Создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов, диагностики и лечения

Банки клеток 4647 могут быть использованы для производстве вакцины против гепатита А (ФСП 42-0168047806, 2006). Согласно данным литературы, культура клеток 4647 высокочувствительна и к другим вирусам (Аксенова Т.А. и др., 1985; Миронова Л.Л. и др., 1990; Грачев В.П. и др. 1990, Миронова Л.П., Хапчаев Ю.Х., 1995, Медуницын Н.В. и др. 2002), что определяет высокую значимость применения ее для диагностики или производства других МИБП.

Изменчивость кариотипа клеток линии 293 из посевного и рабочего банков, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволили рекомендовать культуру 293 для производства противоракового препарата «Канцеролизин». Создание аттестованных банков культуры клеток 293 позволило приготовить производственный штамм Adel2 аденовируса, перспективный в качестве вирусного противоопухолевого препарата [Сергеев А.Н. и др., 2003, Вдовиченко Г.В. и др. 2005]. На основе мутантного варианта аденовируса, культивированного в клетках 293, был разработан препарат «Канцеролизин», пригодный для терапии онкозаболеваний [Vdovichenko G.V et al., 2005], и приготовлены экспериментальные серии препарата, пригодные для проведения доклинических и клинических испытаний [Вдовиченко Г.В., и др.2005].

Ученый Совет ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитет МИБП, на основании представленных данных по исследованию клеток и результатов собственного контроля выдал заключения о соответствии современным требованиям культур клеток 4647, МДСК, Л-68 из посевных и рабочих банков клеток и разрешил использовать их для разработки новых технологий и производства МИБП. В связи с актуальностью разработки и высокой эффективностью препарата «Канцеролизин» в терапии раковых заболеваний, но не достаточной стабильностью кариотипа, было рекомендовано использовать клетки линии 293 в производстве противоракового препарата.

Исследование клеток-продуцентов рекомбинантного эритропоэтина человека

Высокая потребность и коммерческая значимость рекомбинантного ЭПО подчеркивают актуальность и целесообразность проведения исследований по получению новых штаммов-продуцентов, изучению стабильности их продуктивных свойств и безопасности, а также разработке новых лекарственных форм препарата.

Три штамма клеток СНО-рЕ, СНО-972 и СНО-23, продуцирующие рчЭПО, были созданы в институте Молекулярной биологии ГНЦ ВБ “Вектор” с использованием двух разных векторов интегративного типа, а позднее переданы нам для исследования и разработки новых технологий получения лекарственных форм рчЭПО.

Сравнительные исследования рекомбинантных культур клеток показали частичное сходство свойств штаммов клеток СНО-972 и СНО-23, отражающее общность генетических конструкций и линий клеток-реципиентов, используемых для создания данных штаммов; а также полное различие в размерах, типах роста и морфологии клеток этих штаммов с клетками СНО-рЕ.

Анализ показал достаточно высокие культуральные и продуктивные свойства клеток СНО-рЕ и СНО-972, что стало основанием для патентования новых штаммов клеток СНО-рЕ и СНО-972, как перспективных для получения рекомбинантного препарата рчЭПО [Патент РФ 97108266, 1997; Патент RU 2070931, 1996]. Однако пересчет продукции ЭПО на определенное число клеток (удельная продуктивность на 1 млн. клеток) показал несомненные преимущества культуры клеток СНО-рЕ, в качестве продуцента рчЭПО (Рис.7).

Рис. 7. Удельная продуктивность рчЭПО рекомбинантных культур клеток (мкг/10⁶кл/72 часа).

При выборе технологически перспективного штамма клеток важным является стабильность встроенной генно-инженерной конструкции в зависимости от условий культивирования и наличия или отсутствия селективного давления. Контроль продуктивности клеток в питательной среде с селективными добавками (МТХ для клеток СНО-23 и СНО-972 или ГАТ для клеток СНО-рЕ) или без них показал стабильность сохранения высоких продуктивных свойств клеток СНО-рЕ в течение 37 пассажей в селективной среде и не менее 8 пассажей без селективного давления (Рис. 8). И, таким образом, подтвердил стабильность амплифицированного состояния гена, в отличие от клеток СНО-972 и СНО-23, показавших большую зависимость от состава среды.

Рис. 8. Уровень продукции рчЭПО клетками линии СНО-рЕ, выращиваемой на среде с ГАТ или без селективного давления, Ед/мл по ИФА.

Стабильность культуральных, морфологических свойств, характеристик кариотипа и сохранение достаточно высокого уровня продукции рчЭПО клетками СНО-рЕ при длительном их пассировании in vitro, а также независимость продуктивности клетками рекомбинантного гормона от наличия селективных добавок в среде, по крайней мере, в течение 5-8 пассажей, делают культуру клеток СНО-рЕ наиболее перспективной для наработки препарата, регулирующего эритропоэз.

Анализ субстанции рчЭПО. Согласно данным электрофореграммы хроматографически очищенных концентратов эритропоэтина, полученного на разных культурах клеток, молекулярная масса всех трех образцов рчЭПО находилась в пределах значений 35-37 кД (см. Рис. 9), что соответствует молекулярной массе природного эритропоэтина (36 кД). Денситограмма геля показала, что содержание мономера рчЭПО в редуцирующих и нередуцирующих условиях составляет не менее 95% для всех очищенных образцов.

Специфическую активность образцов рчЭПО, полученных на разных культурах клеток, исследовали по гемостимулирующим свойствам или влиянию препарата на рост числа эритроидных колоний в экспериментах in vitro. Результаты показали, что препараты, полученные на культурах клеток СНО-рЕ и СНО-972, обладали колониестимулирующей активностью. Рост числа эритроидных колоний, вырастающих из 0,1 млн мышиных миелокариоцитов, был прямопропорционален увеличению концентрации препарата в диапазоне от 0,5 до 3 Ед/мл.

Рис. 9. Электрофореграмма очищенных образцов рчЭПО, полученного на разных культурах клеток: 1-стандарты молекулярных масс (kD), 2- СНО-рЕ; 3- СНО-972, 4 - СНО-23. Окраска Commassie Brilliant Blue R-250.

Сравнительный анализ специфической активности рчЭПО, полученного в культуре клеток СНО-рЕ, и коммерческого препарата «Recormon» (“Boehringer Mannheim”), проведенный на культуре неприлипающих миелокариоцитов, показал близость кривых доза - эффект в диапазоне концентраций от 0,5 до 10 Ед/мл. Как видно из таблицы 3, при использовании равных концентраций гормона колониестимулирующий эффект рчЭПО, продуцируемого клетками линии СНО-рЕ, в некоторых случаях даже превышал таковой зарубежного аналога. Высокая эритропоэзстимулирующая активность препарата была показана и в экспериментах на лабораторных мышах.

Таблица 3 Зависимость роста числа эритроидных колоний, выросших из 10⁵ неприлипающих миелокариоцитов, от разных концентраций рчЭПО (Х+ m )

Примечание: * - различия между параметрами существенны с вероятностью Р0,95.

Таким образом, контроль физико-химических свойств субстанции рчЭПО, получаемой на всех трех культурах клеток, показал соответствие природному аналогу эритропоэтина человека по молекулярной массе, иммунореактивности и специфической активности по стимуляции эритропоэза в экспериментах in vivo и in vitro.

Учитывая полученные данные и перспективность клеток СНО-рЕ как продуцента для производства рчЭПО, были восстановлены клетки СНО-рЕ из ранее аттестованного национальным органом контроля в соответствии с современными требованиями посевного банка клеток, культивированы и заморожены в виде 2 рабочих банков клеток СНО-рЕ в количестве более 300 ампул. Контроль клеток показал отсутствие контаминантов, стабильность культурально-морфологических и продуктивных свойств.

Получение контролированных банков культуры клеток СНО-рЕ, создало основу для разработки новых технологий производства лекарственного препарата. В результате экспериментальных исследований была разработана впервые в мире технология получения таблетированной формы рчЭПО для перорального применения [Патенты РФ № 2182830 и № 2152206]. Эритростимулирующая активность таблетированной формы препарата в экспериментах на животных оказалась сравнимой с инъекционной (Гольдберг Е.Д. и др. , 2000).

Получение, культивирование и аттестация клеток, пригодных для научных исследований и создания препаратов для заместительной терапии

Одним из перспективных направлений современной биотехнологии является создание новых способов и технологий получения клеток для регенеративной медицины. Рассматриваются возможности конструирования тканей или всего органа с использованием биодеградируемых материалов со стволовыми или дифференцированными клетками. В связи с этим изучение условий получения, культивирования, дифференцировки, аттестации и применения клеток, полученных из разных тканей и органов, представляется актуальным, научно и практически значимым.

Выделение, культивирование и исследование первичных культур клеток из разных тканей и органов. Для получения первичных и диплоидных культур клеток разных тканей и органов использовали ткани эмбриона, взрослого человека или лабораторных животных. Забор эмбрионального материала осуществляли строго после медицинского аборта с соблюдением правил этики, закона об охране здоровья граждан и информированным согласием донора. Ткани и органы животных забирали соблюдая биоэтические нормы.

Клетки выделяли с использованием ферментов трипсина, коллазы, коллагеназы, протеазы или механическим измельчением ткани, криоконсервировали, используя разные криопротекторы (диметилсульфоксид, СКРС, FBS, альбумин сыворотки крови человека). Суспензию клеток или мелкие кусочки тканей разливали по ампулам и замораживали в виде первичных банков клеток. Затем восстанавливали ампулу и изучали жизнеспособность клеток, наличие контаминантов, возможность культивирования in vitro и состав клеток по уровню дифференцировки. В случае выявления контаминации клетки уничтожали.

Результаты исследований показали возможность получения уникальных культур клеток из разных тканей и органов человека и животных. Однако получение жизнеспособных клеток в значительной степени зависело от времени и условий доставки органов, способа выделения клеток, условий их культивирования и криоконсервации.

Для выделения эндотелиоцитов, миокардиоцитов, спинного мозга, мышечной или хрящевой ткани важным являлись не только выбор фермента, его концентрации, но температура и время его воздействия. Клетки печени или головного мозга лучше сохраняли жизнеспособность без применения ферментов для диссоциации, а выделением их в виде небольших конгломератов или групп клеток путем механического продавливания тканей через мелкоячеистый материал.

Использование аттестованного коммерческого альбумина сыворотки крови человека в среду для криоконсервации клеток человека, вместо сыворотки крови животных, позволяло сохранять первичные клетки человека при температуре жидкого азота и исключить вероятность передачи посторонних агентов через сыворотку крови животных.

Изучение условий культивирования показало, что клетки спинного мозга человека, хондроциты, миокардиобласты или эндотелиоциты лучше всего росли в питательной среде ДМЕМ/F12 или RPMI 1640 с добавлением сыворотки крови плодов коровы в количестве 10% - 20%. При выращивании, хондроцитов в данных условиях их число увеличивалось через 3 суток в 2-3 раза. Пересевая через 3-4 дня, клетки хрящевой ткани удавалось поддерживать in vitro в течение 4 и более пассажей. Использование других сред (Игла МЕМ, ДМЕМ) или других сывороток (СКРС, свиная сыворотка) приводило к гибели клеток уже на 1-3 пассаже.

Аналогичные результаты получены и с другими типами клеток. Вместе с тем отмечено, что лучший рост клеток, выделенных из тканей сердца, эндотелия сосудов или мышечной, наблюдался на поверхности, покрытой желатином. Культура клеток, выделенных из миокарда желудочков, была представлена смесью разных типов клеток с преобладанием крупных многоядерных полигональных клеток. После культивирования клеток в течение 20 и более дней исчезали мелкие и крупные многоядерные клетки, но оставались крупные полигональные клетки.

Первичные культуры клеток более всего ценны присутствием стволовых или малодифференцированных клеток. Выявление нестина в первичных клетках головного мозга плода человека с помощью меченых антител подтвердило присутствие нейральных стволовых или прогениторных клеток. Анализ клеток после культивирования in vitro в течение 1 пассажа показал наличие как нестинпозитивных нейральных стволовых клеток, окрашенных флюорохромом taxes red stain, так и ранних нейробластов, меченных антителами на в-III тубулин.

При культивировании нейральные клетки головного мозга делились и мигрировали из кусочков ткани, иногда формировали шарообразные структуры, возможно, нейробластулы. Активного роста клеток мозговой ткани или клеток печени достичь не удалось и, впоследствии, наблюдалась гибель клеток, иногда замещение фибробластоподобными клетками. Из литературы известно, что при выращивании в среде с добавлением сыворотки крови часть клеток эмбрионального мозга плода человека дифференцируется по нейрональному типу [Полтавцева Р.А. и др., 2001].

Ультраструктурное исследование хондроцитов показало, что в ходе I-III пассажей возрастало содержание дифференцированных элементов с признаками синтезирующей активности и накоплением большого количество синтезированного материала. На III пассаже в клетках наблюдалось появление вторичных лизосом, содержащих фрагменты мембран, гранулы секрета и участки цитоплазмы. Структура клеток IV пассажа свидетельствовала о процессах затухания жизнедеятельности культивируемых хондробластов. При световой микроскопии в культуре первичных хондробластов выделялись 3 типа клеток, отличавшихся размерами и количеством цитоплазмы (см. Рис. 10А). Анализ клеток на 2-3 пассаже, окрашенных альциановым синим, показал большое количество суммарных гликозаминогликанов, характерных для дифференцированных хондроцитов гиалинового хряща межпозвонковых дисков, в цитоплазме всех трех типов клеток. Гистохимическая реакция выявила в составе суммарных гликозаминогликанов гранулы хондроитинсульфата и кератансульфата, локализовавшиеся на периферии клеток всех трех типов. В межклеточном веществе отмечалась положительная реакция на коллаген II типа. Отмечено высокое содержание гликогена, особенно, в клетках 2 типа (Рис. 10Б). Полученные данные подтверждают присутствие малодифференцированных клеток гиалинового хряща в первичной культуре и разной степени их дифференцировки в процессе культивирования in vitro.

АБ

Рис.10. Первичная культура фетальных хондробластов человека.

А) Темной стрелкой обозначены клетки первого типа, двойной стрелкой - клетки 2 типа, светлой стрелкой - клетки 3 типа. Окрашено гематоксилин-эозином. Ув. х200.

Б) Реакция на гликоген в клетках разных типов. ШИК-реакция. Ув. х200.

Таким образом, проведенные исследования позволили определить условия выделения, сохранения и культивирования клеток из разных тканей и органов, перспективных для проведения научных исследований или практического применения. Результаты показали, что клетки головного мозга и гепатоциты лучше сохраняли жизнеспособность при выделении и хранении их в виде групп или конгломератов клеток, в то время как клетки других тканей и органов выделяли в виде суспензии отдельных клеток. Использование альбумина сыворотки крови человека позволяло сохранять первичные клетки человека при температуре жидкого азота и исключать вероятности передачи посторонних агентов через сыворотку крови животных. При культивировании первичных культур клеток в среде без добавления специальных факторов стволовые и прогениторные клетки в культуре дифференцируются в течение 1-4 пассажей.

Создание и аттестация банков культур клеток, пригодных для научных исследований или получения препаратов для заместительной терапии.

Создание и аттестация банков первичных культур клеток. Для получения достаточного количества стволовых и малодифференцированных клеток, пригодных для научных исследований или практического применения создавали банки первичных клеток, как уже отмечалось выше. В результате было приготовлено 10 банков первичных культур клеток из разных тканей и органов человека и животных, включавших по 30-200 ампул с клетками.

При создании банка, например, клеток СКМ-30 из тканей головного мозга фетуса человека 20 недель было получено 190 ампул по 1,0х10⁸ клеток в каждой. Однако жизнеспособность клеток оказалась низкой и составила 25%. Низкая доля живых клеток обусловлена высокой скоростью гибели нейральных клеток тканей головного мозга при доставке материала, длительности манипуляций, связанных с выделением, розливом клеток по ампулам и временем заморозки клеток. При ускорении процесса доставки материала, уменьшении количества ампул процедура создания банка сокращалась и позволяла получать суспензию клеток с долей живых не менее 50%.

При создании банка клеток печени плода человека СКП-30 было получено 70 ампул по 1,0х10⁸ клеток в каждой. Число живых клеток составляло 50%, что также свидетельствует о чувствительности клеток печени к влиянию временных и других факторов. Клетки других типов оказались более устойчивыми и, например, выделенные из мышечной ткани (банк СКМц-30, СКМц-16) имели жизнеспособность на уровне 80% и более. Полученные результаты совпадают с данными, описанными ранее, и подтверждают быструю гибель нейральных и нейрональных клеток головного мозга в процессе их выделения.

В настоящее время в России существуют Методические указания, касающиеся аттестации перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов, соответствующие требованиям ВОЗ и разработанные ГИСК им. Л.А. Тарасевича в 1989 году [РД 42 28-10-89, 1989]. Для контроля клеток, пригодных для заместительной терапии, таких требований не было. Опираясь на приобретенный опыт при создании и аттестации банков первичных культур клеток разных тканей и органов и учитывая современный уровень методов контроля, нами были разработаны совместно с сотрудниками ГИСК им. Л.А. Тарасевича новые Методические указания «Аттестация первичных или диплоидных культур клеток, пригодных для трансплантации». Новые требования включают, главным образом, контроль безопасности клеток, пригодных для научных или экспериментальных исследований и создания препаратов для трансплантаци или заместительной терапии. В новые требования введены контроли клеток с использованием современных методов ИФА- и ПЦР-анализов для исключения таких контаминантов, как вирус иммунодефицита человека, гепатиты, туберкулез, хламидии, микоплазмы, цитомегаловирусы и вирусы герпеса человека.

Учитывая требования новых Методических указаний, были проведены контроли первичных банков клеток и оформлены паспорта. По результатам проведенных исследований и по количеству ампул (не менее 100) были отобраны по 2 банка клеток головного мозга (СКМ-30 и СКМ-33) и фетальной печени человека (СКП-30, СКП-33) и представлены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича для последующего контроля в национальном контрольном органе. Впервые созданные и аттестованные банки первичных и малодифференцированных клеток эмбриональной печени или нейральных клеток мозга человека не содержат контаминантов и могут быть использованы для проведения научных исследований или создания препаратов для заместительной терапии.

Создание посевных и рабочих банков культур диплоидных фибробластов человека и их аттестация. Известно, что фибробласты продуцируют важные элементы: коллаген, эластин, полисахариды, факторы роста и другие факторы, необходимые для формирования функциональной структуры кожи (Крихели Э. и др., 2004). Фибробласты обладают сильным стимулирующим действием на адгезию и пролиферацию кератиноцитов, продуцируя гормоны и факторы роста, при этом сами активно пролиферируют (Саркисов Д. С. и др. 1996). Именно эти свойства клеток и позволяют получать хорошие ранозаживляющие эффекты после трансплантации клеток на раны различной этиологии.

Возможность культивирования фетальных или эмбриональных фибробластов человека, сохраняющих стабильные свойства в течение десятков пассажей in vitro, подчеркивает перспективность наработки большого количества стандартных по биологическим свойствам клеток, создания на их основе аттестованных банков клеток, пригодных для научных исследований или разработки новых технологий производства препаратов для заместительной терапии.

Как отмечалось ранее, культуры фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, полученные из тканей легкого или кожно-мышечной ткани эмбриона человека, представлялись наиболее перспективными. Клетки восстанавливали из ампул, замороженных на 6 пассаже, и культивировали в питательной среде до 10-11 пассажа. Из собранного на одном пассажном уровне урожая клетки разливали в ампулы и замораживали при температуре жидкого азота. Так были приготовлены посевные банки клеток легкого ФЭЧ 16-1(ПБК № 1952) и кожно-мышечной ткани ФЭЧ 16-2 (ПБК №1948) в количестве 204 и 312 ампул, соответственно. Рабочие банки фибробластов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 создавали из 1 ампулы посевных банков клеток после культивирования до 15-19 пассажа. Таким образом были созданы банки клеток ФЭЧ 16-1 (РБК № 1957, РБК №2137) и ФЭЧ 16-2 (РБК № 1953, РБК № 1958 и РБК 2138).

В результате было заложено на хранение 7 посевных и рабочих банков эмбриональных фибробластов человека, содержащих по 200-250 ампул с (1,0-1.5)х10⁶ клеток в каждой. Банки клеток аттестовали в соответствии с современными требованиями ВОЗ [РД 42-28-10-89, 1989]. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляла не менее 85% во всех случаях. Фибробласты сохраняли культуральные и морфологические характеристики, оставались субстратзависимыми, формировали монослой, который был представлен однотипными фибробластоподобными клетками с четко выраженной поточностью расположения.

Клетки имели диплоидный набор хромосом, соответствующий нормальному кариотипу человека, 2n=46, XX (см. Рис.11). Основной набор состоял из хромосом с 1-й по 23-ю пару. Модальный класс четко выражен. Маркерные хромосомы не обнаружены. При просмотре 1000 клеток на 14, 30 и 33 пассажах отмечено отсутствие структурных перестроек и гиперплоидных клеток, полиплоидные клетки встречались в 0,4-3% случаев, число диплоидных клеток на 11 и 30 пассажах составляло не ниже 94,5%. Полученные данные свидетельствуют о стабильности кариотипа клеток и соответствии современным требованиям [РД 42-28-10-89, 1989].

Рис. 11. Кариотип культуры клеток ФЭЧ 16-1, 15 пассаж. G -oкраска.

Электрофоретический анализ изоферментов Г6ФДГ и ЛДГ показал видовое соответствие клеткам человека. Отсутствие контаминантов подтверждено методами высева на набор селективных сред, окрашиванием флюорохромом, высевом на чувствительные культуры клеток, на куриных эмбрионах и лабораторных животных. Отсутствие онкогенных потенций показано по отсутствию опухолевых образований у иммуносупрессивных животных через месяц после введения клеток. Отсутствие эндогенных онковирусов показано по низкому уровню активности обратной транскриптазы в исследуемых клетках.

Таким образом, в результате проведенных исследований создано 7 посевных и рабочих банков фибробластов человека, обладающих стабильными культуральными, морфологическими свойствами и неизменным кариотипом при культивировании клеток, по крайней мере, до 35 пассажа. Безопасность клеток подтверждена по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клеток. Национальным органом контроля - ГИСК им. Л.А. Тарасевича было подтверждено, что аттестованные клетки соответствуют современным требованиям. Комитет МИБП разрешил использование их в научных исследованиях и заместительной терапии.

Выбор условий культивирования, транспортировки и поддержания клеток на ране. Одним из перспективных направлений практического применения фибробластов представляется лечение ран различной этиологии [Саркисов Д.С. и др., 1991, 1995; Смирнов С.В., 1994]. Фибробласты субстратзависимы, легко снимаются с помощью трипсина и могут быть трансплантированы на рану в виде суспензии. Однако жидкая консистенция суспензии клеток не способна удерживаться на ране, стекает в повязку, приводит к гибели клеток и, таким образом, снижает их эффективность. В связи с вышеизложенным были проведены исследования по пригодности разных материалов в качестве подложки для выращивания клеток, переноса их и поддержания на ране.

В результате проведенных исследований были подобраны условия выращивания и переноса клеток на специально обработанной целлофановой пленке, на микроносителях или в геле, способы запатентованы [Патенты № 2142820, № 2189223]. Выращенные на прозрачной пленке клетки легко переносились на ровные ожоговые поверхности, рана при этом хорошо просматривалась. Клетки на микроносителях или в геле позволяли переносить клетки на глубокие и неровные раны.

Результаты исследования разных подложек в виде губки или прозрачной многослойной пленки с использованием природных компонентов показали наилучшие результаты при использовании экспериментальных образцов коллагена и хитозана, сшитых глутаровым альдегидом с добавлением альгината натрия, глутаровой кислоты, а также антисептика фурагина и анестетика анилокаина. В отличие от многих других указанные образцы не токсичны и клетки не только прикреплялись к ним, но и равномерно заселяли их, морфология клеток не менялась (см. Рис.12).

Рис.12. Монослой фибробластов на пленке из хитозана, сшитого с коллагеном глутаровым альдегидом. Ув. х20об.

Возможность приготовления субстрата в виде геля, губки или многослойной пленки, нетоксичность и пригодность их для выращивания и поддержания клеток делают данный материал наиболее перспективным для трансплантации клеток на раны различной глубины и формы. Разработанные условия выращивания клеток, транспортировки и удобства трансплантации в геле или на специальных пленках имеют несомненное практическое значение и могут быть использованы в регенеративной медицине.

Ограниченные клинические исследования по применению клеток на пленках, в геле или на микроносителях в ситуациях по жизненным показаниям показали высокую эффективность применения аттестованных фибробластов для лечения обширных и глубоких ожоговых ран; больных диабетом с длительно незаживающими трофическими язвами, больных с отморожениями конечностей или длительно незаживающими дефектами костной ткани [Ефремов А.В. и др., 1995; 1999; Юрченко Н.Д. и др., 2000, Колосов Н.Г. и др., 2005]. Применение клеток приводило к повышению эффективности сопутствующей терапии и ускорению сроков заживления ран, по сравнению с традиционными методами лечения [Колосов Н.Г. 1999; Колосов Н.Г. и др., 2005]. Использование аттестованных клеток позволяло исключить вероятность переноса инфекции и туморогенность препарата.

Уникальность и преимущества предлагаемого метода подчеркивается возможностью использования клеток из аттестованных банков при определенных показаниях: дефицит донорских ресурсов при обширных и глубоких ожогах, у больных с поливалентной аллергией, а также у лиц пожилого и старческого возраста, при показаниях не позволяющих осуществлять аутодермопластику, в детской комбустиологии и в случаях с инфицированными больными (гепатиты, ВИЧ) без дополнительной травмы больного и создания дополнительных ран.

Создание аттестованных банков клеток и подбор условий для выращивания и транспортировки клеток легло в основу создания новой технологии получения стандартного, высокоэффективного и безопасного препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии». Разработка и внедрение технологии применения клеток человека, заранее аттестованных и заложенных на хранение в ампулах в достаточном количестве, позволит обеспечивать стандартным клеточным материалом тяжело обожженных и больных при чрезвычайных ситуациях.

Использование нового метода в практической медицине позволит уменьшить процент смертности ожоговых больных, уменьшить хирургическое вмешательство, сократить размеры донорских участков, уменьшить сроки госпитализации и получить лучшие косметические эффекты. Полученные результаты исследований легли в основу разработки нормативной документации: Фармакопейной статьи предприятия, Регламента производства, Инструкции по применению. Новые штаммы клеток ФЭЧ - 16-1 и ФЭЧ-16-2 запатентованы, как пригодные для заместительной терапии.

ВЫВОДЫ

1. В результате многолетних исследований при нашем участии создана система аттестованных клеток, включающая паспортизованные коллекции и аттестованные банки первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток, пригодных для научных исследований, разработки новых технологий производства препаратов и лечения, соответствующая требованиями ВОЗ и обеспечивающая гарантии качества, стабильности и безопасности клеток и получаемых препаратов.

2. Изучены условия выделения новых культур клеток различного происхождения. Получены новые штаммы диплоидных культур клеток человека и 4 новые линии клеток насекомых МБ ХС-685, МБ ОзС-72, МБ ОзС-73 и МБ КС-23, выделенные из яичников куколок хлопковой, озимой и капустной совок. Клетки насекомых характеризуются стабильными культурально-морфологическими свойствами, способностью к продукции вирусов ядерного и цитоплазматического полиэдроза (ВЯП И ВЦП) и могут служить системой для проведения научных исследований или производства энтомопатогенных препаратов.

3. Созданы и аттестованы в соответствии с современными требованиями ВОЗ 7 посевных и рабочих банков технологически перспективных культур клеток. Стабильные по свойствам и безопасные по отсутствию контаминантов и туморогенных потенций линии клеток МДСК, 4647 и Л-68 разрешены национальным органом контроля для создания новых технологий производства вакцин и других МИБП. Изменчивость кариотипа клеток 293, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволили рекомендовать культуру клеток 293 для производства противоракового препарата «Канцеролизин».

4. Выделенные и хроматографически очищенные образцы субстанции рчЭПО, полученные на трех рекомбинантных культурах клеток, показали высокую степень чистоты и отсутствие посторонних примесей, а также соответствие природному аналогу по молекулярной массе, иммунореактивности и специфической активности по влиянию на эритропоэз в экспериментах in vitro и in vivo на лабораторных животных. Полученные данные легли в основу разработки новой технологии получения таблетированной формы рчЭПО для перорального применения.

5. Стабильность и высокие продуктивные и культуральные свойства культуры клеток СНО-рЕ по сравнению с другими рекомбинантными линиями клеток СНО-972 и СНО-23 показали большую перспективность данной культуры для производства генноинженерного эритропоэтина человека. Клетки СНО-рЕ, заложенные в виде рабочих банков, являются основой для организации стабильного производства препаратов рекомбинантного ЭПО человека.

6. Создана технология получения стандартного, высокоэффективного и безопасного препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии» с использованием впервые полученных штаммов диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 из аттестованных посевных и рабочих банков. Разработаны и утверждены ФСП, Регламент производства, Инструкция по применению, получен Сертификат производства.

7. Экспериментально обоснованы способы выращивания фибробластов на специальных пленках, пористых подложках или микрононосителях для трансплантации клеток на раны различной этиологии. Впервые примененная методика транспортировки клеток в геле или на микроносителях позволяет доставлять материал на большие расстояния, сохранять жизнеспособный материал в течение 5 дней, что может иметь значение при доставке клеток в дальние районы и при чрезвычайных ситуациях.

8. Отработаны условия выделения первичной суспензии клеток из разных тканей и органов, диспергирования и криоконсервации. Показано присутствие стволовых и малодифференцированных клеток в первичных культурах и быстрая их дифференциация при культивировании in vitro.

9. Разработаны Методические указания по контролю клеток, пригодных для научных исследований или трансплантации. Впервые созданы банки первичных малодифференцированных клеток, выделенных из разных тканей и органов и заложенных на хранение при температуре жидкого азота. Созданные и аттестованные в соответствии с современными требованиями 4 банка клеток печени и нейральных клеток головного мозга плода человека могут быть использованы для научных исследований или создания стандартных и безопасных препаратов для заместительной терапии.

сПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Идентификация линий клеток насекомых /Колокольцова Т.Д, Царева А.А., Немцов Ю.В., Исаенко А.А., Бочкова Т.Г. // Вопросы вирусологии. - 1987. - т.32. - № 1. - С. 87-95.

2. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева А.А., Исаенко А.А., Немцов Ю.В, Колокольцова Т.Д., Юрченко Ю.А., Рубцова Н.В., Машукова С.И., Решетникова Г.Ф., Киц И.В., Дмитриева Е.В., Гетманова Т.Н., Чешенко И.О., Махова Н.М.. // Депонирован в ВИНИТИ, - Деп. № 865-В88, - M.,1988. - т. 1. - С. 1-186.

3. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева А.А., Исаенко А.А., Немцов Ю.В, Колокольцова Т.Д., Юрченко Ю.А., Решетникова Г.Ф., Юрченко Н.Д., Махова Н.М., Рубцова Н.В., Урманова М.А., Машукова С.И., Дмитриева Е.В., Гетманова Т.Н., Чешенко И.О., Киц И.В. .// Депонирован в ВИНИТИ, - Деп. № 866-В88, - M., 1988. - т. 2. -С. 1-150.

4. Каталог перевиваемых культур клеток. Царева А.А., Исаенко А.А., Немцов Ю.В, Колокольцова Т.Д., Юрченко Ю.А., Решетникова Г.Ф., Рубцова Н.В., Махова Н.М., Машукова С.И., Гетманова Т.Н., Чешенко И.О. // Депонирован в ВИНИТИ, Деп. № 867-В88, - M., 1988. - т.3, - С. 1-110.

5. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева А.А., Исаенко А.А., Колокольцова Т.Д., Немцов Ю.В, Хромых Т.И., Рубцова Н.В., Юрченко Ю.А., Рябчикова Е.И., Ткачев В.К.. // Депонирован в ВИНИТИ. - Деп. № 869-В88, - M., 1988. - т. 4. - с. 1-141.

6. Штамм перевиваемых клеток эмбрионов Agrothis segetum (Schiff) для культивирования бакуловирусов / Колокольцова Т.Д., Герасимова Н.Г., Царева А.А. // Патент (СССР) № 1808009 Ф3, С12 N5/00, Ф01 № 63/00, опубл. в БИ № 13, 1993г.

7. Колокольцова Т.Д., Царева А.А. Штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armigera (Hubn), продуцент вирусов ядерного полиэдроза // Патент (СССР) № 1808010 Ф3. - БИ. - 1993. -№ 13.

8. Колокольцова Т.Д., ЦареваА.А. Выбор источника получения первичных культур клеток чешуекрылых насекомых // Цитология. - 1994. - № 4. -С.6-7.

9. Колокольцова Т.Д, Герасимова Н.Г. Получение новой линии клеток яичников куколок капустной совки Mamestra brassicae L. // Цитология. - 1994. - № 4. - С. 9-10.

10. Лечение глубоких ожогов кожей, выращенной в искусственных условиях / Ефремов А.В, Юрченко Н.Д. Колосов Н.Г., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А. // Сб. "Актуальные вопросы развития военно-медицинской службы СибВО на современном этапе". - Новосибирск, 1995. - С. 16-17.

11. Колокольцова Т.Д., Царева А.А. Морфологический и кариологический анализ первичных и перевиваемых культур клеток чешуекрылых насекомых // Вопросы вирусологии. - 1995. - № 2. - С. 91-95.

12. Колокольцова Т.Д., Герасимова Н.Г., Царева А.А., Получение первичных культур клеток чешуекрылых насекомых // Вопросы вирусологии. - 1995. - № 2. - С. 89-91.

13. Колокольцова Т.Д. Герасимова Н.Г., Царева А.А. Новая линия клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armigera (HUBN) // Вопросы вирусологии. - 1995. - № 3. - С. 135-138.

14. Колокольцова Т.Д., Царева А.А. Методические основы получения первичных культур клеток насекомых.//Вопросы вирусологии. - 1995. - № 3. - С. 89-91.

15. Выяснение оптимального способа получения культур клеток кожи / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д., Колосов Н.Г., Нечаева Е.А. // Цитология.-1996. - т. 38. - № 2. - С. 262-263.

16. Выбор оптимальных условий получения суспензии жизнеспособных клеток кожи человека / Юрченко Н.Д, Колокольцова Т.Д, Колосов Н.Г, Шумакова О.В., Нечаева Е.А. // Биотехнология.- 1997. - № 11-12. - С. 37-47.

17. Перспективы использования аттестованных фетальных фибробластов человека при лечении ран различной этиологии / Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Колосов Н.Г., Шумакова О.В., Нечаева Е.А. // Вестник РАМН.-1998.- № 3. - С. 32-35.

18. New technology of production recombinant human erythropoietin for peroral administration / Kolokoltsova T.D., Kostina N.E., Nechaeva E.A., Yurchenko N.D., Shumakova O.V., Rizikov A.B., Varacsin N.A., Rjabicheva T.G. // Proceedings of ESACT Meeting: "New Developments and New Application in Animal Cell Technology" / Ed. by Otto Wilhelm Merten, P. Perrin and B. Griffits. - Netherlands.: Kluwer Academic Publishers, 1998. - Р. 463-467.

19. Cultivation of skin cells suitable for recovery of burn wound / Kolokoltsova T.D., Yurchenko N.D., Kolosov N.G., Khristo S.A., Shumakova O.V // Proceedings of ESACT Meeting: "New Developments and New Application in Animal Cell Technology" / Ed. by Otto Wilhelm Merten, P. Perrin and B. Griffits. - Netherlands: Kluwer Acad. Pub., 1998. - Р. 673-675.

20. Первый опыт применения культуры аллофибробластов при ожогах / Христо С.А., Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Юдаев И.П // Сб: «Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине».- Новосибирск, 1998. - С. 183-184.

21. Применение аттестованных фибробластов в Ожоговом Центре / Ефремов А.В., Колосов Н.Г., Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Христо С.А., Юдаев И.Ю., Нечаева Е.А // Сб.:«Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине». - Новосибирск, 1999. - С. 132-134.

22. Creation and maintenance of certified banks of cells suitable for production of healing and immunological preparations / Kolokoltsova T.D., Yurchenko N.D., Nechaeva E.А, Isaenko A.A., Shumakova O.V., Getmanova T.N // Proceedings of ESACT Meeting: «Animal cell technology : products from cells, cells as products» / A. Bernard (eds.). - Switzerland,: Kluwer Acad. Pub., 1999. - Р. 505-507.

23. Рекомбинантная плазмидная ДНК рКЕР-9, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка СНОрЕ-9 - продуцент эритропоэтина человека / Урманова М.А., Щелкунов С.Н., Поздняков С.Г., Колокольцова Т.Д., и др. // Патент РФ № 97108266. - БИ.- 1999. - № 1.

24. Аллотрансплантат для восстановления кожного покрова, способ его получения и способ восстановления кожного покрова при повреждениях различной этиологии / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д., Колосов Н.Г. и др. // Патент РФ № 2142820, - БИ. - 1999. -№ 35.

25. Создание аттестованных банков фибробластов человека, пригодных для лечения ран различной этиологии / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д., Щумакова О.В., Нечаева Е.А., Христо С.А. // Сб. «Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии». - Омск, 2000. - С. 182-184.

26. Гемостимулирующие свойства таблетированной формы рекомбинантного эритропоэтина человека в эксперименте / Голдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Колокольцова Т.Д., Костина Н.Е., Минакова М.Ю., Нечаева Е.А.. Поженько Н., Сандахчиев Л.С., Симанина Е.В., Хлусов И.А. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. - т. 63.- № 5. - С. 37-40.

27. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения и способ его получения / Сандахчиев Л.С., Колокольцова Т.Д., Костина Н.Е., и др. // Патент РФ № 2152206. - БИ. - 2000. - № 10.

28. The comparative study of cultural and productive characteristics of different recombinant cell lines producing human erythropoietin / Kolokoltsova O., Schumakova O., Belova N., Nechaeva E., Kolokoltsova T. // Proceedings of ESACT Meeting: “Animal cell Technology: From target to Market”. / Ed. Lindner E., Chatzissavidou N., Lullau E. - New York/Boston/London: Kluver Academic Publishers, 2001.- Р. 75-78.

29. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина / Сандахчиев Л.С, Колокольцова Т.Д., Вараксин Н. И др. // Патент РФ №2182830. - БИ. - 2002. - № 15.

30. Средство для лечения глубоких кожных дефектов / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д., Шумакова О.В, и др. // Патент РФ № 2189223. - БИ. -2002. - № 9.

31. Kim I., Kolokoltsova T. The production and storage of nucleus-containing cells from umbilical blood // Proceedings of the II Moscow International Congress “BIOTECHNOLOGY: State of the art and prospects of Development”. - Moscow, Russia, 2003. - P. 121-124.

32. Vdovichenko G.V, Kolokoltsova T.D. The development of the method for production of cardiac cells and vascular endothelium // Proceedings of the II Moscow International Congress “BIOTECHNOLOGY: State of the art and prospects of Development”. - Moscow, Russia, 2003. - P. 127-133.

33. Cell-based therapy of chronic degenerative diseases of the central nervous system / Pankratov YV, Ivanov AI, Kolokoltsova TD, Nechayeva YA, Radayeva IF, Korochkin LI, Revischin AV, Naumov SA, Khlusovi IA, Autenshlus AI. // Adv Exp Med Biol. - 2003. - № 534. Р. 97-105.

34. Структурно-функциональный анализ гена рибосомного белка L11 человека /Воронина Е.Н., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А.,. Филипенко М.Л // Мол. Биол. - 2003. - т. 37. - № 3. - С. 425-435.

35. Вдовиченко Г.В., Колокольцова Т.Д., Фатюхина О.Е. Выбор субстрата для культивирования клеток сердца и эндотелия сосудов // Успехи современного естествознания. - 2004.- № 6. -т. 1. -С. 133-134.

36. Создание банка ядросодержащих клеток из пуповинной крови /Ким И.И., Хлусов И.А., Костина Г.А., Колокольцова Т.Д., Иванов А.И., Болгова О.П. // Успехи современного естествознания. - 2004.- № 6.- т. 1.- С. 135-136.

37. Проблемы аттестации культур клеток, пригодных для заместительной терапии / Колокольцова Т.Д., Костина Г.А., Нечаева Е.А., Радаева И.Ф, Шалунова Н.В. // Успехи современного естествознания. - 2004. - т.1.- № 6.- C. 127-128.

38. Зайдман А.М., Сахаров А.В., Колокольцова Т.Д. Культура хондробластов как потенциальный источник для тканевой инженерии при повреждениях и заболеваниях позвоночника // Хирургия позвоночника.-2004. - № 4. - C.115-121.

39. Опыт применения культивированных аллофибробластов при лечении ран различной этиологии /Колосов Н.Г., Ефремов А.В., Колокольцова Т.Д., Евланова Е.А., Шалунова Н.В. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2005. - № 3.- С. 57-59.

40. Культура хондробластов человека - как возможный донорский материал для коррекции нарушений хрящевой ткани / Зайдман А.М., Сахаров А. В., Корель А.В., Ким И., Колокольцова Т. Д. // Вестник трансплантологии и искусственных органов.- 2005. -№ 3.-С. 59-61.

41. Создание и аттестация банков перевиваемой культуры клеток MDCK для производства гриппозной вакцины / Радаева И.Ф., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А., Мазуркова Н.А., Ильина Т.В., Гетманова Т.Н., Балтуева Л.С., Графодатский А.С., Гендон Ю. З., Петручук Е.М. // Вопросы вирусологии. -2005.- № 2.- С. 43-46.

42. Аттестация перевиваемой культуры клеток 293, используемой для культивирования антиракового лечебного препарата «Канцеролизин» / Радаева И.Ф, Вдовиченко Г.В., Сергеев А.А., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А, Сергеев А.Н., Терновой В.А., Нетесов С.В. // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - т. 50. - № 5-6. - С. 7-10.

43. Колокольцова Т.Д., Шалунова Н.В., Петручук Е.М. К вопросу о контроле безопасности культур клеток, пригодных для заместительной терапии // Биопрепараты. - 2006. - № 2. - С. 8-12.

44. Создание банков перевиваемой культуры клеток 293 для производства антиракового лечебного препарата «Канцеролизин» / Вдовиченко Г.В., Радаева И.Ф., Сергеев А.А., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А., и др. // Биотехнология. - 2006. - № 1. - С. 62-65.

45. Влияние имплантации клеток печени эмбриона человека на течение экспериментального токсического гепатита / Хлусов И.А., Наумов С.А., Нечаева Е,А., Колокольцова Т.Д., Хлусова М.Ю., Никифоров С.Б., Антипов С.А., Некрасова А.М. // Биопрепараты. - 2006. - № 2. - С. 17-21.

46. Евланова Е.А., Колокольцова Т.Д., Еремеев А.В. Выбор подложек, пригодных для культивирования и переноса клеток на раны различной этиологии // Биопрепараты. - 2006. - № 2. - С. 33-36.

47. Штамм диплоидных клеток человека для заместительной терапии (его варианты) / Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А., Костина Г.А,.и др. // Патент РФ № 2004126518 А61 К35/54. - Опубл. 2006.

48. Композиция на основе клеточных культур для лечения дефектов костной ткани при повреждениях воспалительной этиологии / Колокольцова Т.Д., Болгова О.П., Радаева И.Ф., и др. // Патент РФ № 2004126519 С12N5/00. - Опубл. 2006.

49. Получение аттестованных фибробластов человека, пригодных для научных и медицинских исследований // Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Нечаева Е.А., Радаева И.Ф, Шалунова Н.В., Петручук Е.М., Бердникова З.Е., Колосов Н.Г. // Биотехнология. - 2007.- № 1. - С. 58-64.

50. Изучение морфофункциональных особенностей хондробластов, полученных из пластинки роста тел позвонков человека, при культивировании in vitro //Сахаров А, Ким И.И., Колокольцова Т.Д., Рябчикова Е.И. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007.-№3. - С. 154-158.

51. Оценка безопасности метода лазерно-индуцированной флюоресценции на модели культуры клеток диплоидных клеток человека // Фатюхина О., Колокольцова Т.Д., Трошкова Г.П. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007.-№4. - С. 203 -206.

Размещено на Allbest.ru