46

Размещено на http://www.allbest.ru/

создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов, диагностики и лечения

Общая характеристика работы

клетка препарат медицина

Актуальность проблемы

Прогресс современной биотехнологии в значительной степени обусловлен применением культивируемых in vitro клеток различного происхождения. Развитие метода позволило получать не только перспективные линии клеток животных, широко использовать их в научных исследованиях, но и создавать на их основе новые современные и уникальные технологии производства препаратов. Число линий клеток животных постоянно растет, часто клетки внешне трудноразличимы. Наличие нескольких линий клеток в лаборатории, особенно, занимающейся получением собственных культур, создает предпосылки контаминации клеток не только посторонними микроорганизмами, но и клетками других линий. Использование клеток с отсутствием идентификационных характеристик ставит под сомнение адекватность получаемых результатов. Эти данные подчеркивают чрезвычайную важность и актуальность создания специализированных коллекций и проведения контроля контаминации поступающих и вновь получаемых культур клеток, используемых в научных или прикладных исследованиях.

Современные технологии позволяют производить достаточно большие количества продукта в клетках. Культуры клеток получили распространение в разработке современных биотехнологий производства профилактических или диагностических препаратов. Общепризнанно применение клеток для получения генно-инженерных препаратов. Как оказалось, именно правильное гликозилирование и полноценная «сборка» полипептида эритропоэтина сделали культуру клеток животных наиболее перспективной для производства генно-инженерного ЭПО с высокой специфической активностью in vivo. И, хотя, полученные разными группами исследователей генно-инженерные штаммы клеток секретируют достаточно высокий уровень рекомбинантного гормона, создание новых более эффективных продуцентов человеческого ЭПО, пригодных для производства препарата, представляется актуальным.

Одним из ведущих направлений современной биотехнологии становится использование клеток для заместительной и органоспецифической терапии у больных с органной недостаточностью, при повреждении кожных покровов, метаболических нарушениях и нейродегенеративных процессах. Применение клеток в клинике в настоящее время ограничено отсутствием аттестованного клеточного материала, что предопределяет актуальность разработки Методических указаний по аттестации клеток, технологии выделения уникальных по свойствам клеток, а также получения новых перспективных штаммов клеток, пригодных для научных и медицинских исследований.

Известно, что объективность результатов и качество биопрепаратов, получаемых с использованием культур клеток, в большей степени зависит от происхождения культуры клеток, ее соответствия паспортным характеристикам и безопасности. Основой стабильного производства безопасного препарата должна быть стандартизованная и аттестованная культура клеток. Система создания двухъярусного банка клеток, при котором создаются посевной и рабочий банки клеток, является необходимым условием для обеспечения продолжительного производства продукта. Аттестация банков клеток в соответствии с современными требованиями ВОЗ, принимая во внимание контроль биологической безопасности клеток, и сохранение их функциональных свойств при длительном культивировании, обеспечит стабильность и безопасность производства получаемого продукта.

Таким образом, создание системы аттестованных клеток, включающей паспортизованные коллекции и аттестованные банки культур клеток, пригодных для научных исследований, разработки новых технологий производства препаратов и лечения, является актуальным и позволит обеспечить гарантии качества, стабильности и безопасности клеток.

Цель исследования

создание системы аттестованных культур клеток, пригодных для научных исследований и производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.

Задачи исследования

· Создать специализированные коллекции культур клеток человека, насекомых и других животных.

· Изучить условия получения новых линий клеток различного происхождения, перспективных для проведения научных исследований или производства препаратов.

· Изучить паспортные характеристики, включая контаминацию, культур клеток, впервые полученных или поступивших в коллекцию из других источников.

· Создать и аттестовать в соответствии с современными требованиями посевные и рабочие банки культур клеток, пригодных для разработки новых технологий и производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.

· Исследовать характеристики генно-инженерных штаммов клеток-продуцентов рекомбинантного эритропоэтина человека, создать и аттестовать банки клеток наиболее перспективного штамма клеток-продуцентов рчЭПО. Изучить возможность создания новых лекарственных форм рекомбинантного препарата

· Создать и аттестовать банки культур диплоидных фибробластов человека, изучить условия культивирования, транспортировки и трансплантации клеток, пригодных для научных исследований и создания препаратов для заместительной терапии.

· Изучить условия получения, культивирования и дифференцировки клеток для исследований или медицинского применения, учитывая влияние условий выделения, криоконсервации, культивирования и дифференцировки стволовых и малодифференцированных клеток из разных тканей и органов.

· Разработать Методические указания по контролю первичных культур клеток, используемых для проведения научных исследований или использования в регенеративной медицине, с учетом современных требований и методов контроля.

· Создать и аттестовать банки первичных малодифференцированных культур клеток для научных исследований или создания стандартных и безопасных препаратов для заместительной терапии.

Научная новизна полученных результатов

При нашем участии созданы и паспортизованы специализированные коллекции культур клеток человека, насекомых и других видов животных. Паспорта культур клеток оформлены и изданы в виде 4-х томов Каталога культур клеток.

Впервые отработаны условия выделения и культивирования клеток чешуекрылых насекомых и впервые в стране получены 4 новые линии клеток хлопковой, озимой и капустной совок, основных вредителей сельского и лесного хозяйства. Новые линии клеток высокочувствительны к видоспецифичным вирусам ядерного полиэдроза и пригодны для проведения научных исследований и наработки энтомопатогенных препаратов.

Показано преимущество клеток СНО-рЕ в качестве продуцента рчЭПО по сравнению с другими генно-инженерно конструированными культурами клеток СНО-23 и СНО-972. Рекомбинантный эритропоэтин, продуцируемый впервые созданными генно-инженерными клетками, по физико-химическим свойствам соответствует природному аналогу, обладает специфической активностью по стимуляции эритропоэза.

Впервые создана технология получения таблетированной формы рчЭПО, показана эритростимулирующая активность экспериментальных серий препарата при пероральном применении.

Установлено, что для получения жизнеспособных стволовых и малодифференцированных клеток из разных тканей и органов, высокоперспективных для исследований или трансплантации, важным является время доставки органа, выбор методов выделения, условий культивирования и криоконсервации клеток.

Показано, что новые штаммы диплоидных фибробластов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 обладают стабильными свойствами, безопасны и пригодны для научных исследований и разработки новых технологий получения препаратов.

Впервые предлагаются способы выращивания фибробластов на специальных пленках, пористых подложках или микрононосителях, что позволяет увеличивать количество клеток, транспортировать и поддерживать функциональноактивные клетки на ранах различной этиологии. Способ транспортировки клеток в геле или на микроносителях позволяет сохранять жизнеспособность клеток в течение 5 и более дней, что актуально при доставке клеток в дальние районы и при чрезвычайных ситуациях.

Впервые создана технология получения препарата «Клеточные культуры диплоидные для заместительной терапии», высокоэффективного для лечения ожоговых и других ран. Система создания аттестованных посевных и рабочих банков фибробластов человека, впервые примененная к штаммам клеток для терапии ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2, позволяет обеспечивать стабильными по свойствам и безопасными по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клетками научные исследования и практическое применение при аллотрансплантации или заместительной терапии.

Предлагаемый подход к созданию и использованию клеток из аттестованных и криосохраняемых банков позволяет решать проблему дефицита донорского материала, актуальную в экстренных и чрезвычайных ситуациях.

Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены патентами и авторскими свидетельствами: № 1808009; № 1808010; №2182830; № 2152206; № 97108266; № 2189223; № 2142820; №2004126519; № 2004126518.

Практическая значимость работы

Аттестованные в соответствии с современными требованиями культуры клеток из коллекций могут быть использованы для проведения научных исследований, создания новых биотехнологий производства препаратов для иммунопрофилактики, лечения или диагностики.

Созданные и аттестованные посевные и рабочие банки линий клеток МДСК, 293, 4647 и Л-68 соответствуют современным требованиям и практически пригодны в качестве субстратов для производства вакцинных, диагностических и лечебных препаратов.

Банки генно-инженерно конструированных клеток СНО-рЕ, характеризующихся стабильностью, безвредностью и обладающих высокой продуктивностью рчЭПО, стали основой для создания технологий получения новых лекарственных форм препарата.

Посевные и рабочие банки диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, аттестованные в соответствии с современными требованиями ВОЗ, пригодны для научных исследований, создания новых технологий и являются основой получения стабильного препарата для заместительной терапии. Разработана технология получения препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии» для лечения ожоговых и других ран.

Технология культивирования и доставки фибробластов в геле, на подложках или микроносителях позволяет применять клетки в разных условиях с учетом дальности и длительности доставки до больного и лечения ран разной этиологии.

Подобранные в результате проведенных исследований условия выделения малодифференцированных клеток, а также система создания аттестованных банков первичных культур клеток могут служить основой получения безопасных клеток для научных исследований и регенеративной медицины.

Впервые разработаны Методические указания «Аттестация первичных или диплоидных культур клеток, пригодных для трансплантации», включающие современные методы контроля безопасности клеток.

Создание банков, впервые полученных культур малодифференцированных клеток, криоконсервированных и аттестованных в соответствии с новыми Методическими указаниями, позволяет иметь достаточные запасы аттестованного клеточного материала для проведения фундаментальных исследований и заместительной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

· Создание коллекций, посевных и рабочих банков клеток, аттестованных в соответствии с современными требованиями ВОЗ, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными и безопасными культурами клеток.

· Стабильность характеристик и безопасность по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клеток линий МДСК, Л-68 и 4647 из посевных и рабочих банков позволяют рекомендовать их для применения в производстве препаратов для лечения, диагностики и иммунопрофилактики.

· Изменчивость кариотипа при длительном культивировании линии клеток 293 из посевного и рабочего банков, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволяют рекомендовать культуру 293 для производства противоракового препарата «Канцеролизин».

· Стабильность характеристик клеток культуры СНО-рЕ и высокая продуктивность рчЭПО по сравнению с другими линиями клеток-продуцентов СНО-23 и СНО-972 при длительном их пассировании in vitro, делают культуру клеток СНО-рЕ наиболее пригодной для наработки препарата, регулирующего эритропоэз.

· Технология производства диплоидных фибробластов человека из аттестованных и криосохраняемых банков клеток позволяет обеспечивать стандартными и безопасными клетками при лечении больных с глубокими и обширными ожогами, в том числе и при чрезвычайных ситуациях.

· Для получения жизнеспособных клеток из разных тканей и органов человека и животных, содержащих высокоперспективные стволовые и прогениторные клетки, необходим индивидуальный выбор способа выделения малодифференцированных клеток, условий культивирования и криоконсервации клеток.

Внедрение результатов исследования в практику

Культуры клеток из аттестованных коллекций используются как при проведении научно-исследовательских работ, так и при разработке новых технологий производства препаратов для лечения, иммунопрофилактики или диагностики. Сохранение и поддержание аттестованных коллекций культур клеток позволяет обеспечивать охарактеризованными клетками не только подразделения ГНЦ ВБ «Вектор», но и научные и медицинские учреждения Сибири и Дальнего Востока.

Новые линии клеток насекомых, высокочувствительные к видоспецифичным вирусам ядерного полиэдроза, использованы при разработке новых технологий получения энтомопатогенных бакуловирусных препаратов, пригодных для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства. Экспериментальные серии вирусов ядерного полиэдроза хлопковой совки Heliothis armigera и капустной совки Mamestra brassicae, полученные на новых линиях клеток МБ-ХС-685 или МБОзС4-788, показали высокую эффективность при лабораторных испытаниях препарата на гусеницах.

Клетки из аттестованных посевных и рабочих банков используются или могут быть использованы в научных исследованиях и разработках новых вакцин против гриппа (клетки МДСК), против кори (клетки Л-68) и вакцины против гепатита А (клетки 4647). Линия клеток 293 является субстратом для производства препарата «Канцеролизин», обладающего противоопухолевой активностью.

Рекомбинантная культура клеток СНО-рЕ имеет практическое значение как стабильный продуцент рекомбинантного эритропоэтина человека и используется в исследованиях по разработке новых технологий получения таблетированной формы лекарственного препарата для регуляции эритропоэза. Произведены экспериментальные серии препарата и начаты доклинические исследования.

Способы получения новых линий клеток, штаммов клеток- продуцентов или культур клеток, пригодных для заместительной терапии, а также способы получения новых форм препаратов для иммунопрофилактики и лечения защищены 9 патентами на изобретение.

Культуры диплоидных фибробластов человека, охарактеризованные в соответствии с современными требованиями, используются при определении специфической активности субстанции и готовых лекарственных препаратов рекомбинантного интерферона-альфа-2 человека. Клетки используются как для проведения научных исследований в вирусологии или биотехнологии, так и при создании новых технологий производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики или лечения.

Вновь полученные и заложенные на хранение в виде аттестованных банков клеток культуры диплоидных клеток ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 показали хорошие заживляющие свойства при лечении ран. Основные результаты этих исследований легли в основу разработки новой технологии получения препарата «Культуры клеток диплоидные для заместительной терапии», производимого в виде суспензии клеток, в геле или в монослое на подложках. Разработаны Регламент производства, ФСП и Инструкция по применению.

Результаты, полученные при выполнении настоящих исследований, вошли в научные отчеты по темам, выполняемым по Программе Центра, опубликованы в более, чем 50 научных трудах.

Результаты исследований используются в программе обучения на кафедрах биотехнологии и военно-полевой и экстремальной медицины Новосибирской государственной медицинской академии, на кафедре фундаментальной медицины медицинского факультета Новосибирского государственного университета.

Апробация диссертационного материала.

Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на научных конференциях: Всесоюзная научная конференция «Энтомопатогенные вирусы и их роль в защите растений» (Новосибирск, 1988); Всероссийская конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995 и 2001); 41 и 42 Congresses of ETCS (European Tissue Culture Society) (Verona Italy, 1994; Brno, Czech Republic, 1996); X International Congress of Virology (Jerusalem, Israel, 1996); XIV, XV, XVI, XVII, XVIII Meetings of the ESACT (European Society Animal Cell Technology) (Villamoura Portugal, 1996; Tour, France 1997; Lugano, Switzerland, 1999; Tylosand, Sweden 2001; Granada-Spain 2003); I и II Международные симпозиумы "Новые методы лечения ожоговых ран" (Тула, 1996; Саратов, 1998); Региональная научно-практическая конференция СО РАМН «Фундаментальные аспекты медицины катастроф Сибири» (Новосибирск, 1998); Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 1999); Научно-практическая конференция «Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии» (Омск, 2000); International Meeting “Bioartificial organs III” (Davos, Switzerland, 2000); Научно-практическая конференция ”ЗДРАВЭКСПО-СИБИРЬ-2001” «Инновации в охране здоровья людей» (Новосибирск, 2001); X, XI, XII, XIII Международная научная Конференция «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 2002., 2003, 2004, 2005); International Congress of Virology: “The World of Microbes” (Paris, 2002); “IX International Symposium on Biomedical Science and Technology” (Antalya, Turkey, 2002); II Международный Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ - 2003» (Москва, 2003); Всероссийская конференция «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2003); III Российский Конгресс по патофизиологии «Дисрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004); III Всероссийский съезд по трансплантологии и искусственным органам, (Москва, 2005); The 5^th International Conference “High medical technologies in XXI Century” (Benidorm, Spain, 2006).

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол № 5 от 03 апреля 2007 г.), на расширенном научном семинаре ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Протокол № 109 от 28.08.07) , и рекомендована к защите.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано более 50 научных работ, в том числе 23 в изданиях, рекомендованных ВАК, 9 - авторские свидетельства и патенты, 1 - Методические указания.

Иисследования выполнены под руководством и при непосредственном участии автора в институте молекулярной биологии НПО «Вектор», НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» и ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Исследования по отдельным разделам диссертации проведены при участии специалистов ГНЦ ВБ «Вектор» (к.б.н. Царевой А.А., к.м.н. Нечаевой Е.А., д.б.н. Рябчиковой Е.И., к.х.н. Беловой Н.В., Юрченко Н.Д., Шумаковой О.В., к.б.н. Костиной Г.А., к.б.н. Богрянцевой М.П., Исаенко А.А, Колокольцовой О.А., Радаевой И.Ф., Немцова Ю.В., Вараксина Н., Рябичевой Т.А., к.б.н. Герасимовой Н.Г.), института Цитологии и генетики СО РАН (д.б.н., проф. Графодатский А.С., к.б.н. Рубцова Н.И.), НИИ Биологии гена РАН (к.б.н. Ревищин А.В.), Новосибирской государственной медицинской академии (чл.корр. РАМН д.м.н., проф. Ефремов А.В., д.м.н. проф. Колосов Н.Г.), НИИ Фармакологии СО РАМН (академик РАМН Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., д.ф.н. Жданов В.В.), НИИ ортопедии СО РАМН (д.м.н., проф. Зайдман А.И.). За что выражаю им благодарность.

Искренне признательна за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.м.н. Шалуновой Н.В., а также директору ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича академику РАМН д.м.н., проф. Н.В. Медуницыну.

Выражаю глубокую благодарность за критические замечания и помощь при обсуждении и оформлении диссертационной работы моим коллегам д.м.н., проф. Воробьевой М.С., д.м.н., проф. Игнатьеву Г.М., д.б.н. Трошковой Г.П., д.м.н., проф. Никифорову С.Б.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела материалы и методы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа изложена на 300 страницах, иллюстрирована 6 таблицами и 45 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 370 источников (135 отечественных и 235 зарубежных).

Связь выполненной работы с планом научных исследований

Работа выполнена в рамках ряда научно-исследовательских работ и научно-технических программ в ГНЦ ВБ «Вектор» (1977-2005 г.) и ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Исследования были поддержаны проектами МНТЦ №133 и 840, (рук. Нечаева Е.А.), PDG № 1911 и № 1858 (рук. Колокольцова Т.Д.); программой НИР ГНЦ ВБ «Вектор» 2000-2002 года по темам «Разработка нового противоопухолевого препарата на основе мутантных штаммов аденовируса» (рук. Сергеев А.Н), «Создание таблетированной формы рекомбинантного эритропоэтина человека для перорального применения» (рук Колокольцова Т.Д.), «Разработка условий получения образцов «искусственной кожи» при лечении ожоговых и других ран» (рук Колокольцова Т.Д.). Исследования были финансово поддержаны также грантом Наукограда п. Кольцова (рук. Колокольцова Т.Д.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток. В работе использовали первичные, диплоидные и гетероплоидные культуры клеток человека и животных, поступавшие в коллекцию из разных источников и получаемые нами в результате проводимых исследований. Культивирование клеток млекопитающих проводили в питательных средах (Игла МЕМ, RPMI 1640, DMEM, 199 среда и др.) с добавлением 10% FBS или СКРС в монослое или суспензии в соответствии с паспортными характеристиками клеток при температуре 37⁰С. Для снятия клеток со стекла применяли 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена в соотношении 1:1.

Культуры клеток насекомых выращивали при температуре 28⁰С. Клетки чешуекрылых и колорадского жука культивировали в питательной среде Грейса, обогащенной 10% FBS, клетки комаров - в питательной среде с 0,5%-ным раствором гидролизата лактальбумина на растворе Хэнкса с добавлением 0,075 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сахарозы, 4 г/л глюкозы и 7-10% СКРС или 10-15% FBS для клеток Aedes albopictus и Aedes pseudoscutellaris.

Криоконсервация клеток. Для замораживания клеток использовали питательную среду для культивирования с добавлением 10% сыворотки крови животных и 10% криопротектора (глицерин, ДМСО). Суспензию клеток разливали по ампулам в объеме 1 мл, запаивали и маркировали. Температуру ампул снижали со скоростью 1^оС в минуту до температуры минус 25^оС, после чего ампулы помещали в криохранилище с жидким азотом для длительного криосохранения клеток. Жизнеспособность определяли путем подсчета неокрашенных после размораживания клеток и после окрашивания 0,04%-ным раствором трипанового синего.

Морфологический анализ. Клетки исследовали под инвертированным микроскопом и фотографировали без дополнительной фиксации или окрашивания. Для получения окрашенных препаратов клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали и окрашивали 0,01%-ным раствором акридинового оранжевого либо гематоксилин-эозином. Электронно-микроскопический анализ проводили после фиксации клеток. Срезы готовили на микротоме Reichert-Jung. Окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты клеток исследовали под микроскопом JEM 100S или Hitachi при ускоряющем напряжении 80 или 75 кВ, соответственно.

Контроль контаминации бактериями и микоплазмами проводили методами микробиологического высева на селективную среду, гистохимического анализа (окраска флюорохромами Hoechst 33258, Dapi или оливомицином) согласно методам [Chen T.R., 1977, Михайлова Г.Р., Новохатский Ф.С., Родова М.А., 1981], электронно-микроскопически и методом ПЦР-анализа. Отсутствие посторонних вирусов подтверждали методами электронной микроскопии клеток, культивированием на чувствительных культурах клеток с последующим контролем с помощью реакции гемадсорбции и гемагглютинации, на куриных эмбрионах и лабораторных животных (мышах-сосунках, взрослых мышах, морских свинках и кроликах) в соответствии с регламентирующими документами [МУК 42-28-10-89, 1989].

Видовую идентичность клеток подтверждали методами анализа электрофоретической подвижности изоферментов и исследования кариотипа. Анализ электрофоретической подвижности изоферментов Г6ФДГ и ЛДГ проводили в вертикальном блоке полиакриамидного геля. Гомогенаты культур клеток готовили по O'Brien S.J., Shannon Y.E., Gall M.N., 1980. Кариологический анализ. Препараты хромосом культур клеток готовили общепринятым методом [Moorchead P, et al. 1960]. В культуральную жидкость на 2-4 сутки после пересева клеток вводили колхицин на 2 часа (для клеток теплокровных) или на 4-5 часов (для клеток насекомых). Гипотонию проводили в 0,56%-ном растворе KCl в течение 30 минут при температурах 37⁰С или 28⁰С, соответственно. Анализ хромосом проводили на фиксированных препаратах клеток в метафазе, используя методы дифференциального окрашивания (С, G и Q) и окраску азур - эозином [Moorchead P., 1960; Motara MA, Rai KS, 1977]. Для рутинного анализа и определения кривой распределения числа хромосом исследовали не менее 50 метафаз. Число полиплоидных клеток определяли при анализе 1000 метафазных пластин диплоидных культур клеток на разных пассажных уровнях.

Аттестацию банков клеток культур клеток проводили согласно Методических указаний, утвержденных ГИСК им. Л.А. Тарасевича [МУК 42-28-10-89, 1989] и современным требованиям ВОЗ [World Health Organization Technical Report, 1998].

Определение количества рчЭПО в пробах осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа. Чистоту и молекулярную массу очищенных образцов рчЭПО определяли методом вертикального электрофореза в ПААГ. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэмли [Остерман Л.А., 1981]. Гель окрашивали красителем Coomassie Brilliant Blue R-250. Для количественной оценки содержания рчЭПО и определения процентного содержания примесных белков проводили сканирование влажного геля при помощи лазерного денситометра.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием критерия Стьюдента и методом двухфакторного дисперсионного анализа [Ашмарин И.П., Воробьев И.А, 1962].

Результаты исследований и их обсуждение

Основой успешного развития вирусологических и биотехнологических работ с использованием культивируемых клеток является наличие коллекций культур клеток, охарактеризованных на современном методическом уровне в соответствии с общепринятыми требованиями (паспортом) и заложенных на хранение в количестве, позволяющем длительное время обеспечивать стандартными клетками развивающиеся направления исследований. Поэтому для проведения исследований в области вирусологии и биотехнологии, становится очевидной актуальность создания специализированных коллекции культур клеток человека и животных.

Формирование коллекций культур клеток человека и животных было проведено, главным образом, в период с 1978 по 1987 год под руководством к.б.н. Царевой А.А. За это время поступило более 300 культур клеток млекопитающих из разных институтов страны и компании «Flow». Начиная с 1981 года, проводились работы по формированию коллекции клеток насекомых. Помимо известных линий клеток, поступивших извне, коллекции пополнялись за счет вновь получаемых нами первичных, диплоидных и гетероплоидных культур клеток человека, животных и насекомых, полученных в рамках данного исследования. С целью выделения штаммов клеток человека, перспективных для заместительной терапии, создавалась коллекция диплоидных фибробластов.

Создание коллекции культур диплоидных фибробластов человека. Для выделения фибробластов было исследовано более 50 образцов ткани, полученных от взрослого человека (ожоговые больные или донорские кусочки кожи, взятые во время операций) или 8-20 недельных плодов человека, абортированных по медицинским показаниям. Суспензию клеток получали методами механической и ферментативной дезагрегации [Юрченко Н.Д. и др., 1997] (см. Таблицу 1).

Таблица 1 Данные по количеству ампул с фибробластами человека, полученных из разных тканей и заложенных для хранения на ранних пассажах

Исследования показали, что клетки, выделенные от ожоговых больных, как правило, были маложизнеспособны, число их практически не увеличивалось. При дальнейшем культивировании клетки быстро старели, что в комплексе делало их непригодными для ауто- или аллотрансплантации и, тем более, для получения больших запасов клеток и создания на их основе технологий получения препаратов. В противоположность этому, эмбриональные или фетальные фибробласты обладали лучшими культуральными характеристиками, имели достаточно высокую пролиферативную активность, равную 2,0-3,5. Через 2 суток клетки формировали равномерный плотный монослой.

Кроме анализа впервые выделенных штаммов фибробластов была проведена ревизия ранее полученных Царевой А.А., Бакулиной Л.Ф и Подзоровой Т.И. штаммов клеток человека и сохранявшихся в жидком азоте. В таблице 1 они отмечены как ДК. На основании данных по отсутствию контаминантов, уровню пассажа и культуральных характеристик были отобраны 18 штаммов диплоидных культур фибробластов и заложены для хранения на разных пассажных уровнях в количестве от 5 до 200 ампул (см. Таблицу 1).

Культуры фибробластов из первичных и повторных заморозок в дальнейшем контролировали на отсутствие контаминантов и характеризовали в соответствии с современными требованиями. Созданная и охарактеризованная таким образом коллекция диплоидных фибробластов человека может быть использована для проведения научных исследований или создания новых препаратов для диагностики и лечения на основе аттестованных клеток человека.

Анализ паспортных характеристик штаммов клеток показал стабильность и высокую перспективность использования в дальнейших исследованиях и технологиях двух штаммов диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, полученных нами из тканей легкого или кожно-мышечной ткани эмбриона человека. Культуры клеток ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 были запатентованы как наиболее перспективные для применения в заместительной терапии [Патент № 2004126518, 2004].

Создание коллекции культур клеток насекомых. Создание коллекции культур клеток насекомых было определено необходимостью выбора известной линии клеток или получения новых, пригодных для проведения исследований по диагностике вирусных инфекций (клетки комаров) или разработки новых технологий получения энтомопатогенных препаратов (клетки чешуекрылых насекомых) для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства.

Всего в коллекцию поступило 26 линий и сублиний клеток насекомых из разных институтов России, Украины и из Saint Christol (Франция). Среди поступивших были 4 линии клеток комаров (Aedes aegypti, Aedes albopictus и Aedes pseudoscutellaris), 2 линии клеток колорадского жука и 20 линий и сублиний клеток чешуекрылых насекомых. Кроме того, проводились исследования по получению новых линий клеток.

Получение первичных и перевиваемых культур клеток насекомых. Для выделения первичных культур клеток использовали куколки, эмбрионы или 1-3 дневные личинки хлопковой, озимой и капустной совки, капустной металловидки, непарного шелкопряда и озимой совки. Поскольку поверхность яиц, куколок, гусениц и взрослых насекомых обильно загрязнена посторонними микроорганизмами, то в первую очередь были проведены исследования по подбору условий их стерилизации. При получении новых линий клеток из эмбрионов, личинок или куколок насекомых стерилизацию их поверхности проводили разными методами, включая обработку растворами 40-70% этилового спирта или 1,0-6,0% перекисью водорода, согласно опубликованным данным [Kitamura S.1977, Hsu S.H., Liu S.Y., Cross J.H. 1972]. Способ обработки насекомых 0,5%-ным водным раствором йода, примененный нами впервые, оказался одним из оптимальных способов стерилизации яиц и куколок для последующего получения первичных культур клеток чешуекрылых насекомых, свободных от контаминантов [Колокольцова Т.Д., Царева А.А, 1995].

Результаты более чем 200 экспериментов по выделению первичных клеток показали, что наилучшим источником для получения культуры клеток являются ткани яичников куколок и взрослых насекомых. По нашим данным в 48% случаях посева клеток из тканей яичников наблюдались активная миграция и деление клеток, причем около 20 культур клеток удалось культивировать в течение 1-4 пассажей in vitro. Далее клетки, как правило, погибали и лишь некоторые из них после длительного периода покоя, возобновляли свой рост in vitro. Опыт многих исследователей показал, что такой период для клеток насекомых составлял от 6 до 10 месяцев [Knudson D.L., Lescott T., Tinsley T.W., 1980; Quiott J.M., 1979].

Наблюдения показали, что мигрировали и делились в культуре, как правило, круглые клетки разного размера, иногда формировали шарообразные структуры. И довольно частое образование везикулярных структур в первичных культурах клеток может служить подтверждением того, что именно стволовые и малодифференцированные клетки формировали структуры, похожие на бластулы, что совпадает с данными литературы [Bolivar J., et al., 2006; Yuzo Niki et.al., 2006]

Наибольший интерес представляет культура клеток яичников хлопковой совки МБ ХС-685, которая достаточно активно начала делиться через 1,5 месяца и к концу 2-х лет культивирования прошла более 60 пассажей. На ранних пассажах культура отличалась полиморфизмом, позднее морфология и культуральные свойства клеток стабилизировались (см. Рис. 1), что совпадает с данными других авторов [Sudeep A.B., et.al., 2002]. Аналогичная картина наблюдалась и в культурах клеток озимой совки Agrothis segetum -ОзС-72 (МБ-ОзС5-688) и ОзС-73 (МБ-ОзС4-788), а позднее в культуре клеток капустной совки Mamestra brassicae (МБ-КС-23).

Рис. 1. Морфология культуры клеток МБ ХС-685 на 45-м (а) и МВ-ОзС4-788 на 22-м (б) пассажах. Ув.х40об.

В результате длительных исследований по поддержанию первичных клеток in vitro, нами впервые в стране были получены 4 новых линии клеток МБ ХС 685, МБ ОзС-688, МБ ОзС-788 и МБ КС-23, выделенные из яичников куколок хлопковой, озимой и капустной совок. Клетки отличались стабильными культурально-морфологическими свойствами и способностью к продукции вирусов ядерного и цитоплазматического полиэдроза (ВЯП И ВЦП). Показано, что перевиваемые клетки озимой совки A. segetum способны продуцировать бакуловирусы (ВЯП ОзС, ВЯП КС-3-86, ВЯП КС-10 и ВЦП ОзС) в количестве, достаточном для наработки вирусной биомассы. Кроме того, впервые полученные штаммы клеток могут служить системой для получения, клонирования и отбора наиболее патогенных или вирулентных штаммов вирусов, а также для наработки рекомбинантных ВЯП и ВЦП. Результаты легли в основу создания новых технологий получения энтомопатогенных препаратов и разработки новых биологических средств защиты растений от вредителей и болезней.

Паспортизация и идентификация культур клеток. Впервые поступающие в отдел линии клеток культивировали в отдельном боксе не более 10 пассажей. В этот период проводили контроль контаминации и осуществляли первичную заморозку культуры клеток в виде 5-15 ампул. На основании результатов предварительного контроля контаминации и значимости культуры принималось решение о сохранении культуры клеток в коллекции, деконтаминации ее от микоплазм, либо уничтожении. В дальнейшем клетки исследовали и проводили повторную закладку клеток на хранение при температуре жидкого азота в количестве не менее 30 ампул.

Контроль контаминации. Известно, что наибольшую опасность при работе с культурами клеток представляют линии, загрязненные микроорганизмами. Если контаминация бактериями или грибами проявляет себя сразу, то много опаснее представляются клетки, загрязненные микоплазмами. Микоплазмы существенно искажают результаты исследований и особенно опасны при использовании контаминированных клеток в производстве препаратов [Lincoln et al., 1998; Uphoff, C.C., H.G. Drexler, 2002].

Результаты исследования линий клеток, поступивших из разных институтов страны и из-за рубежа, показали достаточно высокую частоту контаминации клеток посторонними микроорганизмами, и более всего микоплазмами.

Около 70% культур клеток, поступивших в коллекцию до 1985 года, были контаминированы микоплазмами. Чаще всего эти культуры клеток поступали из неспециализированных лабораторий, где этому не придавали особого значения или не проводили контроля контаминации. Снижение числа контаминированных культур клеток, поступивших позднее, обусловлено, прежде всего, появлением простых и удобных в применении методов контроля культур клеток с помощью ДНК-интеркалирующих флюорохромов [Михайлова Г.Р. и др., 1991].

Сравнение разных методов очистки культур клеток показали малую эффективность применения только антибиотиков, более того, подтвердило их токсичность. Обработка клеток методом термошока путем прогрева клеток при температуре 41⁰С в течение 6-8 часов в сочетании с невысокими дозами антибиотиков позволила деконтаминировать ряд значимых линий клеток от микоплазм или значительно снизить их содержание (Рис 2Б).

Отсутствие вирусной и других видов контаминации подтверждено электронно-микроскопически. Практически все культуры клеток млекопитающих, а также линии и сублинии клеток чешуекрылых были свободны от контаминации вирусами. В клетках комаров (Мos 20A, Аа, A. albopictus и A. pseudoscutellaris) обнаружена контаминация вирусом денсонуклеоза, что совпадает с ранее описанным [Сутугина Л.П. с соавт., 1983]. Показано, что полученные нами новые культуры фибробластов и клетки новых линий насекомых свободны от контаминантов.

Идентификация линий клеток. Одним из важных параметров безопасной работы с культурами клеток, получения адекватных и стабильных результатов, сопоставимых с данными других авторов, является подтверждение соответствия виду или линии используемых клеток. Идентификацию клеток проводили методами анализа кариотипа и изоферментного состава клеток. Анализ кариотипа ряда линий клеток млекопитающих показал наличие маркерных хромосом, характерных клеткам HeLa, что позволило выделить эти линии клеток, как дериваты HeLa [Царева А.А. Исаенко А.А., и др, 1998]. Остальные культуры клеток имели характеристики, сходные с ранее описанными [Графодатский А.С., Раджабли С.И, 1988]. Полученные данные по кариотипу исследуемых линий клеток в виде микрофото хромосом метафазной пластинки, раскладки дифференциально окрашенных хромосом и гистограммы распределения числа хромосом представлены в паспортных характеристиках линий клеток и опубликованы в 4 томах Каталога культур клеток. Данные изоферментного анализа Г6ФДГ и ЛДГ клеток человека и животных соответствовали виду.

В связи с отсутствием характеристик кариотипа и изоферментного состава исследуемых видов насекомых для идентификации поступивших линий клеток проводили анализ кариотипа и изоферментного состава культивируемых клеток и клеток исходных насекомых. Как показано на рис. 3, клетки колорадского жука, полученные из гемолимфы, имели 36 убывающих по величине двуплечих хромосом и одну пару акроцентриков среднего размера. В клетках линий жука КЖ-1 и КЖ-2 обнаружено более 100 мелких голоцентрических хромосом, характерных для чешуекрылых (см. Рис. 3). Клетки комаров имели от 6 до 24 метацентрических хромосом (см. Рис. 4), что соответствует ранее описанным данным [Kurtti T.J., Munderloh U.G., 1984].

Анализ морфологии клеток КЖ-1, КЖ-2, дубового шелкопряда МСАр-1 и ряда других линий клеток показали удивительное сходство. Морфология клеток комаров различалась, что подтверждает различие линий клеток. Электрофоретическая подвижность изоферментов Г6ФДГ, ЛДГ, СОД, ИЦДГ и МДГ клеток и исходных насекомых показали соответствие клеткам непарного шелкопряда.

Рис. 3. Кариотип клеток колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (А), культуры клеток КЖ-1(Б) и линии клеток SCLd-135 (В).

Рис. 4. Метафазные пластинки разных линий клеток комаров:

А) A. aegypti; Б) MOS 20A; В)A. pseudoscutellaris; Г) A. albopictus .

Результаты исследования морфологии, кариотипа и изоферментного состава клеток насекомых показали сходство характеристик 11 линий и сублиний клеток насекомых, имевших разное видовое происхождение по названию, с клетками непарного шелкопряда линии SCLd-135. Характеристики других 10 линий и сублиний клеток насекомых, включая 4 новые линии клеток, подтвердили видовое соответствие.

Таким образом, в результате проведенных исследований были созданы и охарактеризованы специализированные коллекции культур клеток насекомых, диплоидных фибробластов и коллекция перевиваемых культур клеток животных и человека. Результаты контроля показали высокую вероятность контаминации культур клеток не только посторонними микроорганизмами, но и клетками других линий, как при попытке получения новых линий клеток, так и при длительном пассировании уже имеющихся. Вышеизложенное свидетельствует о необходимости обязательного контроля кариотипа и изоферментного состава культивируемых клеток и подчеркивает необходимость использования для исследований клеток только из специализированных коллекций культур клеток, охарактеризованных в соответствии с современными требованиями паспорта.

Создание и аттестация банков культур клеток, пригодных для научных исследований, производства вакцин и других препаратов

Создание и аттестация посевных и рабочих банков клеток. Прогресс в области вирусологии и биотехнологии в значительной степени обусловлен пригодностью культивируемых in vitro клеток для исследования или наработки вирусов или биопрепаратов. Создание посевного и рабочего банков перспективных культур клеток, их аттестация в соответствии с современными требованиями позволит обеспечить производство достаточным запасом стабильных и безопасных по своим свойствам клеток.

В результате работы было создано 3 посевных и 4 рабочих банка линий клеток МДСК, 293, 4647 и Л-68, наиболее перспективных для производства вакцинных, диагностических и лечебных препаратов. Данные по количеству ампул и жизнеспособности клеток в посевных и рабочих банках представлены в таблице 2. Как видно из таблицы посевные и рабочие банки клеток представляли запас не менее 200 ампул с клетками, содержащими от 4 до 9 млн. клеток. Жизнеспособность клеток после восстановления составляла от 80 до 97%.

Таблица 2 Данные по посевным и рабочим банкам культур клеток

Банки клеток были созданы и предварительно контролированы в отделе культур клеток. Аттестацию клеток из посевных и рабочих банков клеток проводили в отделе культур клеток, ОБТК ГНЦ ВБ «Вектор» и в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Сравнительное исследование стабильности кариотипа проведено в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича по протоколам, представленным ГНЦ ВБ «Вектор».

Исследование показало отсутствие контаминантов, стабильность и соответствие морфологических и культуральных характеристик клеток из посевных и рабочих банков. Изучение кариотипа клеток линии МДСК на 47 и 86 пассажах показало соответствие кариотипу собаки вида Canis familiaris, 2n=78, модальный класс составлял 85 хромосом (98% клеток). Клетки характеризовались присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, по некоторым аутосомам отмечена трисомия (пары 29, 30 и 38). Отмечена стабильность кариотипа клеток на разных пассажах (47 и 87 пассаж).

Анализ G-окрашенных метафазных хромосом культуры клеток Л-68 на 16 и 33 пассажах подтвердил соответствие нормальному кариотипу человека 2n=46, ХХ. По отсутствию хромосомных нарушений и низкому числу поли - и гетероплоидных клеток (не более 2%) кариотип Л-68 стабилен и соответствует требованиям Комитета экспертов ВОЗ, предъявляемым к диплоидным клеткам [World Health Organization Technical Report Series, 1998]. Кариотип культуры клеток 293 на уровне 18 и 38 пассажей характеризовался изменчивостью распределения числа хромосом в клетках на разных пассажных уровнях, кроме того, выявлены вариации в числе аутосом и маркерных хромосом, что свидетельствует о неустойчивости кариотипа клеток (Рис. 5). По структуре дифференциально-окрашенных хромосом клетки линии 293 соответствуют клеткам человеческого происхождения.

Рис. 5. G-окрашенные хромосомы клеток линии 293 с разным числом хромосом: А) 2n=27; Б) 2n=72.

Кариотип клеток культуры 4647 представлял производную от нормального кариотипа зеленой мартышки, 2n=60 и характеризовался гетерогенностью по числу хромосом (Рис. 6). Распределение числа хромосом в клетках на 108 пассаже варьировало от 17 до 120, модальное число 60 хромосом. На 128 пассаже число хромосом наблюдалось от 52 до 136 на клетку. Модальный класс выражен нечетко. Доля полиплоидных клеток на 108 пассаже составляла 20%, к 128 пассажу число гиперплоидных клеток возрастало до 79%.

Рис. 6. Распределение числа хромосом в клетках 4647 на 108 (А) и 128 пассажах (Б).

В отличие от культуры 293, в клетках почки зеленой мартышки 4647 наблюдалась стабильность реконструкции кариотипа. Клетки характеризовались присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, отмечена трисомия пары С2. Одна из Х хромосом перестроена. Маркерные хромосомы образованы в результате разнообразных транслокаций участков хромосом. Маркерных хромосом 6: М3 - включает материал хромосомы С5; М1, М2, М4, М5 и М6 трудно идентифицировать. Состав нормальных и маркерных хромосом клеток на 128 пассаже не отличался от такового клеток на 108 пассаже, что свидетельствует о стабильности кариотипа.

Известно, что клетки при культивировании in vitro могут генетически трансформироваться, инфицироваться онковирусами, индуцировать активность эндогенных онковирусов и, таким образом, приобретать туморогенные свойства. Такие изменения клеток значительным образом нарушают безопасность получаемого продукта, в том числе и вакцины. В связи с этим, обязательным этапом изучения безопасности аттестуемых культур клеток является контроль онкогенности клеток [Серия технических докладов ВОЗ, 1987].

Отсутствие эндогенных онковирусов в клетках линий 4647, МДСК, 293 и Л-68, культивированных до максимально рекомендуемых пассажных уровней использования для производства, подтверждено по низкому уровню активности обратной транскриптазы, близкому к значению отрицательного контроля. Исследования туморогенности клеток методом гетеротрансплантации в экспериментах на иммуносупрессивных мышах показали отсутствие туморогеных потенций клеток из аттестуемых посевных и рабочих банков. Все животные через 20 дней наблюдения после введения клеток оставались живыми, опухолевидных образований в органах не выявлено.

Отсутствие посторонних вирусов было подтверждено в контроле на чувствительных культурах клеток и лабораторных животных, используя мышей-сосунков не старше 24 ч (20 голов), мышей массой 15-20 г (10 голов), морских свинок массой 300-350 г (5голов) и кроликов массой 2,5-3, кг (5 голов). Отсуствие изменений в органах и тканях экспериментальных животных подтвердило данные предыдущего анализа и позволяет утверждать, что аттестуемые линии клеток 4647, МДСК, 293 и Л-68 безопасны в пределах исследуемых уровней пассажа (в среднем 20).

Таким образом было создано 3 посевных и 4 рабочих банка клеток, наиболее перспективных для производства профилактических, диагностических и лечебных препаратов. Аттестация банков клеток показала безопасность клеток по отсутствию бактериальной, микоплазменной и вирусной контаминации, отсутствию онкогенных потенций, по крайней мере, в течение 20 последовательных пассажей культивирования in vitro. Стабильность культуральных, морфологических и продуктивных свойств подтвердили постоянство характеристик исследуемых клеток. Стабильность кариотипа отмечена только в клетках МДСК, 4647 и Л-68.

Известно, что вирус кори Л-16 в достаточно высоких титрах размножается в клетках Л-68 [Царева А.А., 1991; Нечаева Е.А. и др, 2001]. Замена первичных клеток перепелов на аттестованные клетки человека Л-68 имеет значительное преимущество при наработке вакцинного штамма вируса кори [Nechaeva E.A.et.al, 2002]. Клетки Л-68 используются также для контроля специфической активности субстанции и готовых лекарственных форм препаратов рекомбинантного интерферона-б2В, производимого в ДГУ «Вектор-Фарм».

Поскольку культура клеток МДСК высокочувствительна к холодоадаптированным реассортантным штаммам вирусов гриппа A/47/Shandon/93/1 (H1N1), A/47/Johannesburg/94/2 (H3N2) или B/60/Petersburg/95/20 [Нечаева Е.А. и др., 2001; Nechaeva E.A. et.al, 2002], то созданные запасы аттестованных клеток делают культуру высокоперспективной для проведения научных исследований, диагностики и промышленного получения гриппозной вакцины.