Методы анализа видового состава и идентификации микроорганизмов

Размещено на http://www.allbest.ru/

КУРСОВАЯ РАБОТА

по дисциплине

«Органолептические, визуальные и микробиологические методы контроля качества продукции»

Тема

«Методы анализа видового состава и идентификации микроорганизмов»

Минск 2011

Реферат

Целью выполнения курсового проекта является изучение методов анализа видового состава и идентификация микроорганизмов.

В работе приведено описание видов и методов оценки развития микроорганизмов в водной среде и пищевых продуктах, бактериальной и грибной порчи пищевых продуктов и связи нормативной документации оценки содержания бактерий и грибов в пищевых продуктах. Описаны основные методы микробиологического контроля и идентификации микроорганизмов.

В ходе выполнения экспериментальной части курсового проекта были изучены методы определения общего содержания бактерий и грибов, методы центрифугирования и фильтрации микроорганизмов. Проведена оценка влияния антимикробных веществ на содержание и видовой состав микроорганизмов. Изучено взаимоотношение грибов и бактерий в смешанной микрофлоре.

микроорганизм пищевой грибной антимикробный

Введение

Микроорганизмы чрезвычайно широко распространены в природе. В пищевой промышленности вода играет важную роль, она используется для мойки сырь и аппаратуры, применяется в качестве основного технологического сырья при изготовлении различных видов продукции.

Одним из принципов производства безопасной продукции является обеспечение надлежащего санитарно-микробиологического состояния производства. Производственное оборудование, коммуникации, воздух в производственных помещениях, тара для расфасовки, а также непосредственно сырье при несоблюдении ряда санитарно-гигиенических нормативов или недостаточно эффективной санитарной обработке, могут стать основными источниками инфицирования всего производства, что окажет негативное влияние на физико-химические и микробиологические показатели готовой продукции. Продукты жизнедеятельности патогенных микроорганизмов, микотоксины, попадающие в технологический процесс, снижают качество производимых пищевых продуктов.

Целью данной работы является изучить методы видового состава и идентификации микроорганизмов. Для этого проведем опыты с использованием различных пищевых продуктов, предварительно теоретически ознакомившись с методами оценки безопасности, особенностями жизнедеятельности микроорганизмов.

1. Основная часть

1.1 Видовой состав и микробиологическое качество пищевых продуктов

Пищевые продукты ежедневно потребляемые человеком, не стерильны, т.е. всегда содержат какое-то число клеток микроорганизмов. Часть этих микроорганизмов безвредна и даже желательна для человека, так как защищает ею от патогенных микроорганизмов, являясь их антагонистами.

Каждый продукт - это арена деятельности и сложного микробного биоценоза. На подвижное равновесие этого биоценоза могут оказывать влияние самые разнообразные факторы и взаимосвязи, направляя его деятельность либо в нужном, либо в нежелательном направлении.

Одни и те же виды микроорганизмов в одних продуктах могут играть полезную роль, а в других нежелательную и даже вредную. В одни продукты специально вносят микроорганизмы в виде различных заквасок, в других продуктах стремятся избавиться от этих же микроорганизмов.

Повседневный санитарно-бактериологический контроль производимого пищевого продукта позволяет контролировать динамику общего санитарного режима производства, выявлять его слабые звенья и устранять их. Контроль необходимо проводить на всех этапах производства. Исследование только конечного продукта не отражают общего санитарного состояния предприятия.

Важное значение имеет контроль соблюдения технологических условий производства, особенно тех продуктов, технология которых предусматривает термическую, химическую или какую-либо иную обработку. При этом необходимо установить количественно и качественно допустимые пределы содержания микроорганизмов после соответствующей обработки и на последующих этапах производства, упаковки, транспортировки, хранения и реализации.

Несоответствие продукта установленным санитарным нормам сразу после производства укажет на несоблюдение технологического режима, а обнаружение санитарного неблагополучия на последующих этапах на вторичное обсеменение выявлены в результате санитарно-бактериологического обследования.

В зависимости от особенностей приготовления и условий последующего хранения устанавливают сроки хранения продукта. Соблюдение условий и режима хранения контролируются санитарно-бактериологическим исследованием, четко определяющим отклонения от установленного режима. При этом необходим анализ выявляемого микробного сообщества с учетом роли отдельных бактериальных показателей, характера продукта и специфики его хранения.

В процессе хранения продукта может происходить размножение микроорганизмов, которое приводит к порче продукта [1].

1.1.1 Бактериальная порча пищевых продуктов

Бактериальная порча продуктов наступает при неправильных условиях хранения что приводит к быстрому развитию микроорганизмов. К возбудителям порчи пищевых продуктов относят гнилостные, маслянокислые бактерии, пропионокислые бактерии, энтерококки, термоустойчивые молочнокислые палочки и фаги (вирусы, поражающие бактерии).

Гнилостные бактерии вызывают распад белков. Антагонистами гнилостных являются молочнокислые бактерии, и гнилостный процесс протекает только там, где не идет молочнокислое брожение. Среди гнилостных бактерий есть спорообразующие аэробы (бактерии рода Bacillus) и анаэробы (Clostridium). Бесспоровые формы представлены пигментными бактериями (Pseudomonas и Serratia) и факультативно-анаэробными (Proteus vulgaris, Escherichia coli).

Маслянокислые бактерии (род Clostridium) являются возбудителями маслянокислого брожения. Маслянокислые бактерии сбраживают молочный сахар и соли молочной кислоты. В результате брожения кроме масляной кислоты образуются уксусная, пропионовая и муравьиная кислоты, этиловый, бутиловый и пропиловый спирт. При этом выделяется большое количество газов (СО₂, Н₂). Известно несколько типов маслянокислого брожения, они различаются образуемыми продуктами. Конечными продуктами одного из типов брожения являются масляная и уксусная кислоты, диоксид углерода и водород:

2С₆Н₁₂О₆ +2Н₂О + 7Ф_н + 7АДФ = СН₃СН₂СН₂СООН + 2СН₃СООН + 4СО₂ + 6Н₂ + 7АТФ

При другом типе маслянокислого брожения получаются бутиловый, изопропиловый спирты и ацетон.

Возбудителем пропионовокислого брожения являются бактерии рода Propionibacterium. Они превращают глюкозу или молочную кислоту в пропионовую и уксусную кислоты с выделением диоксида углерода. Одновременно образуется небольшое количество янтарной кислоты, ацетоина и диацетила. Если брожение начинается с глюкозы, то до образования пировиноградной кислоты процесс идет аналогично гомоферментативному молочнокислому брожению. Суммарное уравнение сбраживания глюкозы пропионовокислыми бактериями:

3С₆Н₁₂О₆ + 8Ф_н + 8АДФ = 4СН₃СН₂СООН + 2СН₃СООН +2СО₂ +2 Н₂О + 8АТФ

Если брожению подвергается молочная кислота, то в результате дегидрирования (с помощью лактатдегидрогеназы) она также превращается в пировиноградную кислоту.

В дальнейшем одна часть пировиноградную кислоты подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием уксусной кислоты:

Другая часть пировиноградную кислоты путем карбоксилирования (при участии карбоксилтрансферазы) и цепи восстановительных процессов превращается в янтарную кислоту, из которой образуется пропионовая:

К энтерококкам относят молочнокислые стрептококки кишечного происхождения, т.е. они являются представителями нормальной микробиоты кишечника человека и животных. К энтерококкам относят два основных вида рода Enterococcus: Ent. faecalis и Ent. fecium. Энтерококки устойчивы к нагреванию (переносят температуру 60С в течение 30 мин), к действию активного хлора, некоторых антибиотиков. Наиболее вредными являются маммококки (Ent. faecalis biovar. liguefaciens) - обитатели молочной железы, которые выделяют сычужный фермент, вызывают прогоркание молочных продуктов и преждевременное свертывание молока.

Термоустойчивые молочнокислые палочки являются сильными кислотообразователями, и их развитие приводит к появлению излишне кислого вкуса творога, сметаны, простокваши. Эти бактерии могут выдерживать кратковременное нагревание до 85-90С, устойчивы к действию дезинфицирующих средств, что затрудняет борьбу с ними.

Бактериофаги вызывают лизис (разрушение) клеток бактерий, входящих в состав заквасок, что снижает активность заквасок, увеличивает сроки выработки молочной продукции и ухудшает ее качество.

Фаговая частица адсорбируется на бактериальной клетке, с помощью протеолитического фермента разрыхляет клеточную стенку, и ДНК бактериофага внедряется в цитоплазму клетки. В клетке начинается синтез ДНК фага и его белка, бактериальная генетическая система подавляется. Образуется большое количество (до 100) новых фаговых частиц, происходит лизис бактериальной клетки и высвобождение этих частиц. Они инфицируют новые клетки.

Бактериофаги характеризуются специфичностью, т.е. способностью размножаться в определенных видах бактерий. В свою очередь, бактериальные клетки имеют разную чувствительность к фагу.

Для предотвращения развития фаговой инфекции на производстве используют многоштаммовые закваски, проводят частую смену штаммов бактерий в заквасках, тщательно моют и дезинфицируют помещения и оборудование. Бактериофаги чувствительны к ультрафиолетовому облучению, ионизирующей радиации, к кислотам.

Заражение пищевых продуктов микроорганизмами и их токсинами происходит различными путями. Так, продукты могут заражаться вследствие санитарных и технологических нарушений производства, транспортировки, хранения и реализации продуктов. Продукты животного происхождения (мясо, яйца, рыба) могут быть поражены еще при жизни животного (в случаях инфекционных заболеваний или бактерионосительства у животных). Однако при употреблении зараженных микробами пищевых продуктов не всегда возникают пищевые отравления. Продукт становится причиной заболевания только при массивном размножении в нем микроорганизмов или значительном накоплении токсинов. Этим объясняется наибольшее количество пищевых отравлений в теплый период года, когда создаются оптимальные условия для развития микроорганизмов [2].

1.1.2 Грибная порча пищевых продуктов

Грибная порча или плесневение продуктов питания происходит при хранении их в условиях благоприятных для развития микроскопических грибов. Споры грибов попадают на продукты при транспортировке и хранении. Плесневение вызывается грибами родов Aspergillus, Mucor, Penicillium и др.

Грибы образуют на поверхности продуктов пушистые налёты белого, серого, зелёного, голубоватого, жёлтого и чёрного цветов. Под микроскопом этот налёт представляет собой длинные переплетённые нити - мицелий. При созревании каждого спорангия образуется около сотни спор, из каждой споры вырастает новый мицелий, поэтому грибы размножаются но продуктах очень быстро. Благоприятными условиями для развития микроскопических грибов является темература 25 - 35^оС, относительная влажность воздуха 70 - 80% и рН продукта от 4,5 до 5,5.

Микроскопические грибы поражают поверхность готовых изделий. Появляется неприятный запах. Заплесневешие продукты могут содержать ядовитые вещества - микотоксины, поэтому продукты пораженные микроскопическими грибами непригодны в пищу.

Для предотвращения плесневения пищевые продукты стерилизуют, консервируют и замораживают. Основные мероприятия по предотвращению плесневения является снижение зараженности спорами грибов воздуха производственных помещений, тары в которой храниться и транспортируется пищевая продукция, с помощью дезинфицирующих средств [1, 8].

1.1.3 Нормативная документация оценки содержания бактерий и грибов в пищевых продуктах

В Республике Беларусь и во все мире действует огромное множество законов, технических нормативно-правовых актов (ТНПА), директив, инструкций, концепций и других документов, направленных на обеспечение безопасности пищевых продуктов.

«Безопасность продовольственного сырья и пищевых продуктов - это совокупность свойств продовольственного сырья и пищевых продуктов, при которых они не являются вредными инее представляют опасности для жизни и здоровья нынешнего и будущего поколений при обычных условий их использования» - Статья 1 Закона Республики Беларусь «О качестве и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов для жизни и здоровья человека» от 29 июня 2003 года №217 - 3.

Нормирование микробиологических показателей качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов осуществляется для большинства групп микроорганизмов по альтернативному принципу - нормируется масса (объем), в которой(ом) не допускаются бактерии группы кишечных палочек, большинство условно-патогенных микроорганизмов, а также патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы и Listeria monocytogenes. В других случаях норматив отражает количество колониеобразующих единиц в 1 г (см³) пробы продовольственного сырья или пищевого продукта (колониеобразующих единиц (КОЕ)/г, см³).

Одной из систем, призванной устранить опасность для жизни и здоровья человека а впоследствии и сократить случаи возникновения инфекционных заболеваний и отравлении, связанных с употреблением пищевых продуктов, является система управления качеством и безопасностью пищевых продуктов на основе рисков и критических контрольных точек (HACCP).

Государственный стандарт СТБ 1470-2004 устанавливает основные требования к системе управления качеством и безопасностью пищевых продуктов на основе анализа рисков и критических контрольных точек (Hazard analysis critical control points-HACCP), изложенных в Директиве 93/43/ECC.

Среди нормативно-технической документации можно выделить стандарты устанавливающие методы отбора и подготовки проб к анализам, метода контроля показателей безопасности и нормативы безопасности.

РУП «Белорусский научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт пищевых продуктов» проводятся комплексные исследования по применению принципов HACCP для всей цепочки производства пищевых продуктов. Обеспечение безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов является основной целью и в других направлениях деятельности института. В их числе, например, разработка технологий производства новых видов продукции, испытания продукции по показателям безопасности, установленным в СанПиН 11 - 63 РБ 98, СанПиН 13 - 10 РБ 2002, ГН 10 - 117 РБ 99.

СанПиН 11 - 63 РБ 98 (Санитарные правила и нормы) устанавливают гигиенические нормативы качества и безопасности продовольственного сырья, пищевых продуктов, блюд для человека, а также требования по соблюдению указанных нормативов при операциях с пищей. Санитарные правила разработаны на основании Закона Республики Беларусь «О санитарно-эпидемическом благополучии населения».

С целью ограничения внутреннего облучения установлены республиканские допустимые уровни содержания радионуклидов цезия - 137 и стронция - 90 в пищевых продуктах и питьевой воде - (РДУ - 99) ГН 10 - 117 РБ 99.

СанПиН 42 - 123-4423-87. Нормативы и методы микробиологического контроля продуктов детского питания, изготовленных на молочных кухнях системы здравоохранения.

В соответствии с Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации» техническими нормативными правовыми актами в области технического нормирования и стандартизации, в которых устанавливаются требования безопасности на государственном уровне и требования которых обязательны для исполнения, являются технические регламенты, утверждаемые Советом Министров Республики Беларусь.

С целью повышения безопасности, качества и конкурентоспособности отечественной продукции институтом с 2001 было разработано 18 технических правовых актов (СТБ), которые учитывают достижения отечественной и мировой науки в производстве пищевых продуктов, применение современного оборудования, новых материалов и упаковочных средств.

При разработке и пересмотре ТНПА особое внимание уделяется требованиям, предъявляемым к сырью и готовой продукции, обеспечивающим ее безопасность, вносятся дополнительные требования при использовании пищевых добавок и генетически модифицированных компонентов.

Для повышения безопасности пищевой продукции разработана «Инструкция по санитарно-микробилогическому контролю производства плодово-ягодных вин», проводятся исследования по подтверждению сроков годности растительных масел, майонеза, безалкогольных напитков, уксуса, а также пищевой продукции и сырья по показателям безопасности для предприятий, не имеющих приборной базы. Разработаны также таблицы, в которых наглядно представлены сравнительные микробиологические показатели качества пищевых продуктов (таблица 1) [3].

Таблица 1 - Сравнительные микробиологические показатели качества пищевых продуктов.

Группа продуктов	МАФАМ КОЕ/г (мл), не более	Общее число грибов в 1 г (мл), не более	Масса продукта (г), в которой не допускается наличия
			БГКП	E. coli	Salmonella	Энтеро-бактерий	S. aureus
1	2	3	4	5	6	7	8
Мясо и мясопродукты	103 - 106	-	0,01 - 1,0	-	25	25	1,0
Яйца и яичные продукты	103 - 105	-	0,01 - 0,1	-	25	-	1,0
Молоко и сливки	103 - 106	-	0,01 - 1,0	-	25	-	0,1 - 1,0
Кисломолочные продукты	-	50	0,01 - 0,1	-	25	-	1,0
Рыба и рыбные продукты	104 - 105	50 - 100	0,01 - 1,0	-	25	-	0,01 - 1,0
Жиры и масла	103 - 105	50 - 200	0,01 - 1,0	-	25	-	0,01 - 0,1

С целью разработки ТНПА и в целях создания условий для участия, а этом процессе всех заинтересованных сторон на базе РУП «БелНИИ пищевых продуктов» в соответствии с приказом Госстандарта от 08.11.2004 г. №201 создан национальный технический комитет по стандартизации №13 «Пищевая продукция». Область его деятельности распространяется на плодоовощную, консервную, кондитерскую, крахмалопаточную, соляную, дрожжевую, пищекислотную продукцию. Основная задача ТК №13 разработка ТНПА, которые будут способствовать обеспечению потребителей безопасными и качественными продуктами.

Изданный в сентябре 2005 г. Международный стандарт ИСО 22000 «Системы менеджмента безопасности пищевых продуктов. Требования к организациям в цепи поставок пищевой продукции» устанавливает гармонизированные на международном уровне требования к системе менеджмента безопасности пищевых продуктов. ИСО 22000 объединяет в одном документе принципы HACCP и требования основных стандартов, разработанных различными ассоциациями. В дополнение к ИСО 22000 изданы:

ISO/TS 22004 «Системы управления безопасностью пищевых продуктов. Руководство по применению ИСО 22000:2005»; ISO/TS 22003 «Системы управления безопасностью пищевых продуктов. Требования к органам, осуществляющих аудит и сертификацию систем управления безопасностью пищевых продуктов» [4].

1.1.4 Методы прогнозирования сроков хранения пищевых продуктов по микробиологическим показателям

Один из методов прогнозирования сроков хранения пищевых продуктов основывается на расчёте кинетических моделях роста микроорганизмов.

Кинетические кривые роста микроорганизмов в закрытых системах (периодическое культивирование) имеют сложный характер (рис 1). Выделяют несколько фаз в развитии культуры.

ь После введения инокулята обычно наблюдают индукционный период (лаг-фазу) (1), в течение которого не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образования каких-либо продуктов. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, специфичные к использованию новых субстратов, активируется биосинтез белка.

ь Индукционный период сменяется фазой экспоненциального роста (2), в течение которой быстро накапливаются биомасса и продукты разных реакций. Эта фаза достаточно строго описывается экспоненциальной кривой.

ь В замкнутой системе экспоненциальная фаза роста не может развиваться неограниченно. Как правило, она переходит в фазу линейного роста (3), характеризующуюся равномерным во времени линейным ростом культуры, имеет место отклонение от точек в сторону меньших значений количества клеток или продуктов, что служит экспериментальным критерием перехода культуры в линейную фазу роста.

ь Фаза линейного роста может смениться весьма непродолжительным периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля. Это фаза замедления роста (4).

ь В некоторых случаях рост культуры может переходить в достаточно устойчивую по продолжительности стационарную фазу (5). В этих условиях культура развивается в режиме постоянства общего числа клеток. Режим характеризуется достаточно высокими скоростями отмирания клеток. При этом скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток.

ь Если система полностью истощается по субстрату или накопление ингибирующих рост продуктов является значительным, то скорость прироста биомассы становится равной нулю, происходят существенные физиологические изменения клеток и, как правило, наблюдается фаза отмирания культуры (6), сопровождаемая часто полным лизисом клеток.

ь

Рисунок 1 - Типичная кинетическая кривая роста популяции микроорганизмов: 1 - индукционный период; 2 - фаза экспоненциального роста; 3 - фаза линейного роста; 4 - фаза замедления роста; 5 - стационарная фаза; 6 - фаза отмирания культуры

Принципиальной особенностью кинетики микробных популяций является зависимость скорости роста культуры от концентрации одного или нескольких наиболее важных компонентов среды, обеспечивающих биосинтетическую основу метаболизма. Эти компоненты, получившие название лимитирующих субстратов, в определенной степени регулируют скорость роста популяции. [5].

Расчёт сроков хранения основывается на определении количества лимитирующих субстратов. После определения количества субстрата прогнозируют как быстро произойдет истощение субстрата при развитии микроорганизмов. И из этих данных получают скорость роста микроорганизмов, которую используют при расчёте сроков хранения.

1.2 Видовой состав микрофлоры и безопасность пищевых продуктов

Безопасность пищевых продуктов в настоящее время оценивается по следующим 4 группам микроорганизмов:

- санитарно-показательные, к которым относится:

а) мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы;

б) бактерии группы кишечных палочек (БГКП).

- условно-патогенные микроорганизмы (Е.coli, Staph. aureus, Bac. cereus, Proteus и сульфитредуцирующие клостридии);

- патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы;

- микроорганизмы, характеризующие надёжность продукта при хранении, в основном это дрожжи и плесени [2].

1.2.1 Санитарно-показательные микроорганизмы как индикатор безопасности продукции

К санитарно-показательным микроорганизмам относятся:

- мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы;

- бактерии группы кишечной палочки.

В зависимости от потребности в кислороде организмы подразделяются на аэробов и анаэробов. Анаэробные микроорганизмы живут без доступа кислорода, они могут присутствовать в герметически упакованных продуктах или продуктах упакованных под вакуумом. Им не нужен кислород, строгие анаэробы погибают в присутствии кислорода, он им «противопоказан», факультативные же выживают в присутствии кислорода, но он им не нужен. Яркие представители анаэробов - сальмонелла (Salmonella) и возбудитель ботулизма (Clostridium botulinum). Последний может развиться только в герметичных упаковках без доступа кислорода).

Аэробы же без кислорода жить не могут, например золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus).

Количество МАФАМ можно рассматривать как общее микробное число, т.е. содержание всех микроорганизмов в продукте. Если контролировать этот показатель на всех этапах производства, то можно проследить насколько «чистое» сырье поступает на производство, как меняется его «чистота» после тепловой обработки и не претерпевает ли продукт повторного загрязнения после термообработки и во время фасовки. Ведь микроорганизмы могут попадать в продукт из тары, причем как бутылок, так и крышечек.

Если в конечном продукте содержание МАФАМ превышает нормы, то это может в равной степени свидетельствовать как о нарушении санитарных условий на производстве или нарушении технологии, так и о нарушении условий хранения и реализации продукта в торговой сети

Кишечные палочки (лат. Escherichia coli) - микроорганизм, открытый в 1885 г. Эшерихом из остатков жизнедеятельности человека. Этот микроорганизм является постоянным обитателем толстого отдела кишечника человека и животных. Кроме Е. coli, в группу кишечных бактерий входят эпифитные и фитопатогенные виды, а также виды, этиология (происхождение) которых пока не установлена. К бактериям группы кишечных палочек относят роды Escherichia (типичный представитель Е. coli), Citrobacter (типичный представитель Citr. coli citrovorum), Enterobacter (типичный представитель Ent. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности морфологических и культуральных свойств. Они характеризуются различными ферментативными свойствами и антигенной структурой.

Бактерии группы кишечных палочек - это короткие (длина 1 - 3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) полиморфные подвижные и неподвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор.

Бактерии хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легко разбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (E.aerogenes). Для лактозоотрицательных вариантов кишечной палочки (B.paracoli) характерны бесцветные колонии. Им свойственна широкая приспособительная изменчивость, в результате которой возникают разнообразные варианты, что усложняет их классификацию.

Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37 °С БГКП делят на лактозоотрицателъные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые формируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5 °С. К ним относится Е. coli, не растущая на цитратной среде.

Бактерии группы кишечных палочек обезвреживаются обычными методами пастеризации (65 - 75° С). При 60 °С кишечная палочка погибает через 15 минут. 1% раствор фенола вызывает гибель микроба через 5 - 15 минут, сулема в разведении 1:1000 - через 2 мин., устойчивы к действию многих анилиновых красителей.

Санитарно-показательное значение отдельных родов бактерий группы кишечных палочек неодинаково. Обнаружение бактерий рода Escherichia в пищевых продуктах, воде, почве, на оборудовании свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, что имеет большое санитарное и эпидемиологическое значение. Считают, что бактерии родов Citrobacter и Enterobacter являются показателями более давнего (несколько недель) фекального загрязнения и поэтому они имеют меньшее санитарно-показательное значение по сравнению с бактериями рода Escherichia. При длительном применении антибиотиков в кишечнике человека также обнаруживают различные варианты кишечной палочки. Особый интерес представляют лактозоотрицателъные варианты кишечной палочки. Это измененные эшерихии, утратившие способность сбраживать лактозу. Они выделяются при кишечных инфекциях человека (брюшном тифе, дизентерии и др.) в период выздоровления. Наибольшее санитарно-показательное значение имеют кишечные палочки, не растущие на среде Козера (цитратная среда) и ферментирующие углеводы при 43-45°С (E. coli).Они являются показателем свежего фекального загрязнения [6].

1.2.2 Потенциально-патогенные и патогенные микроорганизмы

Человек контактирует с множеством микроорганизмов, но лишь немногие их них способны вызывать инфекционные болезни. Патогенность или отсутствие таковой - видовой, генетически детерминированный признак микроорганизма.

Патогенный потенциал многих возбудителей зависит как от свойств, присущих конкретному микроорганизму, так и от состояния факторов защиты организма-хозяина. В зависимости от характера данных взаимоотношений все микробы подразделяют на патогенные, условно-патогенные и непатогенные.

Патогенные микроорганизмы вызывают инфекционные заболевания у здоровых лиц. Такие возбудители произошли от свободноживущих видов, адаптировавшихся к существованию во внутренней среде организма.

Патогенные микробы активно проникают в чувствительные организмы, так как паразитирование - важная часть их жизненного цикла. Адаптация к паразитированию в тканях проявляется специфическими поражениями, выделенными в отдельные нозологические формы.

Условно-патогенные микроорганизмы, как правило, лишены болезнетворных свойств и не вызывают инфекционных заболеваний у здорового человека. Они нередко колонизируют кожу и слизистые оболочки, но способны и к длительному существованию во внешней среде.

Условно-патогенные микробы вызывают поражения после пассивного переноса во внутреннюю среду организма (например, при нарушении целостности анатомических барьеров). Поскольку эти микроорганизмы лишены доступа к тем или иным тканям, то заболевания не имеют выраженной специфичности и больше зависят от степени поражения органа, чем от патогенных свойств возбудителя. Важные условия их развития - массивность инфицирования и нарушения сопротивляемости организма. Чем более выражены эти нарушения, тем более широкий спектр микроорганизмов способен вызывать инфекционные поражения.

Обычно даже непатогенные (точнее, не способные вызывать поражения у здорового человека) микроорганизмы находят «возможность» инициировать инфекционный процесс.

Подразделение микроорганизмов на непатогенные и условно-патогенные виды имеет нечёткие границы. Например, сенная палочка (Bacillus subtilis) не патогенна для человека, но может вызывать тяжёлые глазные инфекции и бактериемию после попадания в кровь. Более правильна оценка паразитических свойств микроорганизма, так как в основе любого инфекционного процесса лежит феномен паразитизма.

Паразитические микроорганизмы используют организм хозяина как источник питания, среду обитания и размножения. В соответствии со степенью паразитизма микроорганизмы разделяют на несколько типов.

Некоторые резистентные штаммы условно-патогенных микроорганизмов представляют угрозу в основном для определенных групп пациентов высокого риска (резистентные грибы для пациентов с неитропенией, резистентные штаммы P. aeruginosa для пациентов отделений реанимации), другие (например, энтеробактерии, продуцирующие бета-лактамазы широкого спектра действия, или ван-комицин-резистентные энтерококки) имеют более широкое распространение. Наибольшее опасение вызывают резистентные варианты золотистого стафилококка (прежде всего, метициллин - (оксациллин-) резистентные стафилококки), которые в последнее время представляют угрозу не только для госпитализированных пациентов, но и для населения за пределами стационаров.

Стафилококк золотистый (лат. Staphylococcus aureus) - шаровидная грамположительная бактерия рода стафилококк, которую часто находят в носу и на коже людей. Порядка 20% населения являются постоянными носителями этой бактерии.

Стафилококк золотистый может вызывать широкий диапазон заболеваний начиная с легких кожных инфекций и до смертельно опасных заболеваний, таких как пневмония, менингит, остеомиелит, эндокардит, токсический шок и сепсис. Диапазон заболеваний простирается от кожных, мягкой ткани, респираторных, костных, суставных и эндоваскулярных до раневых инфекций. Он до сих пор является одной из четырех наиболее частых причин внутрибольничных инфекций, часто вызывая послехирургические раневые инфекции.

Впервые обнаружен в 1880 году в Шотландском городе Абердине Александром Огстоном в гное из хирургических абсцессов. Впервые описан в 1884 году Оттомаром Розенбахом. Название бактерия получила благодаря своему внешнему виду под микроскопом: в отличие от большинства бактерий, которые бесцветны, Staphylococcus aureus имеет золотистый цвет, обусловленный пигментами из группы каротиноидов. S. aureus бактерия комменсал; она колонизирует кожу и поверхности слизистых, таких как слизистые носа и глотки.

С момента открытия пенициллина и активного его использования против стафилококка, бактерия мутировала и в настоящее время большинство штаммов устойчивы к этому антибиотику, благодаря наличию у золотистого стафилококка пенициллиназы - фермента, расщепляющего молекулу пенициллина.

Также к патогенным микроорганизмам относится Bacillus cereus - грамположительная, спорообразующая почвенная бактерия. Вызывает токсикоинфекции у человека. Хемоорганогетеротроф, факультативный анаэроб, способен к нитратредукции. Растёт на простых питательных средах, на плотных питательных средах обрузует плоские, мелкобугристые, слегка вогнутые, матовые колонии. Край волнистый. Клетки крупные 1 x 3 - 4 мкм, эндоспоры расположены центрально, не превышают размер клетки. Жгутики расположены перетрихиально. Вызывает пищевые токсикоинфекции у человека (включая рвотный и диаррейный синдром), продуцирует энтеротоксины.

Первоначально были описаны в 1835 Эренбергом как Vibrio subtilis, в 1872 были переименованы Коном в Bacillus subtilis. Название «сенная палочка» вид получил из-за того, что накопительные культуры этого микроорганизма получают из сенного экстракта. Является продуцентом некоторых полипептидных антибиотиков а также ферментов (амилазы, протеазы) получаемых промышленно.

Клостридии (Clostridium) - род грамположительных, облигатно анаэробных бактерий, способных продуцировать эндоспоры. Отдельные клетки - удлинённые палочки, название рода происходит от греческого клптфед (веретено). Многие виды, которые были отнесены к клостридиям по этому морфологическому признаку, позже были реклассифицированы. Эндоспоры могут располагаться центрально, эксцентрально и терминально. Диаметр эндоспор часто превышают диаметр клетки.

Клостридии - это также форма бактериальных клеток, у которых центрально расположенная спора имеет диаметр больший, чем диаметр самой клетки, из-за чего клетка «раздувается» и приобретает веретенообразную форму. Клостридии входят в состав нормофлоры желудочно-кишечного тракта и женских половых путей. Иногда их обнаруживают в полости рта и на коже. Род включает как свободно живущие виды (например Clostridium pasteurianum), так и патогенные, например, возбудители столбняка, газовой гангрены и возбудитель ботулизма.

Частыми возбудителями инфекции мочевыводящей системы являются бактерии рода Proteus из семейства Enterobacteriaceae. Это грамотрицательные подвижные аэробные палочки; на питательной среде расщепляют мочевину с образованием аммиака, плохо растут в кислой среде.

Протеи, как и другие представители семейства Enterobacteriaceae, вызывают заболевания у людей только в тех случаях, когда выходят за пределы своего нормального места обитания (пищеварительный тракт). Имеет место внутрибольничная передача протеев, распространение инфекции половым путем, а также - заражение при несоблюдении правил личной гигиены. Протеи нередко обнаруживают при хронических инфекциях мочевыводящих путей. Первое место по частоте обнаружения занимает Proteus mirabilis, затем следуют Proteus morganii и Proteus rettgeri. Реже выделяют Proteus vulgaris [7, 8].

1.3 Методы микробиологического контроля и идентификации организмов

1.3.1 Получение чистых культур микроорганизмов

Чтобы из смешанной элективной культуры получить требуемый микроорганизм в виде чистой культуры, необходимо добиться разобщения клеток, после чего обеспечить условия, в которых образуется их потомство. Чистой культурой принято считать популяцию, представляющую собой потомство одной клетки, либо споры, либо вирусной частицы.

Существуют методы прямого выделения одной клетки при микроскопировании (их обычно применяют для относительно крупных организмов) и косвенные методы, основанные на разобщении клеток на плотных средах (с последующим формированием колоний) либо в жидких средах (с последующим формированием суспензий).

Получение чистых культур путём разобщения клеток в питательных средах. Наиболее простым и чаще других используемым способом получения чистой культуры является чашечный метод Коха, который состоит в физическом разобщении клеток на плотной среде, в результате чего одна клетка формирует одну колонию, состоящую из генетически однородных особей - потомков единственной клетки.

Для разобщения клеток аэробных микроорганизмов используют следующие методы:

1. Посев методом Коха на поверхность плотной среды в одной чашке Петри. Для получения изолированных колоний элективную культуру следует развести. При этом бывает трудно предсказать относительное содержание в суспензии требуемых микроорганизмов, и поэтому обычно делают высевы из нескольких серийных разведений (чаще из разведений 10^-4 - 10^-6;

2. Посев методом Коха на плотные среды в трёх чашках Петри. Этот способ обычно даёт наилучшие результаты при высеве смешанных культур, то есть позволяет выявить наибольшее разнообразие морфологических типов колоний;

3. Посев истощающим штрихом. Данный метод выбирают в тех случаях, когда существует уверенность, что требуемый организм находится в элективной культуре в достаточно высокой концентрации.

Для получения изолированных колоний анаэробов выбирают:

1. Глубинный посев. Здесь, также как и при высеве на поверхность плотной среды в одной чашке Петри, требуется произвести разведения элективной культуры. Обычно производят засев разведений 10⁴ - 10^-6;

2. Разведение суспензий в плотных питательных средах. Данный метод используют для облигатных анаэробов. Его суть состоит в том, что в пробирки для разведения элективной культуры вместо физиологического раствора вносят расплавленную агаризованную питательную среду, охлаждают её до 45-46⁰С, после чего совершают все те манипуляции по разведению суспензии. Делают 6 - 10 последовательных разведений с шагом 10. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (в отношении 3:1) для защиты среды от проникновения воздуха.

Для некоторых анаэробов можно использовать все способы получения изолирования колоний на поверхности плотной среды (как для аэробов), но после посева культивирование следует осуществлять в анаэростате.

Для выделения чистых культур микроорганизмов, не формирующих колонии на плотной среде, пользуются методом предельных разведений в жидкой среде, пользуются методом предельных разведений в жидкой среде. Данный способ удаётся реализовать лишь в том случае, когда требуемый микроорганизм преобладает в смешанной популяции. Разведение элективной культуры следует производить с тем расчётом, чтобы при внесении аликвот в серию пробирок с питательной средой среднее число клеток составляло бы менее 0,05 на пробирку. Это достигается, например, при инокуляции аликвот по 1 мл в 100 пробирок из 100 мл суспензии, содержащей всего 5 клеток. В таком случае вероятность того, что пробирки, в которых регистрируется рост микроорганизмов, попала всего 1 клетка, составляет 0,975.

Получение чистых культур прямым выделением клеток при микроскопировании. Методы данной категории требуют специального лабораторного оборудования и не применимы для выделения очень мелких клеток и неклеточных существ.

Капельный метод Линдера. Он позволяет выделять крупные клетки цианобактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, водорослей, простейших.

Суть метода состоит в следующем. Разводят элективную культуру в стерильной питательной среде с тем расчётом, чтобы в небольшом объёме (0,01 мл) содержались одиночные клетки (обычно получают разведения 10^-6 - 10^-8). На поверхность нескольких стерильных покровных стёкол бактериологической петлёй наносят микрокапельки разведённой суспензии (соблюдают правила асептики). Готовят препараты «висячая капля» и просматривают под микроскопом. Отбирают те препараты, в которых присутствует по одной клетке, и инкубируют их во влажных камерах (помещают в чашки Петри с увлажнённой фильтровальной бумагой) 12 - 24 ч. Затем вновь микроскопируют и растущие культуры микробиологической петлёй переносят в жидкие или на плотные питательные среды.

Выделение клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой устройство, которым оснащают микроскоп, позволяющее с помощью специальной микропетли или микропипетки извлекать из суспензии одну клетку. Все действия осуществляются под микроскопом.

Определение степени «чистоты» выделенной культуры. Получив при высеве элективной культуры на плотную среду изолированные колонии, нельзя быть уверенным в том, что они однородны. Обычно в составе колоний, сформированных при первичном высеве элективной культуры, обнаруживаются представители разных видов. Это объясняется тем, что многочисленные представители смешанных популяций на среде определённого составе могут расти медленно или не расти вовсе, но и не погибать. В таком случае невозможно заметить на среде их присутствие.

Поэтому следующей обязательной процедурой получения чистой культуры является «расчистка»: одну типичную колонию рассеивают методом истощающего штриха (для аэробов) или глубинным посевом (для анаэробов) на подходящей по составу полноценной плотной питательной среде. Для глубинного посева одну колонию выделяют из толщи среды петлёй или вырезают стерильным скальпелем маленький фрагмент среды с изолированной колонией, помещают в пробирку с 1 мл физиологического раствора, тщательно ресуспендируют и разводят перед высевом в 100 - 1000 раз. Полученные изолированные колонии анализируют по морфологическим признакам и снова одну типичную колонию рассевают аналогичным образом. Обычно рассев повторяют 2-3 раза.

После «расчистки» необходимо убедиться в степени однородности полученной культуры. Для этого можно воспользоваться визуальным, микроскопическим контролем или высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривают рост микроорганизмов по штриху и сравнивают морфологию полученных изолированных колоний - они должны быть однородными. Микроскопический контроль помогает установить степень однородности клеток в составе колонии. Чистая культура многих микроорганизмов, как правило, морфологически однородна; допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Однако этот метод неприменим для полиморфных микроорганизмов (коринеформных бактерий, микобактерий, актиномицетов и др.). Высев на ряд разнообразных по составу полноценных питательных сред (мясопептонный агар, питательный агар, сусло-агар, картофельный агар и т.п.) помогает выявить присутствие в составе культуры микроорганизмов спутников, которые на каких-либо из этих сред смогут образовать собственные колонии [9].

1.3.2 Методы идентификации бактерий

При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства, морфологию, организацию клетки, физиолого-биохимические особенности, химический состав клеток, содержание гуанина и цитозина (ГЦ) в ДНК и другие фено- и генотипические признаки. При этом необходимо соблюдать следующие правила, работать с чистыми культурами, применять стандартные методы исследования, а также использовать для инокуляции клетки, находящиеся в активном физиологическом состоянии.

Культуральные свойства, т.е. характерные особенности роста бактерий на плотных и жидких питательных средах обычно используют для их характеристики, однако для идентификации применяют довольно редко.

Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию. Полезным может оказаться также выявление в клетках характерных мембранных систем и органелл (хлоросом, карбоксисом, фикобилисом, газовых вакуолей и т.д.), присущих отдельным группам бактерий, а также включений (параспоральных телец, гранул волютина, полигид-роксибутирата, полисахаридов и т.д.). Первостепенное значение для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и строению их клеточных стенок.

Физиолого-биохимические свойства включают прежде всего установление способа питания исследуемой бактерии (фото / хемо-, авто / гетеротрофия) и типа энергетического метаболизма (способность к брожению, аэробному или анаэробному дыханию или фотосинтезу). Важно определить такие признаки, как отношение бактерии к молекулярному кислороду, температуре, рН среды, солености, освещенности и другим факторам среды. В данную группу признаков входит также перечень субстратов, утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы, потребность в витаминах и других факторах роста, образование характерных продуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов. Для этого используют специальные тесты.

Многие тесты, применяемые для обнаружения перечисленных признаков (их иногда называют рутинными тестами), важны для диагностики и широко используются в медицинской микробиологии. Их постановка требует значительных затрат времени, большого количества сложных сред и реактивов, соблюдения стандартных условий проведения. Для ускорения и облегчения процесса идентификации некоторых микроорганизмов, имеющих главным образом медицинское значение, разработаны различные тест-системы: API-20E, Enterotube, Mycolube, Patho-Tec, СИБ, ПБДЭ и другие. Например, система Enterotube, предназначенная для идентификации энтеробактерий, представляет собой пластиковую камеру с 12 ячейками, содержащими окрашенные диагностические среды. Засев всех сред производится поступательно-вращательными движениями через камеру петли с посевным материалом. Инкубацию проводят в течение 24 ч при 37°. О положительном или отрицательном результате теста судят по изменению цвета среды, разрыву агара (тест на газообразование), или после введения специальных реактивов (тест на образование индола, реакция Вогес-Проскауэра). Каждый признак обозначают определенной цифрой, поэтому полученные данные можно ввести в компьютер с соответствующей программой и получить ответ о таксономическом положении исследуемого штамма.

При идентификации симбиотических и паразитических (патогенных) бактерий важно установить специфичность симбионта к хозяину, а также устойчивость к антимикробным веществам и фагам (фаготипирование).

Определение состава клеток бактерий также имеет значение для их систематики (хемосистематика). Хемотаксономические методы могут быть важными, в частности, для тех групп бактерий, у которых морфологические и физиологические характеристики широко варьируются и недостаточны для проведения их удовлетворительной идентификации. В состав клеточных стенок разных прокариот входит несколько классов уникальных гетерополимеров: муреин (или псевдомуреин), липополисахариды, миколовые и тейхоевые кислоты. Состав клеточной стенки 'определяет и серологические свойства бактерий. Это лежит в основе иммунохимических методов их идентификации.

В качестве хемотаксономического маркера иногда используют также липидный и жирнокислотный состав клеток бактерий. Интенсивное изучение жирных кислот стало возможным с развитием метода газо-хроматографического анализа. Различия в составе липидов используют для идентификации бактерий на уровне рода и даже вида. Однако этот метод имеет определенные ограничения, поскольку содержание жирных кислот в клетках может зависеть от условий культивирования и возраста культуры.

В систематике некоторых бактерий учитывается состав хинонов и других переносчиков электронов, а также пигментов.

Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть получена при изучении клеточных белков - продуктов трансляции генов. На основании изучения мембранных, рибосомных, суммарных клеточных белков, а также отдельных ферментов сформировалось новое направление - белковая таксономия. Спектры рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и используются для идентификации бактерий на уровне семейства или порядка Спектры мембранных белков могут отражать родовые, видовые и даже внутривидовые различия. Однако характеристики химических соединений клетки не могут использоваться для идентификации бактерий изолированно от других данных, описывающих фенотип, поскольку нет критерия оценки значимости фенотипических признаков.

Нередко при идентификации бактерий, а иногда и других микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумерической (или адансоновской) таксономии. В ее основе лежат идеи французского ботаника М. Адансона (М. Adanson), предложившего различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, считать равноценными, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отношения числа положительных признаков к общему числу изученных. Сходство между двумя исследуемыми организмами определяется путем количественной оценки возможно большего числа (обычно не менее ста) фенотипических признаков, которые подбирают так, чтобы их варианты были альтернативными и могли обозначаться знаками «минус» или «плюс». Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента сходства (1):

a-\-b+c+d, (1)

где a и d - суммы признаков, по которым штаммы А и В совпадают (a - оба штамма с положительными признаками; d - оба с отрицательными); b - сумма признаков, по которым штамм А положителен, а В-отрицателен; с - сумма признаков, по которым штамм А отрицателен, а штамм В положителен. Значение коэффициента сходства может меняться от 0 до 1. Коэффициент 1 означает полную идентичность, а 0 - полное несходство. Оценки комбинаций признаков производят с помощью компьютера. Полученные результаты представляют в виде матрицы сходства и / или в виде дендрограммы. Нумерическая таксономия может применяться при оценке сходства между таксонами микроорганизмов только невысокого ранга (роды, виды). Она не позволяет делать непосредственные выводы относительно генетического родства микроорганизмов, однако в известной степени отражает их филогенетические свойства. Так, установлено, что фенотипические признаки бактерий, поддающиеся изучению в настоящее время, отражают от 5 до 20% свойств их генотипа.