной кислоты.

10. Фармакологическая характеристика различных групп антибиотиков

10.1.Фармакологическая характеристика группы пенициллина

В основе строения пенициллинов лежит 6-аминопенициллановая кислота - гетероциклическая система, состоящая из двух конденсированных колец: четырехчленного в-лактамного и пятичленного тиазолидинового.

Пенициллины отличаются друг от друга строением ацильного остатка у аминогруппы 6-аминопенициллановой кислоты.

По способу получения выделяют природные биосинтетические и полусинтетические пенициллины.

Природные пенициллины - продукт синтеза различных видов плесневого гриба рода Penicillium.

Спектр действия природных пенициллинов включает преимущественно грамположительные микроорганизмы:

* грамположительные кокки стрептококки, пневмококки; стафилококки, не продуцирующие пенициллиназу;

* грамположительные палочки возбудители дифтерии, сибирской язвы; листерии;

* анаэробы клостридии;

* актиномицеты; а также:

* грамотрицательные кокки менингококки и гонококки;

* спирохеты бледная трепонема, лептоспиры, боррелии.

Природные пенициллины применяют при:

тонзиллофарингите;

* скарлатине;

* роже;

* бактериальном эндокардите;

* пневмонии;

* дифтерии;

* менингите;

* гнойных инфекциях;

* газовой гангрене;

* актиномикозе.

Препараты этой группы - средства выбора при лечении сифилиса и профилактики обострений ревматических заболеваний.

Все природные пенициллины разрушаются в-лактамазами (пенициллиназами), поэтому их нельзя использовать для лечения стафилококковых инфекций, так как в большинстве случаев возбудитель продуцирующий пенициллиназу стафилококк.

Различают следующие препараты природных пенициллинов.

* Препараты для парентерального введения (кислотонеустойчивые).

- Короткого действия. Бензилпенициллина натриевая и калиевая соли.