Методы анализа видового состава и идентификации микроорганизмов

2.2.2 Метод центрифугирования м/о

Порядок проведения работы:

1. Прежде всего готовят соответствующее количество раствора для промывания клеток, получаемых после центрифугирования. Объем раствора должен быть в 4 - 6 раз больше объема культуры, а значения ионной силы и рН промывающего раствора и ростовой среды должны быть очень близки. Перед использованием раствор стерилизуют и охлаждают до 0 - 4 °С.

2. Используемый в работе центрифужный ротор охлаждают в холодильнике. Предостережение: нельзя помещать ротор, имеющий комнатную температуру, на ось центрифуги, а затем охлаждать его с помощью центрифужной системы охлаждения. При этом ротор может сжаться и настолько плотно закрепиться на оси, что впоследствии возникнут сложности при его снятии.

3. Стерилизуют несколько центрифужных пробирок с крышками (полипропиленовые и поликарбонатные пробирки можно автоклавировать) и дают им остыть. Для сохранения стерильности пробирки при ее последующем использовании перед автоклавироваиием крышку и верхнюю часть пробирки обертывают алюминиевой фольгой.

4. Определяют объем центрифужных пробирок и с соблюдением правил асептики заполняют их на 2/3 бактериальной культурой. Пробирки попарно уравновешивают. Если окажется непарная пробирка, ее уравновешивают с пробиркой, заполненной дистиллированной водой. Все пробирки надежно закрывают стерильными крышками.

5. Помещают попарно уравновешенные пробирки в ротор друг против друга.

6. Проводят центрифугирование в соответствующих условиях согласно инструкции фирмы-изготовителя. Большинство бактерий осаждаются при центрифугировании в течение 10-15 мин при 10000 g. Некоторые центрифужные системы имеют специальное приспособление, ограничивающее вибрацию ротора при его вращении с малыми скоростями (при остановке). Если такое приспособление отсутствует, не исключена опасность взбалтывания осадка.

7. Пробирки вынимают осторожно из ротора и отмечают положение бактериального осадка. Надосадочную жидкость в стерильных условиях декантируют или переносят пипеткой в стерильный сосуд. При этом практически невозможно не вызвать частичного ресуспендирова-ния бактериального осадка. Чтобы бактерии не попадали в сосуд, приходится оставлять часть надосадочной жидкости в пробирке.

8. Каждую пробирку с бактериальным осадком с соблюдением правил асептики заполняют на 2/3 объема стерильным холодным раствором для промывания. Осадок бактерий суспендируют в этом растворе с помощью миксера типа Vortex. Этапы 4 - 6 повторяют не менее 4 раз, меняя раствор для промывания.

9. После завершения промывки надосадочную жидкость удаляют с соблюдением правил асептики и осадок суспендируют в небольшом количестве стерильной среды. Полученную суспензию используют в дальнейших исследованиях.

Число отмывок при центрифугировании зависит от условий культивирования, объема раствора для промывания и объема сырой биомассы. Если сырая биомасса занимает около 1/10 объема всей куль-туральной суспензии, то 4-кратной промывкой объемами раствора, равными исходному объему культуры, удаляется до 99,99% всех растворимых примесей. Несколько промывок нельзя заменить одной, объем которой равнялся бы суммарному объему всех промывок, поскольку каждая последующая промывка снижает уровень примесей почти в 10 раз [16].

2.2.3 Метод фильтрации м/о

Чистота молока характеризует санитарные условия его получения.

Степень чистоты определяют специальными приборами типа «Рекорд» или прибором ЦНИМСП. Для определения количества механической примеси в молоке существует несколько методов: весовой, метод отстоя и метод фильтрации. Последний служит официальным критерием степени чистоты молока и наиболее пригоден для анализа его на ферме. Метод основан на фильтровании молока и сравнении количества осадка на фильтре с эталоном для установления степени чистоты молока. Для этого желательно использовать таблицу, предложенную Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии (ВНИИВС). В зависимости от количества механических примесей на фильтре молоко по степени чистоты делиться на три группы. Молоко Й группы не должно иметь видимых частиц механических примесей. Молоко ЙЙ группы имеет на фильтре слабо заметные следы их. Молоко ЙЙЙ группы имеет на фильтре заметный осадок примесей (в виде точек). Согласно ГОСТ 13264-88 молоко, продаваемое государству, при отнесении его к 1-му сорту должно иметь степень чистоты по эталону Й группы ко 2-му сорту - ЙЙ группы.

Порядок проведения работы

Прежде чем фильтровать молоко, его надо нагреть от 35 до 40 °С. Что способствует растворению комочков сливок, которые, задерживаясь на фильтре. Маскируют наличие механических примесей.

1) На металлическую сетку прибора положить фильтровальный кружок, зажав его металлической сеткой и винтовым затвором.

2) 250 мл молока тщательно перемешать и быстро. Не давая механическим примесям осесть, вылить в сосуд по стенке, чтобы не повредить фильтровальный кружок. По окончании фильтрования молока фильтр положить на лист бумаги и просушить на воздухе, не допуская попадания пыли.

3) Фильтровальный кружок сравнить с эталоном и установить группу чистоты молока.

При наличии большого количества механических примесей молока считается недоброкачественным, так как вместе с механическими частицами в него попадают микроорганизмы [17].

2.2.4 Анализ физиологической активности м/о методом редуктазной пробы

Требования к качеству полноценного молока сводятся в основном соблюдению условий, ограничивающих возможность попадания в него бактерий. Об общей бактериальной обсемененности молока можно судить по пробе на редуктазу. По этой пробе судят о санитарных условиях получения молока и о его свежести. Определение бактериальной загрязненности молока проводят не реже одного раза в декаду. Данные первого определения действительны до следующего определения. Согласно ГОСТ 13264-88 молоко, продаваемое государству, при отнесении его к 1-му сорту должно иметь бактериальную загрязненность по редуктазной пробе Й класса, ко 2-му сорту - ЙЙ класса. Проба на редуктазу.

Редуктаза - фермент, вырабатываемый микроорганизмами. Чем боль-ше в молоке микробов, тем больше и фермента. Этот фермент способен обесцвечивать краски - метиленовую синь или резазурин. Чем быстрее про-изойдет обесцвечивания, тем больше в молоке микроорганизмов. На этой за-кономерности и основан метод определения класса молока по бактериальной загрязненности, следует соблюдать санитарно-гигиенические правила. Ре-дуктазная проба может выполняться с метиленовой синью с резазурином.

а) С метиленовой синью. Проба может выполняться двумя методами: стандартным и ускоренным.

Метод основан на свойстве фермента редуктазы, выделяемого микро-организмами восстанавливать метиленовую синь в ее бесцветную лейко-форму. Чем больше микроорганизмов в молоке, тем быстрее идет обесцвечи-вание метиленовой сини. Оптимальная температура восстановления метиле-новой сини ферментом редуктазой составляет от 38 до 40 °С.

Порядок проведения работы

1) В пробку налить 1 мл раствора метиленовой сини и 20 мл молока, закрыть пробкой и хорошо перемешать.

2) Пробирку с молоком поместить в баню (или редуктазник) с температурой воды от 38 до 40 °С. Уровень воды в бане должен быть выше уровня молока в пробирке, необходимо поддерживать постоянную температуру воды.

3) Проверять время обесцвечивания проб через 20 мин. Через 2 часа и через 5,5 часа. Окончанием испытания на редуктазу считать момент, когда молоко в пробирках обесцвечивается. Наличие небольшого окрашенного кольцеобразного слоя наверху или окраска небольшой части внизу в расчет не принимаются.

4) Если молоко исследуется по ускоренному методу, то стандартный раствор метиленовой сини нужно разбавить в 10 раз и для анализа взять 10 мл молока.

На основании изменения окраски молока и продолжительности наблюдения имеется таблица 2, пользуясь которой можно установить класс бактериальной загрязненности молока.

Таблица 2 - Определение класса бактериальной загрязненности молока (с метиленовой синью)

б) С резазурином. Эта проба позволяет быстро определять весь комплекс бактериологических и гигиенических качеств молока (наличие микроорганизмов: стрептококков, стафилококков, бактерий группы кишечной палочки, лейкоцитов - особенно при заболевании коров маститом). Метод основан на свойстве фермента редуктазы выделяемого микроорганизмами, восстанавливать резазурин, легко отдающий свой кислородный атом, в оксазон. При этом молоко медленно изменяет свой цвет (от голубого через все оттенки лилового до розового, а затем и до белого). Восстановление резазурина происходит по следующей схеме: - О +2Н

С₁₂Н₇NO₄> С₁₂Н₇NO₃< С₁₂Н₉NO₃

разарурин оксазон гидрорезаруфин

(синий цвет) (розовый цвет) (белый цвет)

Порядок проведения работы:

1) В пробирку налить 1 мл 0,005% раствора резазурина и 10 мл

молока.

2) Пробирку закрыть пробкой и медленно от 3 до 4 раз перевернуть, не допуская встряхивания.

3) Поставить пробирку в закрытую водяную баню или редуктазник при температуре от 38 до 40 °С.

4) Через 20 мин и 1 ч наблюдать за изменением окраски содержимого пробирки.

Пользуясь таблицей 3, определить класс бактериальной загрязненности молока.

Таблица 3 - Определение класса бактериальной загрязненности молока (с резазурином)

5) Наблюдения записать.

Бродильная проба.

Этой пробой пользуются на молочных предприятиях при общей оценки молока, поступившего в переработку. Метод основан на продолжительности свертывания молока в оптимальных температурных условиях для микробиологических процессов и оценки качества полученного сгустка. Чем больше в молоке бактерий, тем быстрее оно свертывается. Окончательные результаты по этой пробе получаем через сутки.

Порядок проведения работы

1) В пробирке отмерить по 25 мл молока, закрыть пробкой и поставить в баню при 40 °С. Уровень воды в бане должен быть выше уровня молока в пробирках.

2) Осмотреть пробирки через 12 и 24 ч. Хорошее молоко через 12 ч не свертывается или свертываться. Плохое дает вспученный сгусток. Следует помнить. Что в пищу и переработку используется молоко Й и ЙЙ классов. Молоко ЙЙЙ класса обрабатывается особо.

3) По характеру сгустка установить вид микрофлоры и класса молока [17].

2.2.5 Идентификация м/о методом Гисса

Микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью ис-пользовать для поддержания своей жизнедеятельности различные источники углерода. Чтобы выяснить возможность развития микроорганизма за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, испытуемые культуры высевают на среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды. Из углеводов и многоатомных спиртов испытывают, как правило, следующие соединения: глюкозу, фруктозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, маннозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, глицерин, маннит и т.п. Для определения способности микроорганизмов использовать углеводы и спирты применяют агаризованные синтетические или дифференциально-диагностические среды Гисса.

Определение способности микроорганизмов использовать углеводы и спирты на средах Гисса.

В состав сред Гисса входят:

* Основной фон (в%, пептон - 0,5; К₂НРО₄ - 0,1);

* Индикатор (бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, феноловый красный);

* Исследуемый углевод или спирт (1%).

Среды Гисса могут быть использованы в жидком или полужидком состоянии. В последнем случае к среде добавляют 0,5% агара. Рост микроорганизмов на средах с углеводами или спиртами может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов и газов. Образование кислот регистрируется по изменению рН среды, о чем свидетельствует изменение окраски индикатора. Образование газа пределяют по появлению на поверхности среды пены или разрывов и пузырьков в толще среды. С помощью бактериологической петли уколом испытуемый микро-организм засевают в среду Гисса в пробирках. Инкубируют в течение 2 - 4 суток при оптимальной температуре. Рост бактерий в полужидкой среде отмечают в месте укола или на поверхности, также регистрируют образование газа и органических кислот. Полученные результаты сравнивают с характером роста в контрольной (фоновой) среде, не содержащей испытуемого соединения [18]

2.3 Результаты и их обсуждение

2.3.1 Оценка влияния антимикробных веществ на скорость гибели микроорганизмов на поверхности

Для изучения скорости гибели микроорганизмов на поверхности в присутствии дезифектанта необходимо приготовить загрязненную микроорганизмами поверхность. Для получения микробиологической загрязнененности на 5 испытуемых поверхностей размером 2,5 на 7,5 см наносят по 0,5 мл взвеси Escherichia coli, равномерно растирали, подсушивали.

Контрольную поверхность обрабатывали водой, а 4 оставшиеся поверхности обрабатывали дезинфектантом - наносили 0,5 мл 10%-ого раствора диактина, в котором действующего вещества додецилпропилентриамина содержалось 0,1%. Экспозиции были 10, 20, 30 и 40 мин. Затем проводили смыв с поверхности стерильными ватными тампонами, смоченными в ФР, помещали в пробирки, содержащие раствор ФР, встряхивают в течение 10 мин, затем делали разведения, при необходимости, и высевы на ПА. Инкубировали при температуре 37 єС одни сутки и проводили подсчет выросших колоний и расчет скорости гибели тест-культуры на поверхности с учетом контрольного смыва.

При изучении устойчивости Escherichia coli к дезинфицирующему средству на поверхности материала получили следующие результаты, приведенные в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты эксперимента по изучению устойчивости тест-культуры Escherichia coli к антимикробному агенту - 1%-му раствору диактина - на поверхности материала

В результате эксперимента по изучению устойчивости тест-культуры Escherichia coli к антимикробному агенту на поверхности показано, что в смыве с поверхности контрольного образца содержится в 245 раз меньше клеток Escherichia coli в 1 см по сравнению с их нанесенным количеством. Этот факт уменьшает точность определения содержания клеток в смывах.

В смывах после экспозиций 10, 20, 30 и 40 мин не было обнаружено клеток Escherichia coli. Отсутствие колоний на ПА связано с тем, что Escherichia coli достаточно чувствительны к диактину и гибель нанесенных на поверхность клеток тест-культур происходит за время меньшее, чем время первой экспозиции, а также необходимо учитывать степень разведения и что в смывах содержится в 245 раз клеток меньше, чем на поверхности.

Таким образом в результате эксперимента опробован метод определения устойчивости микроорганизмов (Escherichia coli) к действию антимикробных агентов (диактин) на поверхности. При проведении опыта наблюдалось быстрое уничтожение микроорганизмов дезифектантом. Однако для определния возможности длительного применения диактина необходимы более длительные аналогичные исследования.

2.3.2 Изучение взаимоотношения бактерий и грибов в смешанной микрофлоре

Для изучения взаимоотношения бактерий и грибов в смешанной микрофлоре необходимо подготовить смешанные питательные среды и засеять в них микроорганизмы. Опыт проводился следующим образом:

В 2 подготовленные стерилизованные чашки Петри заливали 2 питательные среды: СА и ПА, предварительно смешав их в пробирке до однородности. После того, как питательные среды застыли, засевали культуру грибов Aspergillus niger в каждую чашку Петри с помощью бактериологической петли густым равномерным штрихом по всему диаметру чашки, и перпендикулярно штриху культуре грибов наносили культуру бактерий Bacillus subtilis так, чтобы клетки по всей длине штриха располагались равномерно и касаясь штриха культуры грибов.

Чашки Петри оставляли при комнатной температуре на 4 суток.

По окончании опыта получили следующий результат:

Культура грибов Aspergillus niger полностью поглотила культуру бактерий Bacillus subtilis.

2.3.3 Изучение кинетики изменения численности микроорганизмов от времени и режимов хранения продуктов

Для изучение кинетики изменения численности микроорганизмов от времени и режимов хранения используем классический метод посева на питательный агар. В качестве объекта исследования было взято молоко, которое было подвергнуто порче в течении 4 дней при температуре 20 ^оС.

Результаты посева на ПА представим в таблице 5.

Таблица 5 Посев микроорганизмов на ПА.

Из таблицы видно что число микроорганизмов увеличивается.

Зная Q и N построим график отражающий физиологическую активность микроорганизмов в процессе порчи молока (рисунок 2).

Рисунок 2. Физиологическая активности микроорганизмов в процессе порчи

Также построим зависимость количества микроорганизмов от времени.

Рисунок 3. Кинетическая кривая развития микроорганизмов

Из графика видно что микроорганизмы в портящемся продукте перешли из индукционной фазы в фазу экспоненциального роста, и далее в линейную фазу роста.

В ходе анализа выявлено что по мере порчи молока физиологическая активность микроорганизмов подает, т.е. микроорганизмы выделяют меньше тепла.

Заключение

При выполнении теоретической части работы были изучены виды, способы оценки безопасности, ее параметры и ее связь нормативной документацией. Рассмотрены методы оценки санитарно-показательных микроорганизмов как индикаторы безопасности продукции. Изучена микробиологическая порча и способы продления сроков хранения пищевых продуктов.

В результате выполнения практической части курсового проекта были изучены методы определения общего содержания бактерий и грибов, метод центрифугирования микроорганизмов, метод фильтрации микроорганизмов. Проведён анализ физиологической активности микроорганизмов методом редуктазной пробы. Рассмотрены и проведены методы оценки жизнеспособности клеток бактерий к влиянию антимикробного вещества диактина.

По проведенным экспериментам сделаны следующие выводы:

- диактин является эффективным антимикробным веществом в борьбе с микроорганизмами.

- при взаимоотношении бактерий и грибов в смешанной микрофлоре культура грибов Aspergillus niger полностью поглотила культуру бактерий Bacillus subtilis.

- молоко полностью не пригодно для употребления по истечению 4 суток при неправильных режимах хранения.

Список литературы

1. Безопасность пищевых продуктов и продовольственного сырья: обзор европейского законодательства/ В.Л. Гуревич, Л.И. Григорьева // Новости. Стандартизация и сертификация. - 2005. - №3. - С. 20-23.

2. Безопасность пищевых продуктов: системный подход/ З.В. Ловше // Новости. Сертификация и стандартизация. - 2005. - №5. - C. 40-43.

3. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Каграманова К.А., Карцев В.В., Потехина Т.С. Санитарно-микробиологический контроль в пищевой и фармацевтической промышленности - Санкт-Петербург.2004. - 248 с.

4. Анализ риска приченения при потреблении пищевых продуктов: обзор методов/ В.И. Гельгор, И.З. Арбнеев // Новости. Сертификация и стандартизация. - 2006. - №1. - с. 4-8.

5. С.Д. Варфоломеев, С.Д. Варфоломеев Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов: Учеб. Пособие для биол. и хим. спец. вузов. - М.: Высш. шк., 1990.

6. Основы фармацевтической микробиологии: Учебное пособие/ В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, В.И. Кочеровец А.А. и др. - СПб: «Проспект Науки». - 2008. - 304 с.

7. Жарикова Г.Г., Микробиология производственных товаров. Санитария и гигиена - 2007 г.

8. Жвирблянская А.Ю, Бакушинская О.А. микробиология в пищевой промышлен-ности. Москва, 1966 г. - 240 с.

9. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Р85 Учеб. Пособие/ Под редакцией И.С. Егорова - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

10. http://dic.academic.ru

11. http://www.septech.ru

12. Нецепляев С.В., Панкратов А.Я. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. - М.:Агропромиздат, 1990.

13. http://www.agroxxi.ru

14. Белясова Н.А. Микробиология. Лабороторный практикум: учебное пособие для студентов специальностей «Биотехнология», «Биоэкология». - Минск: БГТУ, 2007.-160 с.

Размещено на Allbest.ru