Размещено на http://allbest.ru

ЗМІСТ

Вступ

1. Інтерферон, молекулярна структура та властивості

1.1 Класифікація інтерферонів

1.2 Особливості молекулярної структури інтерферонів

1.3 Властивості інтерферонів. Молекулярні механізми дії інтерферонів в організмі людини

2. Мета і метод генетичної модифікації інтерферону

2.1 Мета генетичної модифікації

2.2 Метод генетичної модифікації інтерферону

3. Технологія виробництва генетично модифікованого інтерферону

3.1 Технологічна схема виробництва інтерферону лейкоцитарного людського

3.2 Технологічна схема виробництва генетично модифікованого інтерферону

3.2.1 Отримання штаму E. coli - суперпродуцента рекомбінантного інтерферону

3.2.2 Виробництво рекомбінантного інтерферону

4. Контроль якості препарату

4.1 Фізичні та фізико-хімічні методи аналізу

4.1.1 Визначення прозорості

4.1.2 Визначення кольоровості

4.1.3 Потенціометричне визначення рН

4.2 Мікробіологічні методи аналізу

4.2.1 Перевірка на стерильність

4.2.2 Контроль токсичності

4.2.3 Кількісне визначення противірусної активності

5 Теоретичне обґрунтування можливості використання електрофорезу, як методу часткової очистки та концентрування рекомбінантного інтерферону.

5.1 Загальні відомості про електрофорез

5.2 Поведінка білків при електрофорезі в залежності від рН середовища

5.3 Електрофорез в поліакриламідному гелі, як метод очистки та концентрування рекомбінантного інтерферону

Висновок

Перелік джерел інформації

ВСТУП

Інтерферон - лікарський препарат, що має антивірусну, імуномодулюючу, противопухлинну та антимутагенну дію на організм людини. Цей препарат застосовується для лікування багатьох захворювань, таких як ОРЗ, гепатит, вірусні та бактеріальні інфекції. Лікує також рак нирок, сечового міхура, яєчників та молочної залози.

Виробництво іинтерферону ускладнюється тим, що сировиною для його отримання є людська кров. Це дуже цінний, дорогий матеріал, який швидко руйнується і має малий термін зберігання. Дуже велика кількість крові йде на отримання малих доз інтерферону. Наприклад, з 10 л донорської крові можливо отримати тільки 1 мг інтерферону. До того ж після 48-72 годин клітини-продуценти ( лейкоцити крові ) гинуть.

Багато вчених з різних країн досліджували механізм синтезу та механізм дії інтерферону. Але однією з важливих обставин, що перешкоджає поглибленню знань про цей препарат являється відсутність досить чистих препаратів.

Всі ці обставини стали причинами для винайдення методів виробництва генно-інженерних інтерферонів, що синтезуються спеціальними штамами мікроорганізмів, таких як E. coli, Bac. subtilis та Pseudomonas putida.

Використання генної інженерії дало значний ефект - якщо з 1 л культуральної рідини (крові) отримують 10 ⁸ од. інтерферону, то 1 л культури E. coli дає 10¹⁰ од. рекомбінантного інтерферону. Це підвищило об'єм виробництва препарата .До того ж мікроорганізми, які використовуються для синтезу інтерферону не мають специфічності культивування. Такий метод виробництва не потребує людської крові, що вирішує гуманістичний аспект проблеми.

На основі цих данних можна зробити висновок, що розробка методу генетичної модифікації інтерферону, для його використання як лікувального засобу на сьогоднішній день є актуальною з економічної та гуманістичної точки зору.

Умовні позначення

ДНК	дезоксірибонуклеїнова кислота
МО	міжнародні одиниці
ПАР	поверхнево-активні речовини
РНК	рибонуклеїнова кислота
од.	одиниці
HCl	соляна кислота
Н2О2	пероксид водню
Na OH	гідроксид натрію
В	вольт
Гц	герц
КДа	кілодальтон
л	літр
мл	мілілітр
E. coli	кишкова паличка
IFN	інтерферон

1. ІНТЕРФЕРОН, МОЛЕКУЛЯРНА СТРУКТУРА ТА ВЛАСТИВОСТІ

1.1 Класифікація інтерферонів

Інтерферон (від латинського inter-між, загибель, знищення; ferre-нести, переносити).

Відкритий у 1957 році А. Айзексом і Дж. Ліндеманом, які знайшли, що клітини, інфіковані вірусом грипу, починають виробляти і виділяти в навколишнє середовище особливий білок, який перешкоджає розмноженню вірусів у клітинах.

В залежності від клітин-продуцентів інтерферони поділяються на три групи:

а) a?? інтерферон (лейкоцитарний), що одержаний з культури лейкоцитів, яку для цієї мети виділяють з крові донорів. Існує майже 20 рекомбінантних варіантів (A, B, C, D, E, F, G, H, I, N та інші), що відрізняються послідовністю амінокислотних залишків в поліпептидному ланцюзі, а також біологічною активністю;

б) b???інтерферон (фібробластний), для одержання якого використовують культуру фібробластів;

в) g-інтерферон (імунний), біосинтез якого здійснюється в сенсибілізованих Т-лімфоцитах при повторному контакті з мітогенами, бактеріальними і вірусними антигенами, антисиворотками проти поверхневих детермінантних лімфоцитів.

Крім трьох класів розрізняють два типа інтерферонів:

?a і b - інтерферони відносяться до першого типу і є так названими вірусіндукованими інтерферонами;

?g - інтерферон- належить до другого типу.

Сучасна класифікація інтерферонів людини припускає виявлення рекомбінантних варіантів, яких у a?- інтерферону відомо не менш 20, а у b і g - інтерферонів рекомбінантні варіанти поки ще не виявлені. Хоча є підстави вважати, що в геномі еукаріотичних клітин є набір генів, що кодують різні b- інтерферони, однак на стадіях транскрипції, трансляції і посттрансляціонних перетворень у клітині створюється ситуація, в результаті якої можливо виділити тільки один білок, що відноситься до групи b інтерферонів людини - інтерферон b1. (див. малюнок 1.1) [ ]

Малюнок 1.1 - Схема класифікації інтерферонів.

1.2 Особливості молекулярної структури інтерферону

Молекулярна маса a- інтерферону від 18 кДа до 25 кДа. Більшість інтерферонів цієї групи - неглікозовані білки, що не містять потенційної ділянки гликозування. Молекула a?інтерферон складається з 143 амінокислотних залишків. Найбільш розповсюджені a?інтерферони людини, такі як a2- інтерферон (А-інтерферон), a1- інтерферон (Д-інтерферон), a3- інтерферон (F-інтерферон).Вони відрізняються між собою деякими амінокислотними залишками, а також мають невелику біологічну різницю. Клінічне значення цих відмінностей поки що не з'ясовано. Інтерферони містять на N-кінці залишок цистеїну який бере участь в утворенні одного з двох наявних у молекулі дисульфідних містків. Наявність цих містків важливо для біологічної активності інтерферонів. Від С-кінця цих інтерферонів може відщеплюватися пептид, що складається з декількох амінокислотних залишків.

b?інтерферон складається з одного чи декількох глікопротеїнів. Його молекулярна маса - 20 кДа. Молекула b-інтерферону складається з 145 амінокислотних залишків і містить ділянку глікозування Asn-Glu-Thr (аспарагін-глутамінова кислота-треонін).

g?інтерферон складається з 140 амінокислотних залишків і має дві потенційних ділянки глікозування. ??інтерферон представлений трьома білками:

молекулярна маса білка 15 кДа. Цей білок неглікозованний;

молекулярна маса білка 20 кДа. Цей білок глікозованний по одній з ділянок;

молекулярна маса білка 25 кДа. Цей білок глікозованний по обох ділянках.

Від С-кінця g?інтерферона може відщеплюватися різна кількість амінокислотних залишків, що робить його гетерогенним. Після відщіплення у g?інтерферона утворюється блокований N-кінець, тобто він не містить вільних груп NH₂. (див. табл.1.1) [ ]

Таблиця 1.1 - Особливості молекулярної структури інтерферонів

Група інтерферону	Характеристика молекули
	молекулярна маса кДа	число амінокислот	хімічний склад
a?- інтерферон	18 - 25	143	протеїн
b?- інтерферон	20	145	глікопротеїн
g?- інтерферон	15 - 25	140	глікопротеїн

1.3 Властивості інтерферонів

Інтерферони володіють двома типами біологічної активності - противірусної і проти клітинної. По відношенню до вірусів дія a та?b інтерферонів більш виражена ніж у g?інтерферону, але по відношенню до клітин більш активний інтерферон g, причому проти пухлинних клітин він активніший, ніж проти нормальних. Противірусна дія - це придушення розмноження інфекційних і онкогенних вірусів. Ця дія найбільш виявляється в організмі чи клітинних структурах того виду тварин, у клітинах якого він отриманий. Інтерферони не є вірусоспецифічними. При змішаній вірусній інфекції один вірус придушує іншої за рахунок інтерфероногенності першого феномен вірусної інтерференції. Інтерферони діють практично на усі віруси, крім інфекції,що викликана вірусом Скрепі.

Інтерферони стабільні в широкому діапазоні рН. Навіть при рН 12,5 інтерферони цілком не руйнуються і зберігають до 10% активності. При рН 2,0 інактивується 67% активності (тільки g-інтерферон не активний).

Ізоелектрична точка знаходиться в межах від рН 3 до рН 9.

Інтерферон інактивуеться протеолітичними ферментами - трипсином, хемотрипсином і папаїном. Він довго зберігає активність при (4-10)⁰ С, а також у замороженому стані.

За своєю природою інтерферони належать до тканинних гормонів,що володіють поліпотентною дією: вони мають здатність до індукції резистентності у клітин щодо широкого спектру вірусів, сповільнюють поділ клітин, модифікують поверхневі властивості нормальних та пухлинних клітин, модифікують клітинний фенотип, призводять до реверсії трансформації та зниженню онкогенности пухлинних клітин. Інтерферони модифікують взаємовідношення клітин одна з одною та з іншими біологічними субстанціями: антитіла, лімфокінами, цитокінами, гормонами, факторами росту.

Доведена клінічна ефективність інтерферонів при:

- гострих та хронічних вірусних інфекціях;

- бактеріальних інфекціях;

- злоякісних новоутворень. [ ]

Властивості інтерферонів, в залежності від групи, представлені в таблиці 1.2.

інтерферон генетичний противірусний електрофорез

Таблиця 1.2 - Основні властивості інтерферонів

Група інтерферону	Характеристика
	активність в присутності ПАР (Na додецилсульфат)	Стабільність при рН 2	Значення рІ	Найбільш виражена біологічна дія
a?- інтерферон	так	так	5,5-7,5	антивірусна
b?- інтерферон	так	так	5,5-7,5	антивірусна
g?- інтерферон	ні	ні	8,6-8,7	імунорегулююча, антипухлинна

1.4 Молекулярні механізми дії інтерферонів в організмі людини

Інтерферони володіють одночасно універсальним для всіх клітин і тканин людини, і в той же час специфічним для кожного їхнього типу багатопрофільним регулюючим ефектом . Це досягається за рахунок стимуляції одних і придушення інших ключових для клітинної регуляції систем - посередників. А оскільки для кожного типу клітин одна і таж система - посередник взаємодіє з тканиноспецифічними системами безпосередньої відповіді (білоксинтезуючими, відповідальними за розподіл, деградацію макромолекул) та кінцевий результат виявляється специфічним і виборчим. Цим досягаються здавалося б взаємовиключні по своїй спрямованості протилежні результати. Так, наприклад, інтерферон блокує ріст пухлинних клітин визначених типів, тобто перешкоджає клітинному розподілу, і в той же час стимулює загоєння ран, тобто сприяє поділу клітин. Пояснити це можна тим, що системи - посередники чуттєвих до інтерферону пухлинних клітин і нормальних, активуються цим регулятором та впливають на різні наступні події, тому що самі клітини (пухлинні і нормальні) різні, і ланцюги процесів обміну речовин у них регулюються неоднаково.

Унаслідок такої широкої регуляторної, фактично всеохоплюючої , так і конкретної, строго специфічної дії, інтерферони виявляються високо ефективними при різних патологіях.

Експериментально продемонстровані наступні активності інтерферонів:

антивірусна;

імуномоделююча;

протипухлинна;

вплив на диференціацію клітин ( незрілі клітини - диференційовані клітини );

регуляція росту клітин;

детоксикуюча;

антимутагенна.

Антивірусна активність інтерферону здійснюється через індукцію визначених клітинних білків, що гнітять розмноження вірусу. Існує два індуцибельних ферментативних шляхи, які втягнуті в процес гноблення реплікації вірусів через порушення трансляції вірусної РНК. В одному з цих варіантів інтерферон індукує синтез спеціального ферменту (2,5 -оліго-А-синтетази), що активується двуланцюговою РНК (вірусної) і каталізує синтез коротких олігомерів аденілової кислоти. Ці короткі олігомери (тримери і тетрамери), активують ендонуклеазу, називану a--чи F, що розщеплює вірусну мРНК. (див малюнок 1.2)

Другий шлях здійснення антивірусної активності інтерферону реалізується через інший індуцибельний фермент, протїнкіназу Р1. Цей фермент також активується двуланцюговою РНК і каталізує фосфорилювання еукаріотичного ініціюючого фактора (еl-2a). Фосфорилювання фактора el-F 2a блокує подальшу ініціацію трансляції, що в свою чергу блокує вірусну реплікацію.(див. малюнок 1.3)

Системи 2,5-оліго-а-синтетаза і Р1 протеїнкіназа є основними відомими сьогодні механізмами, через які інтерферон гнітить вірус. [ ]

Малюнок 1.2 - Схема анти вірусної дії інтерферону на організм людини через фермент 2,5 - оліго - А - синтитазу



Малюнок 1.3 - Схема механізму антивірусної дії інтерферонів на організм людини через фермент протеїнкіназу

Інтерферон впливає на широкий спектр клітинних функцій. Біологічний вплив інтерферону є комплексним. Він включає гноблення клітинного росту, вплив на диференціацію. Інтерферон впливає на імунну систему так:

він підсилює експресію антигенів гістосумісності на клітинній мембрані, В-мікроглобуліна;

природну кіллерну активність лімфоцитів;

антитілозалежну цитотоксичність;

- супресуе гноблення антитіло- і мітоген-індуцибельних лейкоцитів.

Основою всіх цих ефектів є індукція інтерфероном експресії клітинних генів, що у нормі зарепресовані. Ця індукція, що часто тканиноспецифічна, веде до експресії білків, які в залежності від типу клітин, або стимулюють, або гнітять клітинну проліферацію, диференціацію, а також імуномоделюючу взаємодію клітина-клітина.

Встановлено, що інтерферони є цитокінами, що передають регуляторний сигнал між клітинами, секретуясь з одних клітин, зв'язуються зі специфічними рецепторами інших клітин, активуючи тканиноспецифічну транскрипцію генів, що кодують білки, які регулюють клітинний ріст і (чи) імуномодулюючі функції.

Інтерферони впливають на структурні клітинні компоненти, якщо індукують деякі цитоскелетні білки і посилюють організацію мікрофіламентів і перерозподіляють розташований на поверхні клітин фібронектин.

Комплекс інтерферон-рецептор зв'язується з цитоскелетним матриксом. Інтерферон гнітить одні функцій і підсилює інші. Інтерферон індукує диференціацію лейкозних клітин у макрофаги і гранулоцити, стимулює диференціацію мієлоїдних лейкозних клітин і эритроцитних клітин, а також дозрівання В-клітин до імуноглобулін-секретуючих.

Інтерферони промотують міогенез у лігобластних культурах. Вони також підсилюють експресію В-клітин, антигенів диференціації ендотеліальних клітин і антигенів Ly-6. Противопухлинні ефекти інтерферонів пов'язані з їхньою здатністю модулювати диференціацію.

a-інтерферони як цитокіни характеризуються:

вони індукують експресію антигенів 1 класу МНС (головний комплекс гістосумісності, від англійського Major histocompatibility complex), коли гнітуть проліферацію попередників гемопоетичних клітин;

мають послідовність, подібно деяким глікопротеїнам, що забезпечують реакцію зв'язування між лімфоцитами , моноцитами і гранціоцитами.

Інтерферони відіграють велику роль у процесі ембріогенезу.

Експериментально доведено, що інтерферон має антимутагенну дію, а також знімає інтоксикацію при опроміненні і хіміотерапії.

Не виявлено дії препарату, що ушкоджує основні органи і системи організму при вивченні його токсикології, ембріотоксичних властивостей, алергійної і імунотоксичної дії, мутагенної активності, що пошкоджує ДНК, а також концерогенної дії препарату.

Фармакокінетика a-інтерферонів вивчена досить добре. Після внутрім'язової чи підшкірної ін'єкції інтерферон виявляється в сиворотці крові через 3 години, максимальна концентрація препарату досягається через 6 годин, зберігається в кров'яному руслі 24 години. При щоденній ін'єкції інтерферону в дозі 3 млн МО він поступово визначається в крові в кількості 80-300 МО/мл. При внутрівенному введенні інтерферон у крові з'являється через кілька хвилин, але через 1-2 години вже не визначається.

Основним шляхом елімінації є нирки, у меншій ступені в цьому процесі бере участь печінка.

2. МЕТА І МЕТОД ГЕНЕТИЧНОЇ МОДИФІКАЦІЇ ІНТЕРФЕРОНУ

2.1 Мета генетичної модифікації

Інтерферон як лікарський препарат є високо ефективним при різних захворюваннях, тому на нього зростає попит. Але збільшити об'єм виробництва нелегко, тому що для отримання людського інтерферону необхідні такі джерела як лейкоцити периферичної крові, диплоїдні фібробласти та інші клітини людського організму. Це дорогий матеріал, підготовка якого займає багато часу та сил. До того ж однією з важливих причин, що перешкоджає поглибленню знань про механізм дії інтерферону на організм людини є відсутність досить чистих препаратів. Всі ці проблеми дали поштовх до розробки методу синтезу рекомбінантних інтерферонів. На сьогоднішній день були розроблені штучні біологічні системи суперсинтезу людських інтерферонів, який забезпечується відповідними людськими генами, що входять до складу векторних молекул мікроорганізмів. Цього досягнуто через використання генної інженерії в умовах мікробіологічних технологій з використанням методів молекулярної гібридизації ДНК і РНК та рестриктазної техніки.

Використання генної інженерії дало значний ефект - з 1 л донорської крові людини отримують 10⁸ од. інтерферону, в той час як 1л культури E. coli дає 10¹⁰од. рекомбінантного інтерферону. В процесі виробництва рекомбінантного інтерферону на жодній стадії не використовується людська кров, що економічно вигідно та гуманістично.

Так можна зробити висновок, що метою винайдення рекомбінантного інтерферону є збільшення обсягу виробництва препарату, щоб забезпечити потреби в ньому, а також можливість використання менш дорогої сировини ніж людська кров.

2.2 Метод генетичної модифікації інтерферону

Нові генетичні молекули, які отримані методом генної інженерії являють собою рекомбінантні ДНК, що включають два компонента - вектор (переносник) та “чужу” ДНК, яку клонують. Так як переносник повинен мати властивості реплікону та обумовлювати реплікацію утвореної рекомбінантної ДНК, то як вектор використовують такі ріплікони, як плазміди, помірні фаги та віруси тварин. Всі ці переносники мають циркулярно замкнуту структуру ДНК. ДНК, що клонується - це фрагмент ДНК, який несе необхідний ген, що контролює утворення потрібної речовини.

Найбільш простий прийом отримання рекомбінантних молекул ДНК зводиться до обробки ізольованих молекул ДНК-вектора і ДНК, яка несе необхідний ген, ферментами рестриктазами (ендонуклеази рестрикції), що розщеплюють взяті молекули ЛНК в строго визначених місцях з утворенням одноланцюгових комплементарних один одному кінців, так називаємих липких кінців. Це перший етап отримання рекомбінантних молекул ДНК - “розрізання” молекул ДНК за допомогою ендонуклеаз рестрикції. Другий етап заключається в обробці отриманих лінійних молекул ДНК ферментом полінуклеотидлігазою, яка “зшиває” дві різні молекули в одну рекомбинантну ДНК. На третьому етапі рекомбінантні молекули вводять в клітини тих чи інших бактерій методом трансформації. На завершальному, четвертому, етапі проводять клонування трансформаційних клітин.

Трансформація - це процес переносу генів, при якому частина ДНК клітини-донора може приникати в бактеріальну клітину-реципієнт. В результаті відбувається включення в ДНК реципієнта фрагмента хромосоми ДНК донора, що обумовлює зміну ознак бактерії-реципієнта.

Процес трансформації можна поділити на декілька стадій:

1-контакт ДНК з поверхнею клітини;

2-проникнення ДНК в клітину;

3- з'єднання трансформаційної ДНК з відповідним фрагментом хромосоми реципієнта.

Подальший процес пов'язаний з рекомбінацією частини екзогенної молекули трансформуючою ДНК з реципієнтною ендогенною хромосомною ДНК. Остання стадія - реплікація включеної в хромосому нової інформації.

Для синтезу генетично модифікованого інтерферону використовують штами E. coli, Bac. subtilis, Sacchromyces cerevisiae, а також бактерії що відносяться до родів Methylomonas, Pseudomonas, Salmonella. У E. coli інтерферон накопичується в середині клітини, а Bac. сubtilis здатна виділяти синтезуємий білок в навколишнє середовище. В залежності від виду мікроорганізму, який застосовується для біосинтезу інтерферону, процес виділення та очистки препарату індивідуальний.

3. ТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА ГЕНЕТИЧНО МОДИФІКОВАНОГО ІНТЕРФЕРОНУ

3.1 Технологічна схема виробництва інтерферону лейкоцитарного людського

Виробництво інтерферону здійснюється в приміщеннях 2,3 та 4 класу чистоти. Приміщення, обладнання, інвентар, а також технологічний одяг перед виробничим процесом підлягають санітарній обробці. Повітря, що потрапляє в приміщення, проходить багатостадійну очистку за допомогою ячейкових (ФЯВ), рулонових (ФРП) та комбінованих фільтрів, які встановленні безпосередньо перед повітрьовідбірними установками.

Виробництво інтерферону умовно можна розділити на 3 етапа:

1) культивування вірусу хвороби Ньюкасла;

2) виділення лейкоцитів з донорської крові;

3) біосинтез інтерферону, його очистка та ліофілізація.

Культивування вірусу Ньюкасла здійснюється в алантоісній порожнечі куриних ембріонів .Для чого ампулу з висушеним вірусом відкривають, вносять ізотонічний розчин натрію хлориду. Робочим являється 10^-4розведення вірусу. Заражену дозу вірусу вводять в алантоїсну порожнечу . Через 48 годин вилучають рідину, яка містить вірус, в бутилі та додають антибіотики - пеніцилін та каноміцин.

Для виробництва інтерферону використовують лейкоцити, які отримують з донорської крові, еритроцитної маси та плазми.

Кожна партія донорської крові супроводжується сертифікатом обслідування донорів та контролю на HBS-ад, СНІД, PW .Сировину потрібно використати не пізніше 24 годин з моменту отримання.

Бутилі з кров'ю центрифугують .Плазму розливають по 300-350 мл в бутилі за допомогою стиснутого повітря і фракціонують. В бутиль з стабілізуючим розчином додають розчин цитрату натрію. Сюди ж за допомогою вакууму переносять лейкомасу з домішками ер маси. Додають розчин полі вінілового спирту. Суспензію перемішують та поміщають в холодильник на 45 хвилин. За цей час вміст бутилі розділяється на два шари нижній шар видаляють, а верхній центрифугують. Рідину над осадом видаляють, а до осаду додають поживне середовище. Сюди додають розчин хлористого амонію перемішують та центрифугують на протязі 10 хвилин. Метаболізм лейкоцитів активізують дією інсуліну та нативного інтерферону. Для індукції інтерферогенезу використовують вірус хвороби Ньюкасла. Таким чином: в лейко масу додають алантоїсну рідину, що містить вірус, та інкубують в термостаті при Т=(37 - 38)⁰С на протязі 16 -18 год при постійному перемішуванні. Після завершення біосинтезу рідину, що містить інтерферон центрифугують. Надосадочну рідину (нативний інтерферон) піддають інактивації розчином соляної кислоти. Ін активований інтерферон фільтрують через мембранний фільтр. Піддають ультра фільтрації та стерилізуючій фільтрації. Після цього препарат надходить на розлив та леофілізацію. Препарат що надходить на розлив повинен мати рН до 7,0, що регулюється за допомогою NaOH. В напівфабрикат додають розчин натрій фосфатного буфера. Розливають інтерферон по 2 мл в ампули ШП - 5. Замороження препарату відбувається в низькотемпературному прилавку при Т=60⁰С в продовж 24 годин. Ліофілізують інтерферон в сублімаційній охолодженій установці при Т=(50 - 60)⁰С. Загальний час ліофілізації 30 годин.

Ампули з препаратом герметизують, маркірують пакують в пачки та відправляють на склад готової продукції. На протязі всього процесу виробництва інтерферону здійснбється постадійний контроль. [ ]

Схема виробництва лейкоцитарного інтерферону з донорської крові представлена на малюнку 3.1.



Малюнок 3.1 - Блок-схема виробництва лейкоцитарного інтерферону

3.2 Технологічна схема виробництва генетично модифікованого інтерферону

3.2.1 Отримання штаму E. coli -суперпродуцента рекомбінантного інтерферону

Рекомбінантний штам E. сoli отримують в виробничій лабораторії. Це дуже складний процес який потребує строгої регламентації дій на багато численних етапах.

Спочатку добувають іРНК, яка програмує біосинтез інтерферону з лейкоцитів крові людини. Лейкоцити виділяють з донорської крові. Для початку кров центрифугують, отриману плазму розливають по бутилям та дають відстоятися. Відстояну лейкомасу з домішками ермаси

добавляють в стабілізуючий розчин, сюди ж приливають розчин цитрату натрію та полі вінілового спирту. Суспензію перемішують, поміщають в холодильник при Т=6⁰С на 45 хвилин. Вміст бутиля чітко розділяється на два шари. Нижній темний шар видаляють - це еритроцитна маса. Верхній світлий шар зливають в утиль та центрифугують. Після чого надосадкову рідину видаляють, а до осаду додають живильне середовище. Для гемолізу остаточних еритроцитів використовують 0,83% розчин хлористого амонію при Т=6⁰С. Цей розчин додають в клітинну суспензію перемішують та центрифугують на протязі 10 хвилин. Надосадкову рідину видаляють, а осад поміщають в живильне середовище. Отриману суспензію перемішують і беруть контрольну пробу для підрахунку життєздатності лейкоцитів, яка визначається за формулою 3.1.

Х = А_х 200 1100 ( 3.1 )

де

Х - кількість життєздатних клітин;

А - кількість нефарбованих клітин в камері;

Активізують метаболізм лейкоцитів шляхом обробки їх вірусом Ньюкасла, який виявляє індукуючий ефект на біосинтез інтерферону. З лейкоцитів отримують іРНК, яка програмує біосинтез інтерферону. За допомогою фермента зворотної транскриптази (ревертази) на полінуклеотидній основі іРНК синтезують комплементарну їй одно ланцюгову копію ДНК (кДНК). Перед цим етапом синтезують дезоксирибонуклеотид - затравку, що складається з 32 мононуклеотидів та при гібридизації взаємодіє з відповідною комплементарною ділянкою, виділеною з лейкоцитів іРНК. Вона в подальшому виступає в якості стартової відмітки, від якої починається РНК - залежний синтез одного з ланцюга к днк.

Малюнок 3.2 - Схема клонування генів інтерферону людини. [ ]

На наступному етапі від гібридної структури ДНК - РНК відділяють одно ланцюгову к днк, на якій здійснюється біосинтез другого комплементарного ланцюга ДНК. Щоб забезпечіти к ДНК яка синтезується компліментарність липких кінців, до них приєднують лінкери (переходники), які являються синтезованими хімічним шляхом короткими ділянками ДНК, що мають різні липкі кінці. Обробка реструктазною ендонуклеазою Hind ІІІ кінцівка ДНК, а також підібраної плазміни вектора наприклад pBR 322, яка в результаті ферментного гідролізу розщепляється рестриктазою з утворенням лінійної молекули к днк з липкими кінцями, дозволяє поєднати к днк з плазмі дою і завдяки липким кінцям з допомогою ДНК - лігази утворить кільце видну рекомбінантну плазміну з синтезованою к ДНК, в якій знаходиться ген що кодує біосинтез рекомбінантного інтерферону.(див. малюнок 3.2) [ ]

Потім рекомбінантну плазміну вводять в бактеріальну клітину методом трансформації.(див. пункт 2.2) Як продуцент рекомбінантного людського інтерферону використовуються такі штами E. сoli:С 600 hsdRM, leu, thr, lacy, ton A, C 6000.

3.2.2 Синтез та очистка напівфабрикату рекомбінантного інтерферону

Виробництво рекомбінантного інтерферону здійснюється в приміщеннях 2,3 та 4 класу чистоти. Приміщення, обладнання, інвентар, а також технологічний одяг перед виробничим процесом підлягають санітарній обробці. Повітря, що потрапляє в приміщення, проходить багатостадійну очистку за допомогою ячейкових (ФЯВ), рулонових (ФРП) та комбінованих фільтрів, які встановленні безпосередньо перед повітрьовідбірними установками. Виробничі приміщення мають системи водопроводу , каналізації, вентиляції та систему видалення відходів виробництва. Приміщення мають освітлення, температурний режим, вологість та вентиляцію, які не впливають на якість препарату, роботу обладнання та на здоров'є персоналу.

Для вирощування рекомбінантних штамів E. сoli, які містять гібридну плазміду з геном інтерферону використовують бульйон Хотінгера з добавкою глюкози і антибіотиків - стрептоміцина та карбеніциліна. Біосинтез рекомбінантного інтерферону продовжується 16-18 годин.

У E. сoli рекомбінантний інтерферон накопичується в періплазматичному просторі всередині клітини, тому для його отримання необхідно зруйнувати клітину.

Для цього суспензію клітин піддають сепарації, щоб звільнитися від залишку бульйону. Потім клітини переносять в 0,1 молярний трис-HCl-буфер з рН=7.5, в якому знаходиться 0,2 молярний хлорид натрію, 10% сахарози,5 мм ЕДТА, 1 мілімоль фенілметилсульфонілфториду. Клітини руйнують ультразвуковою обробкою 6-15 секунд. В результаті чого в буферний розчин надходить суміш білків.

Для біотехнологічного методу отримання очищеного препарату використовують пришиті моноклональні антитіла, які отримують для кожного виду інтерферону відповідно. Моноклональні антитіла являють собою імуноглобуліни, що синтезовані лімфоцитами тільки одного клону. Клон являє собою групу генетично ідентичних клітин, які були отримані шляхом розмноження однієї клітини. Моноклональні антитіла прикріпляють до полісахаридних кульок .

Через шар іммобілізованих моноклональних антитіл пропускають суміш білків, отриману після руйнування рекомбінантних клітин E. сoli. Інтерферон взаємодіє з антитілами та затримується на полісахаридних кульках, з яких потім змивається розчином слабкої кислоти.

Схема очистки рекомбінантного інтерферону за допомогою моноклональних антитіл представлена на малюнку 3.3.



Малюнок 3.3 - Схема очистки рекомбінантного інтерферону за допомогою моноклональних антитіл.

Умовні позначення:

1 - суміш інтерферону з іншими бактеріальними білками;2 - інтерферон;3 - баластні білки;4 - моноклональні антитіла;5 - інтерферон, зв'язаний з моноклональними антитілами; 6 - слабка ктслота

Отриманий напівфабрикат рекомбінантного інтерферону фільтрують через мембранний фільтр з діаметром пор 0,22 мм.

Потім препарат надходить на ультрафільтрацію, яка здійснюється на апараті “Pelicon”.

З напівфабрикату інтерферону отримують концентрований препарат за допомогою катіонообмінної хроматографії на целюлозі. Кількісно визначають антивірусну активність в МО/мл. (див пункт 4.2.3)

До концентрованого розчину рекомбінантного інтерферону добавляють розчин хлориду натрію, буферний розчин та поліглюкін в такій послідовності:

1) розчин хлориду натрію змішують з розчином поліглюкіна;

2) до цієї суміші приливають буферний розчин

3) добавляють розчин субстанції інтерферону.

В залежності від противірусної активності концентрованого рекомбінантного інтерферона знаходять його кількість, яка необхідна для отримання кінцевого препарату з різною противірусною активністю, за формулою 3.2

, (3.2)

де Х - кількість субстанції концентрованого рекомбінантного інтерферону, (мл);

V - об'єм заданої серії препарату, (л), V = 10 л;

С - антивірусна активність кінцевого препарату, (МО/мл), С = 1 10⁶ МО/мл;

В - антивірусна активність субстанції концентрованого рекомбінантного інтерферону, (МО/мл), повинна бути не менше 8 10⁸(МО/мл); (див п 4.2.3)

0,7 - коефіцієнт, який враховує втрати розчину кінцевого препарату на всіх стадіях технологічного процесу.

Для даного виробництва:

(мл).

РН кінцевого розчину рекомбінантного інтерферону повинна бути 6,0 - 7,5, що регулюється за допомогою NaOH

Розчин препарату фільтрують через мембранний фільтр з діаметром пор 0,22 мм. Фільтрація відбувається під тиском стиснутого повітря. Очищений рекомбінантний інтерферон розливають в сухі, стерильні ампули по 1,1 мл, поміщають в низькотемпературний прилавок, де його заморожують при температурі - 45⁰С, а потім ліофілізують в сублімаційній камері. Ампули з сухим препаратом запаюють, маркірують, пакують в картонні пачки та відправляють на склад готової продукції. [10]

Схема виробництва рекомбінантного інтерферону представлена на малюнку 3.2.



Малюнок 3.4- Блок-схема виробництва рекомбінантного інтерферон

4. КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ ПРЕПАРАТУ

Показники якості рекомбінантного інтерферону, які контролюються на виробництві, представлені в таблиці 4.1 [18]

Таблиця 4.1 - Показники якості рекомбінантного інтерферону

Об'єкт контролю	Показник якості	Регламентований норматив	Метод контролю
Рекомбінантний інтерферон	Час розчинення	не більше 30 секунд	візуальний
	прозорість розчину	прозорий	візуальний
	колір розчину	не інтенсивніше еталону №5б	візуальний
	рН	від 6 до 7,5	потенціометричний
	стерильність	стерильний	візуальний
	токсичність	не токсичний	мікробіологічний
	Кількісне визначення противірусної активності	1 106 МЕ в 1 ампулі	візуальний

4.1 Фізичні та фізико-хімічні методи аналізу

4.1.1 Визначення прозорості

Для визначення прозорості рідини використовують однакові пробірки з безбарвного прозорого нейтрального скла з плоским дном, що мають внутрішній діаметр від 15 мм до 25 мм. 40 мм шар випробовуваної рідини порівнюють з 40 мм шаром еталону. Порівняння рідин проводять у розсіяному денному світлі, переглядаючи зразки вздовж вертикальної осі пробірок на чорному фоні. Випробувану рідину вважають прозорою, якщо вона витримує порівняння з водою або розчинником.

Ампулу з препаратом відкривають та добавляють 2 мл дистильованої або кип'яченої води. Після розчинення препарату перевіряють його на прозорість в порівнянні з водою. Розчин рекомбінантного інтерферону повинен бути прозорим.[8, 9, 18]

4.1.2 Визначення кольоровості розчину

Колір розчину визначають візуально шляхом порівняння його з відповідними еталонами. Порівняння проводять в пробірках, які виготовленні з однакового скла та мають однакові розміри. Процес ведуть при денному світлі на матово-білому фоні. Колір визначаємого розчину повинен бути ідентичним еталону або бути приблизним до кольору еталона, не перевищуючи його по інтенсивності, але дещо відрізнятися по тону.

Для визначення кольору розчину рекомбінантного інтерферону використовують шкалу б - еталони жовтих відтінків. Колір проби не повинен перевищувати колір еталона №5б. [8, 9]

4.1.3 Потенціометричне визначення рН

Потенціометричне визначення рН проводять шляхом вимірювання різниці потенціалів між двома відповідними електродами зануреними у випробовуємий розчин. Один з електродів чутливий до іонів водню - скляний електрод; другий - електрод порівняння. В даному виробництві застосовують водневий електрод порівняння.

Вимірювальним приладом є потенціометр з вхідним опором у 100 разів більше за опір використовуваних електродів. Прилад звичайно градуюється в одиницях рН і повинен мати чутливість, щоб можна було виявити відмінність 0,05 одиниць рН або 0,003 В.

Перед використанням, прилад калібрують за допомогою буферного розчину калію гідрофталату. Визначення рН проводять при температурі 25⁰С.

Ампулу з препаратом відкривають та добавляють 2 мл дистильованої або кип'яченої води. Після розчинення препарату перевіряють його рН, що має бути від 6 до 7,5. [8, 9, 18]

4.2 Мікробіологічні методи аналізу

4.2.1 Перевірка на стерильність

Використовують метод прямого засівання. Випробовуємий лікарський засіб вносять безпосередньо у живильне середовище. Кількість лікарського засобу має становити не більше 10% від об'єму живильного середовища.

Антимікробну активність нейтралізують шляхом додавання нейтралізаторів або збільшення об'єму живильного середовища.

Використовують соєво - казеїнове живильне середовище.

Вміст живильного середовища:

панкреатичний гідролізат казеїну 17 г,

папаїновий гідролізат соєвої муки 3,0 г,

натрію хлорид 5,0 г,

дикалію гідро фосфат 2,5 г,

глюкози моногідрат 2,5 г,

вода 1000 мл.

Інгредієнти змішують, розмішують до розчинення. Фільтрують для одержання прозорого середовища, розливають у чашки Петрі, стерилізують у паровому стерилізаторі. Зберігають у стерильному контейнері.

Середовище перевіряють на стерильність. Для цього декілька контейнерів інкубують при Т=36⁰С протягом 14 діб. Після закінчення періоду інкубації не має спостерігатися ріст мікроорганізмів.

На стерильне поживне середовище засівають препарат та інкубують 14 діб. Посіви переглядають періодично під час і після закінчення періоду інкубації, відмічаючи наявність візуально виявленого росту мікроорганізмів.

Якщо випробовуваний зразок викликає каламутність живильного середовища, що робить неможливим візуальний облік, то через 14 діб після початку інкубації з кожної посудини переносять певну кількість середовища в посудини з тим самим свіжим живильним середовищем. Продовжують інкубацію вихідних і повторних посівів. Препарат витримує випробування на стерильність, якщо при візуальному обліку не виявляється ріст мікроорганізмів. При наявності росту мікроорганізмів вважають, що лікарський засіб не витримує перевірку на стерильність.

Якщо результати випробування визнані не вірогідними, його повторюють на тій самій кількості зразків, що й початкове.

Якщо в результаті повторного випробування не було виявлено росту мікроорганізмів,вважають, що лікарський засіб витримує випробування на стерильність. Якщо в результаті повторного випробування було виявлено ріст мікроорганізмів, вважають, що лікарський засіб не витримує випробування на стерильність.

Рекомбінантний інтерферон повинен бути стерильним. [9, 18]

4.2.2 Контроль токсичності

Контроль токсичності здійснюється по ВФС-42У-200-20/128-1444-99

Для контролю токсичності використовують первинну культуру клітин шкірно-м'язової тканини ембріонів людини, монослойну культуру лінії клітин нирки бика (МДВК), що перевиваються чи інші лінії клітин, що перевиваються, чутливі до інтерферону альфа-типу.

Клітини вирощують у лунках 96-луночних планшетів з плоским дном. У лунки з 1-2 добовою культурою з сформованим монослоем вносять відповідно по 0,1 мл розведення 10^-2-10^-3 препарата в середовищі №1, що містить 5-10% сиворотки плодів корів, 100 од/мл пеніциліну, 10 од/мл гентаміцину чи відповідну кількість інших антибіотиків. Для кожної випробуваної серії використовують не менш 4-х лунок. У лунки з контрольною культурою вносять відповідно середовище №1 без препарату по 0,1мл культури витримують три доби при температурі (37,01,0)⁰С в атмосфері з (5,00,5)% СО₂ і вологості (705,0)%.

Переглядають під мікроскопом при збільшенні 100^х

Клітинний монослой повинен залишатися неушкодженим, без ознак дегенерації, не відрізнятися від контролю. У випадку появи ознак дегенерації в досліджуваних культурах аналіз на токсичність повторюють на подвоєній кількості лунок. При наявності ознак дегенерації при повторній постановці аналізу - препарат бракують.

При контролі на тваринах використовують безпородних мишей масою 17-20г (не менш 5 шт.).Препарат вводять по 0,5 мл внутрібрюшинно зі швидкістю не більш 0,1мл/сек. Якщо реєструють загибель, захворювання, зменшення маси тіла, розвиток некрозу чи абсцесу хоча б в однієї тварини, аналіз повторюють на подвоеній кількості тварин того ж виду.

При повторному негативному результаті препарат бракують. [9, 18]

4.2.3 Кількісне визначення противірусної активності

Визначення проводять у первинній культурі клітин шкірно-м'язової тканини ембріонів людини, у культурі клітин нирки бика (МДВК), що перевивається чи іншій культурі клітин, що перевивається, високочутливої до інтерферону альфа-типу, у порівнянні з першим міжнародним стандартом ВОЗ рекомбінантного людського інтерферону альфа 2Б чи іншого аналогічного стандарту.

Клітини вирощують у вигляді монослоя в скляних матрацах місткістю 0,5л. Для культивування клітин використовують поживне середовище 199 або KPMI з 5-10% сиворотки плодів корови (середовище №2),100од/мл пеніциліну і 10од/мл гентаміцину.

Для засіву використовують 3-4 добову культуру з цілком сформованим клітинним монослоєм.Після видалення поживного клітинного середовища шар промивають 40-50 мл 0.02% розчином Версена, підігрітого до температури (37,01,0) ⁰С. Потім у матрац вносять суміш розчину трипсину 0,25% і розчину Версена в співвідношенні 1:1. Інкубують клітини 5-10 хвилин при температурі 37⁰С до початку відшаровування клітин від поверхні скла. Після цього суміш видаляють, клітини суспендують у 10мл середовища 199 з 5% сирворотки плодів (середовище №1). Відбирають пробу для підрахунку кількості клітин у 1мл середовища в камері Горяева. Суспензію клітин розводять так,щоб у 1мл містилося (4-6)10⁵ клітин.

Тестування проводять у 96-лункових плоскодонних пластикових планшетах. У кожну лунку вносять по 0,1мл суспензії клітин у поживне середовище №1. Вміст ампул розводять в 1мл середовища №1, готують десятикратне розведення до концентрації 10^-3, а потім безпосередньо в лунках планшета в об'ємі 0,1мл роблять дворазове розведення до розведення, близького до припустимого титру активості. Паралельно проводять робочий стандартний зразок ,активність якого виражена в МО.

На кожне розведення використовують не менш як 4 лунки. 4 лунки залишають для контролю клітин, 16-для контролю дози індукторного вірусу.

У кожну з 96 лунок вносять по 0,1мл клітинної суспензії в концентрації (5,01,0)10⁵ клітин у 1мл середовища №1. Інкубують 24 години при температурі 37⁰С, атмосфері (50,5)% СО² і вологості (705)%.

Середовище з лунок видаляють. У кожну лунку з випробуваним матеріалом вносять визначену заздалегідь дозу вірусу везикулярного стаматиту (VSV). Одночасно здійснюють контроль взятої дози вірусу на призначених для цієї мети 16 лунках з культурою. Використовують по 4 лунки на кожне розведення вірусу, починаючи з розведення, що відповідає 0,1 ТЦД₅₀ з коефіцієнтом розведення 10.

Після внесення індукторного вірусу і титрування його дози, культуру інкубують 2 доби за тих самих умов. Облік визначаємої активності інтерферону здійснюють через 24-48 годин, коли доза внесеного вірусу відповідає 100 ТЦД₅₀. Облік результатів проводять у випадку відсутності дегенерації в контрольній культурі.

За титр інтерферону приймають величину, зворотну розведенню препарату, при якій клітинна культура в 50% лунок виявилася цілком захищеною від цитопатичної дії вірусу. [17]

5 . ТЕОРЕТИЧНЕ ОБГРУНТУВАННЯ МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ, ЯК МЕТОДУ ЧАСТКОВОЇ ОЧИСТКИ ТА КОНЦЕНТРУВАННЯ РЕКОМБІНАНТНОГО ІНТЕРФЕРОНУ

5.1 Загальні відомості про електрофорез

Електрофорез - метод розділення багатокомпонентних сумішей на фракції, який оснований на здатності заряджених частинок рухатись в зовнішньому електричному полі .Переміщення частинок при електрофорезі залежить від ряда факторів, основними з яких являються:

- напруга електричного поля;

- величина електричного заряду;

- швидкість та розмір частинок;

- в'язкість середовища;

- рН середовища;

- температура середовища;

При електрофорезі на твердому середовищі на ефективність розділення впливають також:

- процес адсорбції;

- неоднорідність речовини носія;

- іонообмінні властивості носія;

- електроосмос;

- капілярний ефект.

Електрофоретична рухомість являється величиною, яка характерна для даної речовини. Розрізняють абсолютну і питому електрофоретичну рухомість. Абсолютна електрофоретична рухомість вимірюється в сантиметрах за секунду під впливом градієнту потенціалу 1В на 1см та виражається в см²в^-1с^-1.Питома електрофоретична рухомість є відношення рухомості досліджуваної речовини до рухомості іншої речовини, яка прийнята за стандарт.

Існує два різних метода електрофорезу:

а) фронтальний електрофорез, який проводять в вільному незакріпленому середовищі;

б) зональний електрофорез, який проводять в закріпленому середовищі, яким може бути стабілізована рідина або носій.

Для проведення електрофорезу обома методами застосовують таку апаратурну схему:

- джерело струму;

- камера для електрофорезу;

- два електроди, які з'єднують камеру та джерело струму;

- апаратура для зібрання та ідентифікації речовин, що розділилися.

Приблизна схема проведення електрофорезу:

1) підготування середовища ( носія);

2) нанесення речовин, які підлягають розділенню;

3) проведення електрофорезу;

4) якісна та кількісна оцінка речовин, що розділилися.

Електрофорез можна використовувати для аналізу, а також для очистки та концентрування як низькомолекулярних так і високомолекулярних сполук, таких як білки, нуклеїнові кислоти та пептиди.[9]

5.2 Поведінка білків при електрофорезі в залежності від рН середовища

Молекули білків в одному середовищі містять основні групи HONH₃ та кислотні групи COOH і тому являються амфотерними сполуками. Схематично білкову молекулу можна зобразити так:

HONH₃ - R - СООН

де R - достатньо довгий вуглецевий ланцюг, що містить групи - CONH - .

У водному розчині при визначеній концентрації водневих іонів, що відповідає ізоелектричній точці, у амфотерного електроліту число іонізованих основних груп рівне числу іонізованих кислотних груп. При цьому число як тих, так і інших груп мінімальне. Молекулу білку в ізоелектричному стані вважають в цілому нейтральною, хоча вона й має ще іонізовані групи. Умовно її можна відобразити у такому стані таким чином:

OH^-+NH₃⁺-R-COO^-+H⁺

Оскільки білок є більш сильною кислотою ніж основою, то ізоелектрична точка його лежить при рН нижче 7. Так як в ізоелектричній точці число взаємодіючих іонізованих основних та кислотних груп в молекулі однакове, то гнучка молекула в цьому стані закручується в клубок.

В кислому середовищі, наприклад в присутності HCl, коли в результаті залишку водневих іонів пригнічена іонізація карбоксильних груп:

OH^-+NH₃⁺-R-COOH+H⁺+CL^- Cl^-+NH₃⁺-R-COOH+H₂O

Молекула білку веде себе в цьому випадку як основа, набуває позитивного заряду і при електрофорезі рухається до “ - ” електроду. Оскільки між однойменно зарядженими групами, розкиданими по всій довжині молекули, діють електричні сили відштовхування, завернута у клубок ланцюгова молекула білку в кислому середовищі прагне розпрямитися. Однак при великому залишку HCl із-за великої кількості хлорид-іонів ступінь іонізації сполуки ClNH₃ - R - COOH, яка є сіллю сильної кислоти та слабкої основи, буде знижуватися і молекула знову звернеться у клубок.

В лужному середовищі (NaOH) із-за великої кількості ОН^- іонів, які знаходяться в розчині, іонізація груп HONH₃^- пригнічена:

HONH₃-R-COO^-+H⁺+Nа⁺+OH^- HONH₃-R-COO^-+Nа⁺+H₂O

Молекула білку веде себе як кислота, набуває від'ємного заряду і при електрофорезі рухається до “+” електроду. В результаті взаємодії однойменно заряджених груп - СОО - ланцюгова молекула прагне розпрямитися. Однак при надлишковому NaOH, із-за присутності більшої кількості іонів Na⁺ та зниження іонізації солі HONH₃-R-COONa, заряд буде зменшуватися, макромолекула знову зкрутиться у щільний клубок. [20]

5.3 Електрофорез в поліакриламідному гелі, як метод очистки та концентрування рекомбінантного інтерферону

З усіх методів електрофорезу для очистки, концентрування , кількісного та якісного аналізу білків найбільш підходить метод зональний електрофорезу. Цей метод широко застосовується завдяки своїй універсальності, швидкості виконання та зручності застосованих приладів.

Зональний електрофорез проводиться в гетерогенному середовищі, яке складається з пористого носія та буферного розчину. Застосування носія дозволяє повністю ліквідувати теплову конвекцію та значно збільшити напругу, що зменшує час проведення аналізу.

По виду носія та способу виконання аналізу розрізняють зональний електрофорез на колонках, в блоках, на папері або плівці, проточний електрофорез, гель - електрофорез та диск- електрофорез. При роботі з біологічними об'єктами найкраще використовувати гель -електрофорез, а саме електрофорез в поліакриламідному гелі.

Поліакриламід представляє собою синтетичний продукт сополімерізації акриламіду з сшиваючім агентом, найчастіше це N, N'-метиленбісакриламід. Завдяки утворенню поперечних зв'язків між сусідніми поліакриламідними ланцюгами , які з'являються в результаті полімеризації вінільних груп, такий гель має структуру тримірної сітки. На відміну від природного полімеру - крохмалю, синтетичний гель прозорий, хімічно стабільний, інертний, стійкий до змін рН та температури, нерозчинний в більшості розчинників, в ньому практично відсутня адсорбція та електроосмос. Пори гелю, розміри яких можна контролювати, в процесі електрофорезу виконують роль молекулярного сита.

Поліакриламід готують на буфері, в якому розчиняють акриламід, зшивку та каталізатор. Можливо отримати гель з концентрацією акриламіду від 2 до 50%. Збільшення концентрації гелю знижує його пористість. Буферна система та склад гелю визначається природою речовини, яка розділяється. Концентрацію акриламіду підбирають в залежності від молекулярної маси фракціонуємих речовин.(див. табл.5.1)

Таблиця 5.1 - Залежність концентрації акриламіду від молекулярної маси фракціонуємих речовин [9]

Молекулярна маса фракціонуємих речовин Мм	Концентрація акриламіду С %
< 10 10 3	>30,0
(10 -30 ) 103	15,0 - 30,0
(30 - 100) 103	7,5 - 15,0
> 100 103	<7,5

Для очистки рекомбінантного інтерферону від баластних білків та його концентрування можна використати поліакриламідний гель, який готують за такою методикою:

- розчин А:

1 N розчин HCl 48 мл;

тріс-(оксиметил)-амінометан 36,6 г;

ТЕМЕД 0,23 мл;

вода 100 мл;

- розчин В:

акриламід (99%) 28 г;

N, N' - метилен біс акриламід 0,735 г;

вода 100 мл;

- розчин С:

персульфат аммонію 0,14 г ;

вода 100 мл.

Порядок приготування розчину А: беруть наважку тріс-(оксиметил)-амінометану, розчиняють її в невеликій кількості води, добавляють HCl, ТЕМЕД та доводять об'єм водою до 100 мл

Порядок приготування розчину В: спочатку розчиняють метиленбісакриламід в невеликій кількості води, потім добавляють акриламід та доводять об'єм розчину до 100мл. Перед використанням розчин фільтрують.