Производство молочной кислоты

Размещено на http://www.allbest.ru/

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Молочная кислота

1.1 Пищевые органические кислоты. Молочная кислота

1.2 Применение пищевых кислот

1.3 Получение молочной кислоты

1.4 Кисломолочное брожение

2. Молочнокислое брожение

2.1 Молочнокислое брожение

2.2 Кинетика молочнокислого брожения

3. Описание технологической схемы производства молочной кислоты

4. Молочная кислота в организме человека

5. Основы синтеза молочной кислоты

6. Отходы и их использование

Заключение

Список использованных источников



ВВЕДЕНИЕ

Кисломолочные продукты человек использует в питании с древнейших времен. После того как в XVIII в. шведский химик и фармацевт Карл Вильгельм Шесле открыл в лимонах, осадке вина (винном камне) и скисшем молоке соответственно лимонную, винную и молочную кислоты, а позже было создано промышленное производство их, эти кислоты стали вводить в пищу для придания ей кислого вкуса. Таким образом, практика добавления кислот в пищевые продукты исходит из существования натуральных кислых продуктов, а сами тривиальные названия кислот этимологически связаны с ними.

Пищевая молочная кислота представляет собой водный раствор молочной кислоты, который получают ферментацией углеводсодержащего сырья молочнокислыми бактериями Lactobacillus delbrueckii.

Молочная кислота принадлежит к классу ациклических оксикислот, т.е. соединений, содержащих одновременно спиртовый гидроксил и карбоксильную группу. Её можно рассматривать как гидроксильную производную карбоновой кислоты. Так, при замещении водорода в радикале пропионовой кислоты спиртовым гидроксилом получается оксипропионовая, или молочная кислота.

Кисломолочное брожение известно с незапамятных времен. Этот вид брожения впервые изучил Л. Пастер в 1857г.

Сырьем для производства молочной кислоты служит смесь тростникового сахара-сырца, рафинадной патоки и свекловичной мелассы.

В России в промышленных масштабах молочную кислоту впервые получили в 1923 году на московском химико-фармацевтическом заводе им. Л.Я. Карпова по ферментативному способу, предложенному В.Н. Шапошниковым и А.Я. Мантейфель. В 1928 г. организовано производство также в Москве на Хамовническом заводе "Пищепродукт".

Молочную кислоту используют в качестве добавки к безалкогольным напиткам, эссенциям, фруктовым сокам, джемам и сиропам, для декальцификации кож в дубильной промышленности, а также при производстве пластмасс, когда форму полимеризуют в полилактат, применяемый, для производства пластиковых оберток. Соли молочной кислоты используются в медицине.

кислота молочная брожение технологический



1. МОЛОЧНАЯ КИСЛОТА

1.1 Пищевые органические кислоты. Молочная кислота

Молочная кислота широко применяется в пищевой, фармацевтической и других отраслях промышленности. В пищевой промышленности она используется в производстве кондитерских изделий, безалколгольных и ликеро-водочных напитков, фруктовых соков, в хлебопекарном производстве. Пищевая молочная кислота представляет собой водный раствор молочной кислоты, который получают ферментацией углеводсодержащего сырья гомоферментативными молочнокислыми бактериями Дельбрюка (Laktobacillus delbrueckii). Сырьем для производства молочной кислоты служит смесь тростникового сахара сырца, рафинадной патоки и свекловичной мелассы. Тростниковый сахар-сырец содержит 99,4-99,6 % сухого вещества, в том числе 96,5 -98 % сахарозы. Рафинадная патока является отходом производства сахара-рафинада, содержит не менее 72 % сухого вещества, в том числе 49 % сахарозы. Гомоферментативное молочнокислое брожение может быть представлено следующим уравнением:

С6Н12О6 -> 2C3Н6О3 + 94 кДж.

Технологическая схема производства молочной кислоты включает следующие процессы: подготовка питательной среды и получение посевного материала; сбраживание питательной среды; очистка культуральной жидкости; кристаллизация лактата кальция, отделение кристаллов лактата кальция; разложение лактата кальция; очистка раствора молочной кислоты; выпаривание раствора молочной кислоты; розлив молочной кислоты. Готовая молочная кислота содержит различные продукты дегидратации, которые называются ангидридами. При повышении концентрации кислоты содержание ангидридов возрастает. Образование ангидридов приводит к снижению кислотности, ухудшению качества кислоты. Пищевую молочную кислоту выпускают 40%-й концентрации высшего, I и II сортов. Она представляет собой прозрачную жидкость без мути и осадка, со слабым запахом, без постороннего привкуса. Содержание золы для высшего сорта не более - 0.6, для I - 1, II - 4 %. Пищевую молочную кислоту разливают в бутыли вместимостью 10 л, бочки из полиэтилена вместимостью 50 л. Стеклянные бутыли укладывают в деревянные ящики, заполненные упаковочным материалом. Хранят в таре изготовителя в закрытых помещениях в течение 1 года со дня выработки.

1.2 Применение пищевых кислот

Роль молочной и других оксикислот в питании человека недостаточно ясна, хотя и признана их полезность для организма. Введение этих кислот с фруктами, кисломолочными продуктами, безалкогольными напитками и др. стимулирует секреторные функции поджелудочной железы, усиливая выделение желудочного сока, повышая аппетит и способствуя лучшему усвоению пищи. Кислоты после всасывания из кишечника полностью сгорают.

Молочная кислота вездесуща, она присутствует везде, где есть жизнь и, возможно, появилась на земле раньше, чем кислород в атмосфере. В организме животного и человека она образуется из глюкозы или гликогена в результате гликолиза (гликогенолиза). При достаточном снабжении организма кислородом образования молочной кислоты не происходит. Молочная кислота накапливается в мышцах при интенсивной работе и понижении их энергетических запасов. Она подвергается дальнейшему окислению, выделяясь с мочой и потом, или используется печенью для ресинтеза гликогена.

Человек постоянно вводит в свой организм молочную кислоту со сметаной, творогом, простоквашей, кефиром, ацидофилином, айраном, кумысом, сыром, ржаным хлебом, квасом, квашеной капустой, солеными огурцами и многими другими продуктами. Следовательно, она не чужда нашему организму. Традиционное употребление кисломолочных продуктов объясняется влиянием молочнокислых бактерий -- антагонистов гнилостной микрофлоры кишечника -- уменьшением образования токсичных для организма продуктов разложения органических веществ и улучшением усвояемости животного белка.

Молочная кислота используются в разнообразных продуктах питания, в различных отраслях промышленности, в сельском хозяйстве и медицине. Чтобы составить некоторое представление о чрезвычайном разнообразии и роли этой кислоты в народном хозяйстве, целесообразнее исходить из проявления ими следующих свойств: 1) подкисления и регулирования рН; 2) бактериостатичности действия; 3) образования комплексов с металлами; 4) пластифицирования белков и эмульгирования.

- Подкисление и регулирование рН.

Молочная кислота по сравнению с неорганическими - слабая кислота. Она обладает более кислым вкусом, чем можно было бы ожидать, исходя только из констант электролитической диссоциации. Кислый вкус зависит от общей (титруемой) кислотности, а не от величины рН, поэтому при одном и том же рН он будет тем сильнее, чем менее диссоциирована кислота. Порог ощущения при данном рН все же увеличивается с уменьшением константы электролитической диссоциации этой кислоты и составляет для молочной кислоты 38--40мг/л. Молочная кислота -- умеренный подкислитель, вызывающий слабое ощущение, которое держится долго.

Молочная кислота за рубежом завоевала признание, как пищевая, сравнительно недавно--около 35 лет тому назад; до этого она находила лишь техническое применение (в кожевенной промышленности).

Она во многих продуктах должна заменить уксусную с сохранением ее лишь в некоторых традиционных продуктах со специфическим вкусом. Уксусная кислота задерживает в организме окисление конечных продуктов, вызывает денатурацию белка, впитываясь в кровеносную систему, вызывает гемолиз, эмболию и симптомы ацидоза, в больших количествах -- катар кишок, тошноту, понос, анемию, воспаление почек, тогда как молочная кислота не имеет противопоказаний и разрешена в диете при различных заболеваниях почек, желчного пузыря и поджелудочной железы.

Молочную кислоту добавляют в затор или сырцовый солод в пивоварении, для снижения жесткости воды и рН до величины, близкой к оптимальной для действия амилолитических и протеолитических ферментов. При этом увеличивается выход экстрактивных веществ из солода, улучшается физиологическое состояние дрожжей, устраняется опасность инфицирования и повышается качество готового пива. Молочную кислоту применяют в производстве хлебопекарных дрожжей для очистки засевных дрожжей от посторонней микрофлоры, в том числе и от лактобацилл, а также для очистки мелассы, стимулируя размножение дрожжей. Подкисление мелассной среды в спиртовом производстве, с дальнейшим использованием спиртовых дрожжей в качестве хлебопекарных приводит к повышению активности, выхода дрожжей и улучшению качества выпеченного на них хлеба.

- Бактериостатическое действие.

Молочной кислоте часто приписывают свойство консерванта, но она не обладает каким-либо специфическим бактериостатическим действием, кроме действия, обусловленного кислотностью, и в этом отношении уступает уксусной кислоте. Подкисление предотвращает рост микроорганизмов, и, так как жизнь их не продолжительна, то при прекращении размножения они погибают.

Молочная кислота сдерживает развитие только гнилостных бактерий (0,2%-ная кислота полностью подавляет бактерии группы мезентерикус, 0,3%-ная--бактерии коли), не действует на микроскопические грибы, на дрожжи или даже стимулирует их развитие, на чем основано применение ее в производствах, основанных на дрожжевом брожении. Тепловую стерилизацию в присутствии молочной кислоты можно вести при более низкой температуре.

Умеренно кислый вкус молочной кислоты при относительно высокой кислотности делает ее употребление, наряду с уксусом, предпочтительным в производстве таких продуктов, как консервированная рыба в кислом соке, маринованные столовая свекла, цветная капуста, огурцы, оливы, лук, в производстве майонеза и майонезных приправ. Молочную кислоту добавляют в тесто главным образом в летний период для предотвращения развития в хлебе картофельной палочки (очень чувствительной к кислотности).

Эту кислоту издавна используют в ветеринарии для подавления вредных кишечных микробов у поросят, только что отнятых от материнского молока, при воспалении желудка и кишечника, при гинекологических заболеваниях, язвенных поражениях кожи.

- Пластификация белков и эмульгирование.

Хорошо известно, что при забое животных мясо получается вкуснее, если они находятся в спокойном и неизнуренном состоянии. Это объясняется тем, что в мышцах животных содержится больше гликогена, который после смерти диссимилирует в молочную кислоту, пластифицируя белок.

Известно также, что при изготовлении хлеба молочную кислоту добавляют или получают при брожении теста, воздействуя на клейковину.

Молочную кислоту можно использовать для ускорения получения молочно-белкового сгустка при производстве творога.

Сказанным выше не ограничиваются возможные пути использования оксикислот в различных отраслях народного хозяйства. С углублением наших знаний о свойствах этих кислот и их производных следует ожидать новых достижений в данной области.



1.3 Получение молочной кислоты

Молочная кислота (СН₃СНОНСООН) - органическая одноосновная кислота, образуемая в результате анаэробного превращения углеводов молочнокислыми бактериями. В 1847 г. С. Блодно доказал, что данная кислота является продуктом брожения, а Л. Пастер установил, что этот процесс вызывают бактерии. Образование молочной кислоты из глюкозы возможно несколькими путями. При сбраживании гомоферментными молочнокислыми бактериями:

С₆Н₁₂О₆ 2 СН₂ОН₂СНОНСНО (глицеральдегид) 2 СН₃СОСНО (метилглиоксаль) + 2 Н₂О,

СН₃СОСНО (метилглиоксаль) + Н₂О СН₃СНОНСООН (молочная кислота).

Второй путь, гетероферментный, включает распад глюкозы до пировиноградной кислоты и восстановление последней до молочной кислоты:

С₆Н₁₂О₆ СН₃СОСООН + Н₂ СН₃СНОНСООН.

Для промышленного получения молочной кислоты используют гомоферментные молочнокислые бактерии. У гомоферментных молочнокислых бактерий только 3 % субстрата превращается в клеточный материал: а остальной - трансформируется в молочную кислоту, выход которой достигает до 1.5 %. Теоретически из 1 моля глюкозы должно образоваться 2 моля лактата. На практике эта величина несколько ниже, 1.8 моля, то есть выход продукта от субстрата достигает 90 %.

Применяют молочную кислоту в пищевой промышленности для получения напитков, мармеладов, в процессах консервирования, а также в кормопроизводстве. Соли молочной кислоты используют в фармацевтике.

Промышленное производство молочной кислоты начато в конце ХIХ века с участием молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii, L. leichmannii, L.bulgaricus. Молочнокислое брожение протекает в анаэробных условиях, однако лактобациллы относятся к факультативным анаэробам, поэтому при ферментации воздух полностью не удаляют из ферментеров. В качестве сырья используют сахарную и тростниковую мелассу и гидролизаты крахмала, при этом концентрация сахаров в исходной среде в зависимости от характера брожения составляет примерно от 5 до 20 %. Используют восстановленные формы азота, сульфаты или фосфаты аммония, а также солод и кукурузный экстракт в качестве источника факторов роста. Возможно использование сульфитного щелока с участием бактерий L. delbrueckii. Ферментацию проводят в глубинной культуре при рН 6.3-6.5 и строго постоянной температуре 50С. Длительность процесса составляет до 7-11 суток. В ходе процесса брожения для коррекции изменяющегося рН в культуру вносят мел, 3-4 раза в течение суток. Конечная концентрация образующегося лактата кальция составляет 10-15 %, остаточная концентрация сахаров - 0.5-0.7 %.

На стадии получения готового продукта культуральную среду нагревают до 80-90, затем нейтрализуют гашеной известью до слабощелочной реакции. После отстаивания в течение 3-5 ч взвешенные частицы декантируют. После этого раствор лактата кальция подают на фильтр-пресс. Фильтрат упаривают до концентрации 27-30 %, охлаждают до 25-30 и подвергают кристаллизации. Промытый лактат кальция отделяют центрифугированием и подвергают расщеплению серной кислотой при 60-70. Сырую молочную кислоту 18-20 % концентрации упаривают в несколько этапов в вакуум-выпарных аппаратах до 70 % концентрации. Отфильтрованную кислоту после фильтр-пресса подают на розлив с внесением небольших количеств мела, при этом около 10 % кислоты превращается в кристаллический лактат, который связывает молочную кислоту.



2. КИСЛОМОЛОЧНОЕ БРОЖЕНИЕ

2.1 Молочнокислое брожение

В 1857 году Л. Пастер впервые изучил и объяснил биологическую природу молочнокислого брожения.

Гомоферментативное молочнокислое брожение выражается следующей суммарной химической реакцией:

В действительности оно происходит сложнее. Вначале в результате гликолиза из одной молекулы моносахарида образуются две молекулы пировиноградной кислоты и две молекулы НАД.Н₂ . Пировиноградная кислота в анаэробных условиях не превращается в уксусный альдегид, как при спиртовом брожении, так как молочнокислые бактерии лишены фермента пируваткарбоксилазы. Поэтому не уксусный альдегид, а сама пировиноградная кислота принимает водород от восстановленной формы НАД.Н₂ и превращается в молочную кислоту

Реакция катализируется ферментом лактатдегидрогеназой. Гомоферментативное молочнокислое брожение может вызываться микроорганизмами различных таксономических групп, но главным образом бактериями и микроскопическими грибами. Среди последних известны некоторые виды ризопуса и мукора. Оптическая активность образующейся молочной кислоты зависит от стереоспецифичности лактатдегидрогеназы, а также от того, обладает ли микроорганизм лактатрацемазой.

Чаще применяют гомоферментативные бактерии, образующие до 98 % молочной кислоты. Наилучшим источником углерода для них является глюкоза. Молочнокислые бактерии характеризуются ярко выраженной специфичностью по отношению к сахарам: бактерии, развивающиеся на растительных объектах (Lactobacillus), предпочитают мальтозу; развивающиеся на молоке и молочных продуктах (Streptococcus), -- лактозу. L. delbruckii ассимилирует также фруктозу, галактозу и сахарозу, не ассимилирует лактозу, раффинозу и полисахариды. Для конструктивного и энергетического обмена может использовать лимонную, яблочную, пировиноградную и другие кислоты. Лимонная и уксусная кислота стимулируют рост бактерий. Молочнокислые бактерии малочувствительны к содержанию в среде меланоидинов. Палочковые формы дают больший выход молочной кислоты.

Возбудителем молочнокислого брожения в производстве молочной кислоты является Thermobacterium cereale -- термофильная зерносусловая бактерия. Она была открыта Лейхманом еще в 1896 г. и названа им в честь известного микробиолога М. Дельбрюка Bacillus derbruckii. Родовое название этих бактерий по существу ошибочное, так как все молочнокислые бактерии, за редким исключением (к которому не принадлежит и L. delbruckii), не образуют спор. Однако это название рода так укоренилось, что оно осталось и в современной номенклатуре бактерий.

Молочнокислые бактерии положительно окрашены по Граму, неподвижные факультативные анаэробы. Палочки крупные, длиной 7--8 мкм, толщиной 0,5--0,8 мкм, образующие, как правило, короткие цепочки из 2--4 клеток. Особенностью их конструктивного метаболизма являются слаборазвитые биосинтетические способности и, как следствие, сильная зависимость роста от наличия готовых органических веществ (аминокислот, витаминов группы В, компонентов нуклеиновых кислот). Это свидетельствует о примитивности их конструктивного метаболизма и о появлении данных бактерий на ранних стадиях развития жизни на Земле. Культивирование молочнокислых бактерий на синтетических средах не удается; это -- типичная сусловая культура.

L.delbruckii требовательны к азотному питанию. Набор необходимых аминокислот тщательно не изучен, но, как и большинству молочнокислых бактерий, им необходим аргинин, цистеин, глютаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан, тирозин и лизин, а, возможно, еще и некоторые другие (L.casei, например, требуется 16 аминокислот). Из витаминов необходимы рибофлавин, никотиновая или фолиевая кислота; тиамин ингибирует образование молочной кислоты. Потребность в витаминах зависит от температуры культивирования, рН.

Для молочнокислый бактерий нужны натрий, калий, фосфор, медь, железо, сера, магний и особенно марганец. Цинк ускоряет рост бактерий, но подавляет образование молочной кислоты.

К сахарсодержащим средам предложено добавлять: сухие ростки (корешки) ячменного, ржаного и пшеничного солода, солодовый экстракт, осадочные винные и спиртовые дрожжи, дрожжевой автолизат, пшеничные зародыши, молоко, сухой порошок хлореллы и т. д. Обычно пользуются сухими ячменными ростками.

Солодовые ростки содержат до 30% азотистых веществ, около половины которых растворяется в воде. Из свободных аминокислот в ростках найдены: аспарагиновая и глютаминовая кислоты, аргинин, гистидин, лизин, серин, треонин, аланин, валин, метионин, лейцин, изолейцин, р-фенилаланин, пролин. Амиды представлены главным образом аспарагином. Из углеводов, кроме клетчатки и целлюлозы, содержится около 20 % глюкозы и фруктозы, немного мальтозы, В ростках заключена основная масса витаминов и биостимуляторов проросшего зерна (рибофлавин, пиридоксин, цианокобаламин, никотиновая и пантотеновая кислоты, токоферол, инозит, биотин).

Недостатком солодовых ростков является сильное впитывание влаги и набухание, что повышает вязкость культуральной жидкости и ухудшает последующее отделение ростков фильтрованием. Ростки должны быть желтого или коричневого цвета, не подгоревшие, не заплесневевшие, с хлебно-солодовым запахом, горьковатые на вкус. По техническим условиям допускается содержание зерновой примеси 5--6 %, минеральной не более 0,5 %, влажность не выше 10 %.

Оптимальной температурой для развития L. delbruckii считается 48--50°. Достаточной чистоте брожения способствует также слабокислая реакция среды. Оптимальный рН находится около 5,5, несколько изменяясь от состава среды, ее концентрации, температуры сбраживания и штамма молочнокислых бактерий. При рН 4,5 развитие бактерий задерживается, при рН 3,0 -- прекращается. Молочнокислые бактерии лучше развиваются при рН 5,8--6,0, но появляется опасность заражения посторонними бактериями. При рН 7 и выше питательная среда утрачивает защитные свойства и инфицируется.

Молочнокислые бактерии не имеют геминовой системы, водород переносится не на молекулярный кислород, как у аэробов, а на органические соединения, образующиеся в процессе брожения (пировиноградную кислоту, а, возможно, на 4-фосфоглицериновую кислоту).

2.2 Кинетика молочнокислого брожения

Процесс брожения разделяется на две фазы, в первой оно идет в условиях размножения бактерий, во второй -- без увеличения их общей численности за счет жизнеспособных клеток. Сколько делящихся, жизнеспособных и мертвых клеток присутствует в каждый момент, неизвестно. Кинетика брожения зависит от многих факторов,

В первом приближении можно считать скорость молочнокислого брожения, как и других ферментационных процессов, за реакцию первого порядка и кинетическую константу -- независящей от начальной концентрации сахара.

На рис. 1 показано влияние количества добавленных солодовых ростков на скорость брожения сахарного раствора начальной концентрацией 10 % с 10 % по объему культуры молочнокислых бактерий. Видно, что размножение бактерий заканчивается в основном за 24 ч и плотность их популяции тем выше, чем больше внесено солодовых ростков по массе сахара. Интенсивное образование лактата также начинается в то время, когда в культуральной жидкости накапливается основная масса молочнокислых бактерий, но скорость накопления лактата отстает от скорости размножения бактерий. На рисунке 1.1 .

Рис.1.1 Кинетика изменения плотности популяции молочнокислых бактерий (1-4) и лактата кальция(1'-2') в зависимости от количества солодовых ростков на 100г сахара

Брожение продолжается без изменения численности молочнокислых бактерий и даже при некотором их уменьшении за счет лизиса и автолиза. Отмечено, что к концу брожения содержание азота в культуральной жидкости несколько возрастает. При сбраживании среды, приготовленной в основном из сахара-сырца и рафинадной патоки оптимальная норма ростков 15--20% по массе сахара.

Влияние количества засевной культуры при брожении отъёмно-доливным способом изображено на рис. 1.2. Кривая имеет максимум, соответствующий 20--30 % ее.

Рис.1.2 Зависимость среднесуточного образования лактата кальция от количества засевной культуры молочнокислых бактерий при брожении отъёмно-доливным способом

В зависимости от ряда условий числовое значение константы скорости брожения будет различным, но величина энергии активации, вычисленная с помощью уравнения Аррениуса для скорости химических реакций, останется примерно на уровне 4080 Дж ^. моль^-1. Средний температурный коэффициент в интервале 40-50 ^оС равен 2,4.

Очень важно, чтобы оптимальная величина рН поддерживалась постоянной с помощью автоматической подачи мелового молока.



3. ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПРОИЗВОДСТВА МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Рис. 1.3 Принципиальная схема промышленного производства молочной кислоты

РЕЖИМ СБРАЖИВАНИЯ

Сбраживание проводят в аппаратах (чанах) цилиндрической формы со сферическими днищем и крышкой вместимостью 25-45 м³, изготовленных из алюминия или нержавеющей стали. Хотя молочнокислое брожение - экзотермический процесс, удельное тепловыделение небольшое. Чтобы поддерживать заданную довольно высокую для брожения температуру, культуральную жидкость подогревают через змеевики. Во время брожения в них лучше подавать не пар, а горячую воду, не вызывающую сильного нагрева теплообменной поверхности. Бродильный аппарат снабжен барботером для подачи воздуха при перемешивании.

При переработке сахарного сырья питательную среду готовят непосредственно в бродильном аппарате, поэтому мелассу и рафинадную патоку после взвешивания направляют в него по трубопроводу самотеком. Сахар-сырец и часть рафинадной патоки растворяют в выше расположенной емкости и также сливают в бродильный аппарат. К нему подведена коммуникация мелового молока (относительной плотностью 1,13--1,16), которое готовят в отдельной емкости. Кроме того, аппарат снабжен коммуникациями холодной воды и промывной воды от промывки меловых осадков и гипсового шлама. В нижней части бродильного аппарата установлены трубопроводы - для слива культуральной жидкости и канализационный.

Аппарат наполняют на 2/3 рабочей вместимости водопроводной водой или промывными жидкостями и в них растворяют мелассу и рафинадную патоку, исходя из необходимости получения концентрации сахара в растворе 3--4%. Раствор нагревают до 70°С и пастеризуют при этой температуре 1 ч. Затем раствор охлаждают до 48--50 °С, добавляют в него 15% солодовых ростков к суммарной массе вводимого сахара, 20 % по вместимости бродильного аппарата засевной культуры молочнокислых бактерий, отобранной на вторые-третьи сутки из хорошо бродящей питательной среды в предыдущем или другом бродильном аппарате. Аппарат, из которого проведен отъем, доливают свежим сахарным раствором и продолжают брожение. Так как величина отъема довольно значительна, то начинающееся вскоре размножение резко сокращает продолжительность лаг-фазы.

Через 6 ч питательную среду начинают размешивать периодическим барботированием воздуха. Когда кислотность достигнет 0,5--0,6 %, считая на молочную кислоту (примерно через 1 сутки), добавляют меловое молоко. Обычно при ручной дозировке мел подают каждые 1,5--2 ч небольшими порциями. Перед подачей в бродильный аппарат мел должен быть хорошо измельчен, отсеян от комков и стерилизован. Проще стерилизовать меловое молоко острым паром (кипячение 20 мин). Количество воды, которое вводят с меловым молоком, учитывают при приготовлении питательной среды.

При отсутствии на заводе мела нейтрализацию молочной кислоты можно вести известковым молоком, но при этом нужно строго контролировать кислотность, так как раствор легко подщелочить, тогда как при нейтрализации мелом рН раствора устанавливается в слабокислой области независимо от количества заданного мела. При расчете количества добавляемого мела учитывают его чистоту, которая составляет 60--65 %. В результате нейтрализации образуется 120% лактата кальция к массе сброженной гексозы, или 125% к массе сброженного дисахарида.

При нормальном брожении за 1 сутки сбраживается до 2 % сахара. Убыль его компенсируют добавлением в бродильный аппарат в несколько приемов 50%-ного раствора сахара-сырца или с добавкой в него рафинадной патоки, поддерживая концентрацию сахара в бродящей среде на уровне 3--4%. Вводят такое суммарное количество сахара, чтобы содержание лактата в культуральной жидкости в конце брожения было не более 15%, а содержание несброженного сахара 0,2--0,5 %, Брожение продолжается 6--8 суток.

По окончании брожения аппараты моют горячей водой со щеткой, хлорной известью натирают внутреннюю и наружную поверхность аппарата, тщательно моют змеевик, хорошо ополаскивают аппарат холодной водой (несколько раз), затем набирают в него воды, нагревают ее до кипения и оставляют с нагретой водой 2--3 ч, после чего воду спускают. Моют также и коммуникации.

Во время брожения контролируют все основные параметры процесса. Если температура в бродильном аппарате упадет ниже 45 °С, неминуемо разовьется посторонняя микрофлора. В этом случае культуральную жидкость нагревают до 75 °С, пастеризуют 1 ч, снижают температуру до 50 °С и снова задают в нее чистую культуру или отъем из другого бродильного аппарата. При кратковременном повышении температуры сверх 55 °С резко снизится активность молочнокислых бактерий, поэтому в бродящую жидкость необходимо внести дополнительное количество активной культуры.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОЧИСТКА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ.

Культуральная жидкость содержит взвешенные частицы - мел, не вступивший в реакцию с молочной кислотой, нерастворимые примеси его, солодовые ростки и коллоиды. Отделить осадки, называемые в производстве меловыми, на фильтрующих аппаратах не удается из-за липкости шлама и небольшой скорости фильтрования. Поэтому культуральную жидкость в бродильном аппарате нагревают до 70 °С и нейтрализуют известковым молоком до слабо-розового окрашивания по фенолфталеину. При нейтрализации коагулируют белки, осаждается железо и разрушаются следы оставшегося сахара. Затем культуральную жидкость отстаивают 6--12 ч при температуре не ниже 48 °С и, не взмучивая осадка, по прогретой паром коммуникации направляют на фильтр пресс или вакуум-фильтр, также прогретые паром, а фильтрат - в кристаллизатор лактата.

Меловой осадок заливают горячей водой (1:3) и тщательно перемешивают. После трехчасового отстаивания, не взмучивая осадка, первую промывную жидкость отделяют и добавляют к первому лактатному маточному раствору, К осадку в отстойнике присоединяют гипсовый шлам и также заливают горячей водой. Хорошо перемешанную суспензию фильтруют. Осадок выбрасывают, а вторую промывную жидкость используют для приготовления сахарсодержащей среды.

Фильтрование отстоявшейся культуральной жидкости не полностью освобождает ее от взвешенных примесей. Поэтому сначала на фильтре нарабатывают слой гипсового шлама, а в конце фильтрования оставшийся в нем раствор лактата отмывают водой и вытесняют воздухом.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ЛАКТАТА КАЛЬЦИЯ

Для очистки лактата кальция от примесей при получении молочной кислоты высшего сорта проводят кристаллизацию. Кристаллизация - мощный фактор очистки, поэтому во всех производствах, где она возможна, ею обязательно пользуются

В кристаллизаторе отфильтрованную культуральную жидкость доводят до температуры 30 ^оС и вносят затравку в виде кристаллов лактата кальция предыдущей кристаллизации в количестве 6…7% к массе раствора. В процессе образования центров кристаллизации и роста кристаллов смесь постепенно охлаждают. Конечная температура утфеля не должна превышать 10 ^оС. Продолжительность процесса кристаллизации 10…12ч. При получении молочной кислоты высшего сорта кристаллы лактата кальция обычно не пробеливают. Из маточного раствора после разложения лактата, отделения гипса и осветления раствора активным углем вырабатывают молочную кислоту второго сорта.

РАЗЛОЖЕНИЕ ЛАКТАТА КАЛЬЦИЯ И ОТДЕЛЕНИЕ ГИПСОВОГО ШЛАМА

Лактат, выделенный из культуральной жидкости кристаллизацией или находящийся в ней в растворенном состоянии, разлагают серной кислотой. Разложение идет по реакции:

Сульфат кальция выделяется из раствора в виде бигидрата (гипса). С увеличением концентрации молочной кислоты растворимость гипса возрастает, при 10%-ной концентрации достигает максимума, затем снижается и при концентрации молочной кислоты около 40 % стабилизируется.

Для получения крупнокристаллического хорошо фильтрующего осадка гипса необходимы следующие условия: коэффициент пересыщения им раствора 1,30--1,40; концентрация лактата кальция не выше 18%, температура 80 °С, избыток серной кислоты 0,5%, созревание кристаллов гипса 1 ч. При увеличении концентрации лактата возрастает коэффициент пересыщения гипса, что приводит к возникновению многочисленных центров кристаллизации и получению мелких кристаллов, росту которых препятствует повышающаяся вязкость растворов. Повышение и понижение температуры уменьшает средний проектируемый радиус кристаллов гипса. Так как получающиеся в оптимальных условиях кристаллы гипса сравнительно крупны, то скорость фильтрования будет больше (в среднем в два раза), и вследствие меньшей удельной поверхности - меньше раствора молочной кислоты будет удерживаться осадком и снизится расход воды на промывку гипса на 40%. Избыток серной кислоты затем нейтрализуют.

Концентрация лактата кальция в растворе после расплавления его кристаллов в ванне паром с добавлением жидкости от промывки гипса составляет 20--25 %, Полноту разложения лактата кальция контролируют с помощью цветной реакции с 0,1%-ным раствором метилового фиолетового (при правильно проведенном разложении васильковое окрашивание, при избытке серной кислоты -- зеленоватое, при избытке лактата -- фиолетовое), Избыток серной кислоты или лактата устраняют добавлением соответственно лактата или серной кислоты.

После разложения лактата калия серной кислотой образуется растворимый сульфат калия, увеличивающий зольность молочной кислоты на 0,3--0,4%. Кроме того, сульфат калия имеет горький вкус и обладает послабляющим действием. Поэтому осаждение железа рекомендуется вести гексацианоферроатом кальция:



Как и в предыдущей реакции, в лактат связывается 12 молекул молочной кислоты, но образующийся после разложения лактата кальция гипс мало растворим и отделяется от раствора при фильтровании. Полноту осаждения ионов железа проверяют с помощью того же реактива, избыток гексацианоферроата -- с хлоридом железа. Тяжелые металлы и мышьяк осаждают сульфидом бария.

При расщеплении лактата непосредственно в культуральной жидкости процесс ведут так же - гипсовый шлам отделяют и промывают на барабанных вакуум-фильтрах.

ОСВЕТЛЕНИЕ РАСТВОРА МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Раствор молочной кислоты, полученный без кристаллизации лактата кальция, осветляют после отделения гипсового шлама или в его присутствии.

Если раствор осветляют после отделения гипсового шлама, то оптимальными являются следующие условия: температура 80 °С, продолжительность контакта раствора молочной кислоты с активным углем 30 мин. При отсутствии кристаллизации лактата оптимальной считается доза 3--4 % свежего угля к массе 40%-ной молочной кислоты.

При осветлении раствора молочной кислоты в присутствии гипса в конце разложения лактата в реактор добавляют весь активный уголь, частично отработавший на исправлении выпаренной молочной кислоты, и 0,5 % свежего активного угля (также к массе 40%-ной молочной кислоты). Уголь удаляют вместе с гипсовым шламом.

Цветность растворов молочной кислоты в основном зависит от цветности сырья, но в производстве во время выпаривания происходит и новообразование красящих веществ за счет протекания меланоидиновой реакции. Решающую роль при этом играет содержание азота (вид и количество аминокислоты). Растворы молочной кислоты, полученные из мелассных сред, осветляются хуже, чем из паточных. Еще хуже осветляются растворы молочной кислоты, выпаренные до 40% -ной концентрации.

ИОНИТОВАЯ ОЧИСТКА И ВЫПАРИВАНИЕ РАСТВОРА МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Ионитовую очистку раствора молочной кислоты обычно применяют при отсутствии в схеме производства кристаллизации лактата, а также при получении кислоты, содержащей минимальную примесь минеральных веществ или их отдельных ионов. Для очистки молочной кислоты на отечественных заводах иониты были применены в 1950 г. При фильтрации через катионит в Н-форме и анионит в ОН-форме в результате ионообмена из раствора удаляются не только минеральные вещества, но частично молекулярно сорбируются красящие и азотистые вещества.

Ионирование растворов молочной кислоты и регенерацию ионитов в принципе ведут аналогично обработке растворов лимонной кислоты.

Растворы молочной кислоты концентрируют в горизонтальных вакуум-выпарных аппаратах. По-видимому, лучшим аппаратом: следует признать "Центрнтерм", который очень быстро (за несколько секунд) выпаривает молочную кислоту без увеличения ее цветности. В горизонтальных вакуум-аппаратах выпаривание ведут при разрежении не менее 80 кПа и избыточном давлении греющего пара в пределах 100--150 кПа. Выпаривают кислоту с подкачиванием раствора до концентрации, несколько большей 40%, в течение нескольких часов. При этом удаляется и значительная часть летучих кислот.

ИСПРАВЛЕНИЕ И РОЗЛИВ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Качество выпаренной молочной кислоты корректируют. Если кристаллизацию лактата не проводят, процессы разложения лактата и осветления раствора молочной кислоты не разделяют, то при исправлении добавляют 5,5 % свежего активного угля по массе 40%-ной молочной кислоты. Уголь добавляют в горячую кислоту, продолжительность контакта -- 30 мин. Если лактат кристаллизуют, уголь добавляют в раствор молочной кислоты, освобожденный от гипсового шлама, или в кислоту второго-сорта, и количество угля для осветления устанавливают с таким расчетом, чтобы обеспечить нормы цветности для каждого сорта молочной кислоты.

Молочную кислоту еще раз проверяют на полноту разложения: лактата, на содержание железа, тяжелых металлов и мышьяка. Затем кислоту фильтруют на фильтрпрессе с деревянными фильтрующими элементами, покрытыми пищевой резиной, на зарубежных заводах -- с фильтрующими элементами, выполненными из высокомолекулярных полиолефинов, и на фаянсовых нутч-фильтрах.

ТРЕБОВАНИЯ К ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ

Согласно ГОСТ 490-79 пищевая молочная кислота выпускается 40%-ной концентрации и в зависимости от показателей качества -- высшего, первого и второго сорта. Первый сорт кислоты получается без кристаллизации лактата и с проведением очистки активным углем и ионообменом. Молочная кислота всех сортов -- это прозрачная без мути и осадка густая жидкость со слабым, специфичным для молочной кислоты, запахом; кислого вкуса, без постороннего привкуса. Кислота не должна иметь неприятного запаха, обусловленного примесью летучих кислот.

По химическим показателям кислота должна соответствовать нормам, указанным в таблице. Для нужд фармацевтической промышленности выпускается небольшое количество кислоты по временным техническим условиям.

В США выпускают молочную кислоту четырех сортов: техническую, пищевую, пластическую и стандартную (по фармакопее США). Особенно высокие требования предъявляют к кислоте для пластмассовой промышленности; она содержит 50--85 % молочной кислоты, 1--2 % летучих кислот, не более 0,01 % золы, отсутствуют обугливаемые вещества, сульфаты и хлориды; бесцветна и содержит только следы меди и железа. В пищевой молочной кислоте допускается содержание золы до 0,5 %, присутствие обугливаемых веществ, хлоридов, следы сульфатов и светло-соломенная окраска. Высший сорт отечественной молочной кислоты по ГОСТ 490--79 находится на уровне лучших образцов зарубежной пищевой кислоты, получаемой путем сбраживания сахаросодержащих отходов.

Очень важно иметь ясное представление о количестве ангидридов, содержащихся в молочной кислоте. Так как образование их сопровождается уменьшением числа свободных карбоксильных групп, а, следовательно, и снижением кислотности, то присутствие ангидридов в товарной молочной кислоте нежелательно. Образование их -- обратимая бимолекулярная реакция.

Исходя из этого можно записать следующее ее уравнение:

или сокращенно

По закону действия масс для установившегося динамического равновесия имеем:

,

где [L] ,[P], [H₂O] - соответственно начальная общая концентрация молочной кислоты; равновесные концентрации ангидридов и воды; К - константа равновесия.

С целью упрощения расчетов и приближения их к производственным выразим концентрации молочной кислоты в г на 100 г воды. Разделив числитель и знаменатель дроби, стоящей в левой части уравнения, на [Н₂О]² и обозначив начальную общую концентрацию молочной кислоты [L]/[H₂O] и концентрацию ангидридов [Р]/[Н₂О] в процентах к массе воды соответственно через l и p получим К = l² / p.

Пусть до образования ангидридов на 100 частей воды приходилось А частей молочной кислоты, после их образования осталось AD/100 частей молочной кислоты (где D - концентрация прямо титруемой молочной кислоты в пересчете на безводную кислоту в %). Следовательно, содержание ангидридов будет А-(АD)/100. Отсюда l= (AD)/100 и р = A(1 --D/100). Подставляя эти значения в уравнение для К найдем



Содержание отдельных форм молочной кислоты при установившемся равновесии показано на рис.4. При этом содержание ангидридов х в общей концентрации молочной кислоты у будет

Так как при прямом титровании определяется только половина карбоксильных групп лактилмолочной кислоты, то содержание ее в пересчете на молочную кислоту будет вдвое больше, чем ангидридов. Содержание ангидридов не пропорционально концентрации молочной кислоты, поэтому простой пересчет количества ангидридов с большей ее концентрации на 40%-ную невозможен. Результат будет завышен.

Скорость образования ангидридов подчиняется уравнению реакции второго порядка, гидролиз ангидридов -- уравнению первого порядка.

Рис.4 Соотношение отдельных форм молочной кислоты в зависимости от общей концентрации при установившемся равновесии: 1-прямо титруемая, 2-лактилмолочная, 3-свободная

Для данной обратимой реакции справедливо дифференциальное уравнение скорости:

,

где к₁ и к₂-- константы скорости соответственно образования ангидридов и их гидролиза как реакций второго и первого порядков; а=А; х -- равновесна концентрация ангидридов, равная А (100--D).

После интегрирования этого уравнения и на основании экспериментальных данных определены кинетические константы к₁ и к₂. Поскольку константа равновесия не зависит от общей концентрации молочной кислоты, при прочих равных условиях не зависят от нее и константы к₁ и к₂, а следовательно, и время достижении равновесия. Найдено, что величина константы скорости гидролиза ангидридов в 2460 раз больше константы скорости их образования.

Рис.5. Образование ангидридов в растворе молочной кислоты 84,95%-ной концентрации при температуре 100 ^оС

На рис.5 показано образование ангидридов при температуре 100 ^оС. По сравнению с температурой 20 ^оС скорость реакции возросла в (70х24):3=560 раз, а конечное (равновесное) содержание ангидридов осталось без изменения. Даже трехчасового выпаривания, особенно до 40-45%-ной концентрации раствора, недостаточно для установления равновесного содержания ангидридов, поэтому процесс их образования будет продолжаться и во время хранения готовой молочной кислоты.

Серная кислота является сильным катализатором реакции образования ангидридов, не влияя на состояние равновесия. Определение ангидридов в присутствии редуцирующих сахаров завышает аналитические данные (каждый 1 % сахара пропорционален 0,9 % ангидридов).



4. МОЛОЧНАЯ КИСЛОТА В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА

Молочная кислота формируется при распаде глюкозы. Иногда называемая "кровяным сахаром", глюкоза является главным источником углеводов в нашем организме. Это основное топливо для мозга и нервной системы, так же как и для мышц во время физической нагрузки. Когда расщепляется глюкоза, клетки производят АТФ (аденозинатрифосфат), который обеспечивает энергией большинство химических реакций в организме. Уровень АТФ определяет, как быстро и как долго наши мышцы смогут сокращаться при физической нагрузке.

Производство молочной кислоты не требует присутствия кислорода, поэтому этот процесс часто называют "анаэробным метаболизмом" (см. Анаэробная тренировка). Ранее считалось, что мышцы производят молочную кислоту, когда недополучают кислород из крови. Другими словами, вы находитесь в анаэробном состоянии. Однако современные исследования показывают, что молочная кислота образуется и в мышцах, получающих достаточно кислорода. Увеличение количества молочной кислоты в кровотоке свидетельствует лишь о том, что уровень её поступления превышает уровень удаления^[1][2]. Резкое увеличение (в 2-3 раза) уровня лактата в сыворотке крови наблюдается при тяжелых расстройствах кровообращения, таких как геморрагический шок, острая левожелудочковая недостаточность и др., когда одновременно страдает и поступление кислорода в ткани и печеночный кровоток.

Зависимое от лактата производство АТФ очень незначительно, но имеет большую скорость. Это обстоятельство делает идеальным его использование в качестве топлива, когда нагрузка превышает 50 % от максимальной. При отдыхе и умеренной нагрузке организм предпочитает расщеплять жиры для получения энергии. При нагрузках в 50 % от максимума (порог интенсивности для большинства тренировочных программ) организм перестраивается на преимущественное потребление углеводов. Чем больше углеводов вы используете в качестве топлива, тем больше производство молочной кислоты.

Исследования показали, что у престарелых людей в головном мозге количество солей кислоты (лактатов) имеет повышенный уровень



5. ОСНОВЫ СИНТЕЗА МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Молочная кислота СН₃--СН(ОН)--СООН (б-оксипропионовая, этилиденмолочная) содержит асимметрический атом углерода и поэтому может существовать, в оптически изомерных формах.

Молочная кислота может быть получена различными синтетическими способами, но при всех этих синтезах кислота получается в виде оптически недеятельной, т. е. всегда получаются равные количества правого и левого изомеров. То же наблюдается и во всех других случаях, когда путем синтетических реакций получаются вещества, содержащие асимметрический атом углерода.

Причина обязательного образования оптически недеятельных соединений при синтетических реакциях может быть показана на следующих примерах:

Как видно из приведенной схемы, при действии цианистоводородной кислоты на уксусный альдегид анион CN- может атаковать р-связь карбонильной группы равновероятно как с одной, так и с другой стороны плоскости, в которой расположены у-связи а, b и с молекулыкетона. В результате должны образоваться равные количества оптически изомерных молекул оксинитрилов.

Точно так же в тех случаях, когда асимметрический атом углерода появляется в результате реакций замещения

или реакций расщепления

вероятности образования молекул оптических антиподов совершенно одинаковы, что и должно вести к образованию оптически недеятельных смесей или рацемических соединений.

Значительные количества молочной кислоты образуются при действии щелочей на водные растворы простейших сахаристых веществ(моноз). Так, например, из смеси глюкозы и фруктозы ("инвертный" сахар) можно получить до 60% молочной кислоты. И в этом случае образуется недеятельная молочная кислота.

Наиболее важным источником получения молочной кислоты является процесс молочнокислого брожения, которому легко подвергаютсярастворы многих сахаристых веществ (молочного сахара, тростникового сахара, виноградного сахара и др.). Брожение является результатом жизнедеятельности бактерий молочнокислого брожения, зародыши которых всегда находятся в воздухе. Протеканием этого процесса и объясняется наличие молочной кислоты в кислом молоке, откуда она была впервые выделена Шееле (1780). Молочнокислое брожение сахарных растворов лучше всего протекает под действием чистых культур молочнокислых бактерий (Bacillus Delbrьckii) при температуре 34--45° С, с добавкой необходимых для жизни бактерий минеральных веществ, а также мела или карбоната цинка. Последние добавки вводятся для нейтрализации свободной кислоты, так как при сколько-нибудь значительной концентрациикислоты бактерии погибают и брожение прекращается.

Молочнокислое брожение является одним из процессов, протекающих при изготовлении масла (из скисшего молока), при созревании сыра, квашении капусты, при силосовании кормов и пр. Уравнение процесса молочнокислого брожения имеет вид:

Для молочнокислого брожения, как и для спиртового, доказано существование особого энзима, зимазы молочнокислого брожения,могущего вызывать брожение и без живых бактерий (Бухнер и Мейзенгеймер).

Обычно молочнокислое брожение приводит к образованию оптически недеятельной молочной кислоты, однако часто при этом получается кислота, обладающая слабым правым или левым вращением.

Чистая левовращающая молочная (D-молочная) кислота может быть получена брожением сахаристых веществ при посредстве особого возбудителя брожения

(Bacillus acidi laevolactici). Правовращающий изомер молочной кислоты (L-молочная) был открыт Либихом (1847) в мясном экстракте и получил названиемясомолочной кислоты. Правовращающая молочная кислота всегда содержится в мышцах животных.

Обыкновенная (недеятельная) молочная кислота, часто называемая "молочной кислотой брожения", долгое время была известна лишь в виде густой жидкости. Осторожным выпариванием в высоком вакууме (0,1--0,5 мм рт. ст.) можно получить ее в безводном состоянии в виде кристаллической массы, плавящейся при 18° С. Из солей i-молочной кислоты характерной является хорошо кристаллизующаяся цинковая соль, содержащая три молекулы воды (С₃Н₅О₃)₂Zn • 3Н₂О.

Различие свойств недеятельной молочной кислоты и оптически деятельных кислот и их солей показывает, что недеятельное веществопредставляет собой не смесь, а рацемическое соединение обеих (D- и L-) кислот или их солей (лактатов).

Правовращающая (L-молочная) и левовращающая (D-молочная) кислоты представляют собой расплывающиеся на воздухе призмы с т. пл. 25--26° С. Они обладают равным, но противоположным оптическим вращением (в 10%-ном растворе [б]_D^15°C=±3,82° и в 2,5%-ном [б]_D^15°C=±2,67°). При продолжительном нагревании до 130--150°С оптически деятельные изомеры рацемизуются и дают ангидридынедеятельной молочной кислоты. Цинковые соли оптически деятельных изомеров молочной кислоты кристаллизуются только с двумямолекулами воды (C₃H₅O₃)₂Zn • 2H₂O и обе обладают совершенно одинаковой растворимостью в воде (1 : 175 при 15° С), отличной отрастворимости недеятельной соли (1 : 50 при 10° С).

Оптически недеятельная молочная кислота может быть разделена на оптически деятельные изомеры с помощью плесневых грибков, а также кристаллизацией молочнокислых солей оптически деятельных алкалоидов: стрихнина, хинина или морфина.

Реакции молочной кислоты типичны для б-оксикислот.

Особенно легко (даже при высушивании в вакууме) идет выделение воды с превращением в лактид, являющийся гомологом гликолида.

Молочная кислота брожения находит значительное применение в технике, например в протравном крашении, в кожевенном производстве, в бродильных производствах (для предохранения от попадающих из воздуха посторонних бактерий), а также в медицине (80%-ный сироп; относительная плотность 1,21 -- 1,22).