Методы анализа видового состава и идентификации микроорганизмов

Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе дает возможность построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов [9].

1.3.3 Методы идентификации грибов

Идентификация грибов до классов, порядков и семейств основана на характерных чертах строения и способах образования в первую очередь половых структур. Кроме того, используется характеристика бесполых спороношений, строение и степень развития мицелия (зачаточный, хорошо развитый, септированный или несептированный), культуральные (колония) и физиологические признаки. Дифференциация родов внутри семейств и идентификация видов проводятся с применением морфологических признаков, полученных с использованием электронной микроскопии, а также физиологических и культуральных особенностей. Единого определителя для идентификации всех грибов не существует, поэтому вначале определяют класс или порядок идентифицируемого гриба и далее пользуются соответствующим определителем для этого класса или порядка.

Идентификация дрожжевых грибов, которые относятся к числу широко используемых объектов разных микробиологических исследований, основана на культуральных (макроморфологических), цитологических, физиолого-биохимических особенностях, характеристике жизненных циклов и полового процесса, специфических признаках, связанных с экологией, и проводится с использованием специальных определителей для дрожжей [9].

1.4 Методы разделения грибов, бактерий и определения их содержания

1.4.1 Центрифугирование м/о

Центрифугирование - способ разделения неоднородных, дисперсных жидких систем в поле центробежных сил (центрифугатном поле). Обладает более высокой способностью к разделению, чем отжимание, отстаивание и фильтрование. Центрифугирование осуществляют в центрифугах, принцип работы которых основан на создании центробежной силы, увеличивающей скорость разделения компонентов смеси по сравнению со скоростью их разделения только под влиянием силы тяжести. Эффективность центрифуги оценивают по «фактору разделения» К, который рассчитывают по формуле:

К= (2Пn)²r/g,

где n - число оборотов в мин; r - радиус вращения ротора; g - ускорение свободного падения. В практике чаще с этой целью применяют g, которое может быть найдено из вышеприведенной формулы или по формуле:

g=l, 117*l0^-5N²r,

где N - число оборотов; г - радиус.

Центрифуги состоят из корпуса, двигателя, ротора, механизма передачи, рабочей камеры и панели управления. Гнезда для пробирок или стаканов для более быстрого разделения компонентов смеси располагают под углом (в угловых роторах) или они принимают такое положение при вращении горизонтального ротора. Различия в скоростях седиментации частиц смеси увеличиваются при увеличении плотности среды, в которой происходит разделение. В связи с этим иногда центрифугирование проводят в плотной среде, например, в растворе сахарозы. В микробиологии центрифугирование используют для осаждения микробов, освобождения микробной взвеси от грубых примесей, увеличения плотности микробов в ед. объема и для других целей. В зависимости от массы микробов применяют различные типы центрифуг. В вирусологии и иммунологии обычно нужны центрифуги с высоким фактором разделения, т.н. супер- и ультрацентрифуги. Для осаждения бактерий лучше использовать центрифуги с фактором разделения около 7 тыс. (9 - 10 тыс. об/мин). Осаждение грибов, простейших, животных клеток, грубых примесей проводят на центрифугах с малым фактором разделения (1,5-3 тыс. об/мин). При малых концентрациях процесс оседания частиц затягивается. Его можно ускорить добавлением коагулянта или, например, убитых бактерий этого же вида. Процесс центрифугирование начинают с уравновешивания на специальных весах стаканов с содержащими жидкость пробирками, располагающимися в роторе друг против друга. На дно стаканов следует поместить резиновые прокладки. Перед центрифугированием крышку центрифуги плотно закрывают, включают двигатель, скорость оборотов ротора постепенно увеличивают, доводя до заданной. По истечении времени центрифугирования двигатель выключают, крышку открывают после полной остановки ротора. При центрифугировании живых микробов необходимо строго соблюдать правила асептики и техники безопасности. Центрифугирование взвесей, содержащих микробы, лучше проводить в стеклянных или др. надежно стерилизующихся пробирках. Ватную пробку следует обогнуть вокруг края пробирки или стакана и прижать резиновым кольцом. Использование металлических колпачков допустимо только при малых скоростях вращения. Пробирки не следует наполнять более чем на 1 см от края. Применять для центрифугирования обычные пробирки или бутылки нельзя [10].

1.4.2 Мембранной фильтрации

Мембранная фильтрация незаменима для избавления воды от микробов. Принцип метода мембранной фильтрации - концентрирование присутствующих в анализируемой пробе микроорганизмов на поверхности мембранного фильтра с размером пор 0,45 - 0,65 мкм путем пропускания пробы через фильтр. После фильтрации пробы, фильтр с задержанными микроорганизмами помещают на питательную среду и инкубируют в соответствующих условиях.

Метод мембранной фильтрации обладает следующими преимуществами:

- количественное определение;

- высокая точность;

- исследование проб больших объёмов;

- исключение влияния ингибиторов роста;

- экономия питательных сред;

- экономия времени;

- документирование результата.

Метод мембранной фильтрации решает все недостатки очистки воды от микробов:

Если в исследуемом образце воды ожидается низкое содержание микроорганизмов, мы можем взять большой объем пробы. При фильтрации на мембране задержатся все микробы.

1. Чтобы исключить влияние естественных бактериостатиков, мембрану после фильтрации пробы можно промыть физраствором или дистиллированной водой.

2. Процесс фильтрации занимает немного времени (при использовании установки на 47 мм, и фильтре 0,45 мкм - скорость фильтрации при 90% вакууме 400 - 600 мл/минуту в зависимости от происхождения фильтра).

3. Оборудование компактно, не требует обширного рабочего места

Установка вакуумной фильтрации для анализа жидких проб выполнена из нержавеющей стали, что делает ее долговечной, простой в использовании, позволяет проводить обработку пламенем.

Для работы также потребуются мембранные фильтры и питательные среды.

Питательные среды можно готовить самостоятельно, на что потребуется дополнительное время, персонал, оборудование.

Но удобнее и выгоднее использовать питательные картонные подложки (ПКП).

ПКП - это диск из сорбирующего материала, пропитанный селективной питательной средой, а затем высушенный в специальных условиях и стерильно упакованный в пластиковую чашку Петри. Активация питательной среды проводится непосредственно перед использованием путем смачивания подложки стерильной водой. В комплекте с подложками поставляются стерильные мембранные фильтры.

Материал мембранных фильтров - нитрат целлюлозы. Как показала многолетняя практика, этот материал обеспечивает оптимальные условия роста задержанных микроорганизмов, исключая получение ложного отрицательного результата.

Процесс изготовления ПКП стандартизован и сертифицирован по международным стандартам ISO и GMP. Это означает, что, используя ПКП, Вы застрахованы от влияния человеческого фактора на результат анализа, когда при приготовлении питательной среды не выдержана строго рецептура, что приводит к созданию неудовлетворительных условий для роста микроорганизмов. Или когда в стерилизованную среду случайно вносится загрязнение, что обеспечивает ложный положительный результат.

Технология тангенциальной мембранной фильтрации стремительно завоевывает всемирное признание как важная производственная операция в разных отраслях обрабатывающей промышленности. Возможность проводить высокоспецифичное разделение при низкой или комнатной температуре часто делает мембранную фильтрацию гораздо более рентабельной технологией, чем традиционные решения, такие как барабанные вакуум-фильтры или фильтр-прессы.

Мембранная фильтрация осуществляется под давлением через поры диаметром до 5 микрон и позволяет отделять молекулы массой от 100 единиц. В рамках данной технологии выделяют несколько процессов: обратный осмос (ОО), нанофильтрация (НФ), ультрафильтрация (УФ) и микрофильтрация (МФ) [11].

1.4.3 Метод гидролиза м/о ферментными препаратами

Процесс обработки солью включает три этапа: посол, просаливание и созревание. Посол заключается в контакте поверхности рыбы и соли (или рассола). Просаливание - это проникновение соли в ткани рыбы и их консервирование. На этом обработка рыбы солью с целью консервирования заканчивается для сырья, не созревающего при посоле. Получается соленый полуфабрикат, который в дальнейшем используется для сушки, вяления, копчения, производства консервов или кулинарной продукции. Для созревающей при посоле рыбы начинается биохимический процесс созревания когда рыба теряет запах сырого продукта и приобретает вкус и аромат готового к потреблению гастрономического продукта, причем часто уникального, неповторимого по своим органолептическим характеристикам товара.

В созревании рыбы принимают участие мышечной ткани, внутренних органов и ферментные препараты. Созревание неразделанной рыбы происходит при участии ферментов мышечной ткани и внутренних органов. Созревание разделанной рыбы протекает только при участии ферментов мышечной ткани. Поэтому в первом случае продукт получается более гастрономическим, с букетом «созревания». Ферментные препараты используются для активизации созревания слабосозревающей рыбы или вовсе не созревающей.

Протеолиз (распад белка) в мышечной ткани рыб осуществляется при активном участии ферментов внутриклеточного происхождения - катепсинов, которые действуют с довольно широким оптимумом рН 3-7 и не инактивируются при температуре 50^о С в течение 5 мин. Одним из наиболее изученных является катепсин Д. Он гидролизует гемоглобин, а также растворимые белки и отличается более высокой активностью по сравнению с мышечной тканью наземных животных.

Помимо катепсинов, в созревании принимают участие и другие ферменты протеолитического действия (пептидазы, пептигидролазы). Причем, оптимум их действия лежит в кислой зоне (рН 2,6-3,5). У некоторых рыб (тунца, карпа, горбыля и др.) обнаружена активность и в щелочной зоне рН 8-8,5. Активность протеолитических ферментов разных видов рыб меняется в зависимости от сезона вылова, размеров рыбы. Способность ферментов расщеплять белки рыбы подвержена существенным колебаниям внутри вида, и при обработке сырья следует учитывать различную активность ферментов мышечной ткани в разные периоды вылова рыбы.

Хлористый натрий, который используется в качестве основного консерванта при посоле, вялении, копчении, оказывает ингибирующее действие на протеолитические ферменты.

В слизистой оболочке кишечника и пилорических придатках многих рыб содержится фермент трипсин и другие протеиназы (пепсин, энтерокиназа). У некоторых видов рыб (налима, судака, леща) пепсин примерно в 150 раз, а трипсин в 14 раз энергичнее связывается с субстратом (белком), чем аналогичные ферменты у млекопитающих. Во внутренних органах рыб найдены пептидазы: лекцин - аминопептидаза, карбоксипептидаза, дипептидаза, трипсиноподобные эндопептидазы.

Для технологической обработки важно, что температурный оптимум пищеварительных ферментов у рыб значительно ниже, а способность расщеплять белки выше, чем у наземных животных. Имеет значение также сезонная изменчивость активности пищеварительных ферментов. Так, максимум активности пепсина и трипсина у налима, судака, леща совпадает с периодами интенсивного питания.

Для ускорения процесса созревания, особенно слабосозревающей рыбы, используют ферментные препараты. Ферментный гидролиз на основе ферментных препаратов основан на глубоком и быстром расщеплении белковых молекул, изменении структурных показателей мышечной ткани и улучшении физикохимических и органолептических показателей готовой продукции. К ферментам, которые могут быть использованы при обработке пищевых продуктов, предъявляются следующие требования: они должны обладать определенным и направленным действием, быть активными в зоне рН и безвредными. Последнее особенно важно, поскольку соленая рыба не подвергается тепловой обработке, во время которой должно разрушаться остаточное количество ферментных препаратов. Одной из главных особенностей ферментных препаратов должна являться их способность не только расщеплять белки, но формировать вкусоароматический букет соленой рыбы. Поэтому ферменты животных непригодны, ферменты микробиологического синтеза пока остаются на стадии эксперимента. Ферментные препараты грибкового происхождения дают положительные результаты, но необходим постоянный контроль за гидролизом белков в течение всего срока хранения рыбы. Поэтому в последнее время развивается направление по использованию ферментов внутренних органов рыб.

Ферментные препараты получают из внутренностей хорошо созревающей рыбы (минтая, терпуги). Ферментный препарат получил название «Океан» и успешно применяется при посоле обесшкуренного рыбного филе, обычного филе, тушек рыб, при скорости гидролиза белков, как при созревании неразделанной рыбы. Ферментный препарат представляет собой жидкость от светло-коричневого до коричневого цвета и содержит весь набор пищеварительных ферментов, активных в области рН6-9. По существу, ферментный препарат содержит большое количество балластных белков и небелковых соединений, которые придают препарату рыбный запах и вкус. В препарат «Океан» добавляется в качестве консерванта поваренная соль (10-12% от массы).

Таким образом, ускорение созревания соленой продукции основано на применении ферментных препаратов из внутренностей хорошо созревающей рыбы. Не исключается использование ферментов грибкового происхождения при разработке методов их разделения и ускорения созревания.

Созревание соленой рыбы является комплексным биохимическим процессом, направленным на гидролиз белков, жиров, углеводов собственными ферментами мышечной ткани, внутренностей с последующими реакциями взаимодействия образовавшихся продуктов полураспада и окисления, в результате которых мышечная ткань рыбы приобретает своеобразный вкус и аромат, хорошую консистенцию и становится пригодной в пищу без дополнительной обработки. Скорость созревания соленой рыбы определяется активностью протеолитических, липолитических, амилолитических ферментов, а также строением, составом белков, липидов, температурой хранения продукта и другими факторами.

Созревание соленой рыбы прежде всего связано с превращениями белков. Полный период созревания можно условно разделить на три этапа.

Первый этап проходит под воздействием пептидгидролаз мышечной ткани. Этот период характеризуется небольшим накоплением всех небелковых фракций и приводит к преимущественному образованию крупных пептидных фрагментов. На этом этапе пептидазы и прежде всего катепсин Д подготавливают белки к воздействию на них других ферментов, в том числе ферментов внутренностей.

Второй этап характеризуется активно идущим протеолизом под суммарным воздействием ферментов мышечной ткани и внутренностей. Отмечается количественный рост всех азотсодержащих веществ. Крупные «осколки» белковой молекулы, образовавшиеся в начальный период созревания, подвергаются дроблению до мелких пептидов и свободных аминокислот ферментами внутренних органов.

Третий этап отмечается формированием вкуса и аромата. Образовавшиеся три-, дипептиды, аминокислоты, весьма реакционноспособны и вступают во взаимодействие с продуктами распада и окисления жиров (летучими жирными кислотами, альдегидами, кетонами, перекиси, спиртами) веществами амилолитического распада гликогена (мальтозой, глюкозой) и фосфоролиза глюкозы (фосфодиоксиацетоном, фосфоглицериновым альдегидом, пировиноградной, молочной кислотами и др.).

Появление гастрономического вкуса и аромата соленой рыбы связано с синтезом новых веществ из продуктов полураспада и распада естественных компонентов мышечной ткани. Таким образом, не только белки, но и жиры и углеводы принимают участие в формировании вкусо-ароматических свойств созревающей соленой рыбы. Созревшая рыба имеет несколько разрыхленную консистенцию, что способствует более равномерному распределению межмышечного или локализованного жира по всей мышечной ткани и усиливает впечатление приятного вкуса и запаха.

Процесс созревания необходимо контролировать во избежание перезревания рыбы и последующего микробиологического гниения. Органолептически (по вкусу, запаху, консистенции) контроль созревания осуществлять сложно, так как это субъективно и неубедительно. Поэтому определяют количество небелковых азотистых экстрактивных веществ. По соотношению небелкового и белкового азота устанавливают степень созревания рыбы. Полагают, что 30% небелкового азота аминокислот, пептидов, аммиака характеризуют готовность продукта к потреблению. Оценку готовности соленой рыбы определяют также по показателю буферной емкости. Между степенью созревания, устанавливаемой органолептически, и величиной буферной емкости водной вытяжки и мяса соленой рыбы имеется определенная связь. В лабораторной практике при проведении экспертизы обычно устанавливают величину буферной емкости.

Скорость созревания рыбы зависит прежде всего от температуры. Чем выше температура посолочной смеси, тем активнее созревание, но тем сложнее контролировать процесс. Однако при более низких температурах созревания продукт получается маслянистее, ароматнее, вкуснее. При слишком активном созревании тормозят биохимические процессы в рыбе после ее просаливания путем охлаждения и даже замораживания, чтобы исключить перезревание [12].

1.4.4 Метод подавления м/о бактерицидами и фунгицидами

Бактерициды (от слова бактерии и лат. caedo - убиваю), вещества, убивающие бактерии. Известны также вещества бактериостатического. действия, которые не убивают бактерии, а препятствуют их развитию. Многие бактерициды активны против др. микроорганизмов - грибов, водорослей, вирусов и т.п.; в свою очередь фунгициды, напр., часто обладают бактерицидным действием. Бактерициды применяют как дезинфекцию, средства, для обеззараживания воды, как антисептики, химиотерапевтического и дерматологического средства, для защиты материалов и изделий от биоразрушения, борьбы с бактериозами растений и разложением удобрений почвенными бактериями.

В качестве бактерицидов используют следующие группы химических соединений:

1. Вещества, в молекулах которых содержится активный атом С1 - гипохлориты, хлорная известь, СЮ₂, С1₂, дихлоризоцианурат Na, трихлоризоциануровая кислота, N-хлорсукцинимид, хлорамины, три- и пентахлормеламины и другин. Эти бактерициды малоизбирательны и применяются главным образом для обработки воды и дезинфекции.

2. Йод, йодоформ (применяемые как антисептикиХ а также иодофоры - комплексы иода, чаще всего с неионными ПАВ.

3. Ароматические гидроксисоединения - фенол, крезолы, хлорфенолы, бензил- и фенилфенолы, галогенсодержащие 2,2'-дигидроксидифенилметаны (ди-, тетра- и гексахлорофены) и анилиды салициловой кислоты. Применяются как дезинфекционные и антисептические средства; обладают высокой фунгицидной активностью.

4. Спирты: этанол, изопропанол, бензиловый и дихлорбензиловый спирты, 2-феноксиэтанол и другие. Применяются, главным oбразом, как растворители и добавки для стабилизации фармацевтических и косметических препаратов.

5. Окислители: Н₂О₂, СН₃СОООН, КМnО₄, О₃.

6. Альдегиды: глутаровый, формальдегид, а также соединения, его образующие (тригидроксиметилнитрометан, N-метилоламиды, гексаметиленимин, 1,3,5 - триалкил- и 1,3,5 - три - (гидроксиэтил) гексагидро-сим-триазины и др.).

7. Соли и комплексные соединения Ag; соли Hg и ртутьорганические соединения (фенилмеркурборат, этилмеркуртиосалицилат Na и др.).

8. Четвертичные соли - С₁₂-С₁₄-алкилдиметиламмоний-хлориды и ди(С₈-С₁₀-алкил) диметиламмонийхлориды.

9. С₈-С₁₀-Алкиламины, гуанидины и бигуаниды, некоторые карбоксипроизводные 1,3 - пропилендиамина и диэтилентриамина.

К бактерицидам, применяемым в качестве химиотерапевтических средств, относятся антибиотики, сульфаниламидные препараты, амиды и тиоамиды пиридин и пиразинкарбоновых кислот, производные 5-нитрофурана и оксихинолина, налидиксовая и оксолиниевая кислоты и другие. Эти вещества отличаются наибольшей специфичностью и малой токсичностью.

Действие большинства бактерицидов зависит от температуры и рН среды. Активность их в присутствии белков обычно снижается, в присутствии ПАВ изменяется по-разному, например, анионные ПАВ усиливают действие спиртов и фенолов, не влияют на хлорамины и ослабляют действие четвертичных солей.

Фунгициды - химические вещества, способные полностью (фунгицидность) или частично (фунгистатичность) подавлять развитие возбудителей болезней сельскохозяйственных растений и используемые для борьбы с ними.

Фунгициды подразделяют на группы:

В зависимости от химических свойств:

* неорганические (соединения серы: известково-серный отвар, молотая и коллоидная сера; меди: медный купорос, хлорокись меди, ртути: хлорная ртуть);

* органические (производные карбаминовой кислоты, фтальимиды, хиноны, эфиры динитроалкалфенолов, ртутьорганические соединения, оксатииновые соединения, препараты на основе бензимидазолов).

В зависимости от действия на возбудителя:

* профилактические, или защитные (предупреждают заражение растения или приостанавливают развитие и распространение возбудителя в месте скопления инфекции до того, как произойдёт заражение, подавляя главным образом его репродуктивные органы);

* лечебные, или искореняющие (действуют на мицелий, репродуктивные органы и зимующие стадии возбудителя, вызывая их гибель после заражения растения).

По характеру использования:

* протравители семян (используются для борьбы с болезнями, возбудители которых распространяются с семенами или находятся в почве);

* препараты для обработки почвы (уничтожают почвенных возбудителей болезней растений, особенно эффективны в парниках и теплицах);

* препараты для обработки растений в период покоя (уничтожают зимующие стадии возбудителя, используются рано весной до распускания почек, поздно осенью и зимой);

* препараты для обработки во время вегетации (в основном препараты профилактического действия, применяемые летом);

* препараты для опрыскивания, фумигациии хранилищ, в частности зернохранилищ и овощехранилищ.

По характеру распределения внутри тканей растений фунгициды делятся на:

* контактные (локальные);

* системные (внутрирастительные).

Контактные фунгициды при обработке ими растений остаются на поверхности и вызывают гибель возбудителя при соприкосновении с ним. Некоторые из них обладают местным, глубинным действием, например способны проникать в наружные оболочки семян. Эффективность контактных препаратов зависит от продолжительности действия, количества, степени удерживаемости на обрабатываемой поверхности, фотохимической и химической стойкости, погоды. Системные фунгициды проникают внутрь растения, распространяются по сосудистой системе и подавляют развитие возбудителя вследствие непосредственного воздействия на него или в результате обмена веществ в растении. Эффективность их в основном определяется скоростью проникновения в ткани растений и в меньшей степени зависит от метеорологических условий. Быстрый рост масштабов использования системных фунгицидов в практике мирового сельскохозяйственного производства объясняется рядом их преимуществ перед препаратами контактного действия:

1. Быстрым (в течение 0,5 - 1 ч) поглощением растениями; поэтому их эффективность в меньшей степени, чем контактных, зависит от осадков.

2. Способностью передвигаться по растению (чаще всего по ксилеме) и защищать прирост, появившийся уже после обработки, тогда как контактные препараты защищают только те части растения, на которые наносятся;

3. Продолжительность их защитного действия составляет 2 - 4 недели, а иногда и больше, контактных - 7 - 10 дней, а в действительности - до первого обильного дождя.

4. Системные фунгициды защищают растения не только от инфекции, находящейся на поверхности семян, но и от внутренней инфекции, а стойкие системные фунгициды - и от аэрогенной инфекции на ранних фазах развития растений (30 - 45 дней).

5. Системные фунгициды в большинстве случаев характеризуются защитным и лечебным действием, тогда как контактные - только защитным, поэтому обработку ими можно проводить не только до начала заболевания растений по прогнозу, но и после появления видимых признаков болезни, т.е. после прорастания спор и внедрения гифов.

Протравители семян химические препараты из группы фунгицидов для обеззараживания (протравливания) семян и другого посадочного материала (рассады, сеянцев, клубней и т.п.) с целью защиты растений от болезней в начальном периоде роста и развития. По своему назначению протравители семян могут быть одноцелевыми, т.е. предохранять растения только от болезней, и комбинированными. Комбинированные, в которые входят несколько действующих веществ, защищают семена и всходы от почвенной микрофлоры и обитающих в почве насекомых; предохраняют семенные клубни и корнеплоды от болезней при хранении, семена - от склевывания птицами; улучшают развитие растений и повышают их устойчивость к неблагоприятным условиям погоды, иногда и к действию гербицидов.

Конечно, деление фунгицидов на группы условно. Например, многие профилактические препараты в больших дозах или повышенных концентрациях обладают лечебным действием, протравители семян уничтожают также возбудителей болезней, обитающих в почве.

Применяют фунгициды путем опрыскивания и опыливания растений и почвы, протравливания семян, фумигацией семян и хранилищ. Формы препаратов - дусты, эмульсии, суспензии, смачивающиеся порошки, аэрозоли. При систематическом использовании одних и тех же фунгицидов эффективность их может снижаться вследствие образования стойких рас возбудителя. Чтобы предотвратить это явление, необходимо строго соблюдать дозы расхода препарата и чередовать применяемые фунгициды, используя блочную систему применения (контактные фунгициды - системные фунгициды - контактные фунгициды). Также для расширения спектра фунгицидного действия необходимо применять комбинированные препараты.

Токсичность фунгицидов для растительных организмов зависит от химической природы, концентрации или дозы препарата, возраста растений, анатомии и морфологии их тканей, особенности метаболизма, погодных условий. При завышенных по сравнению с рекомендуемыми, дозах или концентрациях фунгицидов могут вызвать ожоги и отмирание тканей. Для теплокровных животных (и человека) большинство фунгицидов обладает слабой токсичностью - летальная доза, при которой погибает 50%, от 500 до 11000 мг на 1 кг массы. Чтобы избежать неблагоприятного влияния фунгицидов на окружающую среду, необходимо строго соблюдать правила использования данных средств защиты растений, особенно дозы и сроки обработки [13].

2. Экспериментальная часть

Целью данной работы являлось изучение методов анализа видового состава и идентификации микроорганизмов.

Все проведенные исследования включают следующие этапы: отбор проб, посев проб на питательные среды, выращивание посевов, выделение и идентификация «чистых» культур микроорганизмов, формирование коллекции штаммов микроорганизмов для тестирования различных средств и методов противомикробной защиты.

В ходе эксперимента тщательно соблюдались условия асептики работы с тест-культурами.

2.1 Материалы и микроорганизмы

При проведении измерений использовались следующие материалы и оборудования:

Бактериологические петли, стеклянные шпатели, спиртовки, этиловый спирт, стерильные пробирки, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1, 2, и 10 мл, штативы для пробирок, водяная баня, термостаты на 30 и 37⁰С, культуры бактерий и грибов на наклоненном агаре и в чашках Петри, ПА, ФР, СА, этиловый спирт, диактин, спиртовки и спички, стерильные фильтры, маркер

Используемые питательные среды:

1. Физиологический раствор (ФР). 8,5 г хлористого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. Стерилизуют при 0,15 МПа в течение 20 минут.

2. Питательный агар (ПА). Может быть приготовлен из сухого агара (способ приготовления приведен на этикетке): сухой питательный агар - 35,0 г; сухой экстракт кормовых дрожжей - 2,5 г; глюкоза - 1,0 г; вода дистиллированная - 1 л. Готовят среду, устанавливают pH 7,0, фильтруют, стерилизуют при 0,12 МПа в течение 20 минут.

3. Сусло-агар (СА). Во флаконы с СБ вносят агар-агар до концентрации 2,0-2,5% для плотной среды и 1,0-1,5% для полужидкой. Стерилизуют при 0,5 атм 30 мин [14].

2.1.1 Питательные среды для культивирования бактерий и грибов

В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах, поэтому питательная среда должна содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред.

По составу принято выделять естественные, или натуральные, среды и синтетические среды.

Натуральными называют среды, в состав которых входят продукты животного или растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, разведенная кровь, молоко, воды морей, озер и минеральных источников, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов, таких как мясо, почва, навоз, различные части растений, клетки микроорганизмов.

На натуральных средах хорошо растут многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей.

Мясопептонный бульон (МПБ). Основой для его приготовления служит мясная вода, которую готовят следующим образом: 500 г. мяса, освобожденного от костей, жира и сухожилий, мелко нарезают или пропускают через мясорубку, заливают 1 л водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 ч или в термостате при 30° на 6 ч, а при 37° на 2 ч. За это время из мяса экстрагируются различные вещества, в том числе водорастворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю, и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначального объема. К мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl.

МПБ - богатая питательная среда, но она почти не содержит углеводов. В случае необходимости их добавляют к МПБ чаще всего в количестве 1 - 2 г на 100 мл. МПБ стерилизуют при 1 атм.

Солодовое (неохмеленное пивное) сусло - хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов. Основные компоненты сусла - углеводы (до 90% от общей массы сухого остатка) и азотсодержащие соединения (до 6-7% от общей массы сухого остатка). Из углеводов в наибольшем количестве содержатся мальтоза и декстрины. В состав сусла входят витамины, преимущественно группы В, органические кислоты и минеральные соли.

Сусло готовят следующим образом. 250 г. размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48-50° и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие полчаса температуру поднимают до 55-58° и поддерживают на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т.е. до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и пептидов. Полученный экстракт фильтруют через бумажную пульпу или вату. В фильтрате определяют концентрацию сахара, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (°Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в сусле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой. Для культивирования микроскопических грибов чаще всего используют 3 - 4°С сусло, для дрожжей 6-8°С, а для наиболее требовательных молочнокислых бактерий 8-12°С сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Дрожжевая среда используется для культивирования ряда гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды - дрожжевая вода. Для ее приготовления 70 - 100 г. свежих прессованных или 7 - 10 г. сухих дрожжей 30 мин кипятят в 1 л воды и после осаждения клеток дрожжей жидкость декантируют или фильтруют через вату. К фильтрату добавляют 1 л воды, еще раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. К 100 мл полученной дрожжевой воды добавляют 1 - 2 г углеводов и минеральные соли, чаще всего К₂НРС₄ (0,1 г) и NaCl (0,5 г). Доводят рН среды до 6,8 - 7,2. Среду стерилизуют при 0,5 атм 20 - 30 мин.

Картофельная среда используется в основном для культивирования спорообразующих бактерий, представителей рода Caulobacter и некоторых других хемоорганотрофных бактерий. Для приготовления этой среды 200 г. тщательно вымытого и очищенного от кожуры и глазков картофеля нарезают мелкими ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 20 - 30 мин. Отвар фильтруют через вату, доводят объем фильтрата до 1 л и разливают в сосуды для культивирования. Среду стерилизуют 1 ч при 1 атм или 30 мин при 1,5 атм.

Синтетические среды - это среды, в которые входят лишь соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Синтетические среды широко используют при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. Наряду с натуральными и синтетическими средами выделяют так называемые полусинтетические среды. Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического состава - углеводы, соли аммония или нитраты, фосфаты и т.д. Однако в их состав всегда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизат казеина. Эти среды находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Примером индикаторной среды для выявления бактерий из группы кишечной. палочки в естественных субстратах может служить агаризованная среда Эндо следующего состава, г: пептон - 10; лактоза - 10; К₂НРО₄ - 3,5; NaHS0₃ - 2,5; агар - 150; вода дистиллированная - 1000 мл; рН 7,4. К среде добавляется 4 мл 10%-ного спиртового раствора основного фуксина. Среду стерилизуют при 1 атм 15 мин и сохраняют в темноте. Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют малиновые колонии с металлическим блеском.

При определении видовой принадлежности бактерий используют рН-индикаторные среды, в состав которых входит один из индикаторов - нейтральный красный (0,0005%), феноловый красный (0,005%) или бромтимоловый синий (0,0005%). Если развитие микроорганизмов сопровождается образованием кислоты или щелочи, цвет индикатора изменяется. Дифференциально-диагностические среды особенно широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.

По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие и плотные среды.

Жидкие среды широко применяют для накопления биомассы или продуктов обмена, для исследования физиологии и биохимии микроорганизмов, а также для поддержания и сохранения в коллекции культур микроорганизмов.

Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.

Плотные среды используют для выделения чистых культур, в диагностических целях для описания колоний, для определения количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для хранения культур в коллекциях и в ряде других случаев. С целью уплотнения сред применяют агар или желатину. Плотной основой могут служить пластинки силикагеля, которые пропитывают питательной средой.

Агар используют для уплотнения сред особенно часто. Он представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входит агароза и агаропектин. Кроме того, агар включает небольшое количество легко ассимилируемых веществ и различные соли. Агар получают из некоторых морских водорослей и выпускают в виде пластин, стебельков или порошка. Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при 100° и затвердевает при температуре 40°. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать значительную часть известных микроорганизмов.

Чаще всего агар добавляют к средам в количестве 1,5%. Если необходимо получить более влажную среду, вносят 1,0%, а более плотную и сухую - 2 - 3% агара. Среду с агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного его расплавления. Если предполагают выращивать микроорганизмы на скошенной агаризованной среде в пробирках, то каждую пробирку заполняют средой не более чем на 1/3. Чтобы среда не подсыхала, ее скашивают после стерилизации, перед посевом. Для этого пробирки с расплавленной в кипящей водяной бане средой устанавливают в наклонном положении и дают среде застыть. Скошенная агаризованная среда не должна доходить до ватной пробки на 4 - 6 см. Среду, предназначенную для культивирования бактерий в чашках Петри, разливают по 20 - 25 мл в пробирки большего объема, чем для скошенной агаризованной среды, или стерилизуют в колбах. В последнем случае до стерилизации агар не расплавляют.

Агар имеет слабощелочную реакцию, поэтому его добавление может привести к незначительному повышению рН среды. В слабокислых, нейтральных или слабощелочных средах агар сохраняет способность образовывать гель после нескольких циклов плавления и затвердевания и даже после повторной стерилизации. Однако необходимо помнить, что при рН среды ниже 5,5 агар при стерилизации частично гидролизуется и поэтому теряет способность образовывать гель, т.е. не застывает. В этом случае его стерилизуют отдельно от среды в определенном объеме воды, расплавляют на водяной бане и приливают при постоянном перемешивании к стерильной, предварительно подогретой среде.

Агар, как указывалось выше, содержит примеси органических
и минеральных веществ, которые иногда нежелательны. Чтобы избавиться от большинства из них, поступают следующим образом, агаризованной среды в пробирках Агар заливают водопроводной водой и ставят в термостат на 30 - 37°. Примеси вымываются в воду и разлагаются под действием развивающихся в ней микроорганизмов. Через день - два жидкость сливают, агар промывают несколько раз свежей водой, снова заливают водой и вновь ставят в термостат. Когда и эта вода помутнеет, то ее опять заменяют новой, и так делают до тех пор, пока не исчезнет запах, а вода не перестанет мутнеть. Обычно через 2 - 3 недели, получают агар, почти лишенный растворимых органических и минеральных веществ. Воду сливают, агар помещают в двойной марлевый меток и 2 - 3 суток промывают проточной водопроводной водой, затем раскладывают его тонким слоем и просушивают на воздухе или в сушильном шкафу при 40 - 50 °С.

Эффективно заменять агар может более дешевый каррагенан, экстрагируемый из определенных видов красных морских водорослей. Каррагенан не разрушается большинством видов микроорганизмов. Из него можно готовить гели, устойчивые к температурам до 60 °С. Среды с каррагенаном готовят, как и среды с агаром. После добавления каррагенана к основной жидкой среде ее кипятят, чтобы полностью растворить его, а затем стерилизуют автоклавированием. Стерильную среду охлаждают до 55 - 60 °С, разливают в чашки и дают застыть. Для гелей, устойчивых при 60 °С, добавляют 2,4% каррагенана, при 45 °С - 2,0%.

Иногда для экономии агара используют его смесь с полиак-риламидами (Separan NP-10, пластагар) в соотношении 1:1.

Желатина - это экстракт, получаемый из субстратов, богатых коллагеном - белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи. Образуемый желатиной гель плавится при температуре 25 °С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30 - 37 °С). Кроме того, желатина разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатины ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Желатину используют главным образом в диагностических целях - для выявления протеолитической активности микроорганизмов, а также для получения гигантских и глубинных колоний дрожжей. В первом случае употребляют мясопептонную, во втором - сусловую желатину.

К жидким средам добавляют 10 - 20% желатины, оставляют набухать 5 - 10 мин и нагревают на водяной бане до растворения. Доводят рН среды до 6,8-7,0. Желатина имеет кислую реакцию и обладает большой буферностью, поэтому на ее нейтрализацию идет больше щелочи, чем, например, на нейтрализацию МПА. Желатиновые среды стерилизуют при 0,5 атм 15 мин или дробно - 3 раза по 20 мин в кипятильнике Коха. Повторная стерилизация желатиновых сред, особенно при рН сред ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, поскольку желатина частично гидролизуется и теряет гелеобразующие свойства.

Кремнекислый гель (силикагель) используют иногда как твердую основу для синтетических сред. Гель готовят следующим образом. К соляной кислоте плотностью 1,1 добавляют при перемешивании равный объем раствора жидкого стекла (Na₂Si0₃ или K₂Si03) той же плотности. Смесь разливают в чашки Петри по 20 - 30 мл в каждую и оставляют чашки на горизонтальной поверхности на несколько часов до образования кремнекислого геля. Когда гель станет плотным, открытые чашки помещают в стеклянный или эмалированный сосуд, промывают 2 - 3 суток проточной водой для удаления хлоридов, а затем несколько раз горячей дистиллированной водой. Об отсутствии хлоридов судят по качественной пробе промывных вод с 1 - 5%-ным раствором азотнокислого серебра: при наличии хлоридов образуется белый осадок. Отмытые от хлора пластинки пропитывают 23 мл концентрированной среды, содержание компонентов в которой в 5 - 10 раз выше, чем в соответствующей среде. Затем чашки с гелевыми пластинками помещают открытыми в сушильный шкаф и подсушивают при 50 - 60°С, следя за тем, чтобы гель не растрескался и его поверхность осталась влажной. Если необходимо, чашки завертывают в бумагу и, не переворачивая, стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 15 мин. Пластинки, предназначенные для выделения и культивирования автотрофных бактерий, можно не стерилизовать. Стерилизуют только среду, которой пропитывают гель. Чашки с силикагелевыми пластинками до употребления сохраняют под водой [9].

2.1.2 Выделение чистых культур бактерий и грибов

Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевается потомство бактерий, возникающее в результате размножения одной микробной клетки.

Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды.

Очень широко применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.

Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воздействию определенных факторов внешней среды. Индивидуальная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных микробов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из. патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологический метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43 - 45 °С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливающегося роста. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во вторую и третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 180°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется постепенно, и по линиям сетки, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов [15].

2.2 Методы анализа

2.2.1 Метод определения общего содержания бактерий и грибов

Метод определения общего содержания бактерий.

Метод основан на способности мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при 30 ⁰С на протяжении 72 часов.

Количество продукта, который засевают, устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного осеменения в соответствии с таблицами в ГОСТах. Для мороженого засевают разведение пробы 10^-1, 10^-2, 10^-3. Каждое разведение должно быть засеяно в количестве 1 мл. в чашку Петри и залито 10 - 15 мл. расплавленным и охлажденным до температуры 45 ⁰С питательной средой для определения общего количества бактерий (ОКБ). Содержимое чашки Петри старательно перемешивают путем легкого кругового движения для равномерного распределения засеянного материала. После застывания агара в чашке Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком положении в термостат с температурой 30 ⁰С на 72 часа [14].

Методы определения содержания грибов.

Разведения готовят в стерильном физрастворе, пользуясь постоянным коэффициентом разведения, равным 10. Для приготовления разведений физраствор разливают по 9,0 (4,5) мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1,0 (0,5) мл исследуемой воды, взятой стерильной пипеткой, переносят в пробирку с физраствором - это первое разведение 1:10. Полученную в первом разведении суспензию тщательно перемешивают стерильной пипеткой. Этой же пипеткой берут 1,0 (0,5) мл полученного разведения и переносят во вторую пробирку с физраствором - это второе разведение 1:100. Таким же образом готовят и последующие разведения.

Из каждой пробы и ее разведений производят посев по 1,0 мл параллельно на две чашки с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. С флаконов, содержащих исследуемую пробу, снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего пробу тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку. Эту операцию производят перед приготовлением разведений. Стерильной пипеткой отбирают 1 мл пробы (и ее разведений), вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку. При этом для каждой пробы и для каждого разведения используется отдельная стерильная пипетка. Посевы из разведений можно делать одной пипеткой, но начинать следует обязательно из большего разведения. После внесения пробы (и ее разведений) в эти чашки, с соблюдением условий стерильности, заливают остуженный сусло агар в количестве 10,0 - 12,0 мл. Пробу быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку. Необходимо полностью заливать дно чашки, избегая попадания среды на края и образования пузырьков воздуха. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Чашки с посевом оставляют к вверх дном. Посевы выращивают при температуре 20 - 25 ^оС в течение 5 суток. Подсчет колоний, выросших на поверхности и в глубине агара, производят при помощи лупы. Нельзя оставлять при температуре выше 28 ⁰С так как дрожжи и плесени погибают [15].